專利名稱：培養(yǎng)大腸菌群的培養(yǎng)基和檢測大腸菌群的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于培養(yǎng)大腸菌群的培養(yǎng)基和檢測大腸菌群的方法。
作為食品和飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)之一是測定大腸菌群，大腸菌群一方面能反映被檢物有無糞便污染，根據(jù)數(shù)量多少判斷樣品被污染程度，另一方面在一定程度上反映了食品在生產(chǎn)、加工、運輸、保存等過程的衛(wèi)生狀況，所以具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。
現(xiàn)有的檢測方法國外有氣相色譜法、放射性測定法和量熱法、電化學(xué)法和雙層培養(yǎng)基法，酶分解法。圍內(nèi)有傾注平皿復(fù)蓋法、DC瓊脂傾注法、TTC顯色法，簡易快速紙片法，以上大部分方法基本上仿效濾膜法，濾膜法有一定缺點，容易阻塞濾膜，這樣就造成檢查污水及食品不便;如遇到游走細(xì)菌造成細(xì)菌不典型，大腸菌群值高于發(fā)酵法等缺點，氣相色譜法、放射性測定法需要特殊昂貴的儀器設(shè)備，技術(shù)復(fù)雜，不宜基層單位推廣使用。雙層培養(yǎng)基法、傾注平皿復(fù)蓋法與DC瓊脂傾注法都是出現(xiàn)典型菌落為依據(jù)，事實上往往大腸菌群在膽鹽瓊脂培養(yǎng)基上的菌落是多樣的，這就造成了判斷上的困難。電化學(xué)法是利用細(xì)菌產(chǎn)生分子氫的時間與接種細(xì)菌的數(shù)量成線性關(guān)系來快速測量大腸菌群，但大腸菌群細(xì)菌需生長至每毫升含菌105～106個時才能用上法測出，靈敏性差，酶分解法對一些志賀氏菌屬變形桿菌屬，普羅威登斯菌屬梭菌屬菌株也能產(chǎn)生谷氨酸脫羧酶而干擾。國內(nèi)的紙片法將乳糖膽鹽培養(yǎng)基加指示劑鋪在濾紙上干燥后，加樣品通過顏色反應(yīng)表示發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，這樣往往容易由于雜菌抑制不全使一些分解乳糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的菌株誤為大腸菌群，如化膿性金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、珠白葡萄球菌、歐文氏菌種等，特別還有發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的氣單胞菌無法排除。
現(xiàn)有國內(nèi)普遍使用的檢測方法，有部頒發(fā)酵法(GB法)包括如下步驟(a)檢樣稀釋，以無菌操作將檢樣稀釋(b)將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1me以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1me及1me以下者用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管，每一稀釋度接種3管，置36°±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2小時，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行(c)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂單板上，置36°±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18～24小時，然后取出，(d)在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1～2個進(jìn)行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置36°±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24±2小時，觀察產(chǎn)氣情況，凡乳糖管產(chǎn)氣革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌，可報告為大腸菌群陽性。
整個過程需要3～6天時間，既耗時，又費力，特別是檢測冷飲食品，待檢驗結(jié)果出來時，往往銷售已空。
現(xiàn)有技術(shù)中還有一種較先進(jìn)的方法，即美國《水和廢水標(biāo)準(zhǔn)檢驗》中所述的A-1法。其方法如下樣品處理和接種量同GB法，接種后35℃±0.5℃溫箱培養(yǎng)32小時，再轉(zhuǎn)至44.5℃±0.2℃溫水浴培養(yǎng)21±2小時，如出現(xiàn)有產(chǎn)氣者，即表示糞大腸菌群為陽性，查表計算MPИ值。它的培養(yǎng)基為每升水溶液含胰蛋白胨20克，乳糖5克，氯化鈉5克，水楊素0.5克，TritonX-100，1毫升。
它通過改良培養(yǎng)基和提高培養(yǎng)溫度改為一步法檢測，縮短了檢測時間，但應(yīng)用中操作較麻煩，而且方法也不全面，不能從生物形態(tài)上進(jìn)行鑒別。象某些革蘭氏陰性非發(fā)酵桿菌及非凝集性(ИAG)弧菌等，如嗜水氣單胞菌，它是屬于 弧菌科。近年來發(fā)現(xiàn)對人有致病性，可引起細(xì)菌性食物中毒，而生化特性發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣，容易誤診為大腸菌群，它無證實試驗，影響它的特異性，培養(yǎng)基抑制雜菌效果差。且操作麻煩，需用兩種溫度培養(yǎng)。
本發(fā)明的目的之一，就是提供一種抑制雜菌敏感，并能加速大腸菌群生長的培養(yǎng)基，以縮短檢測時間，提高功效，節(jié)約成本。
本發(fā)明的另一個目的，就是提供一種用上述培養(yǎng)基快速檢測大腸菌群的方法，它靈敏、簡便，快速、準(zhǔn)確、全面，操作容易，一方面，本發(fā)明提供了一種能有效抑制雜菌生長并加快大腸菌群生長的培養(yǎng)基，它是一種干粉組合物，經(jīng)溶解水后可得到一種每1升水溶液含下列組分的培養(yǎng)基胰蛋白胨10～20克，乳糖5～10克，氯化鈉5克，十二烷基硫酸鈉0.4～1克，磷酸氫二鉀3.75～9.75克，磷酸二氫鉀0.5～1.3克，硫酸鎂0.02～0.05克，氯化鐵0.0025～0.005克，氯化鈷0.01～0.02克。
此組分中的磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀是成對選擇的。
本培養(yǎng)基中的胰蛋白胨含豐富的色氨酸，能增加營養(yǎng)，促進(jìn)大腸菌群的生長。緩沖鹽類，是成配對含量加入的，不必調(diào)整培養(yǎng)基的PH值。選擇適宜量的十二烷基硫酸鈉能有效抑制雜菌生長，本培養(yǎng)基選擇0.4～1克/升的量，能使抑制雜菌效果最佳，其抑制雜菌能力比采用膽鹽和美國A-1法中的TritonX-100大2～3倍，且成本低。培養(yǎng)基中加入的微量元素，是為了增加大腸菌群的營養(yǎng)成份，增加大腸菌群的生命代謝活力，加快生長，加快和促進(jìn)對乳糖發(fā)酵產(chǎn)氣遲緩的大腸菌群產(chǎn)氣，補充目的菌的無機鹽中的金屬鹽類;另一方面，本發(fā)明提供了一種使用上述培養(yǎng)基全面、靈敏、快速地檢測大腸菌群的方法，它包括(1)檢樣稀釋;
(2)將上述樣品接種于上述培養(yǎng)基中;
其特征在于培養(yǎng)溫度為35℃～37℃，時間為13～15小時;
(3)證實試驗a、培養(yǎng)物直接涂片革蘭氏染色鏡檢;
b、培養(yǎng)物直接氧化酶試驗;
c、培養(yǎng)物直接吲哚反應(yīng)試驗。
本方法采用上述公開的培養(yǎng)基，縮短了培養(yǎng)時間，其證實試驗是直接挑取培養(yǎng)物作試驗，同時在大腸菌群的檢測中對其作氧化酶試驗，排除非腸桿菌科細(xì)菌對乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的假陽性;直接吲哚試驗用于表明是否存在糞大腸菌群。(本法培養(yǎng)基能排除乳糖和其他試劑對吲哚反應(yīng)試驗的干擾。)本發(fā)明提出了一種簡便經(jīng)濟，反應(yīng)靈敏，抑制雜菌強并加快目的菌生長的新型培養(yǎng)基，把胰蛋白胨提高營養(yǎng)成份，采用十二烷基硫酸鈉抑制雜菌，并適量加入微量元素以促進(jìn)目的菌的生長發(fā)育并發(fā)酵產(chǎn)氣，不加指示劑便于做證實試驗。本發(fā)明提供的方法中氧化酶試驗?zāi)苡行懦悄c桿菌科細(xì)菌對乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，再加涂片鏡檢驗證第(2)步驟的結(jié)果，準(zhǔn)確、全面、直接顯示吲哚反應(yīng)檢測糞大腸菌群，采用價廉的十二烷基硫酸鈉代替昂貴的膽鹽，并有效地抑制雜菌，整個檢測時間由部頒法GB法的3～6天美國A-1法24小時縮短至15～18小時，提高功效分別為3.6～7.2倍，1.2～1.6倍，成本由部頒法GB法一個樣品需0.467～0.694元，美國A-1法0.189元減少到0.117元，節(jié)約經(jīng)費分別為74.94～83.14%、38.1%(按87年市場價計算)實施例1將胰蛋白胨20克，乳糖5克，氯化鈉5克，十二烷基硫酸鈉0.5克，磷酸氫二鉀9.75克，磷酸二氫鉀1.3克，硫酸鎂0.025克，氯化鐵0.003克，氯化鈷0.01克混合放入球磨機中，攪拌均勻，取出，放入1升蒸餾水中加熱溶解，分裝裝有小倒管的試管中各5毫升;高壓滅菌115℃20分鐘，檢測過程如下(1)樣品按常規(guī)法經(jīng)前處理后操作;
(2)根據(jù)樣品污染程度，接種不同量于上述培養(yǎng)基內(nèi)，10毫升及以上用雙料，1毫升及以下用單料，溫度為置37℃溫箱內(nèi)，15小時觀察結(jié)果，如出現(xiàn)有產(chǎn)氣者，即表示為陽性管。
以上陽性管繼續(xù)做證實試驗(3)證實試驗a、菌液涂片革蘭氏染色鏡檢有革蘭氏陰性無芽胞桿菌，而雜菌少或無。
b、氧化酶試驗產(chǎn)氣管取約1毫升培養(yǎng)物，滴加試劑2～3滴，紅色為氧化酶陽性，不變色或呈試劑的本色為陰性反應(yīng)。
c、吲哚反應(yīng)試驗約0.2毫升試劑直接加入培養(yǎng)管中，紫紅色為吲哚反應(yīng)陽性。
上述過程中，如有產(chǎn)氣、從形態(tài)上見到革蘭氏陰性的無芽胞桿菌，并且氧化酶陰性，表示有大腸菌群存在，然后再做吲哚試驗，反應(yīng)陽性表示糞大腸菌群存在，然后查表計算MPИ值。
實施例2培養(yǎng)基組分中十二烷基硫酸鈉為1克，磷酸氫二鉀為3.75克，磷酸二氫鉀為0.5克，其余均同實施例1。
實施例3培養(yǎng)基組分中磷酸氫二鉀為7.5克，磷酸二氫鉀為1.0克，其余同實施例1。
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)大腸菌群的培養(yǎng)基，其特征在于它為一種干粉組合物，經(jīng)溶解水后可得到一種每1升水溶液含下列組分的培養(yǎng)基胰蛋白胨10～20克，乳糖5～10克，氯化鈉5克，十二烷基硫酸鈉0.4～1克，磷酸氫二鉀3.75～9.75克磷酸二氫鉀0.5～1.3克，硫酸鎂0.020～0.05克，氯化鐵0.0025～0.005克，氯化鈷0.01～0.02克。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的組分是成對選擇的。
3.一種使用上述培養(yǎng)基檢測大腸菌群的方法，它包括(1)檢樣稀釋;(2)將上述樣品接種于上述培養(yǎng)基中;其特征在于培養(yǎng)溫度為35℃～37℃，時間為13～15小時;(3)證實試驗a、培養(yǎng)物直接涂片革蘭氏染色鏡檢;b、培養(yǎng)物直接氧化酶試驗;c、培養(yǎng)物直接吲哚反應(yīng)試驗。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于培養(yǎng)大腸菌群的培養(yǎng)基和檢測大腸菌群的方法。它提供了一種每一升水溶液中含胰蛋白胨10～20克，乳糖5～10克，氯化鈉5克，十二烷基硫酸鈉0.4～1克，磷酸氫二鉀3.75～9.75克，磷酸二氫鉀0.5～1.3克，硫酸鎂0.02～0.05克，氯化鐵0.0025～0.005克，氯化鈷0.01～0.02克的培養(yǎng)基及使用該培養(yǎng)基檢測大腸菌群的方法。該培養(yǎng)基反應(yīng)靈敏，抑制雜菌能力強并能加快目的菌生長。該方法準(zhǔn)確、全面、節(jié)材省時，整個檢測時間約為15～18小時。
文檔編號C12Q1/10GK1062000SQ9110684
公開日1992年6月17日 申請日期1991年11月12日 優(yōu)先權(quán)日1991年11月12日
發(fā)明者涂楚國 申請人:湘潭市衛(wèi)生防疫站