專利名稱：利用轉(zhuǎn)拼核酶摘除細胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的轉(zhuǎn)拼核酶以及利用這些核酶摘除細胞的方法。
Ⅰ.Ⅰ組內(nèi)含子具有催化活性的RNA分子稱為核酶或RNA酶(Cech，T.R.，Ann.Rev.Biochen′.59543-568(1990))。嗜熱四膜蟲(Tetrahy-mena thermophila)前體rRNA含有能夠催化其自身切割的內(nèi)含子(核酶)。該核酶是一組結(jié)構(gòu)上相關(guān)的Ⅰ組內(nèi)含子中的一種。
修飾過的嗜熱四膜蟲內(nèi)含子的拼接活性需要有鳥苷輔因子和二價陽離子(Mg++或Mn++)存在，并且是通過兩個連續(xù)的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)(

圖1)發(fā)生的。首先，游離的鳥苷與核酶結(jié)合且其3′羥基被置于攻擊5′拼接位點的磷原子的位置。鳥苷共價連接于內(nèi)含子序列并釋放出5′外顯子。接著，新釋放出的5′外顯子的3′羥基與位于3′拼接位點的磷酸二酯鍵反應(yīng)，從而產(chǎn)生連接的外顯子序列。然后，切除的內(nèi)含子通過一系列的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)(涉及其3′羥基和內(nèi)部序列)形成縮短了的環(huán)形分子。
從化學上講，這些連續(xù)反應(yīng)是相似的并且都發(fā)生在單一活性位點。自拼反應(yīng)的特征在于交替RNA結(jié)構(gòu)的形成，因為不同的RNA鏈均在高度保守的內(nèi)含子周圍形成了類似的構(gòu)象。拼接需要對準位于稱作“內(nèi)部指導(dǎo)序列”(或IGS)的互補序列內(nèi)含子一外顯子接點。
在5′拼接位點進行的首次切割需要在IGS和與拼接位點相鄰的序列之間形成堿基配對的螺旋(P1)。該螺旋中UG“變位”堿基對的存在可限定將在核酶的催化反應(yīng)中破壞磷酸二酯鍵。該鍵斷裂后，部分P1螺旋被取代，且由于IGS和與3′拼接位點相鄰的序列之間的互補性而形成了新螺旋(P10)。不變的鳥苷殘基位于3′拼接位點處的磷酸二酯之前，如同P1序列中被取代的部分一樣。因此，外顯子的連接僅在新的外顯子序列取代了內(nèi)含子序列之處以與第一次切割反應(yīng)相反的方向發(fā)生。應(yīng)當指出，緊接外顯子連接反應(yīng)的內(nèi)含子環(huán)化反應(yīng)同樣也涉及5′序列與IGS的堿基配對，而且反應(yīng)是由內(nèi)含子末端鳥苷殘基的3′羥基介導(dǎo)的(Been，M.D.et al.，“Selection of Circularization Sites In A Group I IVS RNA Requires Multiple Alignments of An Internal Template-Like Sequence，”Cell50951(1987))。
Ⅱ.催化活性為了更好地確定Ⅰ組內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)和催化性質(zhì)，已從嗜熱四膜蟲內(nèi)含子“核心”中剝?nèi)ネ怙@子序列。Cech，T.R，等(WO 88/04300)曾指出，嗜熱四膜蟲內(nèi)含子核酶至少具有三種催化活性(1)脫磷酸活性，它能夠以序列特異性方式除去RNA3′末端的磷酸，(2)RNA聚合酶活性(核苷酸基轉(zhuǎn)移酶)，它能夠催化寡核糖核苷酸轉(zhuǎn)化為多核糖核苷酸，(3)序列特異性核糖核酸內(nèi)切酶活性。
分離的核酶活性能夠與底物RAN進行相互轉(zhuǎn)移作用，且已對這類反應(yīng)進行過鑒定。例如，當將平末端形式的內(nèi)含子和對應(yīng)于5′拼接點的序列一起保溫時，該位點受到類似于拼接第一步的鳥苷依賴性切割。底物與核糖核酸內(nèi)切的內(nèi)含子RNA進行堿基配對，形成螺旋P1，且切割發(fā)生在第4-6位的UG堿基對之后。通過系統(tǒng)發(fā)育比較和突變分析發(fā)現(xiàn)，只要維持了P1螺旋的堿基配對，緊接5′拼接位點處保守尿嘧啶殘基的序列的性質(zhì)對催化作用并不重要(Doudna，J.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA867402-7406(1989))。
選擇3′拼接位點所需的序列似乎主要位于內(nèi)含子本身的結(jié)構(gòu)內(nèi)，它包括螺旋P9.0以及隨后的確定3′內(nèi)含子邊界的鳥苷殘基。但是，如同突變分析所顯示的一樣，3′外顯子內(nèi)的側(cè)翼序列是形成螺旋P10以及進行有效拼接所必需的(Suh，E.R.et al.，Mol.Cell.Biol.102960-2965(1990))。另外，利用平末端形式的內(nèi)含子和“外部”指導(dǎo)序列以及已被5′鳥苷殘基延長的寡核苷酸，已將寡核苷酸轉(zhuǎn)移連接。在連接之前，通過在外部模板上形成類似于P10的螺旋而單獨對準對應(yīng)于3′外顯子序列的底物寡核苷酸(Doudna，J.A.et al.，Nature339519-522(1989))。
通過將分散的“雜交”區(qū)操縱至核酶而將核酶的切割活性對準于特定的RNA，該雜交區(qū)能夠與所需的RNA特異雜交。例如，Ger-lach，W。L等(EP321 201)構(gòu)建出一種含有與靶RNA互補的序列的核酶。通過增加該互被序列的長度可提高該序列對靶RNA的親和性。但是，該核酶的雜交區(qū)和切割區(qū)彼此整合。通過互補區(qū)與靶RNA雜交后，核糖酶的催化區(qū)切割該靶。它提示核酶將可在體內(nèi)用于滅活或切割靶RNA，從而可用于例如治療由于外源宿主RNA的產(chǎn)生所引起的人體疾病。但是，由核酶指導(dǎo)的轉(zhuǎn)拼(與轉(zhuǎn)切相反)則未曾提到或揭示過。
已對各種天然存在的核酶的核糖核酸內(nèi)切酶活性(切割活性)進行過廣泛研究。對這些核酶的結(jié)構(gòu)和序列進行分析后發(fā)現(xiàn)，切割位點周圍的某些核苷酸非常保守，而其側(cè)翼序列則并非如此。這一情況導(dǎo)致人們設(shè)計出自然界尚未發(fā)現(xiàn)的新的核糖核酸內(nèi)切酶活性。例如，Cech等人已構(gòu)建出改變了底物序列特異性的新核酶(Cech，T.R.et al.，WO 88/04300;Koizumi，M.et al.，F(xiàn)EBS Lett.239295-288(1988);Haseloff，J.et al.，Nature 334585-591(1987);及Heus，H.A.et al.，Nucl Acids Res.181103-1108(1990))。根據(jù)自身切割植物類病毒和衛(wèi)星RNA方面的早期研究(Buzayan，J.M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 838859-8862(1986))，已為能夠以高度序列特異性方式轉(zhuǎn)移切割其它RNA分子的核酶的設(shè)計建立了指南(Haseloff，J.et al.，Nature334585-591(1988))。但是，這些構(gòu)建物并不能夠有效地催化針對轉(zhuǎn)拼的反應(yīng)。
分離RNA上含有的外顯子的連接(即轉(zhuǎn)拼)在自然界發(fā)現(xiàn)于snRNP介導(dǎo)的以及自我催化的Ⅰ組和Ⅱ組內(nèi)含子中。在錐蟲及Caenorhabditis eleqans mRNA中，共同的5′前導(dǎo)序列是由各自的基因上轉(zhuǎn)錄并被拼接到mRNA的3′部分(Agabian，N.，Cell611157-11600(1990);Hirsh，D.et al.，Mol.Biol.Rep.14115(1990))。這些小的“拼接前導(dǎo)”RNA(slRNA)由已融合至在哺乳動物snRNA拼接提取物中能夠從功能上取代U1 snRNA的序列的5′外顯子構(gòu)成。
另外，Ⅰ組和Ⅱ組自拼內(nèi)含子均能夠在人工系統(tǒng)中轉(zhuǎn)移連接外顯子(Been，M.D.et al.，Cell47207-216(1986);Galloway-salvo，J.L.et al.，J.Mol.Biol.211537-549(1990);Jacquier，A.et al.，Science2341099-1194(1986);和Jarrell，K.A.et al.，Mol.Cell Biol.82361-2366(1988))。Ⅱ組內(nèi)含子的體內(nèi)轉(zhuǎn)拼發(fā)生在葉綠體的拼接基因中(Kohchi，T.et al.，Nucl.Acids Res.1610025-10036(1988))，且Ⅰ組內(nèi)含子的體內(nèi)轉(zhuǎn)拼在大腸桿菌的人工拼接基因中得到顯示(Galloway-Salvo，J.L.et al.，J.Mol.Biol.211537-549(1990))。在后一情況下，含有Ⅰ組內(nèi)含子的噬菌體T4胸苷酸合成酶基因(td)在連接內(nèi)含子螺旋p6a的環(huán)處被斷開。已證實td基因片段的轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過體外轉(zhuǎn)拼拼營救發(fā)生機能障礙的大腸桿菌宿主細胞。已知的堿基配對(p3、p6和p6a)和內(nèi)含子片段之間可能的三級反應(yīng)使得基因片段能夠正確裝配和加工。
在體外，四膜蟲核酶能夠催化單鏈寡核糖核苷酸底物的轉(zhuǎn)拼。其中有四個成分是必需的核酶、3′單鏈RNA、5′外顯子和GTP。在該反應(yīng)中使用了縮短形式的四膜蟲核酶(L-21 Sca I IVS RNA(起始于內(nèi)部指導(dǎo)序列并終止于U409)(Flanegan，J.B.et al.，J.Cell.Biochem.(Supp.)12 part D28(1988))。由GTP在5′拼接位點所進行的攻擊釋放5′外顯子，接著，該5′外顯子在3′拼接位點進行的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)中被核酶連接至3′外顯子。
已有人提出在體內(nèi)用核酶代替反義RNA對準和破壞特定的RNA(Gerlach，W.L.et al.，EP2，21，201;Cotten，M.，Trends Biotechnol.8174-178(1990);Cotten，M.et al.，EMBO J.83861-3866(1989);Sarver，N.et al.，Science 2471222-1225(1990))。例如，已有人提出，對于HIV-1感染期間所表達出的RNA具有核酸內(nèi)切催化活性的核酶的表達可作為一種抵抗1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)感染的可能治療方法(Sarver，N.et al.，Science 2471222-1225(1990);Cooper，M.，CDC AIDS Weck-ly，April 3，1989，page2;Rossi，J.J.，Abstract of Grant No.IROIAI29329 in Dialog's Federal Research in Progress File 265)。但是，這一想法并未獲得成功。
在為調(diào)查核酶作為治療1型人體免疫缺陷病毒(HIV-1)感染的治療劑的替在應(yīng)用而進行的研究中，hammerhead motif核酶(Hutchins，C.J.et al.，Nucl.Acids Res.143627(1986);Keese，P.et al.，in Viroids and Viroid-like Pathogens，J.S.Se-mancik，ed.，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L，1987，PP1-47)所作用的是HIV-1 gag轉(zhuǎn)錄本。作用于gag的核酶在人細胞培養(yǎng)物中的表達導(dǎo)致HIV-1 gag RNA及抗原p24水平的下降(但不是完全喪失)(Sarver，N.et al.，Science 2471222-1225(1990))。因此，Sarver氏核酶的醫(yī)療效果受其低效所限，因為任何逃脫的致病RNA都會給宿主帶來問題。
在體內(nèi)應(yīng)用核酶的另一個問題是，為了在核提取物中發(fā)揮核酶的抑制功能需要有高比值的核酶/底物，而這一比值難以達到。Cot-ton等通過顯微注射法獲得了高比值的核酶/底物，它是將含有與強tRNA啟動子(聚合酶Ⅲ啟動子)可操縱連接的核酶產(chǎn)生基因的表達盒與含有核酶切割序列的底物RNA一起注射進蛙卵母細胞中(Cotton，M.et al.，EMBO J.83861-3866(1089))。但是，對于多細胞生物來說顯微注射不是一種合適的給藥方法。
抗編碼大腸桿菌β-半乳糖苷酶的mRNA的核酶體內(nèi)活性已有報道(Chuat，J.-C.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.1621025-1029(1989))。但是，這一活性只有當核酶和靶被轉(zhuǎn)染至細菌細胞內(nèi)的同一分子上時才能觀察到。當作用于自具有β-半乳糖苷酶基因的靶部分的細菌F游離基因轉(zhuǎn)錄的mRNA時，核酶的活性無效。
因此，目前對核酶活性的技術(shù)應(yīng)用僅限于利用核酶的切割活性以破壞靶RNA的活性。不幸的是，為了保證其效力這類應(yīng)用常常需要完全破壞所有的靶RNA分子和/或需要相對高比值的核酶/底物，而這一高比值難得達到。更重要的是，現(xiàn)有技術(shù)中修飾過的核酶不能夠有效、定向地轉(zhuǎn)拼。
因此需要開發(fā)高度有效的核酶和核酶表達系統(tǒng)。尤其是，現(xiàn)有技術(shù)中沒有提到通過將新RNA序列轉(zhuǎn)拼至宿主RNA來破壞已有的RNA序列或改變已有RNA的編碼序列的有效方法。
鑒于設(shè)計新核酶的可能性以及對在體內(nèi)改變高等真核生物遺傳特征的有效方法的需要的認識，本發(fā)明人對利用核酶在體內(nèi)改變天然RNA遺傳信息進行過研究。這些努力的結(jié)果是開發(fā)出高度有效的轉(zhuǎn)拼核酶并為其操作建立了指南。
按照本發(fā)明，首先提供了一種RNA或DNA分子，該分子編碼轉(zhuǎn)拼核酶，而該核酶能夠在體外或體內(nèi)以高度精確的方式將新的3′外顯子序列有效地拼接至任何選定的靶RNA序列中，并且這種RNA或DNA分子在調(diào)節(jié)任何選定的靶RNA或3′外顯子序列的能力以及在加進了增強該核酶特異性的互短序列方面是新的。
按照本發(fā)明，也提供了一種編碼核酶的RNA或DNA分子，而為該核酶編碼的序列是一融合RNA，該融合RNA產(chǎn)生出可以使核酶與靶RNA雜交的第一RNA序列以及能夠轉(zhuǎn)位至靶RNA中去的第二RNA序列。且該第二RNA序列編碼出一種異源于靶RNA序列的RNA序列。
按照本發(fā)明，也提供了一種編碼核酶的RNA或DNA分子，而編碼該核酶的序列為上面所述的融合RNA，由融合RNA產(chǎn)生的第一RNA序列是一種使得該RNA分子與GAL4 RNA雜交的序列，且融合RNA的第二RNA序列提供白喉毒素A鏈(DTA)的編碼序列。
按照本發(fā)明，也提供了一種RNA或DNA分子，它編碼的是構(gòu)象被破壞的本發(fā)明核酶(核酶原)，該核酶原由底物激活，即，該核酶原在與靶RNA發(fā)生特異性反應(yīng)而被重新激活之前只有微不足道的或沒有自切或轉(zhuǎn)拼活性。
按照本發(fā)明，也提供了含有核酶或核酶原表達盒的RNA或DNA分子。該表達盒能夠穩(wěn)定地插入至宿主基因組中，該表達盒產(chǎn)生能夠在宿主中起作用的啟動子序列，而該序列與本發(fā)明的核酶或核酶原序列可操縱地連接。
按照本發(fā)明，也提供了含有核酶或核酶原表達盒的RNA或DNA分子。該表達盒能夠穩(wěn)定地插入至宿主基因組中，該核酶表達盒產(chǎn)生應(yīng)答GAL4的啟動子序列，而該序列與本發(fā)明的核酶或核酶原序列可操縱地連接。
按照本發(fā)明，也提供了一種體外轉(zhuǎn)拼的方法，該方法包括以下步驟(1)在體外提供本發(fā)明的核酶或核酶原以及適合于該核酶的底物，(2)提供促進所需的該核酶或核酶原催化活性的體外反應(yīng)條件，(3)使該核酶或核酶原與該底物在該條件下反應(yīng)。
按照本發(fā)明，也提供了一種體內(nèi)轉(zhuǎn)拼的方法，該方法包括以下步驟(1)將本發(fā)明的RNA或DNA分子提供給宿主細胞，(2)在該宿主細胞中表達由該分子所編碼的核酶或核酶原，(3)在該宿主細胞中表達該核酶或核酶原底物，(4)將該核酶或核酶原與該底物在該宿主細胞中反應(yīng)。
按照本發(fā)明，也提供了一種滅活靶RNA活性的方法，該方法包括(1)提供本發(fā)明的核酶或核酶原，該核酶或核酶原對靶RNA具有催化活性，(2)提供該靶RNA，和(3)提供使該核酶或核酶原表達其作用于靶RNA的催化活性的條件。
按照本發(fā)明，也提供了一種在體內(nèi)為宿主細胞提供所需遺傳序列的方法，該方法包括(1)為所需宿主細胞提供本發(fā)明的核酶或酶原，該核酶或核酶原在該宿主細胞中對靶RNA具有催化活性，(2)提供編碼該所需遺傳序列的該核酶或核酶原，(3)提供條件使得該核酶或核酶原將該所需的遺傳序列轉(zhuǎn)拼至靶RNA序列中。
按照本發(fā)明，也提供了一種摘除多細胞動物或植物細胞的方法，該方法包括將本發(fā)明的核酶或核酶原提供給任何宿主細胞(尤其是受精的胚胎宿主細胞)，該核酶或核酶原編碼對該宿主細胞有毒的基因序列，且該核酶或核酶原能夠在該宿主細胞中與所需的靶轉(zhuǎn)拼。
按照本發(fā)明，也提供了一種對農(nóng)業(yè)上重要的植物種進行雄性或雌性不育處理的方法，該方法包括利用本發(fā)明的核酶或核酶原摘除受精所需的任何細胞。
按照本發(fā)明，也提供了一種對植物進行抗病原菌免疫的方法，該方法包括構(gòu)建能夠表達本發(fā)明的植物病原菌特異性融合核酶或核酶原的轉(zhuǎn)基因植株，該核酶或核酶原能夠摘除被該病原體感染的任何宿主細胞。
按照本發(fā)明，也提供了一種轉(zhuǎn)化的、抗病原菌微生物，該微生物被本發(fā)明的核酶或核酶原所轉(zhuǎn)化，而該核酶或核酶原對該病原體所表達的核酸分子具有催化活性。
按照本發(fā)明，還提供了一種能夠?qū)⑺璧暮嗣富蚝嗣冈钚詡鬟f給所需宿主的病毒病原體，該核酶或核酶原活性由本發(fā)明的核酶或核酶原傳遞。
圖1是Ⅰ組內(nèi)含子的核酶拼接機制示意圖。
圖2是(A)嗜熱四膜蟲rRNA內(nèi)含子;(B)本發(fā)明靶mRNA和轉(zhuǎn)拼核酶或核酶原的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3(A)是CAT-LacZ α-肽轉(zhuǎn)拼核酶的設(shè)計圖;(B)是CAT-LacZ核酶的完整DNA編碼序列。
圖4表示黃瓜花葉病毒(CMV)RNA4轉(zhuǎn)拼核酶的序列。A病毒RNA靶序列;B寡核苷酸靶序列;CCMV RNA4-白喉毒素A鏈轉(zhuǎn)拼核酶。
圖5是黃瓜花葉病毒3/4序列的比較。
圖6(A)是Gal4-白喉毒素A(DTA)轉(zhuǎn)拼核酶的設(shè)計圖;(B)是具有異亮氨酸取代基的Gal4-DTA核酶的完整編碼序列。
圖7是用于表達Gal4蛋白的p-成分介導(dǎo)的“增強子-誘捕”法示意圖。
圖8表示了野生型DTA和DTA3′外顯子突變體的部分序列。
圖9是pGaTB和pGaTN的酶切圖譜。
圖10是pUAST的酶切圖譜。
圖11是表達Gal4-DTA轉(zhuǎn)拼核酶的果蠅胚表皮制品。
圖12表示了“核酶原”設(shè)計的基本原理。箭頭顯示核酶切割位點，“反義”區(qū)用黑色表示，輻射狀陰影表示催化區(qū)，淺陰影表示3′“外顯子”序列。在沒有靶mRNA的情況下，轉(zhuǎn)拼核酶可進行瞬時堿基配對，并與異源序列(包括其自身)反應(yīng)。另外，在“3′外顯子”連接區(qū)將發(fā)生剪切。所構(gòu)建的無活性“核酶原”含有額外的自身互補序列，該序列引起核酶的催化中心誤疊。只有當與所需的靶mRNA進行堿基配對并且干擾二級結(jié)構(gòu)接著被取代后，才會形成具有活性的核酶。
圖13顯示了CAT-LacZ轉(zhuǎn)拼核酶的序列及其估計的二級結(jié)構(gòu)。核酶“核心”序列被涂成陰影(按照Cech，Gene 73259-271(1988))。其中顯示了未修飾核酶和核酶原1和2所作用的螺旋p8，它們分別具有13和18個核苷酸的互補于“反義”區(qū)(已標明)的序列。
圖14(1)顯示了活化的CAT-LacZ核酶，反義，具有螺旋p8和3′“外顯子”序列的核酶區(qū);(2)(a)顯示了在修飾過的螺旋p8的序列與“反義”區(qū)之間進行了堿基配對的無活性CAT-LacZ核酶原2;(b)與CAT mRNA堿基配對以取代螺旋p1-“反義”配對并重新形成螺旋P1后具有活性的核酶原。
圖15顯示了CAT-LacZ核酶原轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性。用EcoRI切割含有CAT-LacZ核酶和核酶原序列的質(zhì)粒，并利用T7或SP6 RNA聚合酶及〔32p〕UTP進行轉(zhuǎn)錄。在7M尿素和25%的甲酰胺中通過5%聚丙烯酰胺凝膠電泳對放射性標記的轉(zhuǎn)錄本進行分級分離。核酶轉(zhuǎn)錄本受到深度水解(主要在“3′外顯子”連接處)。而核酶原則明顯地很少反應(yīng)。
圖16顯示了CAT-LacZ核酶原的核糖核酸內(nèi)切酶活性。用ScaI切割含有CAT-LacZ核酶和核酶原序列的質(zhì)粒，并用T7或SP6 RNA聚合酶進行轉(zhuǎn)錄。在40mM Tris-HCl(PH7.5)、6mM MgCl2、2mM亞精胺、10mM NaCl、2mM GTP中將轉(zhuǎn)錄本與放射性標記的CAT RNA(由T7 RNA聚合酶自PuvⅡ切割的質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄)一起分別于37℃、45℃和50℃保溫30分鐘。然后在7M尿素和25%甲酰胺中通過5%聚丙烯酰胺凝膠電泳對產(chǎn)物進行分級分離，并放射自顯影。由RNA介導(dǎo)的173核苷酸CAT RNA的切割產(chǎn)生分別為76和97個核苷酸的5′和3′片段。
圖17顯示了用于核酶原設(shè)計的“野生型”和修飾過的螺旋p8，它具有圖示的可能的堿基配對。與相應(yīng)核酶原的“反義”部分互補的堿基以黑體形式表示。在每一螺旋邊列出了互補堿基的數(shù)目。螺旋由相應(yīng)的核酶轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性控制，如同通過體外轉(zhuǎn)錄過程中“3′外顯子”水解程度所測定的一樣。
圖18顯示了GAL4-DTA核酶原的穩(wěn)定性。用XhoI使含有核酶和核酶原序列的質(zhì)粒開環(huán)，并利用T7 RNA聚合酶進行轉(zhuǎn)錄。將轉(zhuǎn)錄本于50℃在40mM Tris-HCl(PH7.5)、6mM MgCl2、2mM亞精胺、10mM NaCl、1mM GTP中保溫60分鐘，然后在7M尿素及25%甲酰胺中通過5%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分級分離，并進行放射自顯影。在上述條件下核酶轉(zhuǎn)錄本大量水解，而核酶原1水解較少，核酶原2則很穩(wěn)定。
1、定義在以下的敘述中，使用了重組DNA(rDNA)技術(shù)領(lǐng)域所廣泛利用的各種術(shù)語。為了對本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求書(包括這些術(shù)語的給定范圍)有一個清楚和一致的理解，下面對其進行定義。
核酶遺傳上具有催化活性的RNA分子。
轉(zhuǎn)拼一種遺傳操作形式，由此，第一多核苷酸的核酸序列被共同線性連接至或插入至第二核苷酸的序列中，并保留了這些多聚核苷酸之間的3′→5′磷酸二酯鍵。“定向”轉(zhuǎn)拼或“底物特異性”轉(zhuǎn)拼指需要特定RNA(即專用于拼接轉(zhuǎn)換序列的RNA)作為轉(zhuǎn)拼反應(yīng)底物的轉(zhuǎn)拼反應(yīng)。如果設(shè)計出針對于相應(yīng)套RNA上出現(xiàn)的靶序列的核酶或核酶原，則定向轉(zhuǎn)拼可作用于一個以上的RNA。
靶RNA作為本發(fā)明核酶或核酶原催化活性底物的RNA分子。
表達盒為本發(fā)明核酶或核酶原的表達提供所需序列的遺傳序列。
穩(wěn)定將序列“穩(wěn)定地”插入基因組是指以導(dǎo)致該序列在該基因組的拷貝中遺傳的方式進行插入。
可操縱的連接指將一序列與另一序列相連以改變該序列功能的發(fā)揮的連接。例如，通過將核酶或核酶原編碼序列可操縱地連接于啟動子，就可將核酶或核酶原編碼序列的表達置于該啟動子的控制之下。如果啟動子功能的誘導(dǎo)導(dǎo)致核酶或核酶原編碼序列的轉(zhuǎn)錄且如果這兩個序列之間鍵合的性質(zhì)沒有(1)導(dǎo)致移碼突變的引入(2)影響指導(dǎo)核酶表達的表達調(diào)節(jié)序列的能力，則可將這兩個核酸序列(如核酶或核酶原編碼序列及在編碼序列5′端的啟動子區(qū)序列)稱作被可操縱的連接。因此，如果啟動子能夠引起該核酸序列的合成，則啟動子區(qū)是與核酸序列可操縱地連接的。
Ⅱ.本發(fā)明核酶的操縱本發(fā)明的轉(zhuǎn)拼核酶、核酶原和方法首次提供了能夠定向轉(zhuǎn)拼至任何RNA序列，尤其是成熟(不含內(nèi)含子)的mRNA中的核酶。這里所述的與靶的互補性得到延長的轉(zhuǎn)拼核酶與現(xiàn)有技術(shù)中所述的得自嗜熱四膜蟲的核糖核酸內(nèi)切酶活性極不相同。本發(fā)明核酶互補性的增加提高了它對靶的親和性和特異性，且該互補性并不是催化活性不可缺少的部分。另外，在無變性劑和含有高濃度Mg++的情況下切割有效而精確地發(fā)生。
這里所述的設(shè)計轉(zhuǎn)拼核酶的準則是保守的，它基于Ⅰ組自拼內(nèi)含子的突出性質(zhì)，其目的是為任何定向轉(zhuǎn)拼核酶的設(shè)計提供一個總方案。因此，這里所提出的準則并不限于嗜熱四膜蟲前mRNA的Ⅰ組內(nèi)含子，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)這些準則和已有知識設(shè)計出具有其它的Ⅰ組內(nèi)含子的本發(fā)明核酶。
在下面的嗜熱四膜蟲染色體外rDNA序列中，天然嗜熱四膜蟲核酶(內(nèi)含子序列)位于53-465堿基之間。
TGACGCAATT CAACCAAGCG CGGGTAAACG GCGGGAGTAA CTATGACTCTCTAAATAGCA ATATTTACCT TTGGAGGGAA AAGTTATCAG GCATGCACCTCCTAGCTAGT CTTTAAACCA ATAGATTGCA TCGGTTTAAA AGGCAAGACCGTCAAATTGC GGGAAAGGGG TCAACAGCCG TTCAGTACCA AGTCTCAGGGGAAACTTTGA CATGGCCTTG CAAAGGGTAT GGTAATAAGC TGACGGACATGGTCCTAACC ACGCAGCCAA GTCCTAAGTC AACAGATCTT CTGTTGATATGGATGCAGTT CACAGACTAA ATGTCGGTCG GGGAAGATGT ATTCTTCTCATAAGATATAG TCGGACCTCT CCTTAATGGG AGGTAGCGGA TGAATGGATGCAACACTGGA GCCGCTGGGA ACTAATTTGT ATGCGAAAGT ATATTGATTAGTTTTGGAGT ACTCGTAAGG TAGCCAAATG CCTCGTCATC TAATTAGTGACGCGCATGAA TGGATTA [SEQ ID NO.1](Kan，N.C. et al.，Nucl.Acids Res. 102809-2822(1982)).
如這里所述，利用該內(nèi)含子的催化核心對本發(fā)明的定向轉(zhuǎn)拼核酶進行操縱。利用已知方法可分離出內(nèi)含子及其催化核心。內(nèi)含子的催化核心(即平頭內(nèi)含子)與全長內(nèi)含子的不同僅在于它在ScaI位點被剪平，從而除去了內(nèi)含子的最后5個核苷酸。該平頭內(nèi)含子RNA可按已知技術(shù)制備或通過商業(yè)途徑以藥盒的形式得到，例如購自US Biochemical，Clevelend，OH的產(chǎn)品＃72000(RNAzymeTMTel 1.0kit)。該US Biochemical kit提供了核酶以及使用方法。可利用轉(zhuǎn)錄的Tet.1 cDNA作為如下所述的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)突變的底物以產(chǎn)生合成的轉(zhuǎn)拼酶。
本發(fā)明核酶的底物特異性(即核酶“對準”作為底物的特定RNA的能力)是通過將特異于靶(底物)RNA的互補序列融合于核酶的5′末端而產(chǎn)生的。
本發(fā)明核酶的定向轉(zhuǎn)拼特異性(即利用靶RNA的序列轉(zhuǎn)拼所需外源序列的特異性)是通過在核酶的3′端產(chǎn)生新的3′外顯子而獲得的。下面提供了設(shè)計的詳情。
為了改變Ⅰ組內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)和催化性質(zhì)，用外顯子序列取代該內(nèi)含子的側(cè)翼序列以使得僅保留了內(nèi)含子的催化核心(核酶)。所產(chǎn)生的修飾過的核酶能夠與底物RNA進行轉(zhuǎn)拼反應(yīng)。當將平末端形式的內(nèi)含子(即催化“核心”，在ScaI位點處平切以除去內(nèi)含子的最后5個核苷酸)與天然核酶5′拼接連接處相應(yīng)的序列一起保溫時，該位點按與拼接第一步相同的方式進行鳥苷依賴性切割。
對本發(fā)明的核酶進行操縱需要考慮到以下四個準則。
首先，拼接位點必須選擇在靶RNA內(nèi)。在最后的轉(zhuǎn)拼復(fù)合物中，只有P1雙螺旋的5′部分受靶RNA的作用。在緊接所需拼接位點的5′端僅需要唯一的一個保守殘基(尿嘧啶)，這是對靶RNA序列的唯一要求。對靶RNA沒有天然結(jié)構(gòu)要求。所作用的可能是成熟的mRNA，并在細胞質(zhì)中完成轉(zhuǎn)拼反應(yīng)，而不是在細胞核中作用于前mRNA。從而避免了對細胞核中高濃度核酶的需要。
其次，在選定了特定的靶序列后，必須將補償序列更換加至核酶的5′部分，以在靶和核酶RNA之間形成合適的螺旋P1。所非常需要的是，螺旋P1應(yīng)在預(yù)期的5′拼接位點處含有UG堿基對并應(yīng)位于從螺旋的底部開始的第4、第5(優(yōu)選)或第6位(Doudna，J.A.，et al.，“RNA Structure，Not Sequence Determines The 5′Splice-Site Specificity of a Group I Intron，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 867402-7406(1989)，在此引用以作參考))。對于天然嗜熱四膜蟲內(nèi)含子，P1比預(yù)期的5′拼接位點延長3個堿基對，并且在一優(yōu)選實施方案中，它在本發(fā)明的轉(zhuǎn)拼核酶中被維持。為使轉(zhuǎn)拼有效，底物和核糖核酸內(nèi)切內(nèi)含子RNA必須進行堿基配對的形成螺旋P1，并帶有所產(chǎn)生的變位UG堿基對。靶RNA的切割發(fā)生在緊接UG堿基對3′端的磷酸二酯鍵處。系統(tǒng)發(fā)育比較和突變分析表明，只要螺旋P1的堿基配對得以維持，緊接5′拼接位點處保守尿嘧啶殘基的序列的性質(zhì)對催化并不重要。
第三，必須選擇3′拼接位點側(cè)翼的外顯子序列，并根據(jù)需要在核酶的5′部分進行調(diào)整以形成穩(wěn)定的P10螺旋。盡管P10螺旋在某些情況下可以省卻，但它的存在可增強拼接，且在本發(fā)明核酶的優(yōu)選實施方案中保留了P10螺旋(Suh，E.R.et al.，“Base pair-ing Betueen The 3′ Exon And An Internal Guide Sequence Increases 3′ Splice Site Specificity in theTetrahymena Self-Splicing rRNA Intron，”Mol.Cell.Biol.102960-2965(1990))。螺旋P1和P10沿嗜熱四膜蟲內(nèi)含子內(nèi)含子IGs重疊且緊接5′和3′拼接位點的第二和第三個殘基與IGS中的相同殘基互補(圖2)。雖然這一點可能有某些優(yōu)越性，但許多天然Ⅰ組內(nèi)含子并不受這一約束。因此，對3′外顯子序列的選擇主要是出于對實驗的考慮。這種考慮反映了在選擇拼接位點上的廣泛靈活性。例如，如果需要將兩種序列在某一特定位點進行連接，則該位點處的序列不能因轉(zhuǎn)拼而突變或發(fā)生其它變化。如果重疊序列不另外對所需拼接位點進行調(diào)節(jié)P1或P10均可被縮短。
選擇3′拼接位點所需要的序列似乎主要位于內(nèi)含子(核酶)本身的結(jié)構(gòu)中，其中包括螺旋P9.0和鄰接3′端的劃定3′內(nèi)含子邊界的鳥苷殘基。P9.0完全包含在內(nèi)含子序列中并幫助確定鄰接的3′拼接位點。為設(shè)計轉(zhuǎn)拼，P9.0螺旋及內(nèi)含子中其余的功能RNA成分未被改變。P9.0螺旋的結(jié)構(gòu)特征是已知的(Michael，F(xiàn).et al.，“The Guanosine Binding Site of the Tetrahymona Ribozyme”Na-ture342391-395(1989))。但是，3′外顯子中的側(cè)翼序列是形成螺旋P10和有效拼接所必需的，如同突變分析所顯出的一樣。
第四，將互補序列區(qū)置于轉(zhuǎn)拼核酶的5′末端以增加其對靶RNA的親和性和特異性。如這里所示，使用了約40個殘基的任意長度。只要不影響所需效果也可使用其它長度。
例如，由如下嗜熱四膜蟲自拼內(nèi)含子開始
(在上圖以及整個申請文本的其它核酶圖中，“1”和“2”分別表示第1和第2拼接位點)。
(1)在選定的靶RNA內(nèi)尿嘧啶殘基的相鄰處選擇“5′”位點。引起互補性的序列與引起P1螺旋形成的序列并不是緊密相連，而是分開的，例如被也引起P10形成的5個核苷酸所隔開;
(2)將與選定的RNA互補的序列融合至自拼Ⅰ組內(nèi)含子的5′部分。核酶和靶RNA之間的堿基配對導(dǎo)致螺旋P1的形成;
(3)將選定的“3′外顯子”融合至核酶的3′部分，并維持保守的螺旋P10;及
(4)如果需要增加對靶RNA的親和性，將延長序列互補性的部分融進核酶的5′部分以形成30-40個堿基對。
所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)拼核酶與其靶RNA的排列用下圖顯示。頂上行表示靶RNA序列。核酶序列在其下排列，在其下兩行5′和3′以及核酶的P1和P10的核苷酸雜交的區(qū)域內(nèi)可看到一連續(xù)序列。
按照本發(fā)明所設(shè)計的轉(zhuǎn)拼核酶將轉(zhuǎn)拼幾乎任何RNA序列至任何RNA靶上。并不需要使該靶含有內(nèi)含子序列或者使該核酶為靶序列中的內(nèi)含子。例如，用于這一設(shè)計的方案可包括(1)鑒定所需的靶RNA，(2)對該所需的靶RNA或其一部分進行克隆和/或序列分析，(3)篩選轉(zhuǎn)拼至靶RNA中去的所需編碼序列，(4)利用這里所述的準則構(gòu)建能夠與該靶雜交的本發(fā)明核酶，(5)證實本發(fā)明的核酶將利用該靶作為所需特定轉(zhuǎn)拼反應(yīng)的底物，(6)將核酶插入至所需宿主細胞中。
對靶RNA的選擇將反映出所需轉(zhuǎn)拼反應(yīng)的目的。如果反應(yīng)的目的是滅活特定的RNA，則該RNA必須在破壞由該RNA編碼的所有功能肽區(qū)的位置以及在不導(dǎo)致不需要的遺傳序列連續(xù)表達的位置被轉(zhuǎn)拼。如果存在一個以上的編碼該RNA的基因的等位基因，則所設(shè)計的核酶最好能夠在所有表達形式所共有的位點滅活靶RNA?；蛘撸o細胞提供一個以上的核酶，而每一核酶被設(shè)計成滅活靶RNA的特定等位基因的形式。
當僅需要滅活靶RNA而不需要表達新的所需RNA序列時，并不需要由核酶代表的外源RNA產(chǎn)生能夠被宿主細胞翻譯的序列，且可利用含有翻譯終止密碼子的序列作為平末端內(nèi)含子，例如在ScaI位點切平的內(nèi)含子核酶。
如果轉(zhuǎn)拼反應(yīng)的目的是為宿主細胞提供遺傳特性，則對靶RNA的選擇將反映出所需遺傳特性的表達方式。如果需要使遺傳特性被宿主連續(xù)表達，那么靶RNA也應(yīng)被連續(xù)表達。如果需要使遺傳特性僅在所需的生長、內(nèi)分泌或環(huán)境條件下進行選擇性表達，那么靶RNA也應(yīng)在同樣條件下被選擇性地表達。
如果核酶的底物并不另外存在于宿主中，則不需要使核酶本身的表達專門限于在所需的生長、內(nèi)分泌或環(huán)境條件下，因為核酶本身并不被宿主轉(zhuǎn)譯。因此，在發(fā)生轉(zhuǎn)拼行為之前由本發(fā)明核酶所代表的RNA編碼的序列并未在宿主中被翻譯，且該轉(zhuǎn)拼行為可被宿主中核酶底物的表達所控制。
如果需要的話，可對核酶的表達進行操縱，使其發(fā)生應(yīng)答于誘導(dǎo)調(diào)節(jié)的靶表達的相同因素，或?qū)嗣傅谋磉_進行操縱以產(chǎn)生另一水平的調(diào)節(jié)，使得轉(zhuǎn)拼行為的發(fā)生僅限于在某些條件下，在該條件下核酶和靶均在細胞中僅被不同因素所選擇性地誘導(dǎo)，而這些因素的結(jié)合則是不希望有的行為。這種調(diào)節(jié)將使得宿主細胞在核酶自身不被共同表達的條件下表達核酶靶。
與靶RNA雜交的核酶區(qū)的序列是由靶RNA的序列決定的。靶RNA的序列是在克隆編碼該RNA的序列之后或在對由該靶RNA編碼的多肽進行序列分析并由此推斷出編碼這種肽的RNA序列之后而確定的?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的克隆技術(shù)對編碼靶RNA的序列進行克隆。
可被轉(zhuǎn)拼到靶RNA中的預(yù)期序列(在此稱為“轉(zhuǎn)拼序列”)的選擇可體現(xiàn)轉(zhuǎn)拼的意圖。如果期望一種不導(dǎo)致新的基因序列表達的轉(zhuǎn)拼行為，則轉(zhuǎn)拼序列不需要編碼可轉(zhuǎn)譯的蛋白質(zhì)序列。如果期望一種確實可導(dǎo)致某一新的基因序列，特別是新的肽或蛋白質(zhì)序列表達的轉(zhuǎn)拼行為，則轉(zhuǎn)拼序列可進一步提供轉(zhuǎn)譯終止密碼子，和RNA在宿主細胞內(nèi)正確轉(zhuǎn)譯加工所必需的其它信息。如果期望轉(zhuǎn)拼行為的結(jié)果是產(chǎn)生一種特定的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，則在所產(chǎn)生的融合體中保持該氨基酸解讀密碼將是必不可少的。
對本發(fā)明核酶的特異性的鑒定和確證可通過檢測推斷核酶僅在預(yù)期的靶序列存在下催化預(yù)期的轉(zhuǎn)拼反應(yīng)的能力來完成。如果存在的唯一RNA序列是該核酶不應(yīng)對其敏感(或不太敏感)的非靶序列，則轉(zhuǎn)拼反應(yīng)不應(yīng)發(fā)生?？山柚谝环N標記物進行這樣的定性，以便可更容易地監(jiān)測正確(或不正確)的核酶活性。在多數(shù)情況下，體外檢測對抗其預(yù)期靶物的核酶，然后用它轉(zhuǎn)化宿主細胞以研究其體內(nèi)作用就足夠了。
當需要除去宿主的RNA時，這樣的刪除應(yīng)該是盡可能完全的。當需要給宿主細胞提供新的基因序列時，本發(fā)明的轉(zhuǎn)拼反應(yīng)不需要是完全的。本發(fā)明的優(yōu)點在于，根據(jù)從這樣的基因序列轉(zhuǎn)譯的肽的生物學活性，轉(zhuǎn)拼活動的效率實際上可以是相當?shù)偷?，只要發(fā)生的轉(zhuǎn)拼可足以為預(yù)期的目的提供給宿主足夠的mRNA，從而編碼多肽即可。
本發(fā)明的核酶在宿主細胞中的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在核酶基因引入到宿主細胞之后。如果不需要由宿主細胞穩(wěn)定保持該核酶，這樣的核酶就可被化學合成或酶促合成并用機械方法，例如顯微注射、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電擊、或磷酸鈣沉淀提供給宿主。而當需要穩(wěn)定保持編碼該核酶的基因時，可通過將該核酶的至少一個DNA拷貝穩(wěn)定地插入宿主的染色體，或通過提供一種該核酶的DNA拷貝于一個由宿主細胞穩(wěn)定地保持的質(zhì)粒上而實現(xiàn)。
最好是將本發(fā)明的核酶插入宿主的染色體作為表達暗盒的一部分，該暗盒可提供轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)成分，這些成分可控制核酶在宿主細胞中的轉(zhuǎn)錄。這樣的成分可包括，但不一定局限于，啟動子成分、增強子或UAS成分、和轉(zhuǎn)錄終止信號。不轉(zhuǎn)譯核酶時，多聚腺苷酸化不是必需的。然而，對于編碼被轉(zhuǎn)拼的成分的序列，可提供這樣的多聚腺苷酸化信號。
其編碼序列已插入宿主染色體的核酶的表達受與核酶編碼序列可操縱地連接的啟動子序列所控制?？芍笇?dǎo)核酶表達的啟動子可以是任何在宿主細胞中起作用的啟動子，原核啟動子是在原核細胞中所需要的，真核啟動子則是在真核細胞中所需要的。啟動子由分立的單元所組成，這些單元可指導(dǎo)啟動子在宿主細胞中的轉(zhuǎn)錄激活和/或阻遏。在核酶的啟動子中可使這樣的單元混合和相配以便為核酶在宿主中的適當表達提供條件。真核啟動子可以是任何可在真核細胞中發(fā)揮作用的啟動子，特別是任何具有RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、或Ⅲ特異性的啟動子。如果需在多種真核宿主細胞中表達核酶，則應(yīng)選擇可在多種真核宿主細胞中發(fā)揮作用的啟動子，例如rRNA或tRNA啟動子，或被廣泛表達的mRNA的啟動子，例如肌動蛋白基因，或糖酵解基因的啟動子。如果只需在某一種細胞或組織類型中表達該核酶，則應(yīng)選擇只在該細胞或組織類型中發(fā)揮作用的細胞特異性(或組織特異性)啟動子成分。
轉(zhuǎn)拼反應(yīng)無論是在體外還是在體內(nèi)進行在化學上都是相同的。但在體內(nèi)，由于輔助因子通常已存在于宿主細胞中，所以靶物和核糖酶的存在將足以導(dǎo)致轉(zhuǎn)拼。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)拼核酶和方法可用于產(chǎn)生適用于靶細胞的基因修飾，和/或細胞死亡的基因活性。例如，本發(fā)明的轉(zhuǎn)拼反應(yīng)可用于將具有毒性的蛋白質(zhì)引入所需細胞，細胞的感受性將由靶RNA和支配核酶的表達的調(diào)控物的選擇來決定。例如，可操縱一種能使編碼某一毒性蛋白的FNA序列轉(zhuǎn)位的核酶，以便該核酶的表達將取決于可操縱連接的啟動子的特性。在一個非常優(yōu)選的實施方案中，白喉毒素肽A是由轉(zhuǎn)位到宿主內(nèi)預(yù)期靶物中的那部分核酶所編碼的。核酶和白喉毒素肽A鏈的有條件表達可導(dǎo)致宿主細胞的死亡。其它有用的肽毒素包括蓖麻毒素、外毒素A，和皰疹胸苷激酶(E-vans，G.A.，Genes&Dev.3259-263(1989))。此外，各種水解酶具有破壞細胞代謝的潛能。例如，真菌的核糖核酸酶可用于引起植物的雄性不育(Mariani，C.et al.，Nature 347737-741(1990)。由于靶RNA的有限表達可破壞特定的組織。再者，如果用病毒RNA作為靶物，則可操縱新形式的病毒抗性或治療。
可用本發(fā)明的核酶設(shè)計一種控制組織特異性基因表達和/或用于異位切除的二元系統(tǒng)。例如，可以使用利用P-成分增強子捕集載體以組織特異性和空間特異性方式表達酵母轉(zhuǎn)錄激活子GAL4果蠅品系。任何轉(zhuǎn)錄激活子都可用來代替GAL4，本發(fā)明并非只限于GAL4。可將一種編碼能夠轉(zhuǎn)拼DTA序列的融合核酶的基因置于GAL4-UAS啟動子的控制之下并以穩(wěn)定遺傳的方式插入果蠅，這樣的核酶在無GAL4存在下不能在果蠅中得以表達。因此，遺傳上攜帶這一核酶構(gòu)建物的果蠅宿主與以組織特異性方式表達GAL4的果蠅宿主雜交可導(dǎo)致子代隨機編碼，當GAL4表達被誘導(dǎo)時，顯示出與GAL4表達方式相似的細胞死亡方式。
此外，通過將核酶作為與GAL4 mRNA轉(zhuǎn)拼的對象，該核酶的拼接活性可鈍化GAL4的表達并可自我調(diào)節(jié)核酶的表達。
核酶原如上所述，轉(zhuǎn)拼核酶由三種融合序列成分所組成，即與靶RNA互補的5′“反義”區(qū)，基于自拼Ⅰ組內(nèi)含子的催化區(qū)，和3′“外顯子”序列。5′區(qū)可與所選靶RNA進行堿基配對，使之與Ⅰ組內(nèi)含子的催化序列接近。Ⅰ組內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)可提供一種適于催化靶RNA與3′“外顯子”序列精確拼接的化學環(huán)境。然而，在無合適的靶RNA存在下，該核酶序列仍能催化在3′“外顯子”連接處的切割(相似的水解可見于Ⅰ組自拼內(nèi)含子(Zaug et al.，Science231470-475(1986))，并且可能能通過核酶與異源RNA序列(可包括它們自身)的瞬時堿基配對催化不正常的拼接活動。這樣的副反應(yīng)和不正常的拼接活動是多余的，或許是有害的。例如，如果要將轉(zhuǎn)拼用于毒素在體內(nèi)的條件釋放，則不正常的轉(zhuǎn)拼可能會導(dǎo)致有毒活性的不期望表達。在3′“外顯子”連接處的自發(fā)性切割會降低轉(zhuǎn)拼的效率。
為了有助于避免這些問題，已構(gòu)建了核酶原形式的轉(zhuǎn)拼RNA，例如其中螺旋P8被破壞。構(gòu)建的核酶原含有額外的自我互補序列，這些序列可導(dǎo)致核酶催化中心誤折。在預(yù)期靶RNA不存在時，核酶原是無活性的;只有在核酶和靶RNA進行堿基配對一伴隨著對核酶內(nèi)二級結(jié)構(gòu)干擾的取代之后才能形成活性形式。核酶原是指在靶RNA不存在下無催化活性的種類，從而可消除體外和體內(nèi)多余的自我切割、自拼和不正常的轉(zhuǎn)拼反應(yīng)(圖12)。
這里所述的核酶原是構(gòu)象受到破壞的且因此成為無轉(zhuǎn)拼活性的形式。該核酶原具有很少的自我切割活性。它們只能通過與靶RNA特異地相互作用重新活化，因而是不大可能催化非預(yù)期靶RNA的轉(zhuǎn)拼的底物活化核酶。期望將轉(zhuǎn)拼核酶用于新基因活性在體內(nèi)的釋放，在不希望的副反應(yīng)或不正常拼接的程度上的任何減少都是可取的，而且可能是必需的。
盡管對于轉(zhuǎn)拼核酶原這里已舉例說明了螺旋P8的破壞，但也可能已應(yīng)用了催化活性所需的其它螺旋。
以這樣的方式，即只與預(yù)期的底物RNA進行堿基配對可形成活性核酶，破壞催化上重要結(jié)構(gòu)的構(gòu)象的同樣方法可應(yīng)用于其它核酶的設(shè)計。例如，“錘頭”型核糖核酸內(nèi)切酶的環(huán)序列(Haseloff et al.，Nature334585-591(1988))可被擴展并使之與核酶的“反義”臂之一互補一與螺旋P8的以上修飾相似。只有在與所選的靶RNA進行堿基配對，對二級結(jié)構(gòu)的破壞被取代，和催化所需的干環(huán)結(jié)構(gòu)重新形成之后才會顯示出核糖核酸內(nèi)切酶活性。這樣將有效地增強核酶對其靶物的特異性。
此外，核酶原的激活不需依賴于與底物本身進行堿基配對。附加的堿基配對或RNA與蛋白質(zhì)間的相互作用可能是活性核酶復(fù)合物的形成所需的。這些額外組分的可得性將決定核酶的活性，并可被用來改變核酶的選擇性。
本發(fā)明的核酶或核酶原可被引入任何原核或真核宿主細胞，特別是植物或哺乳動物宿主細胞，尤其是人的細胞，既可是細胞培養(yǎng)物也可是活體細胞，所用的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的適合于上述宿主的方法。也可操縱本發(fā)明的核酶以破壞病毒。在一個優(yōu)選的實施方案中，在病毒侵襲之前以一種遺傳上穩(wěn)定的方式將本發(fā)明的核酶或核酶原提供給宿主細胞。合適病毒的感染，或潛伏性病毒在這種宿主細胞中的表達(導(dǎo)致宿主細胞中出現(xiàn)核酶或核酶原的靶RNA)，將通過可引起病毒感染細胞死亡的轉(zhuǎn)拼激發(fā)該核酶的催化活性和病毒RNA靶的破壞和/或毒素的產(chǎn)生。在另一個實施方案中，可操縱核酶或核酶原并包裝到病毒自身中。這樣的實施方案特別適用于為研究目的所用病毒的設(shè)計，其中設(shè)計出的核酶或核酶原可破壞特異性病毒RNA的功能，因而可在這種RNA不存在時研究病毒的功能。攜帶核酶的病毒也可用作轉(zhuǎn)染具有所需核酶或核酶原活性的宿主細胞的載體。
可利用本發(fā)明的核酶或核酶原在農(nóng)學重要性物種中操縱雄性或雌性不育。例如，可通過將TA29或TA13 mRNA(煙草花藥特異性基因;Seurinck，J.et al.，Nucl.Acids Res.183403(1990))作為對象，用可將DTA3′外顯子轉(zhuǎn)拼到那些靶物中的本發(fā)明的核酶或核酶原操縱煙草的雄性不育。
可通過用本發(fā)明的核酶或核酶原對組織進行選擇性破壞或修飾控制農(nóng)作物的形式。例如，可通過將種子貯存蛋白mRNA作為對象，用可將DTA3′外顯子轉(zhuǎn)拼到該靶物中的本發(fā)明的核酶或核酶原獲得無籽果實。
可通過病毒特異性核酶或核酶原的表達殺死感染細胞而保護轉(zhuǎn)基因植物抵抗感染。這將成為一種人工形式的“超敏反應(yīng)”。例如，可用本發(fā)明的核酶或核酶原(可將DTA3′外顯子轉(zhuǎn)拼到靶物中)以黃瓜花葉病毒外殼蛋白mRNA作為對象。
經(jīng)引入轉(zhuǎn)拼核酶或核酶原可使微生物群體變得耐受特異性病原體。例如，通過將細菌毒素基因或由本發(fā)明的核酶或核酶原所提供的3′外顯子編碼的水解酶作用于噬菌體RNA可使干酪產(chǎn)生細菌耐受噬菌體感染。例如在噬菌體感染后通過引起過早溶菌現(xiàn)象而干擾噬菌體復(fù)制。
可構(gòu)建通過轉(zhuǎn)拼釋放有毒活性的病毒病原體。以這種方式，可以特定的細胞類型作為切除的對象，如進行癌癥或病毒治療。例如，可通過攜帶DTA3′外顯子的本發(fā)明的核酶或核酶原以HIV mRNA作為對象進行病毒或脂質(zhì)體釋放。
下列實施例只是為說明目的，不能看作是對本發(fā)明范圍的限制。
實施例1CAT-LacZ轉(zhuǎn)拼核酶的構(gòu)建和定性Ⅰ.本發(fā)明核酶的PCR擴增和克隆按照上述指導(dǎo)路線，設(shè)計一種轉(zhuǎn)拼融合核酶，該酶可將大腸桿菌β-半乳糖苷酶(LacZ)mRNA的部分氨基末端編碼序列拼接到氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)mRNA中的某一位點上(圖3)。將側(cè)接嗜熱四膜蟲(T.thermophila)核酶核心和3′外顯子的新序列的各區(qū)域合成為寡核苷酸。然后通過連續(xù)聚合酶鏈反應(yīng)，用合成連接寡核苷酸作為引物與核酶和β-半乳糖苷酶DNA模板一起裝配完整的核酶序列(盡管存在其它可利用的方法，但該方法是最便利的)。
為了構(gòu)建一種能夠?qū)ⅵ?半乳糖苷酶(LacZ)α-肽編碼序列拼接到氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)的5′編碼序列中的某一位點上的核酶，合成了三種寡核苷酸。
寡核苷酸15’－GGCCA AGCTT CTTTA CGATG CCATT GGGAT ATATCAACGG TGGTA TAAAC CCGTG GTTTT TAAAA GTTAT CAGGCATGCA CC-3’[SEQ ID NO.2]寡核苷酸25’－GATTA GTTTT GGAGT ACTCG TACGG ATTCA CGGCCGTCGT TTTAC AA－3’ TTTAC AA-3’[SEQ ID NO.3]寡核苷酸35’－GGCCG AATTC TTACA ATTTC CATTC AGGCT GCGCAACTGT TGG－3’ [SEQ ID NO.4]將寡核苷酸2和3(各200pmoles)與0.1μg PvuⅡ切割的pGEM4 DNA(含有LacZ α-肽序列)合并，以100μl的體積進行PCR擴增50mM KCl.
10mM Tris-HCl PH8.3，1.5mM MgCl2，0.4mM dNTPs0.1%明膠，和5U TaqI DNA聚合酶，
并于94℃下保溫1分鐘，50℃下保溫2分鐘，72℃下保溫2分鐘，這一保溫循環(huán)共進行30次。
質(zhì)粒pGEM4可購自美國Promega公司(Madison WI，USA)。
用低膠凝溫度瓊脂糖電泳法純化210堿基對的擴增產(chǎn)物，并用作第二輪PCR擴增的引物。
在第二輪PCR擴增之后，將2.0μg 210堿基對的擴增產(chǎn)物、200pmoles寡核苷酸1和0.1μg含有嗜熱四膜蟲IVS的450堿基對的片段混合并采用上述條件進行PCR擴增。用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和Hind Ⅲ消化所得到的660堿基對的產(chǎn)物，并克隆到質(zhì)粒載體pGEM4中。CAT-LacZ α-肽核酶DNA序列的完整序列用SEQ ID No.5表示，并示于圖3B。
用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)(Maniatis，Molecular Cloning，A Laboratory Guide，2nd edition，1989，Cold Spring Harbor Laboratory，Publishers)，將含有克隆序列的克隆載體轉(zhuǎn)化到細菌宿主XL1/Blue(Strategene，La Jolla;California)中并在那里增殖。然而，任何能夠穩(wěn)定維持該載體的細菌宿主均可使用，例如JM109。
為了進一步分析，可用本領(lǐng)域中公知的技術(shù)(Maniatis，Molecular Cloning，A Laboratory Guide，2nd，edition，1989，Cold Spring Harbor Laboratory，Publishers)從宿主細胞中提取質(zhì)粒。
Ⅱ.克隆核酶和靶RNA的體外轉(zhuǎn)錄采用標準方法，從細菌宿主中純化克隆序列并用不切割核酶序列的限制性核酸內(nèi)切酶(例如，EcoRI)將質(zhì)粒線性化，用T7RNA聚合酶進行轉(zhuǎn)錄，體積為100μl，含有5μg線性質(zhì)粒DNA，40mM Tris-HCl PH7.5，6mM MgCl2，2mM亞精胺，10mM NaCl，10mM DTT，1mM NTPs(含有20μCi〔α-32P〕UTP，如果需要被標記的RNA轉(zhuǎn)錄本)，100U RNA酶，和50U T7RNA聚合酶，反應(yīng)物在37℃下保溫2小時。
使用前用5%聚丙烯酰胺凝膠電泳法(TBE，7M尿素凝膠)純化RNA轉(zhuǎn)錄本。含有活性嗜熱四膜蟲IVA序列的RNA在轉(zhuǎn)錄期間經(jīng)歷在3′內(nèi)含子-外顯子連接處某種自發(fā)性切割。經(jīng)電泳純化移出這些片段用于在后面的轉(zhuǎn)拼測定過程中清楚地進行分析。
Ⅲ.體外轉(zhuǎn)拼反應(yīng)條件將靶物和/或轉(zhuǎn)拼核酶在下列條件下保溫0.1-0.5μg RNA組分(其用量取決于實驗的類型，通常核酶的量比靶物量多5倍)，30mM Tris-HCl PH7.5，100mM NaCl，2mM GTP，5mM MgCl2，體積為5μl，42℃下，60分鐘。
用95μl 0.1mM Na2EDTA，200mM NaCl稀釋反應(yīng)物，并用乙醇沉淀，然后在5%含有TBE緩沖液，7M尿素和25%甲酰胺的聚丙烯酰胺凝膠上分析RNA，并放射自顯影。
Ⅳ.核酸內(nèi)切酶解活性的測定核酶和靶物進行堿基配對之后，轉(zhuǎn)拼的第一步是鳥苷介導(dǎo)的在預(yù)定5′拼接位點靶RNA的切割。退火和轉(zhuǎn)拼可在緩沖液如30mM Tris-HCl(PH7.5)，100mM NaCl，5mM MgCl2，2mM GTP中，在42℃下進行。由于3′拼接位點是這一反應(yīng)所必需的，所以平末端轉(zhuǎn)拼核酶應(yīng)表現(xiàn)得如同高度特異性核糖核酸內(nèi)切酶一樣，為了測試這一活性，將上述CAT-LacZ α-肽轉(zhuǎn)拼核酶的縮短了的體外轉(zhuǎn)錄本(SEQ ID No.5和圖3)與CAT mRNA序列一起保溫，CAT-LacZ核酶暗盒在HindⅢ-EcoRI片段上。ScaI切割位點可標明3′拼接位點上游5位堿基。該核酶特異地在所期望的單一位點切割靶RNA以產(chǎn)生所期望大小的片段。
Ⅴ.轉(zhuǎn)拼反應(yīng)為了確證CAT-LacZ α-肽核酶催化3′外顯子序列在5′拼接位點的連接的能力，將不同的形式與放射標記的CAT RNA一起保溫。核酶轉(zhuǎn)錄本由DNA模板合成，它在由核酶核心末端至外顯子序列之間的幾個位置被3′平切。與標記過的CAT一起保溫導(dǎo)致預(yù)期拼接產(chǎn)物的形成，這些產(chǎn)物的長度依3′外顯子序列的長度而異。
此外，一定比例的CAT-LacZ α-肽核酶分子在體外轉(zhuǎn)錄期間經(jīng)歷了在3′拼接位點的自發(fā)性切割，與完整嗜熱四膜蟲內(nèi)含子相似。這些切割形式(在鄰近3′拼接位點的鳥苷殘基處終止)也與CAT RNA一起保溫。在這種情況下，核酶自身可與CAT RNA的3′部分連接，以產(chǎn)生大小約為550個核苷酸的產(chǎn)物。這一反應(yīng)與完整內(nèi)含子的自我成環(huán)相似，同樣的連接反應(yīng)見于其它轉(zhuǎn)拼反應(yīng)。
Ⅵ.轉(zhuǎn)拼的精度將得自CAT-LacZ α-肽轉(zhuǎn)拼反應(yīng)的產(chǎn)物逆轉(zhuǎn)錄，并通過聚合酶鏈反應(yīng)，用兩種與預(yù)定拼接位點任一側(cè)上的序列互補的寡核苷酸通過聚合酶鏈反應(yīng)進行擴增。將擴增的序列克隆并進行序列分析。各個重組體從拼接產(chǎn)物的預(yù)期序列來看都無變異。如對完整內(nèi)含子的研究中所見，拼接似乎是相當精確的。
因此，以上研究表明按照本發(fā)明的指導(dǎo)路線設(shè)計的轉(zhuǎn)拼核酶能夠在體外精確、有效的轉(zhuǎn)拼。
實施例2提供植物病毒抗性的轉(zhuǎn)拼核酶的設(shè)計黃瓜花葉病毒(CMV)是一種有很多已知毒株的廣泛流行的病毒。在RNA3和亞基因組mRNA4所編碼的病毒外殼蛋白順反子的起始區(qū)域中顯示了病毒株的九條序列(SEQ ID Nos.7-25圖4(A)和圖5)。已選出兩個位點，它們保存在序列中，位于外殼蛋白的AUG起始密碼子的下游。用于構(gòu)建能夠?qū)惲涟彼嵬蛔冃虳TA轉(zhuǎn)拼到CMV外殼蛋白mRNA中的核酶的寡核苷酸示于圖4B且在下文中進行了討論。
以圖4C和4D中所示的轉(zhuǎn)拼核酶作用于圖4B中所示的CMV病毒序列，不但會導(dǎo)致CMV RNA分子的切割，而且會導(dǎo)致受感染的細胞中白喉毒素A-鏈的表達?？捎帽绢I(lǐng)域中已知的技術(shù)將圖4所示的轉(zhuǎn)拼暗盒轉(zhuǎn)化到任何CMV感性植物中，并使轉(zhuǎn)基因的子代受到CMV感染。應(yīng)這樣設(shè)計核酶，即病毒感染是引發(fā)通過RNA轉(zhuǎn)拼產(chǎn)生毒素所必需的，因為核酶本身不被轉(zhuǎn)譯。由毒素的表達而造成的被感染細胞的局部死亡可限制病毒在顯示人為超敏反應(yīng)的植物體內(nèi)的復(fù)制和蔓延。
實施例3Gal4-白喉毒素A鏈轉(zhuǎn)拼核酶的構(gòu)建和定性按照本發(fā)明和實施例1所述的方法，已設(shè)計出一種融合核酶，它是一種Gal4-白喉毒素A鏈轉(zhuǎn)拼核酶(圖6)(該核酶的序列用SEQ ID No.6表示)。GAL4-DTA核酶暗盒是SalI-XhoI片段。ScaI位點可標明3′拼接位點上游的5位堿基。這種酶能夠?qū)缀矶舅谹鏈的編碼序列拼接到GAL4 mRNA5′區(qū)的某一位點上。這種轉(zhuǎn)拼活性在體外(如上)和體內(nèi)(見下)均有活性。成功設(shè)計GAL4-DTA核酶，和任何可轉(zhuǎn)拼編碼毒性產(chǎn)物的序列的轉(zhuǎn)拼核酶的主要標準在于不但有效和精確催化轉(zhuǎn)拼，而且毒性產(chǎn)物(如DTA)的表達不在無轉(zhuǎn)拼的情況下發(fā)生。
按照上述設(shè)計構(gòu)建核酶的催化部分，然后分別在GAL4和DTA的5′編碼區(qū)選擇5′和3′拼接位點。3′外顯子序列相應(yīng)于已用于在真核細胞中表達的DTA基因的3′外顯子序列，所不同的是刪除了第一個AUG密碼子和幾個近端氨基酸。原始白喉棒桿菌形式的DTA在這個5′區(qū)也不同，它是利用CUG密碼子啟動轉(zhuǎn)譯。原始DTA序列也含有一個后來不存在的信號肽前導(dǎo)序列。
這些核酶分子可經(jīng)歷在3′拼接位點的自發(fā)性切割。假使DTA的毒性極強，任何釋放的3′外顯子序列都不產(chǎn)生毒性轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物這一點是重要的。3′外顯子在13位含有一個碼組內(nèi)蛋氨酸，設(shè)想它可能會產(chǎn)生一種平頭但有毒性的多肽。為了消除這種可能性，在兩個獨立的核酶構(gòu)建中將野生型序列(Rz-DTAmet)該位置上的蛋氨酸改為異亮氨酸(Rz-DTAile)或亮氨酸(Rz-DTAleu)(圖6)。
實施例4本發(fā)明核酶的體內(nèi)活性Ⅰ.簡介按本文所提供的指導(dǎo)路線設(shè)計的核酶的體內(nèi)活性和這種核酶傳給宿主細胞新的基因活性的能力，用所述的Gal4-白喉毒素A鏈轉(zhuǎn)拼核酶(實施例3和圖6)將高毒性白喉毒素A產(chǎn)物傳給宿主細胞得到了證實。在該系統(tǒng)中，果蠅是選定的宿主，期望在果蠅宿主中以組織特異性方式控制本發(fā)明核糖酶的表達。
白喉毒素是由對B噬菌體為溶源性的白喉棒桿菌分泌的。該毒素以單個多肽形式產(chǎn)生，該多肽經(jīng)蛋白水解產(chǎn)生A和B鏈。A鏈(DTA)含有很強的ADP核糖基酶活性，該活性對真核細胞轉(zhuǎn)譯延伸因子EF-2具有特異性。即使僅有該酶的幾個分子存在就足以在多種真核細胞中引起轉(zhuǎn)譯停止和最終死亡。B鏈允許毒素通過結(jié)合甘露糖殘基附著于細胞表面受體上在胞內(nèi)釋放，被細胞內(nèi)吞并經(jīng)泡囊融合進入細胞質(zhì)。
在B-鏈不存在時，A-鏈在胞外存在時毒性小得多。這一特性，和它的高毒性已提示了它在異位切除實驗中的用途。例如，用視蛋白啟動子引發(fā)在發(fā)育眼球中的表達，已在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達了編碼DTA的序列。產(chǎn)生的小鼠雙目失明，眼球畸形(Breitman，M.L.，Science 2381563-1565(1987))。在其它研究中，進行了小鼠胰腺的切除(Palmiter，R.D.et al.，Cell 50435-443(1987))，Wert，S.E.et al.，Am.Rev.Respir.Dis.141(no.4，part2)A695(1990)描述了通過使用由人表面蛋白C基因(在Ⅱ型肺泡細胞中被表達)的啟動子和5′側(cè)翼序列和DTA基因組成的嵌合基因切除肺泡細胞。
然而，用這種類型的方法，不可能維持或繁殖可能具有更嚴重，或致死性表型的轉(zhuǎn)化生物體。此外，目前未有用完整DTA序列對某些物種(如果蠅)進行轉(zhuǎn)化的報道。在這樣的轉(zhuǎn)化過程中DTA基因的滲漏表達可導(dǎo)致即刻死亡。
Ⅱ.果蠅系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)展了一種靶基因表達的一般方法。首先，該系統(tǒng)可使各個品系迅速產(chǎn)生，其中異位基因表達可涉及不同的組織或細胞類型利用增強子檢測劑技術(shù)(O′Kane，C.J.and Gehring，W.J.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9123-9127(1987);Bellen et al.，Genes and Development 31288-1300(1989);Bier et al.，Genes and Development 31273-1287(1989))以各種方式在胚胎、幼體和成體內(nèi)表達轉(zhuǎn)錄激活子。第二，該方法可在不同的品系中從它的靶基因中分離出激活子，以確保各個親代品系都是活的在一個品系中，激活子蛋白存在，但沒有可激活的靶基因，在第二個品系中，靶基因是不活動的。當使這兩個品系雜交時，只在雜交的子代中激活靶基因，從而使顯性表型(包括致死性)可被方便地研究。
為了只異位表達令人感興趣的基因，需要一種在果蠅中沒有內(nèi)源靶的轉(zhuǎn)錄激活子。一種來自酵母的激活子，Gal4能激活在果蠅中的轉(zhuǎn)錄，但轉(zhuǎn)錄只從具有Gal4結(jié)合位點(Fischer et al.，Nature 332853-865(1988))的啟動子開始。對于靶基因表達，以兩種方式將Gal4限制到特定的細胞或者用特征化果蠅啟動子啟動Gal4轉(zhuǎn)錄，或者將無增強子的Gal4基因隨機整合到果蠅基因組中，使之在多種排列形式的基因組增強子的控制之下。為了測定通過Gal4的轉(zhuǎn)激活，使可表達Gal4的果蠅與其轉(zhuǎn)錄是由Gal4結(jié)合位點(Fischer et al.，Nature 332853-865(1988))啟動的帶有LacZ基因的果蠅雜交。β-半乳糖苷酶只在Gal4先被表達的那些細胞中表達。LacZ的組織特異性和細胞特異性轉(zhuǎn)激活已在Gal4被表達和各種方式被建立的品系中得到了證實。
用該系統(tǒng)，有可能1)將Gal4結(jié)合位點置于任何編碼序列上游;2)只在Gal4被表達的細胞中激活該基因和3)觀察這種異常表達對發(fā)育的影響。在異位表達是致死性的情況下，這種方法可使兩個親代品系(一個表達Gal4，另一個攜帶不活動基因，在它的啟動子中具有Gal4結(jié)合位點)得以穩(wěn)定地繁殖。然后在雜交的子代中研究這些表型。
Ⅲ.載體在這些研究中用作起始材料的載體包括1)pGATB和pGATN(圖9)這些載體可被用于克隆啟動子和無啟動子Gal4基因上游的增強子。
構(gòu)建載體，其中獨特的NotI或BamHI位點被插入Gal4編碼區(qū)的上游。一旦將啟動子連接到Gal4編碼序列上，就可從pH-SREM載體骨架上切下該基因(Knipple and Marsella-Her-rick，Nucl.Acids Res.167748(1988))并將其移入P-成分載體。Ph2啟動子已被克隆(Mismer et al.，Genetics 120173-180(1988))到該載體中并已產(chǎn)生Gal4只在單眼中被表達的果蠅。
2)pGawB這是一種在增強子檢測中使用的Gal4載體。
將無增強子的Gal4基因亞克隆到載體plwB(Wilson et al.，Genes and Development 31301-1313(1989))以產(chǎn)生pGawB。plwB先用HindⅢ消化以除去lacZ基因和P轉(zhuǎn)位酶基因的N末端。用P轉(zhuǎn)位酶基因的TATA盒之后的整個Gal4編碼區(qū)置換這些基因。
3)pUAST(圖10)這個質(zhì)粒被用于克隆Gal UAS下游的編碼序列。
在Gal4 USA(上游激活序列)之后可亞克隆進基因的載體在P成分載體pCaSpeR3(C.Thummel，Univ.of Utah Medical Center，Salt Lake City，Utah，Personal communication)中被構(gòu)建。插入了5個Gal4結(jié)合位點，接著是hsp70TATA盒和轉(zhuǎn)錄起始密碼子，多連接子，和SV40內(nèi)含子和多聚腺苷酸化位點?；蚧騝DNA可被插入的獨特位點包括EcoRI，BglⅡ，NotI，XhoI，KpnI和XbaI。
Ⅳ.果蠅品系本文所述的用于定性在這些研究中所用的果蠅品系的遺傳學技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的(“Genetic Variations of Drosophila melanogaster，”D.Lindsley and E.H. Grell，eds)。
用攜帶△2-3的“跳躍起始子(jumpstarter)”品系調(diào)動p成分轉(zhuǎn)位子，△2-3是在可表達高水平的組成活性轉(zhuǎn)位酶的第三染色體上的缺陷性p成分(Robertson et al.，Genetics 118451-470(1988))。通常用于產(chǎn)生插入品系和制圖的三個原種保藏于果蠅貯存中心(the Drosophila Stock Center，Indiana University De-partment of Biology，Jordan Hall A503，Bloomington，Indiana47405)1yw;+/+;Sb P〔ry+，△2-3J/TM6，Ubx2w;+/+;TM3，Sb/CxD(保藏號3665)3w;Cyo/Sco;+/+(保藏號3666)其中三個染色體的遺傳學特征用分號隔開。因此，例如，在品系1中，第一染色體(X染色體)是黃色和白色純合的(“yw”)，第二染色體是野生型(“+/+”)，第三染色體攜帶殘余基因(“Sb”)，和P成分轉(zhuǎn)位子玫瑰色基因(“ry”)和△2-3，而第二三染色體攜帶平衡器倒位(“/TM6，Ubx)。
Ⅴ.產(chǎn)生Gal4表達模式的方法
A.用于分離轉(zhuǎn)化體的方案將構(gòu)建物注射到由原種產(chǎn)生的胚胎中;
♀♀y w/y w;△2-3，Sb/TM6，Ubx X ♂♂y w/Y;△2-3，Sb/TM6，UbxFO;建立單個品系♀y w/y w;△2-3，Sb/TM6，Ubx X ♂y w/Y;+/+or♂y w/Y;△2-3，Sb/TM6，Ubx X ♀y w/y w;+/+F1;選擇〔w±〕和〔Sb±〕子代并建立原種♀y w/y w;+/TM6，Ubx X ♂ y w/y;+/+or♂y w/y;+/TM6，Ubx X ♀ y w/y w;+/+B.用于跳過無增強子Gal4插入體的方案1.從X-染色體跳躍♀♀ FM3/FM7，w;+/+ X ♂♂ y w/Y;△2-3，Sb/TM6，Ubx♀♀ FM7，w/P[Gal4，w+1
♂♂FM7/Y;△2-3，Sb/+♀♀ FM7，w/P[Gal4，w+];△2-3，Sb/+
♂♂ y w/Y;+/+♀ FM7，w/y w;△2-3，Sb/+ X ♂ y w/Y;+/+選擇〔W+〕和〔B〕子代并建立原種2.從∧2-3-染色體跳躍♀♀ y w/y w x ♂♂ y w/Y;P[Gal4，w+]，△2-3，Sb/+選擇〔w+〕和〔Sb+〕子代并建立原種。
C.染色體分離為了分析插入體的分離，使用兩個原種w;+/+;TM3，Sb/CxD和w;Cyo/Sco;+/+。
方法為了產(chǎn)生大量可以細胞特異性和組織特異性方式表達Gal4的品系，已構(gòu)建了攜帶不同形式的Gal4基因的增強子檢測載體。兩個編碼全長度蛋白質(zhì)或平末端蛋白質(zhì)的基因已被克隆到玫瑰色(ry+)和白色(w+)P成分載體中(P成分載體為修飾形式的plArB和plwB;Wilson et al.，Genes and Development 31301-1313(1989))。用ry+或w+作為篩，已通過引入△2-3基因(Robertson et al.，Genetics 118461-470(1988))調(diào)動了這些載體。為了顯現(xiàn)Gal4的表達方式，使Gal4插入品系與攜帶在Gal4 UAS(Fischer et al.，Nature332853-865(1988))的控制下的lacZ基因的品系雜交。通過用X-半乳糖作為底物的酶測定法，或通過用抗β-半乳糖苷酶的單克隆抗體染色檢查由這些雜交產(chǎn)生的胚胎、幼體和成體中β-半乳糖苷酶的表達。由UAS-lacZ構(gòu)建物編碼的β-半乳糖苷酶位于細胞質(zhì)中。
已篩選出大約500個Gal4插入品系并且已鑒定了可用于激活特定組織中的基因的許多品系，例如鑒定了它們的表皮條紋，中胚層，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)。許多品系可在唾腺以及其它組織中表達β-半乳糖苷酶。在構(gòu)建無增強子Gal4轉(zhuǎn)位子時有可能偶然產(chǎn)生位置依賴性唾腺增強子。
Ⅵ.樣品篩選品系號 未著色 唾腺 其它組織 %9 + - - 5.845 - + - 28.881 - + + 51.921 - - + 13.5156 100.0為了以特異性方式激活基因(X基因)，選擇Gal4插入品系，與攜帶在GAL UAS之后被克隆的X基因的品系雜交。
Ⅶ.對無核酶的GAL4/UAS系統(tǒng)的概述Gal4/UAS系統(tǒng)是一個用于控制基因活化的兩部分系統(tǒng)。該方法是多方面適用的，可以是組織特異性的并且不會顯示基礎(chǔ)水平的表達，也許如本文所述，UAS-DTA構(gòu)建物例外?？捎迷摲椒ó愇槐磉_特征化的基因，表達否則對生物體將是致死性的被修飾的基因和表達來自其它物種的基因以研究它們對果蠅發(fā)育的影響。由于該方法使產(chǎn)生顯性，功能獲得性突變成為可能，所以上位顯性試驗和對可見或致死表型的增強子或抑制基因的篩選可得以進行。Gal4系統(tǒng)也允許有毒產(chǎn)物表達，便于研究細胞特異性和組織特異性切除的后果。
Ⅷ.含有本發(fā)明的DTA核酶的Gal4表達果蠅的應(yīng)用將攜帶編碼DTA蛋白質(zhì)的序列的融合核酶的表達置于pUAST(圖10)中的GAL4UAS(上游激活序列)的控制之下。如上所述，用上述被修飾的P成分增強子捕集載體，構(gòu)建了大量穩(wěn)定的果蠅品系，每個品系都可在發(fā)育的果蠅中以特異性時空方式表達酵母轉(zhuǎn)錄激活子。任何在GAL4上游激活子序列(UAS)控制下的基因都可單獨被轉(zhuǎn)化并維持，然后在特定的果蠅組織中通過與可表達GAL4的品系(圖7)雜交被誘導(dǎo)。然而，在不進一步修飾的情況下利用GAL4系統(tǒng)表達DTA本身是不可能的，因為通過DTA的滲漏表達產(chǎn)生UAS-DTA轉(zhuǎn)化體是困難的。
已發(fā)現(xiàn)該二元系統(tǒng)用作通過轉(zhuǎn)拼核酶(圖6)條件性表達DTA的工具克服了這些問題。在可表達GAL4的那些細胞中，GAL4蛋白質(zhì)可提供核酶轉(zhuǎn)錄所必需的活性，而GAL4 mRNA可提供DTA產(chǎn)生所必需的靶。
可得用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)，給果蠅胚胎注射如上所述的置于UAS啟動子控制之下的核酶序列。注射了Rz-DTAmet構(gòu)建物的胚胎不能存活，而正常的轉(zhuǎn)化果蠅得自注射了Rz-DTAile和Rz-DTAleu的胚胎。這一結(jié)果表明內(nèi)部AUG密碼子確實成為注射后的有毒產(chǎn)物轉(zhuǎn)譯的啟動密碼子。該密碼子與在DTA序列中所提出的NAD+結(jié)合位點相鄰，并與遠緣外毒素A(來自銅綠假單胞菌的另一種EF-2特異性ADP-核糖基酶)中所保留的序列相鄰。
含有在GAL4 UAS控制下的Rz-DTAile和Rz-DTAleu的轉(zhuǎn)基因果蠅與可以特定的表達方式產(chǎn)生GAL4的果蠅雜交。例如，在一個特征化品系1J3品系中，將GAL4基因插在毛發(fā)基因附近，并反映它的表達方式。在胚胎發(fā)生過程中在偶數(shù)編號腹節(jié)的表皮條紋中產(chǎn)生毛發(fā)基因產(chǎn)物。當將UAS啟動的LacZ基因引入1J3(其中GAL4以與毛發(fā)基因產(chǎn)物相同的方式表達)時，發(fā)現(xiàn)β-半乳糖苷酶局限在偶數(shù)編號條紋中。當含有Rz-DTAleu基因的果蠅與這種GAL4表達品系雜交時，產(chǎn)生正常子代。然而，當含有Rz-DTAile的果蠅與GAL4表達品系雜交時，在胚胎發(fā)生中子代的發(fā)育受到抑制。顏色較深的條帶在胚胎的表皮上明顯可見，這與潛在細胞的死亡是一致的。當檢查表層制備時，偶數(shù)編號的小齒狀突起條帶被破壞或消失，特別是第4，6和8條紋的小齒狀突起條帶(圖11)。當含有Rz-DTAile的果蠅與含有不同的GAL4表達基因的果蠅雜交時，觀察到細胞死亡的其它特異性方式。
設(shè)計實施例5核酶原的設(shè)計作為一種核酶原的設(shè)計試驗，修飾了前面描述的CAT-LacZ轉(zhuǎn)拼核酶。系統(tǒng)發(fā)育比較和突變分析(參見Cech，Ann Rev.Biochem.59543-568(1990))已表明Ⅰ組自拼內(nèi)含子的核心區(qū)被高度保留，它對活性是重要的(圖8)。為了構(gòu)建轉(zhuǎn)拼核酶原，緊接在該區(qū)旁的螺旋P8被破壞。在最初的實驗中，將新序列的13或18個核苷酸引入螺旋P8的5′股和環(huán)，分別產(chǎn)生核酶原1和2。額外的核苷酸與核酶的5′“反義”部分互補，同時調(diào)整側(cè)翼序列以保留(1)在P8堿基處的真實序列，和(2)在P8內(nèi)可能的堿基配對的程度(圖13)。插入到螺旋P8中的序列與核酶原的5′“反義”區(qū)的自我互補程度可期望在新生轉(zhuǎn)錄本中優(yōu)先于螺旋P8形成這種新螺旋，也可期望這一更替螺旋的形成破壞核酶的催化核心內(nèi)側(cè)面二級或許三級相互作用。因此，核酶原的誤折會使它失去催化活性(圖14)。然而，核酶原與預(yù)期靶RNA的堿基配對可替代P8“反義”堿基配對，隔絕該“反義”序列并允許P8螺旋和活性催化區(qū)的重新形成。P8“反義”螺旋的置換可產(chǎn)生更大數(shù)目的堿基對和允許催化區(qū)的適當折疊，因此應(yīng)是很受歡迎的。
CAT-LacZ核酶原用如上所討論的PCR誘變構(gòu)建相應(yīng)于兩個CAT-LacZ核酶原的克隆序列，并通過體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA。據(jù)觀察CAT-LacZ轉(zhuǎn)拼核酶在轉(zhuǎn)錄期間經(jīng)歷3′拼接處的切割，這是由內(nèi)含子序列催化的水解造成的。相似的水解見于未修飾的嗜熱四膜蟲內(nèi)含子的體外轉(zhuǎn)錄。相比之下，不同的CAT-LacZ核酶原的轉(zhuǎn)錄本較穩(wěn)定，在同樣條件下幾乎無明顯的切割(圖15)。這表明核酶原是無活性的，若催化序列誤折，便可期望核酶原失活。測試了平末端形式的核酶原針對CAT RNA的特異核糖核酸內(nèi)切酶活性。由在ScaI位點被平切的模板轉(zhuǎn)錄CAT-LacZ核酶原，以刪除3′拼接序列和LacZ序列。刪除3′拼接位點后，核酶和核酶原都是穩(wěn)定的。平末端的核酶原與CAT RNA一起保溫導(dǎo)致了靶RNA的特異性切割，從而產(chǎn)生預(yù)期大小的片段(圖16)。在37°，45°和50°下可看出特異的切割活性。
也構(gòu)建了GAL4-DTA轉(zhuǎn)拼核酶的核酶原形式(圖17)。將含20個核苷酸的區(qū)域(與“反義”區(qū)互補)插入螺旋P8的5′股和環(huán)。這兩種核酶原在修飾的螺旋P8中可能的堿基配對程度不同，GAL4-DTA核酶原1具有較長的干，在環(huán)中有較少(3個)可及的堿基。GAL4-DTA核酶原2的螺旋P8更類似于CAT-LacZ核酶原2的螺旋P8，具有較大的環(huán)(14個堿基)，環(huán)中含有與“反義”區(qū)互補的序列。GAL4-DTA核酶原的轉(zhuǎn)錄本比未修飾的核酶的轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定。特別是，核酶原2在可導(dǎo)致核酶形式的基本完全的自我切割的條件下保溫(50℃下30分鐘，10mM MgCl2，2mM GTP，見圖18)之后大體上是完整的。
上面已對本發(fā)明作了充分的描述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不影響本發(fā)明或其任何實施方案的精神和范圍的情況下，可在很寬和等同的條件，參數(shù)等范圍內(nèi)完成本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種多核苷酸分子，該分子編碼轉(zhuǎn)拼核酶，該核酶的序列為融合RNA，該融合RNA的序列包括(1)第一RNA序列，該第一RNA序列足以使該核酶與靶RNA雜交，(2)第二RNA序列，由于該核酶轉(zhuǎn)拼活性的結(jié)果，該第二RNA序列能夠被共線性地轉(zhuǎn)染至靶RNA中；其中該多核苷酸分子的表達與轉(zhuǎn)錄激活子蛋白的表達進行了可操縱地連接，且其中所說的第一RNA序列是與編碼所說轉(zhuǎn)錄激活子蛋白的RNA雜交的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸分子，其中所說的轉(zhuǎn)錄激活子是GAL4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸分子，其中所說的第二RNA序列包括編碼對宿主細胞有毒的肽的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多核苷酸分子，其中所說的肽是DTA肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多核苷酸分子，其中所說的DTA肽是突變肽序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多核苷酸分子，其中所說的突變肽序列包括由SEQ ID No.40編碼的氨基酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多核苷酸分子，其中所說的突變肽序列包括由SEQ ID No.41編碼的氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸分子，其中所說的第一RNA序列是與GAL4雜交的序列，且其中所說的第二RNA序列是編碼DTA肽的序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的多核苷酸分子，其中所說的分子是RNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的多核苷酸分子，其中所說的分子是DNA。
11.一種包含核酶表達盒的多核苷酸分子，該盒能穩(wěn)定地插入至宿主基因組中，且該盒包括能夠在宿主中發(fā)揮功能且與權(quán)利要求1-9任一項的多核苷酸的編碼序列可操縱地連接的啟動子序列。
12.一種包含權(quán)利要求11多核苷酸分子的宿主細胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的宿主細胞，其中所說的宿主細胞是病毒細胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的宿主細胞，其中所說的宿主細胞是原核植物細胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的宿主細胞，其中所說的宿主細胞是真核生物細胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的宿主細胞，其中所說的真核生物細胞是植物細胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的宿主細胞，其中所說的真核生物細胞是動物細胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的宿主細胞，其中所說的動物是果蠅。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的宿主細胞，其中所說的動物是哺乳動物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的宿主細胞，其中所說的動物是人。
21.一種用于體外轉(zhuǎn)拼的方法，該方法包括以下步驟(1)向轉(zhuǎn)拼反應(yīng)混合物中提供權(quán)利要求9的多核苷酸分子，該多核苷酸分子包括能夠與第二多核苷酸雜交的序列;(2)向該反應(yīng)混合物中提供所說的第二多核苷酸;(3)在所說的條件下催化所說的第二多核苷酸的轉(zhuǎn)拼。
22.一種用于體內(nèi)轉(zhuǎn)拼的方法，該方法包括以下步驟(1)為宿主細胞提供權(quán)利要求9的多核苷酸;(2)在所說的宿主細胞中表達由所說分子編碼的所說的核酶;(3)在所說的宿主細胞中表達所說核酶的底物;(4)在所說的宿主細胞中用該底物催化該核酶的轉(zhuǎn)拼。
23.一種滅活靶RNA活性的方法，該方法包括(1)向轉(zhuǎn)拼反應(yīng)混合物中提供權(quán)利要求9的多核苷酸，所說的核酶對靶RNA具有催化活性，該催化活性導(dǎo)致該靶RNA功能的失活;(2)向該混合物中提供所說的靶RNA;(3)提供條件，使得該多核苷酸表達該催化活性。
24.一種在體內(nèi)為宿主細胞提供所需遺傳序列的方法，該方法包括(1)為該宿主細胞提供權(quán)利要求9的多核苷酸，該多核苷酸序列在該宿主細胞中對靶RNA具有催化活性，該核酶能夠轉(zhuǎn)拼該所需的遺傳序列;(2)為該宿主細胞提供所說的靶RNA;(3)提供條件，使得該核酶轉(zhuǎn)拼所需的遺傳序列至該靶RNA的序列中。
25.一種在多細胞動物或植物中摘除細胞的方法，該方法包括給受精胚宿主細胞提供權(quán)利要求9的多核苷酸，該核酶編碼對該宿主細胞有毒的肽且該核酶能夠?qū)⒃撔蛄修D(zhuǎn)拼至該宿主細胞的靶中。
26.一種對植物雄性或雌性不育進行操縱的方法，該方法包括為該種植物的胚細胞提供權(quán)利要求9的多核苷酸，該核酶作用于一RNA，該RNA所表達的蛋白質(zhì)是該植物受精所必需的，并導(dǎo)致表達該蛋白的細胞被摘除。
27.一種對植物進行抗植物病原菌的免疫的方法，該方法包括用權(quán)利要求9的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細胞，其中所說的多核苷酸所編碼的轉(zhuǎn)拼序列能夠給該植物提供抗該病原菌的免疫力，且其中被該病原菌感染的植物細胞導(dǎo)致該細胞的摘除。
28.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所說的多核苷酸分子，其中所說的核酶是核酶原。
29.根據(jù)權(quán)利要求8的多核苷酸分子，其中所說的核酶是核酶原。
30.根據(jù)權(quán)利要求9的多核苷酸分子，其中所說的核酶是核酶原。
31.根據(jù)權(quán)利要求10的多核苷酸分子，其中所說的核酶是核酶原。
32.根據(jù)權(quán)利要求11的多核苷酸分子，其中所說的核酶是核酶原。
33.根據(jù)權(quán)利要求12的宿主細胞，其中所說的核酶是核酶原。
34.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所說的核酶是核酶原。
35.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所說的核酶是核酶原。
36.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所說的核酶是核酶原。
37.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所說的核酶是核酶原。
38.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所說的核酶是核酶原。
39.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所說的核酶是核酶原。
40.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所說的核酶是核酶原。
全文摘要
本發(fā)明介紹了根據(jù)Ⅰ組內(nèi)含子的催化活性而設(shè)計的能夠進行自我催化的轉(zhuǎn)拼的新核酶。利用這一設(shè)計，有可能構(gòu)建出能夠以非常精確的方式將新的3′外顯子序列有效地拼接至任何選定的靶RNA序列中去的核酶。還介紹了利用本發(fā)明的新轉(zhuǎn)拼核酶摘除細胞的方法，該方法能夠在體內(nèi)以定向、調(diào)節(jié)方式為宿主細胞提供毒性產(chǎn)物。還介紹了無活性的核酶原。
文檔編號C12N15/52GK1065681SQ9210029
公開日1992年10月28日 申請日期1992年1月17日 優(yōu)先權(quán)日1991年1月17日
發(fā)明者J·哈塞爾福, A·布蘭德, N·波瑞蒙, H·M·古德曼 申請人:綜合醫(yī)院有限公司