專利名稱：一種新的癌胎基因及其基因產(chǎn)物和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種從T-淋巴瘤文庫中獲得的新的cDNA克隆。此新cDNA克隆被稱為Pem，它能與胎盤和胚胎階段中特異性表達的轉錄產(chǎn)物雜交。Pem cDNA順序編碼一種細胞內(nèi)親水性蛋白質(zhì)，與其它DNA或蛋白質(zhì)序列都沒有顯著的序列相似性。本發(fā)明的DNA序列和重組DNA分子均特征性地編碼一種新的蛋白質(zhì)，其具有下列特點(1)由T-淋巴瘤細胞表達;(2)在正常胸腺，激活的脾細胞，腸系淋巴組織或骨髓中都不表達;在成年腦，肝，大腸或卵巢中都不能檢測到;(3)在不滅的或癌細胞系中表達;(4)在胚胎發(fā)育過程中發(fā)達。在下文中可以看到，該DNA序列，重組DNA分子和生產(chǎn)胚胎發(fā)育過程中表達的該新蛋白質(zhì)的過程及生產(chǎn)大體上純的新的Pem蛋白，在操縱胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)，改變腫瘤發(fā)生表型方面可能有用處，也可能有益于對含有Pem致癌基因的腫癌進行定位。
很多參與發(fā)育過程的基因已在無脊椎生物如黑腹果蠅，Caenorhabditis elegans和Saccharomyces cerevisiae中鑒定出來。在哺乳動物系統(tǒng)中，只有少數(shù)在整體水平上起作用的基因已被鑒定。(Blau1988 Cell 53673)例如肌肉中專一表達的基因，MyoDl和Myo-genin已成為鼠發(fā)育的遺傳控制的重要模型。體節(jié)和肢芽分別在妊娠第8和第10天開始表達和MyoDl(Sasson，et al，(1989)Nature341303-308)，并且在體外控制對成肌細胞譜系的轉換(Davis，et al，(1987)Cell51987-1000)，Hox-5基因復合體在妊娠第九天后鼠肢芽中的表達表現(xiàn)出一種有趣的模式，盡管這些基因編碼的功能還尚未詳盡，在鼠發(fā)育的早期和中期階段幾乎還沒有遺傳標記還作為標志。例如，分節(jié)始于小鼠妊娠的第八天，但未發(fā)現(xiàn)與分節(jié)起始過程專一有關的基因。(Rossant and Joyner(1989)Trends in Genetics 5277-283)。
不滅和完全轉化的細胞經(jīng)常轉錄一些基因，這些基因在正常哺乳動物發(fā)育過程中表達，并被認為對發(fā)育有影響(Reviewed，Ruddon(1987)Gene Derepression in cancer cells，in Cancer Biology，Oxford U-niversity Press，New York，Pages 431-436)。在有些情況下，這些癌胎基因似乎與贅生性表型無關。例如，甲胎蛋白在不滅細胞和許多腫瘤細胞中表達。另外一些情況下，在細胞向轉化的表型轉變的過程中，隨發(fā)育過程進行調(diào)控的基因起主要作用。例如，原癌基因C-myc，C-src，C-fos和C-fms都在胚胎發(fā)育過程中表達，并已實驗證明在體外調(diào)控發(fā)育步驟(for Review，see Adamson(1987)Placenta 8449-466)。
在免疫系統(tǒng)發(fā)育中，干細胞進入胸腺經(jīng)分化和成熟，形成T-淋巴細胞。當T細胞在胸腺內(nèi)徑歷不同的發(fā)育階段時，許多或者被激活或者被抑制。例如，在這個時期，細胞表面需要IL-2受體，CD4或(和)CD8。這些分化標志對T細胞發(fā)育和(或)功能有著重要作用。正在發(fā)育的T淋巴細胞中，許多基因的表達水平提高。這樣基因包括抗原的T細胞受體，以及標志物CD4和CD8。在許多其他抗原在淋巴細胞中準確功能被了解之前，這些抗原也已被用作T細胞的標志物。就在最近發(fā)現(xiàn)T細胞抗原Pgp1幫助淋巴細胞生存在胸腺中，而T200(CD45)則作為胞內(nèi)信號的一個成分。另一個T細胞標志物，Thy1，尚未發(fā)現(xiàn)與之有關的功能。
SL12.4細胞具有CD4/CD8雙重陰性表型，因而類似于發(fā)育較為早期的淋巴細胞。并且，他們也不表達T細胞受體α亞單位。但是SL12.4細胞在胸腺上皮單層細胞上共培養(yǎng)后，可被誘導在其表面穩(wěn)定地表達CD4和CD8。經(jīng)過這種處理，也可以誘導出TCR-αmRNA。因此，看來SL12.4細胞具有進行分化和成熟的能力。這種獨特的生物系統(tǒng)在一定程序上模擬了胸腺微環(huán)境。
有許多基因已被鑒定，這些基因首先是在發(fā)育過程中的胸腺細胞內(nèi)表達。許多這類基因都編碼蛋白，這些蛋白質(zhì)的表達是T細胞前體在免疫系統(tǒng)中變得有功能所必需的，例如(1)TCR編碼抗原，這種抗原是抗原識別所必需的;(2)CD25(IL2受體)其表達是細胞對細胞分裂素IL2發(fā)生反應所必要的;(3)在抗原識別過程中對信號轉導具有重要作用的基因產(chǎn)物，如CD3，CD4，CDS，CD45;(4)某些基因產(chǎn)物與胸腺細胞移位到靶器官上有關;(5)參與T細胞激活的基因產(chǎn)物(Fowlkes and Pardoll，Advances in lmmunology 44207-264(1989);Hood，et al，(1985)Cell40225-229;Rothenberg and Lugo，Develop.Biol.1121-17(1985);Adkins et al.，Ann.Rev，lmmunol.5325-365(1987);Crabtree，Science 243343-355(1989);Kwon and Weissman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA861963-1967(1989)。在胸腺細胞亞系中存在著顯著的多相性，各個亞系具有各自不同的表達基因的組合。在許多類的胸腺細胞中，對一些(并非全部)種類的基因的表達已進行了詳細的分析;編碼產(chǎn)物在T細胞發(fā)育和位移中起作用的基因還有待鑒定，特別是在那些數(shù)目極少，持續(xù)片刻的前體胸腺細胞中表達的基因。
由于存在胸腺細胞的多樣性，因而不可能分級分離得到足夠量或純度的前體胸腺細胞來研究發(fā)育過程中出現(xiàn)的基因逐次表達。正是基于這個原因，淋巴瘤和白血病細胞系在研究淋巴樣發(fā)育中的基因表達時被廣泛應用(Greaves(1986)Science 234697-704;Hanley-Hyde and Lynch(1986)Ann.Rev.lmmunol.4621-649)。有大量的文獻報道指出，數(shù)目極少，持續(xù)久刻的前體胸腺細胞是向惡性轉化的靶細胞，而且在腫瘤細胞中，轉化的靶細胞的一些性質(zhì)得到了保留。轉化失常時，腫瘤細胞中一些意想不到的基因表達也常常停止。在造血瘤細胞中對“失常的”基因表達的研究發(fā)現(xiàn)極少的正常前體細胞亞系表達這類基因(Greaves(1986)Science 234697-704;Hanley-Hyde and Lynch(1986)Ann.Rev.lmmunol.4621-649;Pierce and Speers(1988)Cancer Res.481996-2004)。
鼠和人淋巴瘤細胞系由單個個體產(chǎn)生的多相性，是因為個體細胞成熟的程度的差異形成的。建立的T淋巴瘤細胞系的多相性已被用于獲得關系極近的細胞克隆，這些克隆只有少數(shù)性質(zhì)不同。Hedrick，et al，(Hedrick，et al.(1984)Nature 308149-153)用差異克隆技術估計，T細胞和B細胞在100個左右的基因表達上有差異。這樣看來關系極近的T淋巴瘤細胞可能只有更少的基因表達上有差異。這些細胞克隆使我們能用純凈的細胞群體進行工作，這些細胞具有已詳知和穩(wěn)定的表型，只在少數(shù)性質(zhì)上有差異。SL12T淋巴瘤模式系統(tǒng)已經(jīng)建立，用以提供一個關系緊密的細胞群。(Hays，et al.(1986)lnt.J.Cancer 30597-601;Mac Leod，et al(1984)Cancer Res 441784-1790;Mac Lead，et al.(1985)J.Nat Camcer lnst 74875-882;Moc Leod，et al.(1986)Proc Narl.Acad.Sci.USA836989-6993;Siegal，et al(1987)J.Exp.Med.1661702-1715)。
SL12.4細胞與成熟中期的胸腺細胞相似(Fowlkes and Pardoll(1989)Advances in lmmunol.44207-264)。這兩個細胞克隆在生物學性質(zhì)上不同。SL12.4細胞產(chǎn)生腫瘤，對糖皮質(zhì)激素誘導的溶菌敏感，而SL12.3細胞引起擴散性的腫瘤，對糖皮質(zhì)激素引起的裂列具有抗性。
此項發(fā)明提供了一個新的cDNA序列，一個基因產(chǎn)物(Pem)蛋白質(zhì)，以及這個新的cDNA序列及Pem基因產(chǎn)物的應用。在這項發(fā)明中，從T淋巴瘤獲得的一個cDNA克隆(Pem)所代表的一個新基因，其序列和表達特點都作了介紹。來源于一些譜系的轉化的和細胞表達Pem轉錄物。本項發(fā)明的DNA序列和重組DNA分子都特征性地編碼一種新蛋白質(zhì)，其具有下列特點(1)在T淋巴瘤細胞表達，(2)在正常胸腺，激活的脾細胞，腸系淋巴組織，或骨髓中都不表達;在成年腦，肝，大腸或卵巢中都不能檢測到(3)在/或癌細胞系中表達，(4)在胚胎發(fā)育過程中表達。在下文中可以看到，該DNA序列，重組DNA分子和生產(chǎn)胚胎發(fā)育過程中表達的該新蛋白質(zhì)的過程及生產(chǎn)大體上純的新的Pem蛋白質(zhì)，在操縱胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)，改變腫瘤發(fā)生表型方面可能有作用。也可能會有益于對含有Pem致癌基因的腫癌進行定位。
盡管在成體組織中，Pem基因的表達未被檢測到，在鼠胎發(fā)育過程中Pem基因順次表達，首先是在早期胚胎，隨后在胚外組織表達。Pem在胎發(fā)育過程中表達，并在不滅細胞和贅生性細胞系存在，這與癌胎基因所預期的性狀是一致的。這段Pem cDNA序列可以作為一個標志，用于贅生性細胞及參與早期胚胎發(fā)育的細胞。
經(jīng)過對本發(fā)明示圖的簡要說明及隨后的詳細介紹之后，可以對此項發(fā)明的對象、特性及優(yōu)越性有進一步的了解。
圖示簡解

圖1示Pem cDNA的序列及推測的蛋白質(zhì)順序。
圖2證實Pem mRNA在細胞系中的表達。
圖3證明在胎發(fā)育過程中Pem mRNA的表達。
為了對此項發(fā)明介紹得更為清楚，下面的部分是對其的詳細說明。
在說明的過程中，可能會用到下列術語“寄主”在此不僅指原核生物，也包括真核生物如酵母、線蟲及植物和動物細胞。
“原核生物”包括所有能被表達本發(fā)明Pem或重組Pem蛋白質(zhì)(rPemP)的DNA所轉化的細菌。
“真核生物”包括所有能被某DNA所轉化的酵母真菌，動物和植物的細胞，該DNA也是用于表達本發(fā)明的Pem或重組Pem蛋白質(zhì)(rPemP)。
編碼本項發(fā)明Pem蛋白的DNA可從任何哺乳動物中所到，所需要的是Pem蛋白(PemP)在原核或真核生物中表達所必須的遺傳序列。在此推薦來源于小鼠能表達Pem蛋白質(zhì)的Pem DNA。特別還要提出那些在多種動物間(如小鼠，兔，海獅或人)存在免疫交叉反應的Pem DNA序列。
編碼本項發(fā)明Pem蛋白的一個重組DNA分子，可以采用本文中提到的任何常規(guī)技術用于轉化。特別是運用一個包括本項發(fā)明Pem蛋白編碼順序的載體的方法進行原核生物的轉化。
對本身Pem蛋白質(zhì)氨基酸順序相比較，本發(fā)明的T細胞重組蛋白(rpem)在末端兩側會多出或缺少一些氨基酸。
當術語“大體上純凈”用于本發(fā)明的Pem蛋白質(zhì)時，是指該多肽基本上無自然狀態(tài)下常與之混雜的其他蛋白質(zhì)，電泳或色譜反應、洗脫曲線、抗原活性結果穩(wěn)定且重復性好。術語“大體上純凈”并不排除人工合成的Pem蛋白質(zhì)混合物中存在有其他化合物。
制備融合的，操作上連鎖的基因，并在細菌中表達的方法已經(jīng)形式，并在U.S.Patent No.4，366，246，中有報道，在此收錄在參考文獻中，其中介紹的遺傳構造和方法可用于在真核生物和原核生物寄主中表達Pem蛋白。
原核生物寄主包括革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌，如大腸桿菌，S.tymphimurium，Serratia marcescens及Bacillus Subtilis真核寄主包括酵母如Pichia Pastoris或哺乳動物細胞。
一般來說，結合寄主采用帶有啟動子序列的表達載體有利于插入的DNA片段的有效轉錄。表達載體都特征性地包含復制起始區(qū)，啟動子，終止子及在轉化細胞中提供表型選擇的特異基因。轉化的寄主可以按本文中的方法進行發(fā)酵或培養(yǎng)，以得到理想的細胞生長。
能用于本發(fā)明的啟動子包括(當然不局限于這些)recA，trp，lac，tac，bacteriophage lambda pR or pL，MMTV，SV40。能用于此發(fā)明的一些質(zhì)?；蚴删w的例子見Maniatis，et al.Molecalar cloning，Cold spring Harbor Laboratories，1982;其他的見本文并可方便地確證。
根據(jù)本文中描述的方法或其他的方法(譬如，用一個溶源性噬菌體轉移遺傳物質(zhì))，可以將本發(fā)明用于任何一個“修飾過的”寄主，使之成為能表達Pem蛋白基因的原核生物或真核生物。
一個基因就是一般DNA序列，通過它的模板或信使RNA編碼一條特異多肽的氨基酸順序。術語cDNA是指去除插入序列的基因。術語rDNA是指通過在體外剪切cDNA或基因組DNA序列得到的一個重組分子。
一個克隆載體是指一個質(zhì)粒、噬菌體DNA或在寄主細胞內(nèi)能夠復制的其他DNA順序，克隆載體特征性地具有一個或數(shù)個內(nèi)切酶識別位點，在此處DNA序列可以一種特定的方式切開而不至產(chǎn)生DNA基本生物功能的喪失，克隆載體還具有一個用于轉化細胞鑒定的標志。標志一般有四環(huán)素抗性，新霉素抗性或者氨芐青霉素抗性。單詞“載體”有時是指克隆載體。
一個表達載體類似于一個克隆載體，但它能在某些調(diào)控序列的控制下在寄主中表達某個給定的結構基因。
寄主用Pem蛋白質(zhì)基因組轉化，特別有利于產(chǎn)生Pem蛋白和多肽。
Pem蛋白可以由Pem蛋白的完整氨基酸序列組成，或者僅包含一個特異決定簇。一只用Pem重組蛋白免疫的動物能產(chǎn)生抗體，抗體會和重組或自然產(chǎn)生多肽的抗原決定簇結合。因此，包含Pem的重組蛋白可以進行商業(yè)性生產(chǎn)。
術語“個體”包括任何動物，一般主要指哺乳動物，特別是一只嚙齒類動物，一只貓，狗，?；蛞粋€人。
檢測標記是指任何能被檢測的分子。常用檢測標記為放射性標記包括(不局限于)32P，14C，125I，3H和35S。生物素標記的核苷酸可通過缺刻翻譯，酶催化或化學方法整合進DNA或RAN中。生物素標記的探針在雜交后，通過使用avidin/streptavidin，熒光的、酶促的或膠質(zhì)金復合物進行檢測。其他的熒光化合物，可免疫檢測的熒光衍生物或生物素類似也可用于核酸標記。核酸也可依靠結合一個蛋白來進行標記。放射性或熒光標記的組蛋白H1，酶(堿性磷酸酶，過氧化物酶)，或單鏈結合蛋白(SSB)與核酸相結合的方法都可以利用。
兩個來源SL12T淋巴瘤細胞系的細胞克隆，根據(jù)它們基因表達的差異及在同源動物寄主中引起腫瘤能力的不同，被挑選出來用于分離新的分化表達的基因。(Hays，et al.(1986)lnt.J.Cancer 38597-601;Mac Leod，et al.(1984)Cancer Res441784-1790;Mac Leod，et al.(1985)J.Nat.Cancer lnst，74875-882;Mac Leod，et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 836989-6993;Siegal，et al.(1987)J.Exp.Med.1661702-1715;Weinroth，et al(1985)Cancer Res.454804-4809;Wilkinson，et al.(1988)EMBO J.7101-109 and Table l for a Summary of phenotypes)。SL12.3細胞系表達極少數(shù)與T細胞功能有關的基因，在同源動物中惡性極大，形成擴散的浸染性腫瘤。而SL12.4細胞除TCR-alpha外表達TCR/CD3復合物中所有成份的mRNA;在某些方面，這種細胞與胸腺細胞發(fā)育過程中期的胸腺細胞類似。SL12.4細胞致瘤能力要弱一些，產(chǎn)生凸出的乳突瘤。
為分離只有SL12.4細胞在表達而在SL12.3細胞中不表達的基因的cDNA克隆，采用經(jīng)典的差異篩選與排除法雜交富集探針技術相結合的方法(Similar to Filmus，et al.(1989)Mol.Cell.Biol.84243-4249，as described in detail elsewhere(Mac Leod，et al(1990)Cell Growth Differ.1271-279)。
本項專利提供DNA序列和重組DNA分子，另外還提供鑒定細胞中是否具有此序列的探針和方法，及將此序列導于無該序列細胞中的手段。
此外，此項專利還提供一個抑制新Pem序列表達的方法即給攜帶有正常Pem DNA序列的細胞提供反義RNA順序或編碼反義RNA的DNA序列，抑制編碼Pem蛋白的RNA合成，本項發(fā)明中另一項技術清楚表明，本發(fā)明的任何蛋白的抗體都可用來阻止配體與蛋白，與靶藥物的結合及其他因子(如標記物)與表達此蛋白的細胞結合。
此發(fā)明提供了一個新的cDNA序列，一個基因產(chǎn)物(Pem)蛋白，新的cDNA序列及與之相應的Pem基因蛋白產(chǎn)物的應用。此cDNA序列長839bp，包括一個長的開放閱讀密碼框架，從堿基對91至720，推測編碼一個210個氨基酸構成的蛋白質(zhì)。(表1)表1右邊的數(shù)字是指核苷酸順序。左邊的數(shù)字推測的氨基酸的位置，序列中出現(xiàn)的第一個甲硫氨酸下面劃有橫線。DNA序列3’末端的(X)表示此處是14個腺苷酸殘基組成的poly(A)尾巴。依賴于(AMP/CGMP的激酶(AG)，蛋白激酶C(C)和酪蛋白激酶Ⅱ(CK)的可能存在的磷酸化位點，通過intelli Genetics Programs在Ser或Thr附近查找每種激酶的一定的保守順序，而得以鑒查出來。保守的多聚腺苷酸化序列，AATAAA，位于poly(A)5′端50bp處。第一個甲硫氨酸密碼子(5′末端91bp處)被Kozak保守序列(G/AXXATGG)所包圍，Kozak保守序列提供有效的轉移起始位點(Kozak 1986)。Pem的有義轉錄物由T7多聚酶制備，在網(wǎng)織紅細胞裂解物中產(chǎn)生了與推測分子量相同大小的蛋白質(zhì)(23Kda，數(shù)據(jù)未列入)。因而，第一個甲硫氨酸在體外轉錄轉譯實驗中作為轉譯的起始位點。Pem cDNA克隆(839bp，排除poly(A)尾巴)與除去poly(A)尾巴的Pem轉錄產(chǎn)物(0.9kb)大小相近。因而Pem cDNA克隆似乎接近全部長度。
Pem蛋白質(zhì)是親水性的，不存在前導序列，無與N結合糖基化位點，也沒有可能的跨膜區(qū)域，因此，Pem不像是在細胞膜中分泌或插入到細胞膜中，但具備一個胞內(nèi)蛋白質(zhì)的特性。推測出的Pem蛋白包含有蛋白激酶C，酪蛋白激酶和依賴(AMP)/cGMP激酶對Ser和Thr磷酸化的保守序列，如圖1所示。因用DNA和推測的氨基酸序列在Genbank和瑞士蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索都未發(fā)現(xiàn)與其他已知的基因和蛋白產(chǎn)物有顯著的相似性，Pem代表一種新基因。
在對本發(fā)明進行綜述之后，接下來用特殊的例子來說明幫助理解。這些例子只是用來說明，而不是變成一種限制，除非特別說明。
例1細胞的分離，鑒定及培養(yǎng)A.淋巴瘤細胞系T淋巴瘤細胞系SL12.1，SL12.3，SL12.4及它們形成的體細胞雜種，其分離，鑒定及培養(yǎng)條件在下列文獻中已有詳述Hays，et al.(1986)Int.J.Cancer 38597-601;Mac Leod，et al.(1984)Can-cer Res 441784-1790;Mac Leod，et al.(1985)J.Nat.Cancer.Inst.74875-882;Mac Leod，et al，(1986)Proc，Natl.Acad.Sci.USA 836989-6993;and Weinroth，et al.(1985)Cancer Res.454804-4809，這些都收到在參考文獻中。SL12.3和SL12.4細胞克隆的表型總結于表1中。轉錄表達，表面蛋白表達，致瘤性和腫瘤類型分別用Northern分析，流式細胞光度法及將克隆的細胞注射到同源動物身上等方法來確定。TCR-β1.0和1.3kb轉錄產(chǎn)物分別編碼(D)-J-C和V-D-J-C序列。糖皮質(zhì)激素反應通過細胞在1mM的地塞米松中生長而確定。
表1
SL12.4和SL12.3細胞無性繁殖系的表型性質(zhì)SL12.4 SL12.3Thy-1 ++ +++TCR-alpha - +TCR-β1.0kb + -mRNA 1.3kb - -TCR-gamma - -TCR-delta - -CD3-gamma + -CD＃-delat + -CD3-epsilon + +/-CD3-zeta + +CD2 + +CD4 - -CD8 - -Thy-1 ++ ++Pgp-1 - +ThB + -表面現(xiàn)象 TL + +T200 + +H-2Kk- -IL2r + +Jlld + +CD3-epsilon - -Mel-14 + NT糖皮質(zhì)激素敏感性 S R腫瘤發(fā)生性 低 高腫瘤型 外節(jié)點 擴散卵巢 肌肉R＝細胞耐溶性，S＝溶解敏感性。
SAK8細胞(Gasson and Bourgeois J.Cell.Biol.96409-415(1983))從Dr.Gasson獲得。淋巴瘤細胞培養(yǎng)在Dulbecoo改進的Ea-gle培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中補充有10%胎牛血清，谷氨酰胺，青霉素和鏈霉素。兩個人類卵巢癌細胞系2008(Disaea，et al.Am.J.Ob-stet.Gynecol.114979-989(1972))和COLO 316(Woods，et al.Cancer Res.394449-4459(1979))培養(yǎng)在RPMI培養(yǎng)基1640中，培養(yǎng)基中被充有5%牛犢血清，谷氨酰胺，1%Fungi-bact(Irvine Scientific，Santa Ana，Californin)。當細胞用于制備RNA時，當細胞長至對數(shù)生長期，大約密度為5-8×105細胞/ml(Wilkinson and Mac Leod EMBO J.7101-109(1988))。來自BALB/C小鼠的脾細胞在3×106細胞/ml時接種，在收集RNA以前用10μg/ml ConA刺激兩天。
B.SL12.4細胞和胸腺表皮單層細胞共培養(yǎng)SL12.4細胞和胸腺表皮單層細胞共培養(yǎng)條件。最主要的，SL12.4細胞的接種濃度要使得共培養(yǎng)三天之后，最終濃度達到1×106細胞/ml。TEL或TEPI在第三天之前開始融合。細胞在37℃生長在ulbecco改進的Eagle′s Medium中，培養(yǎng)基中添加了10%胎牛血清，谷氨酰胺和青霉素/鏈霉素。
C.用于20.2表達研究的細胞系下列來源的細胞系被用于20.2表達研究胚胎癌F9和PCC4(Bernstine，et al.(1973)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.703899-3903)，垂體瘤ATt20(Buonassisi，et al.(1962)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.481184-1192)，胸腺表皮TEPI(Beardsley，et al.(1983)Proc，Natl，Acad.Sci.USA.806005-6009)，乳房表皮MME(E-vans(1988)Science 240889-894)12.9)，3T3(ATCC No.92)MET依照Freshney方法制備(Freshney(1983)In Culture of Animal Cells.Alan R.Inc.Pages 99-110)，B細胞雜種瘤PS.G8，B/T淋巴瘤WEHI-21，巨噬細胞P388D1，胸腺表皮TEL，嗜堿細胞RBL-1，T細胞雜種瘤2H10v，成神經(jīng)細胞瘤N4TG1，骨髓瘤S194/5，T淋巴瘤SL12.3，RS4.2，SAK8，BW5147，AKR1，EL-4，體細胞雜種SL12.3×SL12.4，T細胞雜種瘤BO-4H、H9.1。細胞培養(yǎng)在Dulbecco改進的Eagle′s培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中補充10%胎牛血清，谷氨酰胺，青霉素和鏈霉素。用于制備RNA的細胞培養(yǎng)至對數(shù)期，濃度為5-8×105細胞/ml時收集細胞。取自BALB/C小鼠的脾細胞以3×106細胞/ml接種在RPMI 1640中，添加如前的成份，在收集RNA之前用10μg/ml ConA刺激6，24，48或72小時。
例2克隆及篩選的方法從SL12.4細胞得到的Poly(A)+mRNA作為模板制備雙鏈(ds)cDNA(Gubler and Hoffman(1983)Gene 25263-269)。在甲基化的ds DNA上加上ECORI接頭。去磷酸化的λgt10臂(Stratagene)和cD-NA連結起來，依照制造商的推薦條件用Stratagene包裝抽提物，將其包裝到λ噬菌體中(Huynh，et al.in D.Glover(ed.)(1984)DNA Cloning TechniquesA Practical Approach.IRL Press，Oxford，U.K.)。
排除雜交基本上按Heclrick，et al.(1984)Nature308149-153和Timberlake(1980)Dev.Biol.78497-503，最近介始的方法進行。單鏈cDNA是10mg poly(A)+SL124 RNA加入250mc的32P dcTP(Amersham)，并在存在100μg/ml放線菌素D條件下合成的，與25mg SL12.3細胞的Poly(A)+RNA在68℃ 8ml體積中雜交18小時，直至達到Rot為1260(mol/升×秒)。雜交后，經(jīng)羥磷灰石柱層析收集單鏈cDNA。從1μg SL12.4 cNDA出發(fā)，大約120ng(12%的輸入cDNA具有3×107cpm)被回收，作為探針與兩張150mm硝酸纖維素濾膜雜交，每張濾膜都載有20，000λgt10噬菌斑。從SL12.3λgt10文庫中復印的第一張膜與由SL12.4mRNA得到的總cDNA雜交，第二張膜用上述SL12.4排除富集過的cDNA雜交。這種方法與Filmus，et al.用過的方法類似。經(jīng)過兩次篩選(用分次制備的探針)，得到的純化的λ噬菌體克隆噬斑被鑒定為SL12.4特有的。隨后用Northern分析證實該克隆只與SL12.4細胞的mRNA雜交，而不與SL12.3細胞的mRMA雜交。cRNA插入片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BglⅡ消化從λDNA上切下，用低融點凝膠(Sea Kem)分離，并亞克隆到HindⅢ和BamHI酶切過的質(zhì)粒載體PT7/T3(Bethesda Re-search Labratory)。插入片段不能被EWRI從噬菌體上切除，因為在所有分離物中EcoRI位點都受到損傷。(Kuziel，et al.(1987)Nucl.Acid.Res.153181)。用Pem cDNA，從λZAPⅡSL12 cDNA文庫中得到了15個克隆。這些克隆覆蓋了成熟mRNA轉錄產(chǎn)物的全部長度。
例3Northern印跡法分析用異硫氰酸胍法從細胞系和組織中分離總細胞RNA(Maniatis，et al.(1983)In Molecular CloningA Laboratory Manual。Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)，按照Wilkin-son方法有所修改(Wilkinson，et al.(1988)EMBO J.7101-109)。用吖啶橙染色(Maniatis，et al.(1983)In Molecular CloningA Labora-tory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold Spring Harbor，New York)和與肌動蛋白，CHO-A和/或Cyclophillin cDNA雜交的辦法，來估計每個加樣孔加樣量以及RNA轉移相等。對于組織，方法有所修改，氯化銫離心后得到的RNA沉淀懸浮在10mM Tris(pH8)，0.5%SDS，5mM EDTA中，隨后用酚∶氯仿∶異戊醇(24∶24∶1)抽提兩次，氨仿∶2-丁醇∶異戊醇(20∶5∶1)抽提兩次。RNA印跡時10mg的RNA在1%瓊脂糖-甲醛凝膠中電泳，轉移至尼綸膜上(Maniatis，et al.1982)。Northem印跡膜在10%硫酸右旋糖酐，50%甲酰胺中與隨機寡聚體引物合成的32P標記的cDNA插入片段42℃雜交12-18小時(Meinkoth and Wahl 1984)。為去除標記探針，RNA印跡膜用0.1×SSPE和0.1%SDS在90℃洗脫(Maniatis，et al.(1982)in“Molecular CloningA Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)，冷卻到室溫，空氣中干燥，真空保存至下次雜交時使用。RNA的大小通過與BRL RNA高分子量和低分子量梯度相比較而確定。
例4Southern印跡法分析從細胞，T淋巴瘤和小鼠-倉鼠體細胞雜種及其他種類組織分離得到的總的細胞DNA被限制性酶EcoRI降解。每個電泳加樣孔加入20mg降解的DNA，0.7%瓊脂糖凝膠電泳，轉移至尼綸膜上基本上按Mein Koth和Wahl的方法(Meinkoth and Wahl(1984)Anal.Biochem.13267-284)，雜交和洗脫按Northern印跡分析的方法進行。
B.20.2的Southern印跡法分析20.2的Southern印跡法分析除下面特別指出的以外，按前面的方法進行。
總的細胞DNA從SL12.4細胞，小鼠和倉鼠肝及體細胞雜種中分離。小雞和人肝的DNA購自Clonetec，Palo Alto，California。DNA根據(jù)供應廠家的條件用例子中提到的限制性內(nèi)切酶進行降解。每個加樣孔加入10μg降解DNA，0.8%瓊脂糖凝膠Tris乙酸緩沖液中電泳至少48小時，轉移至尼綸膜上，雜交和洗脫見Northern印跡法分析。從其他物種得到的DNA印跡膜洗脫時條件要溫和一些，最后洗滌在室溫下2×SSPE中進行。
總的細胞DNA按Maniatis的方法分離(Maniatis，et al.1982)，用限制性酶EcoRI降解。每個加樣孔加20μg降解的DNA，0.7%瓊脂糖凝膠，Tris乙酸緩沖液中電泳，按Maniatis的方法轉移至尼綸膜上，洗脫的方法見Northern印跡法。
例5DNA序列分析由Pem cDNA克隆確定出限制性內(nèi)切酶圖譜，片段亞克隆到pT7T3;質(zhì)粒通過氯化銫梯度純化，用序列分析酶試劑(U.S.Biochem-ical corp.，Cleveland，Ohio)直接用雙鏈雙脫氧序列分析法進行序列分析。部分序列用寄主質(zhì)粒的引物確定，其他cDNA的專一寡核苷酸引物(17核苷酸引物)由VCSD Cancer Center Core Molecular Biolo-gy Facility，雙條鏈都作全序列分析，所有順序至少由兩次反應確定。運用Microgenia和Intelli Genetics計算機程序?qū)⒅丿B序列信息連結起來，進行最初的序列分析。推測的蛋白質(zhì)的性質(zhì)由Prosite pro-gram from lntelli Genetics確定。得到的DNA和推測蛋白質(zhì)序列在Swiss蛋白質(zhì)和EMBL數(shù)據(jù)庫中導查相似性。
例6Pem之cDNA及其預期編碼的蛋白質(zhì)序列為了決定cDNA和Pem基因編碼的蛋白質(zhì)序列，著手尋找對應于參與分化和/或瘤形成的基因的新cDNA。為此，選擇了兩個密切相關的T-淋巴瘤細胞克隆SL12.4和SL12.3，其成熟水平和腫瘤發(fā)生性質(zhì)不同。在分析了10種細胞表面抗原和12種特異mRNA基礎上，得到有關細胞克隆，代表著T-細胞發(fā)育的特定各階段或特定世系(Mac Leod等，(1984)Cancer Res.441784-1790;Mac Leod等，(1985)J.Natl.Cancer Inst.74875-882;Mac Leod等，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA836989-6993;Hays等，(1986)Int.J.Cancer 38597-601;Mac Leod等，(1990)Cell Growth Differ.1271-279)。
有一cDNa克隆20.2，從中鑒定出在胎盤和胚胎中表達的轉錄本，命名為Pem。
該cDNA序列長839bp，從第91堿基對到第720，包含單一長的開放閱讀框架，編碼含210個氨基酸的蛋白質(zhì)(圖1)。圖中右邊的數(shù)字示核苷酸位置，左邊的數(shù)字示預期氨基酸的位置。序列中第一個甲硫氨酸劃線下標。聚腺苷化信號保守序列AATAAA也劃線標出。DNA序列3′末端(X)表示poly(A)尾巴一串14個腺苷酸殘基。利用Intelli Genetics程序，鑒定有關激酶作用的Ser或Thr殘基周圍特定保守序列，而從中找到依賴于cAMP/cGMP激酶(AG)，蛋白激酶C(C)和酪蛋白激酶Ⅱ(CK)作用的潛在磷酸化位點。聚腺苷化保守序列AATAAA位于poly(A)區(qū)5′端50bp處。第一個甲硫氨酸密碼子(距序列5′91bp處)圍繞有Kozak保守序列(G/A XXATGG)，提供了有效的翻譯起點(Kozak(1986)Cell44283-292)。利用T7聚合酶制備Pem有意義轉錄本，在網(wǎng)織紅細胞裂解液中翻譯，產(chǎn)生了具預期分子量的蛋白質(zhì)(23kd，數(shù)據(jù)未顯示)。這樣，在體外轉錄一翻譯實驗中，第一個甲硫氨酸是作為翻譯起始點的。Pem cDNA克隆長度(839bp，不包含poly(A)尾)與Pem轉錄本長度(0.9kb)相近，后者poly(A)尾已去除(數(shù)據(jù)未顯示)。這樣看來Pem cDNA克隆是近乎全長的。
該Pem蛋白質(zhì)具親水性，不包含前導序列，N-連接的糖基化作用位點，亦無任何潛在的跨膜區(qū)域。因此，Pem蛋白質(zhì)不象是分泌型蛋白質(zhì)，也不象會插入細胞膜中，而是具有一種細胞內(nèi)蛋白質(zhì)性質(zhì)。預期的Pem蛋白質(zhì)包含被蛋白激酶C，酪蛋白液酶和依賴于cAMP/cGMP的激酶作用的Ser和Thr磷酸化保守序列，如圖1所示。由于在Gen Bank和瑞士蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中沒有發(fā)現(xiàn)該DNA及其編碼氨基酸序列與其他已知基因或基因產(chǎn)物有任何顯著相似性，因此Pem代表一新的基因。
例7Pem轉錄本的表達為了查明Pem轉錄本在不滅和轉化細胞系中的表達，利用northern法分析鑒定表達Pem轉錄本的組織和細胞類型。Pem轉錄本在一種T-淋巴瘤細胞中大量存在，但在成體胸腺淋巴樣組織，靜止的或活化的脾細胞，腸系淋巴樣組織或骨髓中不能檢測到，也不能在成年腦，肝，大腸或卵巢中檢測到。此外，在胰腺，心臟，肺，胃，腎或垂體中，也沒發(fā)現(xiàn)Pem轉錄本。
由于Pem cDNA克隆是從一轉化細胞系中分離到的，故在其他不滅和轉化細胞系中估價Pem基因表達(圖2)。為了獲取在所有細胞系中Pem MRNA表達狀況，用32P標記的Pem克隆插入片段與Northern吸印產(chǎn)物雜交，估價Pem mRNA在下列鼠細胞系中的表達F9，Pcc4(胚胎癌);ATt20(垂體);TEPI(胸腺上皮);MME(乳房上皮);3T3(不滅成纖維細胞);MEF(正常鼠胚成纖維細胞);SL12.4(T-淋巴瘤);PS.G8(B細胞雜交瘤;WEHI-21(B/T-淋巴瘤);P388D1(巨噬細胞);TEL(胸腺上皮);RBL-1(嗜堿細胞);ZH10v(T-細胞雜交瘤);N4TG1(成神經(jīng)細胞瘤);S194/5(骨髓瘤);SL12.3，RS4.2，SAK8，BW5147，AKR1，EL-4(T-淋巴瘤);SL12.3×SL12.4(體細胞雜種);及BO-4H.H.9.1(T-細胞雜交瘤)。所有樣品上樣和RNA轉移的相似性通過18S和28S RNA吖啶橙染色和用32P標記的Cyclophillin(Cy)探針與吸附產(chǎn)物雜交來估價，CY探針能識別在大多數(shù)鼠細胞系中具相同水平的CY轉錄本(Takahoshi等(1989)Nature337473-475)。
兩具多能性干細胞特點的胚胎癌細胞系(F9和PCC4)表達Pem基因。但表達量顯著不同。不滅3T3成纖維細胞大量表達Pem，而正常胚成纖維細胞表達的Pem mRNA至少少30倍。在起源于神經(jīng)元，垂體，巨噬細胞和乳房上皮的細胞系中，Pem是表達的。相反，在胸腺上皮細胞系和大多數(shù)試驗過的B細胞及T細胞瘤與雜交瘤細胞系中，Pem轉錄本實際上檢測不到，雖然-B細胞雜交瘤(PS.G8)和兩T-淋巴瘤細胞系(Pem)表達Pem轉錄本(圖2)。圖2顯示1.1kb轉錄本最為顯著;但是有些細胞還表達一種3.3kb的mRNA。1.1Kb和3.3kb的轉錄本都富集于poly(A)選擇的RNA中，兩者都存在于SL12.4細胞的細胞質(zhì)區(qū)域。
Pem基因表達無任何明顯的譜系特異性，各細胞系中mRNA量變異亦大，這些表明有可能在體內(nèi)或在體外延長培養(yǎng)后，基因已經(jīng)隨機丟失，失活，轉移，或擴增。以前的Southern分析顯示，在SL12.3(Pem-)和SL12.4(Pem+)之間，在另一Pem-T-淋巴瘤細胞系SAK8中，都不能檢測到Pem基因帶的深淺或Pem基因大小的差別(Mac Leod等(1990)Cell Growth Differ.1271-279)。隨之試驗了從幾個表達大量Pem mRNA的細胞系(SL12.4，ATt20，F(xiàn)9，MME，N4TG1，和EL4)來的DNA，任何帶深淺(拷貝數(shù))或大小差異都未檢測到。這樣，基因缺失，大規(guī)模遺傳重排，或基因擴增等與細胞系中Pem MRNA累積差異可能是無關的。
例8胚胎發(fā)育過程中Pem基因表達Pem基因表達模式類似于癌胎基因，因為Pem轉錄本存在于轉化和不滅細胞系，胚胎癌干細胞，而不存在于成體組織(Ruddon(1987)Gene Derepression in Cancer Cells，In Cancer Biology OXford U-niversity Press，New York，pages 431-436)。為了進一步探索Pem屬于這類基因的可能性，在鼠發(fā)育不同階段的胚胎和胚外組織中估價了轉錄本水平。如圖3所示，從妊娠不同時期的胚胎，胎盤(P)，和卵黃囊(Y)中制備RNA。圖3顯示，早至胚胎發(fā)育6天就能檢測到Pem轉錄本。第6天的胚胎包含胚外組織。Pem mRNA在第7天或第8天很多，但到第9天及以后，表達急劇減少，雖然仍可典型觀察到一弱信號(圖3)。與之相反，在第7天或第8天的胎盤或卵黃囊中，很少檢測到Pem轉錄本;但在第9天上轉錄本增加到高的水平，隨后各階段保持如此。第10天和第18天的胚胎，胎盤和卵黃囊與第12天到16天的具有類似的Pem mRNA表達模式(未顯示)。吸印產(chǎn)物用探針雜交，如圖2所述。胚胎和胚外組織中Pem基因表達模式導致兩個有意義的結論(1)Pem mRNA在胚胎中僅短暫高水平積累(第7天和第8天)，雖然在后面階段特定胚胎世系中會保持高水平;(2)胚胎中Pem mRNA表達與觀察到的胚外組織中的表達是交互的。
例9Pem是一種癌胎基因Pem基因在胚胎發(fā)生過程中以階段特異性方式表達，而且在很多不同的不滅和轉化細胞系中表達。在試驗過的成體組織中，其表達不能檢測到。由于這些不尋常的表達特征符合于癌胎基因特征(Ruddon(1987)Gene Derepression in Cancer Cells，in Cancer Biology，Oxford University Press，New York，pages 431-436)，Pem可以作為不滅細胞和/或參與鼠早期發(fā)育細胞的有用的標記。第9天胚中Pem轉錄本急劇下降，而妊娠同一時期胎盤和卵黃囊中Pem轉錄本變多，這一觀察提示可能Pem+細胞從胚中遷移到胚外區(qū)域。來自胚外中胚層(衍生自內(nèi)細胞團)的細胞產(chǎn)生胎盤和卵黃囊細胞，于是具有這種遷移細胞的特征。雖然Pem基因在胎發(fā)育過程中特異表達，但是不能排除它在成體中仍有功能。Pem基因可被存在于成體組織中數(shù)目不多的或短暫的先祖細胞表達。由于成體和胎兒先祖細胞都被認為是轉化/不滅過程的靶子(Pierce和Speers(1988)Cancer Res.481996-2004)，Pem mRNA被很多不滅和轉化細胞系表達這一結果與此概念符合。去調(diào)節(jié)導致Pem在不滅細胞中過量或組成型表達，這可由此對其連續(xù)細胞增殖能力起作用。
為了防止或控制由于Pem過量表達或組成型表達引起的異常增殖，同源重組基因療法或靶基因失活方法可用來抑制該基因功能或抑制有功能基因產(chǎn)物的表達。為此目的，使用了Pem基因的基因組克隆。在Pem基因內(nèi)插入一選擇性標記，使基因失去編碼或表達有功能產(chǎn)物的能力，由此使Pem基因失活。然后通過電穿孔法或顯微注射法，將突變基因轉移至胚干細胞或建立的細胞系中。選擇出合適整入選擇標記的細胞，轉移至個體胚泡中。包含如此轉化的Pem基因之一個或二個等位基因的個體可被選擇出來。
本領域行家將容易鑒別，本發(fā)明非常適于實施目標，得到結果，獲取所提及的及本發(fā)明內(nèi)在固有益處。此文描述的各組分，方法，步驟和技術為當前更常用的代表性的，作為示例，而不是用來限制本發(fā)明的范圍。本領域行家可由此作些改變，作它用，只要在本發(fā)明精神之內(nèi)，不超出所附權利要求書的范圍。
權利要求
1.一種由重組技術產(chǎn)生的多肽，其特征在于其包含Pem基因編碼的一種Pem蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
2.根據(jù)權利要求1的多肽，其特征在于以基本純化形式存在的。
3.根據(jù)權利要求1或2的多肽，其特征在于其中所說Pem蛋白由一種T-淋巴瘤細胞的DNA所編碼。
4.根據(jù)權利要求1的多肽，其特征在于其中所說氨基酸序列由示于圖1的核酸所編碼。
5.包含示于圖1的核苷酸序列的cDNA探針。
6.一種檢測贅生性細胞的方法，其特征在于其包含在雜交條件下根據(jù)權利要求5的探針與靶細胞群體溫育。
7.一種對待贅生性細胞的方法，其特征在于其包含一種失活突變型Pem基因插入贅生性細胞。
8.一種包含根據(jù)權利要求5的cDNA序列編碼的氨基酸序列的多肽。
9.根據(jù)權利要求8的多肽，其特征在于以基本純化形式存在的。
10.一種包含編碼Pem蛋白質(zhì)的DNA序列的表達載體。
11.根據(jù)權利要求10的表達載體，其特征在于其中所說表達載體指一種能在一種宿主中復制的質(zhì)粒，它包含(可操作的連鎖方式存在)a.)一個復制起點;b.)一個啟動子;和c.)編碼Pem蛋白質(zhì)的DNA序列。
12.根據(jù)權利要求11的表達載體，其特征在于其中所說的表達載體指一種能在一種原核宿主中復制的噬菌體或質(zhì)粒，它包含(可操作的連鎖方式存在)a.)一個原核復制起點;b.)一個原核啟動子;和c.)編碼Pem蛋白的DNA序列。
13.根據(jù)權利要求11的表達載體，其特征在于其中所說表達載體從包括pMAMneo，pNEO/Tfr-NC和pMAM/neo/Tfr-NC的群體中選譯。
14.一種包含編碼Pem蛋白質(zhì)的DNA序列的載體。
15.根據(jù)權利要求14的載體，其特征在于其中所說載體從包括一種質(zhì)粒，一種噬菌體和一種裝配型質(zhì)粒的群體中分離。
16.根據(jù)權利要求15的載體，其特征在于其中所說載體為pT7T3-20.2，其中ATCC登記號68304。
17.一種由一種重組DNA分子轉化的宿主，其特征在于其中所說重組DNA分子包含一種編碼Pem蛋白質(zhì)的DNA序列。
18.根據(jù)權利要求17的宿主，其特征在于為大腸桿菌。
19.一種產(chǎn)生Pem蛋白質(zhì)的方法，其特征在于其包括a)用編碼T-細胞蛋白質(zhì)的一種DNA序列轉化一宿主;b)表達所說DNA序列;和c)回收所說Pem蛋白質(zhì)。
20.一種藥劑配方，其特征在于其有助于在包含致免疫有效量Pem蛋白質(zhì)的個體中，誘導抗Pem蛋白質(zhì)抗體的產(chǎn)生。
21.根據(jù)權利要求20的藥劑配方，其特征在于其中所說Pem蛋白質(zhì)通過根據(jù)權利要求19的方法產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的cDNA序列(Pem)，一種基因蛋白質(zhì)產(chǎn)物，及該種新cDNA序列和Pem基因產(chǎn)物的用途。本發(fā)明的DNA序列和重組DNA分子都特征編碼一種新的蛋白質(zhì)，其具下列特點(1)由T-淋巴瘤細胞表達；(2)不在正常胸腺，激活脾細胞，腸系淋巴樣組織或骨髓中表達，也不能在成體腦，肝，大腸或卵巢中檢測到；(3)在不滅或癌細胞系中表達；和(4)在胚發(fā)育過程中表達。
文檔編號C12N5/10GK1060871SQ9110959
公開日1992年5月6日 申請日期1991年9月28日 優(yōu)先權日1990年10月1日
發(fā)明者卡羅爾L·麥克里屋特 申請人:研究發(fā)展基金會