專利名稱：電激基因轉(zhuǎn)移裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種將生物大分子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞，尤其是可作DNA分子轉(zhuǎn)移和細(xì)胞融合的高壓系統(tǒng)。
把外源基因?qū)氲街参锛?xì)胞，是植物生物工程的關(guān)鍵技術(shù)之一。在短短的十多年中，已發(fā)展了多種技術(shù)。但電激法是目前最實(shí)用和廣泛應(yīng)用的少數(shù)幾種重要技術(shù)之一。它的原理是把細(xì)胞置于高壓電場(chǎng)中，使細(xì)胞膜發(fā)生電介質(zhì)可逆擊穿而形成微孔，讓外源基因通過(guò)微孔進(jìn)入細(xì)胞。美國(guó)T.K.Wang于1981年首次把電激技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞，并于1987年研制成功先進(jìn)的Beakon-2000型電激儀(由美國(guó)Beakon公司生產(chǎn))。由于Beakon-2000采用單管變壓器升壓電路，只能輸出短脈沖。因此它只能用于動(dòng)物細(xì)胞或植物原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)移。同時(shí)，Beakon-2000的參數(shù)采用脈沖發(fā)放時(shí)間，實(shí)際使用時(shí)，需根據(jù)幾個(gè)參數(shù)用公式計(jì)算出脈沖休止時(shí)間，不但麻煩，且當(dāng)改變脈沖數(shù)目和脈沖時(shí)間時(shí)，脈沖休止時(shí)間難以在各實(shí)驗(yàn)中保持一致。
本發(fā)明的目的是研制一個(gè)操作參數(shù)可調(diào)的、可連續(xù)進(jìn)行非接觸放電的生物大分子轉(zhuǎn)移和細(xì)胞融合系統(tǒng)。
為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用以下幾部分組成電激基因轉(zhuǎn)移裝置開(kāi)關(guān)穩(wěn)壓電源、采用邏輯電路組成的具有脈沖休止時(shí)間控制器的脈沖發(fā)生器、推挽式高壓形成電路、電激小室。具體框圖如

圖1所示，其中1為脈沖發(fā)生器，采用邏輯電路設(shè)計(jì)，具有脈沖休止時(shí)間控制器;2為推挽式高壓形成電路;3為開(kāi)關(guān)穩(wěn)壓電源;為已有技術(shù);4為電激小室。
圖2為電激小室的結(jié)構(gòu)示圖，其中5為電極，6為樣品杯，7為接地金屬球。
圖3為脈沖發(fā)生器的電路結(jié)構(gòu)圖，具體描述如下由非門(mén)11、12組成的雙穩(wěn)態(tài)觸發(fā)器構(gòu)成防抖動(dòng)電路，其第1、4輸入端分別連接觸發(fā)開(kāi)關(guān)K1的兩個(gè)固定接頭，并通過(guò)電阻R1、R2接電源VDD，觸發(fā)開(kāi)關(guān)K1的活動(dòng)接頭接地，與非門(mén)12的輸出端6通過(guò)電容C和R3構(gòu)成的微分電路進(jìn)入與非門(mén)13的第1輸入端，與非門(mén)13的輸出端連接與非門(mén)17的兩個(gè)輸入端，17的輸出端經(jīng)二極管D1的正極進(jìn)入與非門(mén)18的第1輸入端，18的輸出端連接由與非門(mén)19、20構(gòu)成的雙穩(wěn)電路中19的第1輸入端，19的輸出端和與非門(mén)21的第2輸入端相連，21的第1輸入端與開(kāi)關(guān)K2的活動(dòng)接頭相連接，21的輸出端A接推挽式高壓形成電路的輸入端B;由與非門(mén)14、15組成雙穩(wěn)態(tài)觸發(fā)器，與非門(mén)15的第1輸入端與18的第2輸入端、與非門(mén)29的輸出端相連接，15的第2輸入端和與非門(mén)24的第2輸入端相連，15的輸出端與工作指示電路16、與非門(mén)13的第2輸入端和周期數(shù)計(jì)數(shù)器28的清零腳1相連接;14的第2輸入端與17的二輸入端相通;晶體振蕩器22產(chǎn)生脈沖寬度為61μs、占空比為1/2的方波脈沖，它的輸出端與24的第1輸入端和開(kāi)關(guān)K2的一個(gè)固定接頭相通，24的輸出端和與非門(mén)25的第1輸入端相連，25的第2輸入端和與非門(mén)19的第2輸入端相連;23為可變頻率振蕩器，輸出脈沖寬度為1μs～200μs、占空比為1/2的方波脈沖，其輸出端接開(kāi)關(guān)K2的固定接頭2;脈沖休止時(shí)間計(jì)數(shù)器26的正脈輸出端1經(jīng)二極管D2的正極至與非門(mén)18的第1輸入端，脈沖休止時(shí)間計(jì)數(shù)器26的計(jì)數(shù)輸入端2接25的輸出端，清零端3連接與非門(mén)19的輸出端;每周期脈沖數(shù)計(jì)數(shù)器27的計(jì)數(shù)輸入端3接與非門(mén)21的輸出端，清零端1接與非門(mén)20的輸出端及周期數(shù)計(jì)數(shù)器28的計(jì)數(shù)輸入端2，負(fù)脈沖輸出端2接與非門(mén)20的第2輸入端;周期數(shù)計(jì)數(shù)器28的兩負(fù)脈沖輸出端3、4分別與29的二個(gè)輸入端相連。
圖4為推挽式高壓形成電路的電路結(jié)構(gòu)圖，它采用場(chǎng)效應(yīng)管作為推挽輸出，輸出變壓器B1的初級(jí)二端分別接場(chǎng)效應(yīng)管T1的D極、T2的S極，B1中間抽頭接電源Vcc，T1的S極、T2的D極共同接地，T1、T2各自的D、S極間分別接有雙向保護(hù)器;輸入電路從B點(diǎn)輸入后分兩路，一路接經(jīng)電容C1、電阻R4后接場(chǎng)效應(yīng)管T1的G極，另一路先經(jīng)與非門(mén)30進(jìn)行倒相，再經(jīng)過(guò)電容C2、電阻R5接T2的G極，R4與C1、R5與C2的連接處分別接上二極管D3、D4的負(fù)極，正極共同接地;T1、T2的G極分別接一電阻R6、R7后落地;B1的次級(jí)分二種接法，一種接橋式整流D5～8，由C、D輸出長(zhǎng)脈沖，一種以D9作半波整流，E、F輸出短脈沖。
整個(gè)電路的工作原理是1.初始狀態(tài)(K1打到1)時(shí)，初始化電路(已知技術(shù))使15輸出高電位，使13打開(kāi)，輸出低電平，同時(shí)28清零，工作指示電路16的指示燈熄滅;14輸出低電位，使24關(guān)閉;19輸出低電位，使21關(guān)閉;20輸出高電位，使27清零，25打開(kāi)。
2.觸發(fā)過(guò)程和脈沖發(fā)放期按下觸發(fā)開(kāi)關(guān)K1(打到2處)后，11、12組成的雙穩(wěn)態(tài)電路發(fā)生翻轉(zhuǎn)，經(jīng)微分電路輸出一正脈沖至13，因此時(shí)15輸出高電位，故此正脈沖經(jīng)13反相后輸出負(fù)脈沖至17和14，14、15組成的雙穩(wěn)態(tài)電路發(fā)生翻轉(zhuǎn)，15輸出低電位，使工作指示電路16的指示燈發(fā)亮，同時(shí)使13關(guān)閉。這樣可防止在工作期間亂按觸發(fā)開(kāi)關(guān)對(duì)儀器造成的干擾。觸發(fā)信號(hào)從13至17，反相成為正脈沖輸入18的第1輸入端，18的第2輸入端為高電位，故18的輸出端輸出一負(fù)脈沖觸發(fā)19、20所組成的雙穩(wěn)態(tài)電路，19、20發(fā)生翻轉(zhuǎn)，19輸出高電位使26清零，同時(shí)打開(kāi)21;此時(shí)，從開(kāi)關(guān)K2來(lái)的信號(hào)(61μs或1～200μs脈沖串)從21輸出至高壓形成電路和27，27開(kāi)始計(jì)數(shù)，在達(dá)到所予置脈沖數(shù)后，分兩處進(jìn)行說(shuō)明對(duì)于高壓形成電路，它收到控制部分來(lái)的方波信號(hào)分二路，一路經(jīng)箝位(低電位箝位)后輸至推挽電路，另一路經(jīng)反相后輸至推挽電路。調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)穩(wěn)壓電源的電壓，可控制輸出電壓高低，輸出電壓經(jīng)B1升壓后，半波整流后在E、F端為短脈沖，橋式整流后在C、D端為長(zhǎng)脈沖輸出;對(duì)于每周期脈沖數(shù)計(jì)數(shù)器27來(lái)說(shuō)，此時(shí)輸出負(fù)脈沖使19、20發(fā)生翻轉(zhuǎn)，19輸出低電位，關(guān)閉21，此時(shí)無(wú)脈沖輸至高壓形成電路，整個(gè)電路進(jìn)入脈沖休止期，20輸出高電位，使27清零，28開(kāi)始計(jì)算周期數(shù)，同時(shí)25打開(kāi)，26開(kāi)始計(jì)算脈沖休止時(shí)間數(shù)。
3.脈沖休止期20輸出高電位，25打開(kāi)，14在整個(gè)電路工作期間內(nèi)一直處于高電位，所以24是開(kāi)的，25打開(kāi)后，從22來(lái)的61μs脈沖經(jīng)24、25后輸入26，26開(kāi)始計(jì)數(shù)。在達(dá)到所予置的脈沖數(shù)(儀器面板上所標(biāo)時(shí)間值)后，26輸出一正脈沖。此脈沖加至18的輸入端，在18輸出一負(fù)脈沖，使19、20發(fā)生翻轉(zhuǎn)，19輸出高電位，打開(kāi)21，此時(shí)，第二周期的脈沖發(fā)放期開(kāi)始，21輸出第二周期的脈沖至高壓形成電路和27。周而復(fù)始。
4.周期計(jì)數(shù)在每一周期內(nèi)脈沖數(shù)達(dá)到設(shè)定值后，19、20組成的雙穩(wěn)態(tài)電路發(fā)生翻轉(zhuǎn)，20呈高電位，此電位使28計(jì)數(shù)，在達(dá)到所予置周期數(shù)后，29輸出一負(fù)脈沖使14、15翻轉(zhuǎn)，15輸出高電位，關(guān)掉工作指示電路16的指示燈，同時(shí)打開(kāi)13，28清零，儀器又回到初始狀態(tài)。
5.周期計(jì)數(shù)器置數(shù)00和99時(shí)的特殊狀態(tài)周期計(jì)數(shù)器18置數(shù)為00時(shí)，29輸出保持低電位，使18關(guān)斷，觸發(fā)脈沖不能送到19，使輸出脈沖為零。同時(shí)，15輸出高電位，使工作指示電路16的指示燈不亮。28置數(shù)為99時(shí)，28的第三腳輸出一負(fù)脈沖，使28的第4腳所輸出的脈沖不能通過(guò)29，而使周期數(shù)為無(wú)窮多次。
具體實(shí)施時(shí)，一周期脈沖數(shù)計(jì)數(shù)器27可采用集成電路CD4040，周期數(shù)計(jì)數(shù)器28可用集成電路CD4518，脈沖休止時(shí)間計(jì)數(shù)器26可用集成電路CD4040。
本發(fā)明采用多周期短脈沖輸出方式或長(zhǎng)周期輸出方式，任意選擇，并把脈沖發(fā)放時(shí)間改為脈沖休止時(shí)間，脈沖休止時(shí)間足夠長(zhǎng)，使細(xì)胞膜在兩次電激之間有充分的時(shí)間復(fù)原。利用本發(fā)明的裝置，不但可以把外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞和植物原生質(zhì)體，而且可以把外源基因?qū)胗斜诘闹参锛?xì)胞，如懸浮培養(yǎng)植物細(xì)胞、愈傷組織、葉片和莖組織、種子胚組織等多種受體中。它可以在動(dòng)物、植物、微生物的外源基因轉(zhuǎn)化和細(xì)胞融合中，得到廣泛的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種電激基因轉(zhuǎn)移裝置，有開(kāi)關(guān)穩(wěn)壓電源、電激小室，其特征是采用邏輯電路組成的具有脈休止時(shí)間控制器的脈沖發(fā)生器和推挽式高壓形成電路。
2.一種如權(quán)利要求1所述的電激基因轉(zhuǎn)移裝置，其特征是脈沖發(fā)生器的組成為由與非門(mén)11、12組成的雙穩(wěn)態(tài)觸發(fā)器構(gòu)成防抖動(dòng)電路，其第1、4輸入端分別連接觸發(fā)開(kāi)關(guān)K1的兩個(gè)固定接頭，并通過(guò)電阻R1、R2接電源VDD，觸發(fā)開(kāi)關(guān)K1的活動(dòng)接頭接地，與非門(mén)12的輸出端通過(guò)電容C和R3構(gòu)成的微分電路進(jìn)入與非門(mén)13的第1輸入端，與非門(mén)13的輸出端連接與非門(mén)17的兩個(gè)輸入端，17的輸出端經(jīng)二極管D1的正極進(jìn)入與非門(mén)18的第1輸入端，18的輸出端連接由與非門(mén)19、20構(gòu)成的雙穩(wěn)電路中19的第1輸入端，19的輸出端和與非門(mén)21的第2輸入端相連，21的第1輸入端與開(kāi)關(guān)K2的活動(dòng)接頭相連接，21的輸出端A接推挽式高壓形成電路的輸入端B;由與門(mén)14、15組成雙穩(wěn)態(tài)觸發(fā)器，與非門(mén)15的第1輸入端與18的第2輸入端、與非門(mén)29的輸出端相連接，15的第2輸入端和與非門(mén)24的第2輸入端相連，15的輸出端與工作指示電路16、與非門(mén)13的第2輸入端和周期數(shù)計(jì)數(shù)器28的清零腳1相連接;14的第2輸入端與17的二輸入端相通;晶體振蕩器22產(chǎn)生脈沖寬度為61μs、占空比為1/2的方波脈沖，它的輸出端與24的第1輸入端和開(kāi)關(guān)K2的一個(gè)固定接頭1相通，24的輸出端和與非門(mén)25的第1輸入端相連，25的第2輸入端和與非門(mén)19的第2輸入端相連;23為可變頻率振蕩器，輸出脈沖寬度為1μs～200μs、占空比為1/2的方波脈沖，其輸出端接開(kāi)關(guān)K2的固定接頭2;脈沖休止時(shí)間計(jì)數(shù)器26的正脈輸出端1經(jīng)二極管D2的正極至與非門(mén)18的第1輸入端，脈沖休止時(shí)間計(jì)數(shù)器26的計(jì)數(shù)輸入端2接25的輸出端，清零端3連接與非門(mén)19的輸出端;每周期脈沖數(shù)計(jì)數(shù)器27的計(jì)數(shù)輸入端3接與非門(mén)21的輸出端，清零端1接與非門(mén)20的輸出端及周期數(shù)計(jì)數(shù)器28的計(jì)數(shù)輸入端2，負(fù)脈沖輸出端2接與非門(mén)20的第2輸入端;周期數(shù)計(jì)數(shù)器28的兩負(fù)脈沖輸出端3、4分別與29的二個(gè)輸入端相連。
3.一種如權(quán)利要求1、2所述的電激基因轉(zhuǎn)移裝置，其特征是高壓形成電路的組成為輸出變壓器B1的初級(jí)二端分別接場(chǎng)效應(yīng)管T1的D極、T2的S極，B1中間抽頭接電源Vcc，T1的S極、T2的D極共同接地，T1、T2各自的D、S極間分別接有雙向保護(hù)器;輸入電路從B點(diǎn)輸入后分兩路，一路接經(jīng)電容C1、電阻R4后接場(chǎng)效應(yīng)管T1的G極，另一路先經(jīng)與非門(mén)30進(jìn)行倒相，再經(jīng)過(guò)電容C2、電阻R5接T2的G極，R4與C1、R5與C2的連接處分別接二極管D3、D4的負(fù)極，正極共同下地;T1、T2的G分別按一電阻R6、R7后落地;B1的次級(jí)分二種接法，一種接橋式整流D5～8，由C、D輸出長(zhǎng)脈沖，一種以D9作半波整流，E、T輸出短脈沖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種將生物大分子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞，尤其是可作DNA分子轉(zhuǎn)移和細(xì)胞融合的高壓系統(tǒng)。本發(fā)明由開(kāi)關(guān)穩(wěn)壓電源、采用邏輯電路組成的具有脈沖休止時(shí)間控制器的脈沖發(fā)生器、推挽式高壓形成電路、電激小室四大部分組成，采用多周期短脈沖輸出方式或長(zhǎng)周期輸出方式，操作參數(shù)可調(diào)，可連續(xù)進(jìn)行非接觸性放電操作，且休止時(shí)間足夠長(zhǎng)。使細(xì)胞在兩次電激之間有充分時(shí)間復(fù)原。利用本發(fā)明的裝置可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物、植物、微生物的外源基因轉(zhuǎn)化和細(xì)胞融合。
文檔編號(hào)C12N15/02GK1058043SQ91105038
公開(kāi)日1992年1月22日 申請(qǐng)日期1991年7月21日 優(yōu)先權(quán)日1991年7月21日
發(fā)明者石和平, 李寶健 申請(qǐng)人:中山大學(xué)