專利名稱：Dna及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵生產(chǎn)酰基氨基酸消旋酶的方法和該方法中所使用的新型微生物以及用于產(chǎn)生該新型微生物的新的DNA片段。
?；被嵯笍V泛分布于放線菌中。它是一種催化具有光學活性的N-?；被岬南饔枚鴮哂泄鈱W活性的氨基酸則無作用的專一性酸，并且詳細性質(zhì)也已弄清(美國專利4，981，799;Abstracts of Papers Pesented at the 1990 Annual Nleeting at the Japan Society For Bioscience，Biotechnology，andAgrochemistry，Page 368，1990)。
如上所述，?；被嵯甘且环N可用于生產(chǎn)光學活性氨基酸的酶。但是，迄今未找到一種令人滿意的方法，能夠以低成本、高效率生產(chǎn)該酶。因此，人們一直等待著一種更好方法的出現(xiàn)。
在這種情況下，本發(fā)明人進行了深入的研究并對由擬無枝菌酸屬(AmycoLatopsis)TS-1-60產(chǎn)生的酰基氨基酸消旋酶進行了報道(Abstracts of PapersPresented at the 1990AnnualMeetiny of the Japan Societyfor Bioscience，Biotechnology，and Agrochemistry，page 368，1990)。而且，他們成功地克隆了編碼所說的擬無枝菌酸屬TS-1-60?；被嵯傅腄NA，并且在進一步研究的基礎上完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了含有?；被嵯妇幋a基因的DNA片段、其中插入了該DNA片段的載體、被該載體轉(zhuǎn)化且能夠產(chǎn)生酰基氨基酸消旋酶的新的微生物以及使用該微生物生產(chǎn)?；被嵯傅姆椒?。


圖1顯示了實施例3所測定的酰基氨基酸消旋酶編碼基因的堿基序列;圖2顯示了實施例1所獲得的含有酰基氨基酸消旋酶編碼基因的DNA片段的限制性酶切圖譜;圖3顯示了質(zhì)粒pRA4的制備方法;圖4顯示了質(zhì)粒pRA7的制備方法;圖5顯示了質(zhì)粒pRA4A的制備方法;圖6顯示了質(zhì)粒pRA7A的生產(chǎn)方法;圖7顯示了質(zhì)粒pRA4N的生產(chǎn)方法;圖8顯示了質(zhì)粒pRA4NB的生產(chǎn)方法;圖9顯示了質(zhì)粒pET-3cN的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的含有?；被嵯妇幋a基因的DNA片段(以下偶爾也稱作編碼酰基氨基酸消旋酶的DNA或簡單地稱作?；被嵯窪NA)是由發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)，并可通過以下步驟產(chǎn)生從產(chǎn)生酰基氨基酸消旋酶的放線菌例如鏈霉菌Y-53(IFO14596;FERM P-9518)或擬無枝菌酸屬TS-1-60(IFO15079;FERM BP-3092)或其它菌株中分離相關的DNA，將讀DNA插入噬菌體或質(zhì)粒，用產(chǎn)生的重組噬菌體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主，培養(yǎng)所獲得的轉(zhuǎn)化株，通過適當?shù)姆椒?例如利用酰基氨基酸消旋酶抗體的免疫測定法或利用DNA探針的噬斑或菌落雜交法)從轉(zhuǎn)化株體中分離含有所需DNA的噬菌體或質(zhì)粒，從該噬菌體或質(zhì)粒中切割出所需的克隆DNA并將該克隆DNA亞克隆至合適質(zhì)粒中。可將如此獲得的DNA插入質(zhì)?；蚴删w，然后將所產(chǎn)生的重組體用于轉(zhuǎn)化宿主，例如大腸桿菌、放線菌或酵母。
以上所給出的IFO號代表大坂發(fā)酵研究所(IFO)的保藏號，F(xiàn)ERM P或FERM BP號代表國際貿(mào)易和工業(yè)部工業(yè)科學技術廳發(fā)酵研究所(FRI)的保藏號。以下相同。
TS-1-60菌的典型菌學性質(zhì)如下(a)形態(tài)于280℃在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基[如Trypticase soy Broth(Becton Dickinsor)]振蕩培養(yǎng)24-48小時后，基生菌絲體分裂成類似桿菌的小片段或分枝的短菌絲。
瓊脂培養(yǎng)基中的基生菌絲體呈Z字形，氣生菌噬體通常呈直形或曲折形。
在瓊脂培養(yǎng)基ISP-2和ISP-7上觀察到頂孢，孢子呈具有光滑表面的圓柱形(0.3-0.5X0.6-2.3μm)(b)培養(yǎng)特征表1顯示了TS-1-60菌株在各種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征，表1中所示的顏色是通過與“色譜手冊”(“Color Harmony Manual”，4th edition，Container Corporation of America)中的色條比較而測定的。
(c)生理特征黑色素形成 -牛奶凝結(jié) -牛奶胨化 -白明膠液化 -淀粉水解 -NaCl耐量(%) 5〈 〉7生長溫度范圍(℃) 13-37最佳生長溫度(℃) 20-30不生長溫度(℃) 40(d)碳源利用能利用L-阿拉伯糖，D-木糖，D-葡萄糖，D-果糖，肌醇，D-甘露醇。
不能利用蔗糖，L-鼠李糖，棉子糖。
至于插入所說的DNA于其中所適合的質(zhì)粒，此處可講述的就有來源于大腸桿菌的pBR322[Gene，2，95(1977)]、pBR325[Gene，4，121(1978)]和puc13[Gene，19，259(1982)]。能夠在宿主中復制和維持的任何其它質(zhì)粒均可使用。至于插入所說的DNA于其中的噬菌體載體，此處所講述的例如λgt11[Young，R和Davis，R，ProcNatl、Acad、Sci、U.S.A，80，1194(1983)]。能夠在宿主中繁殖的其它噬菌體載體也可以使用。
作為將所說DNA插入到質(zhì)粒中的方法，可以講述的例如Maniatis，T.等，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，page239(1982)中所述的方法。適用于將DNA插入噬菌體載體的方法，例如Hyanh，T.V.等在DNA Cloning，a practical approach，1，49(1985)中所述的方法。由此產(chǎn)生的重組質(zhì)?；蚴删w載體被引入適宜宿主如大腸桿菌(E.coli)。
可以講述的大腸桿菌的例子有大腸桿菌K12，DH1(Proc、Natl、Acad、SciU.S.A，60，160(1968)]，JM103[Nacl Acids Res，9，309(1981)]，JA221[J.Mol Bicl.，120，517(1978)]，HB101[J.Mol，Biol，41，459(1969)]和C600[Genetics，39，440(1954)]。
可以講述的用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主的方法是Maniatis，等在Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratoyy，Page239(1982)中所述的氯化鈣法或氯化鈣/氯化銣法?？赏ㄟ^例如體外包裝技術將噬菌載體引入培養(yǎng)的大腸桿菌中。
可通過以上所述的方法或其它類似方法得到含有?；被嵯窪NA的放線菌DNA庫。
通過Huynh等的方法[DNA Cloning，a practical approach，1，49(1985)]利用噬菌體載體λgt11和?；被嵯缚贵w，或通過利用根據(jù)擬無枝菌酸屬TS-1-60?；被嵯赴被嵝蛄谢瘜W合成的核苷酸作為探針的菌落雜交或噬斑雜交方法[Maniatis，T等，Molecalar Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，(1982)]可由放線菌DNA文庫中克隆出?；被嵯窪NA。
必要時或合宜時，可將所克隆的?；被嵯窪NA亞克隆至一質(zhì)粒中，如pBR322，pUC12，pUC13，pUC18，pUC19，pUC118或pUC119。
通過Maxam-Gilbert法[Maxam，A.M.and Gilbert，W.Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.174，560(1977)]、雙脫氧法[Messing，J等，Nucl.Acids Res，9，309(1981)]或DeaZa法[Mizusawa，S等，Nucl，Acids Des，14，1319(1986)]對所得DNA進行序列分析，并將其堿基序列與已知氨基酸序列相比較以證實酰基氨基酸消旋酶DNA的存在。當?；被嵯妇幋a區(qū)并未完全包括在內(nèi)時，可使用DNA片段作為再克隆?；被嵯傅奶结樳M行菌落雜交，從而填補缺失的部分。
按以上方式可獲得編碼酰基氨基酸消旋酶的DNA。
本發(fā)明的一個編碼?；被嵯傅腄NA的典型例子是以下所述實施例中所獲得的編碼?；被嵯傅腄NA，其限制性酶切圖譜示于圖2。
按以上方式克隆的編碼?；被嵯傅腄NA可就此使用，或根據(jù)需要在用限制酶消化或定點誘變[Methods in Enzymology，100，468(1983)]以改進質(zhì)粒后使用。
使用啟動子，如lac啟動子、tac啟動子[de Boytr，H.A，Camstock，L.J，Vasser，M.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80，21(1981)]、T7啟動子[Tabor，S.，Richardson，C.C.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82，1074(1985)]等，可在大腸桿菌中大量表達上面提到的編碼N-?；被嵯傅目寺NA。
培養(yǎng)被上述克隆DNA轉(zhuǎn)化的微生物(如放線菌、大腸桿菌、酵母)，從而可從培養(yǎng)基中回收所產(chǎn)生的?；被嵯浮?br> 通過以上方法也可能改善?；被嵯副旧淼哪骋换蚰承┬再|(zhì)(如酶活性、穩(wěn)定性)。
用于表達的宿主的例子有變鉛青鏈霉菌TK64和大腸桿菌HB101。也可以使用其它放線菌、其它大腸桿菌、枯草芽孢桿菌以及酵母。
放線菌的轉(zhuǎn)化本身是已知的，可按Hopwood，D.A.等在Genetic Manipulation of Streptomyces，A Laboratory Manual中所述的方法進行。
大腸桿菌的轉(zhuǎn)化也是已知的，可按Maniatis，T.等在Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，Page 239，1982中所述的氯化鈣法或按氯化鈣/氯化銣法進行。
按照本發(fā)明，這類轉(zhuǎn)化體的一個典型例子是大腸桿菌ER-4(IFO15083;FERM BP-3091)。
按照這里所述的同樣方法，通過適當選擇受體生物體，當然有可能很容易地產(chǎn)生各種轉(zhuǎn)化體。
用已知方法培養(yǎng)所獲得的轉(zhuǎn)化體。在培養(yǎng)放線菌時，種子培養(yǎng)基如下3%甘油、0.5%多聚胨、0.3%肉膏、0.05%N-?；?DL-甲硫氨酸(PH7.2);生產(chǎn)培養(yǎng)基為1.7%胰酶處理酪蛋白、0.3%木瓜蛋白酶處理的脫脂黃豆粉、0.5%氯化鈉、0.25%磷酸氫二鉀、1%葡萄糖、0.05%N-酰基DL-甲硫氨酸(PH7.0)。通常在15-40℃(最好24-30℃)培養(yǎng)10-96小時(最好24-72小時)。必要時，可通氣和/或攪拌。當培養(yǎng)大腸桿菌時，使用LB培養(yǎng)基(1%多聚胨、0.5%酵母浸膏、0.5%氯化鈉)。培養(yǎng)通常在15-40℃(優(yōu)選24-37℃)進行10-96小時(優(yōu)選24-48小時)，必要時可通氣和/或攪拌。
培養(yǎng)完成后，將細胞與上清夜分離，用本領域通用的細胞破裂法，例如超聲波處理、French壓力機破裂、通過研磨機械破裂或用溶菌酶處理，提取出細胞中存留的?；被嵯?。將所得提取物用常規(guī)的蛋白質(zhì)純化方法處理，如鹽析、等電沉降、凝膠過濾、離子交換層析、疏水層析或高壓液相層析，可純化所得提取物中含有的酰基氨基酸消旋酶，從而得到所需的?；被嵯浮?br> 用已知方法(日本專利申請JP01-137973)測定所得?；被嵯傅幕钚?。為此，將50-100ul酶溶液加到由25mMN-乙?；?DL-甲硫氨酸、2mM氯化鈷、2uL-酰基轉(zhuǎn)移酶和50mM Tris-鹽酸緩沖液(PH7.5)組成的反應介質(zhì)中，于30℃反應5分鐘，然后通過煮沸3分鐘終止反應。1單位(U)酶定義為每分鐘形成1μmolL-甲硫氨酸所需酶量。
這里所用的堿基、氨基酸等的縮寫和符號是IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomanclature所推薦的或本領域所通用的。其例子如下。對于存在有光學異構(gòu)體的那些氨基酸，所用縮寫符號除非另有說明均代表L異構(gòu)體。
DNA脫氧核糖核苷酸A腺嘌呤C胞嘧啶G鳥嘌呤T胸腺嘧啶Ala丙氨酸Arg精氨酸Asn天冬酰胺Asp天冬氨酸Cys半胱氨酸Gln谷氨酰胺Glu谷氨酸Gly甘氨酸His組氨酸Ile異亮氨酸Leu亮氨酸Lys賴氨酸Met甲硫氨酸
Phe苯丙氨酸Pro脯氨酸Ser絲氨酸Thr蘇氨酸Trp色氨酸TYr硌氨酸Val纈氨酸以下實施例進一步說明了本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明的范圍。
實施例1分離擬無枝菌酸屬TS-1-60染色體DNA將擬無枝菌酸屬TS-1-60菌株在裝有20ml胰酶解酪蛋白大豆湯(Becton Dickinson)的200ml錐形瓶中于28℃振蕩培養(yǎng)42小時。所得濕細胞(4g)懸浮于20ml緩沖液A
中，向其中加蛋清溶菌酶達2mg/ml的濃度后，將懸浮液于37℃溫和振蕩1小時。然后向懸浮液中加入8ml2%SDS，輕輕渦旋2-3次。再加入5ml氯仿和5ml緩沖液A飽和的苯酚，離心整個混合物(3，000rpm，20分鐘)以提取DNA。三次重復這一苯酚提取過程后，向DNA溶液中加入1/10體積的3M乙酸鉀和2體積的冰凍乙醇以沉淀DNA。離心收集沉淀物DNA，用70%乙醇洗滌，真空干燥后保存。
實施例2克隆?；被嵯妇幋a基因(A)制備基因庫
a)用限制酶HaeⅢ部分消化用限制酶HaeⅢ(Takara Shuzo)部分消化實施例1所分離的擬無枝菌酸屬TS-1-60菌株染色體DNA。為此，將由10mM Tris-HCL緩沖液(PH7.5)、7mM氯化鎂、60mM氯化鈉、7mM2-巰基乙醇、5ug供體DNA及10單位HaeⅢ組成的總體積為50ul反應系統(tǒng)在37℃反應2分鐘。然后通過苯酚一氯仿處理使反應混合物脫去蛋白質(zhì)。并加入2體積乙醇回收消化DNA。
b)甲基化酶反應在ECORI位點的腺苷上使被HaeⅢ部分消化的DNA片段甲基化。為此，將5ug部分消化的DNA片段在由100mMTris-HCL緩沖液(PH8)、2mM二硫蘇糖醇、10mM EDTA、80uMS-腺苷甲硫氨酸和40單位甲基化酶(Takara Shuzo)組成的總體積20ul的反應介質(zhì)中于37℃處理60分鐘。按上面相同的方式回收甲基化的DNA片段。
C)連接子連接將EcoRI連接子連接至甲基化DNA片段的未端。所用EcoRI連接子為d(pGGAATTCC)(Takara Shuzo)。為了連接子的連接而使用了連接盒(Takara Shuzo)。在由5ug DNA、2ul(2ug)EcoRI連接子、16ul溶液A及2ul溶液B組成的總體積20ul的混合物中，將該反應于160℃進行16小時。用氯仿/苯酚處理反應混合物，再通過乙醇沉淀回收DNA產(chǎn)物并干燥。
d)用限制酶EcoRI消化于37℃用限制酶EcoRI消化5ug在c)中獲得的DNA片段3小時。將所得DNA片段進行電泳，并回收大小為1-3kbp的DNA片段。該片段經(jīng)苯酚-氯仿處理、乙醇沉淀及真空干燥后溶于20ulTNE緩沖液(10mM Tris-HCL、1mM EDTA、30Mm NaCL、pH8.0)。
e)與載體(λgt11)連接和包裝用EcoRI和磷酸酶處理λgt11(Stratagenl Cloning Systems，U.S.A)并與DNA片段(1-3kbp)連接。用Gigapack gold(Stratagene Cloning Systems，U.S.A.)包裝連接反應混合物。
(B)制備探針通過用賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶處理，將由擬無枝菌酸屬TS-1-60菌株產(chǎn)生的?；被嵯?純化蛋白，4mg)切割成幾個肽鏈。用逆相層析純化肽鏈，并測定峰2肽的氨基酸序列。該序列為Lys Leu Gly Ala Val Gln Ile Val AsnIle Lys Pro Gly Arg Val Gly Gly Tyr。人工合成由劃線肽部分推斷出的以下寡核苷酸5′-GAGATCCTR4AACATCAAGCC-3′(R4為G和C)。通過常規(guī)方法用32P標記該寡核苷酸的5′-末端將其用作探針。
(C)制備抗?；被嵯缚贵w用1mg來源于擬無枝菌屬TS-1-60菌株的純化酰基氨基酸消旋酶蛋白按4分分開的劑量(400、200、200和200ug)免疫注射給免。結(jié)果獲得了含有多克隆抗體的血清，通過Ouchterlony法測得它的抗體滴度為16。
(D)用免疫檢測法篩選用來源于擬無枝菌屬酸屬TS-1-60菌株的λgt11 DNA庫轉(zhuǎn)染大腸桿菌Y1090，并從約200，000個噬斑中獲得13個陽性噬菌斑。將其純化和增殖后從中提取DNA并用EcoRI切割。然后電泳消化液。用32P標記通過電泳分離的DNA片段，并用上述的探針進行Southern雜交。在13個重組噬菌體中有兩個噬菌體(λ-8和λ-9)與探針雜交。然后利用λ-9的EcoRI片段部分制備約600bp的探針。利用該探針再次與從λgt11DNA庫得到的約50，000個噬斑進行噬斑雜交。結(jié)果得到λ-44。通過仔細研究，發(fā)現(xiàn)它含有編碼?；被嵯傅恼麄€DNA。
實施例3堿基序列測定(序列分析)利用Messing等的方法[Nucl.Acids Res，9，309(1981)]，和Deaza序列分析法[Mizusawa，S et al Nucl Acids Res，14，1319(1986)]將從λ-44分離出的EcoRI片段(1.2kbp)插入到大腸桿菌噬菌體M13mp8和M13mp9。結(jié)果示于圖1。從該堿基序列推斷出的部分氨基酸序列與從擬無枝菌酸屬TS-1-60菌株純化的?；被嵯傅牟糠职被嵝蛄幸恢?。從而發(fā)現(xiàn)λ-44含有編碼酰基氨基酸消旋酶的基因。
實施例4利用放線菌轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)?；被嵯甘褂米冦U青鏈霉菌TK64/pRA32。該菌株是通過從擬無枝菌酸屬TS-1-60菌株的整個DNA中提取酰基氨基酸消旋酶基因、將其插入用于放線菌的質(zhì)粒pIJ702中并用所產(chǎn)生的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化變鉛青鏈霉菌TK64而產(chǎn)生的。于28℃將該菌株在酵母浸膏一麥芽浸膏瓊脂斜面培養(yǎng)基(ISP2培養(yǎng)基)上培養(yǎng)7天。將如此所形成的孢子，用1接種環(huán)的量接種至每個200ml的錐瓶中，其中裝有20ml無菌種子培養(yǎng)基(3%甘油、0.5%多聚胨、0.3%肉膏、0.05%N-乙?；?DL-甲硫氨酸pH7.2)，然后在旋轉(zhuǎn)搖床(200rpm)上于28℃培養(yǎng)48小時。將培養(yǎng)物按每份8ml分裝至15ml小瓶中并于-80℃冷凍保存(冷凍原種培養(yǎng)物)。用1ml冷凍原料培養(yǎng)物接種于與前所述相同的種子培養(yǎng)基并在與前面所述相同的條件下進行培養(yǎng)而制備出第一代種子。再用20ml第一代種子培養(yǎng)物接種于每個2升的坂口燒瓶中的500ml滅菌種子培養(yǎng)基并于28℃培養(yǎng)72小時，就可制備出第二代種子，為了產(chǎn)生酶，將100升生產(chǎn)培養(yǎng)基(1.7%胰酶處理的酪蛋白、0.3%木瓜蛋白酶處理的脫脂黃豆粉、0.5%氯化鈉、0.25%磷酸氫二鉀、1%葡萄糖、0.05%N-乙?；?DL-甲硫氨酸pH7.0)置于200升發(fā)酵罐中并滅菌，然后接種4升第二代種子培養(yǎng)物，并在通氣(80VVm)和攪拌(160rpm)的條件下于28℃培養(yǎng)42小時。作為對照，按同樣方式培養(yǎng)DNA供體擬無枝菌酸屬TS-1-60菌株。對產(chǎn)生的酶進行比較后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化株具有更高的產(chǎn)率。
實施例5利用lac啟動子在大腸桿菌中表達酰基氨基酸消旋酶基因從重組噬菌體λ-44中分離出含有?；被嵯附Y(jié)構(gòu)基因的SmaI-XhoI片段，將該片段與lac啟動子相同的方向插入大腸桿菌質(zhì)粒puc118的多克隆位點(SmaI-SalI位點)，產(chǎn)生質(zhì)粒pRA4(圖3)。用該質(zhì)粒pRA4轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM105。
用竹棒挑起所形成的轉(zhuǎn)化菌株ER-4(IFO15083;FERMBP-3091)，接種于4ml含有氨芐青霉素(50ug/ml)的LB培養(yǎng)基(1%多肽胨、0.5%酵母浸膏、0.5%氯化鈉)，并于37℃震蕩培養(yǎng)16小時。然后將培養(yǎng)物0.3ml的量接種至含有氨芐青霉素(50ug/ml)的30mlLB培養(yǎng)基中并于37℃震蕩培養(yǎng)3小時，加入3ml0.1MIPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖甘)至終濃度1mM后繼續(xù)培養(yǎng)4小時。收集細胞(3.000rpm，10分鐘)，將其懸浮于5ml Tris-Hcl緩沖液(50mM，pH7.5)并進行超聲處理(4分鐘)。離心所產(chǎn)生的破細胞產(chǎn)物(15，000rpm，10分鐘)，用已知方法測定上清液中?；被嵯富钚?。用宿主大腸桿菌JM105未觀察到酰基氨基酸消旋酶活性能夠被轉(zhuǎn)化體ER-4所證實。酶產(chǎn)率為64u/升(培養(yǎng)基)，它約為DNA供體擬無枝菌酸屬TS-1-60菌株的3倍。
實施例6利用tac啟動子在大腸桿菌中表達酰基氨基酸消旋酶基因。
從實旋例5的lac表達質(zhì)粒pRA4中切割出含有酰基氨基酸消旋酶結(jié)構(gòu)基因SmaI-HindⅢ片段。將該片段插入到含有tac啟動子的表達質(zhì)粒載體pKK223-3[BrosiusJ and Holly A，Proc Natl Acad Sci U.S.A，81，6929(1984)]的SmaⅠ-HindⅢ位點，產(chǎn)生質(zhì)粒pRA7(圖4)。用該質(zhì)粒pRA7轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM1-105。
用實例5所述的方法培養(yǎng)所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化菌株ER7，并用已知方法測定?；被嵯富钚?，從而觀察到所述酶活性，酶產(chǎn)率為34u/升(培養(yǎng)基)，它約為DNA供體擬無枝酸屬TS-1-60菌株的1.5倍。
實施例7
起始密碼子由GTG轉(zhuǎn)化為ATG從重組噬菌體λ-44分離和回收含有起始密碼子的EcoRI片段并將其插入到質(zhì)粒載體puc118的EcoRI位點。用所產(chǎn)生的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌MV1184;再用Vieira等人的方法[Methads in Enzymology，100，3(1987)]從所獲得的轉(zhuǎn)化株中制備單鏈DNA。用在in Vityro Mutagenesis System，Version 2.0(Amer sham)中人工合成的含有突變點的寡核苷酸5′-GAGGAGCAATGAAACTC-3′進行定點誘變。從所產(chǎn)生的突變質(zhì)粒pMA1中分離和回收含有突變位點SacI片段并將其連接到預先用SacI處理的表達質(zhì)粒pRA4中，產(chǎn)生lac啟動子表達質(zhì)粒pRA4A，其起始密碼子已轉(zhuǎn)變?yōu)锳TG(圖5)。同樣，從突變質(zhì)粒pMA1中分離和回收含有突變位點的SmaI/SacI片段，并將其連接至預先用SmaI/SacI處理過的表達質(zhì)粒pRA7中，產(chǎn)生tac啟動子表達質(zhì)粒pRA7A，其起始密碼子已轉(zhuǎn)變?yōu)锳TG(圖6)。用這些突變表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM105。分別產(chǎn)生轉(zhuǎn)化株ER4A(JM105/pRA4A)和ER7A(JM105/PRA7A;IFO15131，F(xiàn)ERM BP-3272)。在加入IPTG后按實例5所述方法將這些轉(zhuǎn)化株培養(yǎng)9小時，用已知方法測定?；被嵯富钚?。菌株ER4A和ER7A的酶產(chǎn)率分別為740u/升(培養(yǎng)基)和198u/升(培養(yǎng)基)，且分別是DNA供體擬無枝酸屬TS-1-60的約37倍和約10倍。
實施例8利用T7啟動子在大腸桿菌中表達酰基氨基酸消旋酶基因為將?；被嵯富騎7表達質(zhì)粒pET-3C[Gene56，125(987)]亞克隆至NdeI/BamHI位點，使用定點誘變技術將NdeI位點(CATATG)加至起始密碼子區(qū)，將BgtⅡ位點(AGATCT)加至終止密碼子區(qū)。
A)引進NdeI位點用表達質(zhì)粒pRA4轉(zhuǎn)化大腸桿菌MV1184。并利用Vieiva等人的方法從一個所獲得的轉(zhuǎn)化株中制備出單鏈DNA。利用該單鏈DNA以及含有NdeI位點(CATATG)的合成寡核苷酸(5′GAGTTTCATATGCTCCTCC-3′)，進行定點誘變[in，vitro Mategenesis System，Version，2.0(Amersham)]，產(chǎn)生質(zhì)粒pRA4N，其起始密碼子區(qū)含有NdeI位點(圖7)。
B)引入BglⅡ位點由質(zhì)粒PRA4N中分離出含有NdeⅠ位點的SmaⅠ/HindⅢ片段并將其連接到預先用SmaⅠ和HindⅢ處理過的質(zhì)粒puc119中，用所產(chǎn)生的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌MV1184。按Vieira等人的方法從一個所獲得的轉(zhuǎn)化株中制備出單鏈DNA。使用該單鏈DNA以及含有BglⅡ位點(AGATCT)的合成寡核苷酸(5-GAGGTAGATCTGGTCGGAT-3′)按與A)相同的方法進行定點誘變，產(chǎn)生質(zhì)粒pRA4NB，其終止密碼子區(qū)中含有BglⅡ位點(圖8)。
C)表達從質(zhì)粒pRA4NB中分離和收回含有NdeⅠ/BglⅡ片段的酶基因并將其插入到質(zhì)粒PET-3C中的NdeⅠ位點和BamⅠ位點之間，產(chǎn)生出?；被嵯副磉_質(zhì)粒pET-3CN(圖9)。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌MM294(DE3)。得到轉(zhuǎn)化株MR-1(IFO 15132，F(xiàn)ERM BP-3273)。按實例7的方法培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化株并按已知方法測定酰基氨基酸消旋酶活性。酶產(chǎn)率為1，795μ/升(培養(yǎng)基)，它約為DNA供體擬無枝菌酸屬TS-1-60菌株的90倍。
D)轉(zhuǎn)化株MR-1的發(fā)酵罐培養(yǎng)(20升)將含有氨芐青霉素(50ug/ml)的LB培養(yǎng)基按每份400ml分裝到1升的錐瓶中并滅菌。用1接環(huán)量接種菌株MR-1的細胞于每瓶培養(yǎng)基中。于37℃振蕩培養(yǎng)(250rpm)20小時，將1升所獲得的培養(yǎng)液接種至補充了多聚胨(1.5%)的20升M9培養(yǎng)基[Mamiatis，T等，Molecalar Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory(1982)]中，并在通氣(100VVM)和攪拌(450rpm)的條件下于28℃培養(yǎng)34小時。8小時后，加入IPTG至終濃度為0.01mM，并在連續(xù)加入(150ml/hour)8%葡萄糖和2%多聚胨混合溶液的情況下繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后離心培養(yǎng)物(1，000rpm，20分鐘)，得到1，320g濕細胞。用已知方法測定酰基氨基酸消旋酶活性，酶產(chǎn)率為22，300u/升(培養(yǎng)基)。它約為DNA供體擬無枝菌酸屬TS-1-60菌株的1，100倍。
實施例9從大腸桿菌轉(zhuǎn)化株純化酶將含有氨芐青霉素(50ug/ml)的LB培養(yǎng)基按每份40ml裝至200ml的錐形瓶中并滅菌。向每瓶的培養(yǎng)基中接種菌株ER4A的細胞一菌環(huán)后于37℃震蕩培養(yǎng)(300rpm)16小時。將每份4ml的所得培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至各含有400ml滅菌LB培養(yǎng)基的1升錐瓶中，于30℃震蕩培養(yǎng)(250rpm)30小時。約6小時后，向各錐瓶中加入4mlIPTG(0.1M)(終濃度1mM)。離心8升培養(yǎng)液(10，000rpm，20分鐘)后產(chǎn)生141g濕細胞。
將這些細胞懸浮于Tris-Hcl緩沖液(50mM，pH7.5)至體積500ml，然后通過超聲處理(5分鐘X3)破細胞。加入同樣緩沖液及硫酸鎂(終濃度10mM)使破細胞產(chǎn)物液的體積為1升。經(jīng)加熱處理(60℃，30分鐘)和離心(10，000rpm，20分鐘)后產(chǎn)生940ml上清液。向該上清液中加入107.2g(20%飽和)的硫酸銨。所得溶液于0℃放置2小時后離心(10，000rpm，30分鐘)，并將所得上清液加至預先被含有20%飽和硫酸銨的Tris鹽酸緩沖液平衡的BUTYL-Toyopearl柱(BUTYL-Toyopearl 650M，Tosoh，4.5×30cm)上。用2升含有20%飽和硫酸銨的同樣緩沖液沖洗該柱，然后用硫酸銨由20%飽和度變?yōu)轱柡投葹?%的同樣緩沖液洗脫。按每份20ml分級分離洗脫。在第34和第50分級中觀察到酰基氨基酸消旋酶活性。合并活性級分，對同樣緩沖液透析后加到預先用同樣緩沖液平衡過的DEAE-Toyopearl柱(DEAE-Toyopearl650M，Tosoh，4.1×16cm)上。用1升同樣緩沖液洗柱后，用1升氯化鈉濃度由0變?yōu)?.5M的同樣緩沖液洗脫。按每份10ml分級分離洗脫，在第48和53級分中觀察到?；被嵯富钚?。以上步聚產(chǎn)生1，570u的?；被嵯?，它在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳時基本上產(chǎn)生單一帶，從轉(zhuǎn)化株ER4A純化該酶的結(jié)果如下所示。
步驟 總蛋白 總活性 比活性 純度 產(chǎn)率(mg) (單位) (單位/mg) (倍) (倍)細胞破碎 18000 3180 0.17 1.0 100加熱處理 7123 3256 0.46 2.7 100BUTYL-Toyopearl 249 1620 6.50 38.2 51DEAE-Toyopearl 198 1573 13.5 79.4 49
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)含有?；被嵯妇幋a基因的DNA片段的方法，它包括從產(chǎn)生?；被嵯傅奈⑸锏娜旧wDNA中克隆編碼酰基氨基酸消旋酶的基因，并根據(jù)需要切割、插入、增加和/或消除該基因中的某些堿基。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，基中微生物為放線茵。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中基因與具有以下堿基序列的DNA雜交5′-GAGATCCTR4AACATCAAGCC-3′其中R4為G和C。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所說的基因具有圖1所示第62至1189號堿基序列。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所說的基因具有圖1所示的第1至1400號堿基序列。
6.生產(chǎn)含有編碼?；被嵯富虻腄NA片段的載體的方法，它包括將含有?；被嵯妇幋a基因的DNA片段插入到載體中。
7.生產(chǎn)攜帶有?；被嵯妇幋a基因的DNA片段的載體的轉(zhuǎn)化株的方法，它包括用含有?；被嵯妇幋a基因的DNA片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主。
8.具有圖1所示的氨基酸序列1-370(其N-未端可能具有Met)的多肽或其一部分或通過該多肽或其一部分中某些氨基殘基的取代、插入、增加或減少而產(chǎn)生的具有酰基氨基酸消旋酶活性的多肽的生產(chǎn)方法，它包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)攜帶了編碼酰基氨基酸消旋酶編碼基因DNA片段的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化株，以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累?；被嵯福缓蠡厥赵撓浮?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及含有?；被嵯妇幋a基因的DNA片段。利用該DNA片段，可在工業(yè)上以高效率生產(chǎn)?；被嵯?。
文檔編號C12N9/90GK1059761SQ91108629
公開日1992年3月25日 申請日期1991年9月3日 優(yōu)先權(quán)日1990年9月14日
發(fā)明者德山真治, 波多野和德, 中濱一雄, 高橋健 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社