專利名稱：抗制瘤素m單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到抗制瘤素M的單克隆抗體。本發(fā)明的抗體特征在于能夠結(jié)合到制瘤素M上，抑制制瘤素M受體結(jié)合，和/或抑制制瘤素M的生物活性。本發(fā)明的單克隆抗體可以用來在體內(nèi)或體外檢測制瘤素M的存在和/或調(diào)節(jié)制瘤素M的生物活性。
目前公認(rèn)，體細(xì)胞雜種(“雜種”)是不能從短期原始培養(yǎng)中得到的特定細(xì)胞產(chǎn)物的一個重要來源。關(guān)于這方面的最佳實例是由Milstein和其他人建立的產(chǎn)生雜交骨髓瘤的系統(tǒng)，用這種雜交骨髓瘤可以制備一種抗選擇性抗原的單克隆抗體(Kohler和Milstein，1985，自然雜志(倫敦)256∶495;Galfre et al。，1977，自然雜志(倫敦)266∶550)。這種雜交產(chǎn)物可以不斷地提供特異性抗原的單克隆抗體。且這些抗體可以作為藥劑用于任何已經(jīng)預(yù)先運(yùn)用過抗體的方法中，但是它還賦予了高認(rèn)別力、低背景和能夠不斷提供抗體來源的優(yōu)選性。
一般情況單克隆抗體的制備首先包括免疫接種、免疫應(yīng)答細(xì)胞的分離，這些細(xì)胞在例如聚乙二醇中，與所選擇的不斷地分裂的不能夠分泌免疫球蛋白的腫瘤細(xì)胞(“未滅活的”)進(jìn)行融合。將所產(chǎn)生的細(xì)胞(雜交瘤)在，例如，HAT(6-羥基嘌呤，氨基喋呤，胸苷)培養(yǎng)基中生長被識別。每個雜交瘤都是一種單一的抗體形成細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。這種雜交瘤具有前者的分泌一種單一特異性抗體的能力和后者的永久成活能力，使之能連續(xù)地繁殖，從而提供一種可以永久產(chǎn)生單一特異性抗體的細(xì)胞后代。
本發(fā)明涉及到對制瘤素M具有特異性的單克隆抗體的制備和運(yùn)用，制瘤素M是一種對多種正常和轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有多效性效應(yīng)的新型細(xì)胞分裂素(Cytokine)。具有本文所描述的單克隆抗體特征的任何單克隆抗體都屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，能夠競爭性抑制本文所述單克隆抗體與其制瘤素M抗原決定簇的免疫特異性結(jié)合和/或能調(diào)節(jié)制瘤素生物活性的一種單克隆或嵌合性抗體均屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
用于描述本發(fā)明的實施例中使用了雜交瘤技術(shù)以產(chǎn)生本發(fā)明的抗制瘤素M抗體，但是本發(fā)明的范圍并不局限于這些細(xì)胞雜交技術(shù)的運(yùn)用。根據(jù)是否能夠與天然制瘤素M，變性制瘤素M，或者兩者都可以形成免疫沉淀物對這些典型的抗體進(jìn)行了分類。每一類還據(jù)其對制瘤素M調(diào)節(jié)的生長抑制的阻斷能力和/或制瘤素M與其細(xì)胞表面受體結(jié)合的能力而進(jìn)一步特征化。這種抗體可以用于繪制新型制瘤素M蛋白質(zhì)的表面決定簇及功能位點結(jié)構(gòu)圖。
下列所用術(shù)語具有如下所述的含義DDEIA-雙決定性酶聯(lián)免疫測定GIA-生長抑制測定HRP-辣根過氧化物酶micro-EIA-微量酶聯(lián)免疫測定MAb-單克隆抗體OM-制瘤素MRRA-放射性受體測定OM1-1R10F11單克隆抗體OM2-11R2F8單克隆抗體OM3-12R13D7單克隆抗體
OM4-4R12C7單克隆抗體OM5-3R9D9單克隆抗體OM6-3R13F4單克隆抗體OM7-12R13B5單克隆抗體OM8-12R19E3單克隆抗體

圖1表示從cDNA編碼制瘤素M穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系的上清液中得到的35S-蛋氨酸和35S-半胱氨酸標(biāo)記的制瘤素M的免疫沉淀試驗。圖1A表示抗制瘤素M單克隆抗體與“天然”代謝標(biāo)記的制瘤素M(從代謝性標(biāo)記的CHO轉(zhuǎn)染物中收集的上清液)的一系列反應(yīng)。圖1B表示這些相同抗體與從代謝性標(biāo)記的CHO細(xì)胞中收集的上清液的反應(yīng)，這些上清液通過用SDS，2-巰基乙醇處理以及在與單克隆抗體一起培養(yǎng)前煮沸而使之變性。譜帶1陰性對照抗體;譜帶2OM1;譜帶3OM5;譜帶4OM6;譜帶5OM4;譜帶6OM2;譜帶7OM7;譜帶8OM3;譜帶9OM8。
圖2提供了兩種不同抗制瘤素M單克隆抗體在GIA測定中對A375黑色瘤細(xì)胞系的中和活性測定數(shù)據(jù)。圖2A表示不同濃度的OM2的活性而圖2B表示不同濃度OM1的活性。
圖3表示在放射性受體測定中各種抗制瘤素M單克隆抗體對125I-制瘤素M與H2981肺癌細(xì)胞系結(jié)合的影響。
圖4表示通過EIA所測定的兩種不同抗制瘤素M單克隆抗體與用含有氨基酸缺失或改變的一系列突變制瘤素M結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞所分泌的上清液之間的結(jié)合。所提供的數(shù)據(jù)是表示oD460時的總吸收單位。沒有減去背景結(jié)合。在此圖中，“del”表示從C-末端去掉的最后一個氨基酸，而英文字母表示所進(jìn)行的氨基酸變化。
圖5表示不同的抗制瘤素M單克隆抗體對由親代結(jié)構(gòu)，“SPOM”，或缺失突變體△44-47分泌的制瘤素M的免疫沉淀能力比較。譜帶1陰性對照抗體;譜帶2OM1;譜帶3OM2;譜帶4OM3。
圖6表示由兩種不同抗-制瘤素M單克隆抗體OM3和OM4測定的表面決定簇的定位圖。將以吸收單位表示的OM3和OM4的相對結(jié)合與陰性對照抗體和從質(zhì)?！?88-227，△188-227/L108S，和GAG104轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的無血清條件培養(yǎng)基中得到的OM的結(jié)合進(jìn)行比較。結(jié)合水平與COS細(xì)胞(“SPOM”)分泌的OM的結(jié)合水平進(jìn)行比較(Linsley，et al.，1990，Mol.Cell.Biol.101882-1890)。
圖7是可以影響一系列抗制瘤素M單克隆抗體結(jié)合的制瘤素M突變圖解。OM引導(dǎo)順序位于殘基-25到-1。從COS細(xì)胞中分泌的未加工分子為227個氨基酸長，被切割成一種成熟的196個氨基酸的蛋白質(zhì)。(Linsley，et al.，1990，Mol.Cell.Biol.101882-1890)。在184(△)以內(nèi)和包括184的C-末端氨基酸缺失可以破壞OM1和OM2的結(jié)合。另外，通過殘基22-36或44-47的缺失可以取消OM2結(jié)合?？贵wOM3的表面決定簇位于含有殘基108(箭頭所指)的位點，因為在這個殘基處把亮氨酸換成絲氨酸可以破壞這種mAb的結(jié)合。在殘基104( )處插入甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸三肽可以取消OM4結(jié)合。
本發(fā)明涉及到對制瘤素M(一種對多種不同的正常和轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有多效性作用的新型細(xì)胞分裂素(Cytokine))具有特異性的單克隆抗體。并對結(jié)合制瘤素M，抑制制瘤素M受體結(jié)合，和/或抑制制瘤素M生物活性的單克隆抗體進(jìn)行了描述。
所描述的單克隆抗體可以用來繪制制瘤素M的表面決定簇圖并且定義其領(lǐng)域的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。這種抗體可以用于診斷測定，例如，檢測制瘤素M，或制瘤素M突變形式的存在。也可以使用這種單克隆抗體在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)制瘤素M的生物活性。通過下面的章節(jié)對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
由對制瘤素M的特異性所定義的單克隆抗體的特性對定義天然或變性形式的制瘤素M的各種表面決定簇的單克隆抗體進(jìn)行了描述。并且根據(jù)他們對制瘤素M生物活性抑制能力和/或結(jié)合細(xì)胞表面受體的能力對單克隆抗體進(jìn)一步分類。能夠競爭性抑制所述單克隆抗體與他們的制瘤素M表面決定簇免疫特異性結(jié)合的任何單克隆抗體，包括嵌合抗體，都屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
制瘤素M抗原的識別制瘤素M起初以其對人體癌細(xì)胞系的抑制性作用而被鑒別，它首先是從佛波醇12-十四酸鹽13-乙酸鹽“PMA”)-誘導(dǎo)的人體組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞(Zarling et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)839739-9743)和從激活的T淋巴細(xì)胞(Brown et al.，1987，J.Immunol.1392977-2983)中分離出來。該分子是一種含有Mr＝28，000的單一多肽鏈的熱和酸穩(wěn)定性蛋白質(zhì)。象其他自然形成的生長調(diào)節(jié)因子一樣，制瘤素M具有各種生物活性。發(fā)現(xiàn)它對某些，但不是全部的，人體癌細(xì)胞系具有生長制抑作用。相反，制瘤素M可以刺激某些正常成纖維細(xì)胞，如人體包皮成纖維細(xì)胞或WI-38細(xì)胞的生長(Zarling et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)839739-9743)。已經(jīng)克隆和定序出制瘤素M的基因，并且最近在哺乳動物細(xì)胞中已經(jīng)表達(dá)出一種活性的重組制瘤素M(見于1988年1月15號申請的美國申請流水日.144，574，相同的歐洲專利申請
發(fā)明者蘇珊·F·拉德卡, 彼得·S·林斯雷, 莫罕默德·肖亞伯 申請人:布里斯托爾-米爾斯·斯奎布公司