專利名稱：大量制備戊二酰?；D(zhuǎn)移酶的方法
在以酶學(xué)方法由頭孢菌素C制備7-氨基頭孢菌酸時(shí)，最初是形成7β-(4-羧基丁酰氨基)頭孢菌酸(戊二酰基-氨基頭孢菌酸)，后者須借助于戊二酰酰基轉(zhuǎn)移酶(或戊二酰酰胺酶，以下簡稱“GA”)脫?；兂?-氨基頭孢菌酸。
R.Matsuda和K.I.Kombtsu(J.Bact.163(1985)1222-1228)已描述了以基因工程技術(shù)在大腸桿菌中生產(chǎn)GA的方法。然而，該方法只能使GA的比活性有少許增加(對(duì)于所用菌株從每毫克0.12單位增加到0.2單位)。
Masuda等人(上述文獻(xiàn))在他們的研究中使用了突變的假單孢菌GK16菌種，但沒有指出其保藏登記號(hào)。作者的研究工作是從得自Fermantation Research Institute(FRI)的假單孢菌SY-77-1菌種(保藏登記號(hào)為FERM 2410)開始的。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，可從假單孢菌菌株中得到GA編碼基因，并可借助該基因在大腸桿菌中產(chǎn)生比活性至少高五倍的酶。從此假單孢菌菌株中分離的上述酶與得自已寄存之菌株的GA差不多。
下文詳細(xì)解釋本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案及其他方面，并在本專利權(quán)利要求中限定之。
已有證據(jù)顯示，將該基因克隆到高拷貝數(shù)載體如PUC18中，在正常誘導(dǎo)條件下可導(dǎo)致對(duì)被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的殺傷。為此已構(gòu)建了進(jìn)行繼后研究的低拷貝數(shù)載體，并已用于建立該菌株基因組的基因庫。這些載體，即plac 10、plac 100和plac 200均含有已知質(zhì)粒pACYC 184(A.C.Y.Chang and S.N.Cohen，J.Bact.134(1978)1141-1156)的復(fù)制原點(diǎn)，因此每個(gè)細(xì)胞中約存在5個(gè)拷貝?？捎寐让顾剡x擇這些載體，并進(jìn)而避免可能作用于頭孢菌素的β-內(nèi)酰胺酶的生成。
為了鑒定GA基因，首先用PstⅠ消化含有完整基因組的基因庫。用相當(dāng)于Matsuda等人公開之序列的密碼子30-40和41-51的2個(gè)探針找出含有3.7Kb PstⅠ插入段的克隆。然后將其重新克隆到噬菌體M13mp19中，以進(jìn)行部分序列分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在氨基酸51至209的區(qū)域內(nèi)，有98%以上的序列與已公開的序列相符。然后對(duì)3.7Kb PstⅠ片段作放射標(biāo)記，以其作為探針篩選將PstⅠ部分切割之菌株DNA克隆到低拷貝數(shù)載體plac 100中后所構(gòu)建成的質(zhì)?；驇臁＿M(jìn)行限制性酶切分析，并與已公開資料作裂解位點(diǎn)的比較，結(jié)果顯示克隆pCM145含有完整的GA基因及其5′和3′側(cè)翼序列。該克隆包含載體plac 100連同約10Kb的pstⅠ插入段。它可產(chǎn)生約4單位/升GA。已按照布達(dá)佩斯條約的有關(guān)規(guī)定，于1991年3月8日將該克隆保藏在Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH，Braunschweig，保藏登記號(hào)為DSM 6409。


圖1顯示質(zhì)粒pCM145的限制性酶切圖。插入段中標(biāo)出了對(duì)于克隆有重要意義之限制性酶切位點(diǎn)的編號(hào)。
在經(jīng)過再克隆和亞克隆之后，有可能使GA產(chǎn)率增加到大約450單位/升。
已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，將發(fā)酵溫度從37℃降低到23℃，較好是25-30℃，特別是27°-28℃，可使產(chǎn)率得到顯著的改善。在這一溫度下發(fā)酵有可能持續(xù)很長時(shí)間，而在37℃下用IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌，則對(duì)宿主菌株是致死性的。
誘導(dǎo)較好在對(duì)數(shù)生長期，特別是對(duì)數(shù)生長后期進(jìn)行。優(yōu)選菌株是沒有或只有很低酯酶活性的大腸桿菌K12菌株，因?yàn)檫@類菌株特別利于以這種方式處理。
生產(chǎn)能力可受宿主菌株的影響。例如，已證明的適用菌株有大腸桿菌MC1061(ATCC 53338)、大腸桿菌W3110(ATCC 27325)或大腸桿菌DH1(ATCC 33849)。
發(fā)酵對(duì)可使用已知的無機(jī)鹽培養(yǎng)基和添加酵母浸膏、胨、胰酶解胨或酪蛋白氨基酸的復(fù)合培養(yǎng)基。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)簡單地預(yù)試驗(yàn)很容易地確定發(fā)酵的最適條件。
當(dāng)使用大腸桿菌菌株TGI(由Amersham-Buchler，Braunschweig提供)作宿主時(shí)，按下文所述的再克隆方法(實(shí)施例4)得到的表達(dá)載體T307可在工業(yè)生產(chǎn)條件下達(dá)到大約1000單位/升培養(yǎng)基的產(chǎn)率。質(zhì)粒T307攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因，可利用該基因的表達(dá)產(chǎn)物即β-內(nèi)酰胺酶來選擇重組克隆。同GA一樣，β-內(nèi)酰胺酶也是定位在細(xì)胞周質(zhì)中的分泌酶。其后令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，如用氯霉素抗性基因置換部分β-內(nèi)酰胺酶結(jié)構(gòu)基因，可使產(chǎn)率得到不同程度地改善(比較實(shí)施例9，質(zhì)料T347)?？孤让顾乜剐允怯梢阴＾D(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的，與β-內(nèi)酰胺酶相反，該酶定位于細(xì)胞內(nèi)。
如刪除β-內(nèi)酰胺酶的整個(gè)結(jié)構(gòu)基因，而不只是該酶結(jié)構(gòu)基因的一部分，特別是當(dāng)刪除編碼與β-內(nèi)酰胺酶分泌有關(guān)之信號(hào)肽的區(qū)域，并同時(shí)利用氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因作為選擇的標(biāo)志基因時(shí)，有可能使產(chǎn)率得到進(jìn)一步地改善(比較實(shí)施例10，質(zhì)粒T363)。
因此本發(fā)明還涉及表達(dá)載體的應(yīng)用，所說的表達(dá)載體不含表達(dá)分泌型基因產(chǎn)物的基團(tuán)或表達(dá)定位于周質(zhì)中之酶的選擇基因。然后有可能利用高拷貝載體，更好是沒有β-內(nèi)酰胺酶基因的選擇載體。已進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，可基于使用大腸桿菌K12菌株W3110M和MC1061獲得最佳產(chǎn)率。另外，在這些情況下這些質(zhì)粒都是穩(wěn)定的，可能在發(fā)酵期間被排除掉。
然而，如果定位于周質(zhì)或膜中的標(biāo)志物在戊二酰酰胺酶的生產(chǎn)期內(nèi)的表達(dá)水平能夠降低到不會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定的程度，則可以用該標(biāo)志來代替在細(xì)胞內(nèi)有活性的選擇標(biāo)志。一個(gè)適當(dāng)?shù)睦邮荰U1721的四環(huán)素抗性基團(tuán)，其為受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)的(Klock，G.et al.，J.Bacteriol.161，326-332 1988)或相對(duì)嚴(yán)格調(diào)節(jié)的、編碼定位于周質(zhì)或膜中之標(biāo)志物的基因。
下文詳細(xì)描述為獲得高產(chǎn)率所必需之表達(dá)載體的構(gòu)建。使用的酶得自New England Biolabs(Schwalbach)或Gibco/BRL(Eggenstein)，并須按照制造商提供的使用說明書使用之?；蚬こ滩僮靼碅usubel等人在Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Intersscience，11987及附錄中詳述的方法進(jìn)行，在此不作過細(xì)地描述。
所有涉及質(zhì)粒大小(bp)的說明均為近似數(shù)據(jù)。
下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步解釋本發(fā)明的細(xì)節(jié)。除特別指出者外，所有百分比都是指重量百分比。
實(shí)施例1質(zhì)粒plac10的制備從市售質(zhì)粒325(Sigma)中分離1.1Kb EcoRⅠ-HindⅢ片段，并連接到得自載體PACYC 184的1.5Kb EcoRⅠ-HindⅢ片段上。用HaeⅡ部分消化以這種方法得到的mini-PACYC并連接到得自含有多聚接頭和α-互補(bǔ)lac Z之市售載體PUC12的819 bp HaeⅡ片段上。將所得載體定名為plac10，所說的載體含有插入到PACYC184片段之HaeⅡ位點(diǎn)中的插入段，以此排列方式可使多聚接頭含有處于序列Eco RⅠ-HindⅢ中的切割位點(diǎn)，然后是復(fù)制原點(diǎn)。
實(shí)施例2載體plac100和plac200的制備實(shí)施例1中所述的mini-PACYC含有兩個(gè)與HindⅢ酶切位點(diǎn)相鄰的ClaⅠ酶切位點(diǎn)。
從plac 10中刪除該CaaⅠ片段即得到載體100，后者不再含有用于連接以得到mini-PACYC的HindⅢ酶切位點(diǎn)。
以與實(shí)施例1相似的方式用HaeⅡ部分消化plac 100，并用得自PUC18的相應(yīng)片段取代帶有多聚接頭的HaeⅡ片段，得到載體200。
實(shí)施例3基因庫的建立用pstⅠ徹底消化假單孢菌菌株的完整DNA，并連接到用pstⅠ切割的plac 10中。用此連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1(Pharmacia)。
用于篩選的是最初2個(gè)相當(dāng)于前述已公開之GA序列的密碼子30至40和41至50的寡核苷酸。以這種方法分離含有3.7Kb PstⅠ插入段的克隆PWK96。然后使之與兩探針雜交，再克隆到噬菌體M13mp19中并作部分序列測(cè)定后，顯示在氨基酸150至209的區(qū)域內(nèi)，98%以上是與已公開的DNA序列相符的。與已公開的基因圖相比較則顯示彼此的相關(guān)酶切位點(diǎn)也相互吻合。
對(duì)插入段進(jìn)行放射標(biāo)記，并用作探針以篩選用PstⅠ部分消化完整DNA所建立的基因庫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了含有約10Kb之插入段的克隆pCM145。經(jīng)限制性酶切分析并與已公開的酶切位點(diǎn)作比較，顯示已克隆了完整基因和5′與3′側(cè)翼序列。該克隆提供了每升培養(yǎng)基4單位的GA產(chǎn)率。將其用作進(jìn)行下述操作的起始材料。
實(shí)施例4再克隆用EcoRⅠ和HindⅢ切割質(zhì)粒plac100，并將帶有GA基因的片段插入到已用同樣的酶切開的市售載體pUC19中。以這種方法得到的克隆T286提供了23.5單位/升的GA產(chǎn)率。在此情況下，有一部分酶被分泌到細(xì)胞外(在起始菌株中，該酶只見于細(xì)胞周質(zhì)內(nèi))。
為了刪除可能阻礙基因在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的部分序列，基于已公開的GA基因圖重新構(gòu)建該基因。圖1中標(biāo)出了此構(gòu)建中所涉及之對(duì)應(yīng)限制性酶切位點(diǎn)的編號(hào)。
首先將大小為0.8Kb且包含SalⅠ酶切位點(diǎn)的BamHⅠ片段(BamHⅠ(1)-BamHⅠ(4))克隆到市售質(zhì)粒pUC18中。用SalⅠ切割所得質(zhì)粒并插入一個(gè)大小為0.8Kb的SalⅠ片段(SalⅠ(3)-SalⅠ(6))。用PstⅠ切割該新質(zhì)粒并在其中克隆一個(gè)大小為0.9Kb的PstⅠ片段(PstⅠ(5)-PstⅠ(8))，得到克隆pT93。此外，將1.7Kb SalⅠ片段(SalⅠ(6)-SalⅠ(9))克隆到PUC18中并檢查其是否以正確方向插入;結(jié)果得到質(zhì)粒pT98。因?yàn)榭寺〉膒stⅠ片段(PstⅠ(5)-PstⅠ(8))含有XhoⅠ酶切位點(diǎn)，故有可能通過將pT93的EcoRⅠ-XhoⅠ片段與得自pT98并且也含有復(fù)制原點(diǎn)和抗性基因的較大XhoⅠ-EcoRⅠ片段連接在一起，來克隆完整的基因。如此即得到質(zhì)粒pT103。用其轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)物產(chǎn)生濃度高達(dá)130單位/升的GA，其表達(dá)顯然是受來自假單孢菌DNA的5′啟動(dòng)子活性控制的。
用限制性酶SstⅠ和HindⅢ消化質(zhì)粒pT103后，從中分離攜帶GA基因的片段，然后克隆到用同種酶切割的載體plac200中，得到表達(dá)載體pT104，使用該載體質(zhì)?？墒笹A產(chǎn)率達(dá)到1000單位/升。
將重新構(gòu)建的基因再克隆到市售表達(dá)載體pBtac(由Boehringer-Mannheim公司生產(chǎn))的EcoRⅠ-HindⅢ酶切位點(diǎn)中，得到質(zhì)粒pT105。以其轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1菌株，在搖瓶中于37℃發(fā)酵溫度下發(fā)酵3天后，GA產(chǎn)率達(dá)到288單位/升。
在載體pTrc99A(E.Amann et al.，Gene 69(1988)301-315)中克隆GA基因所需的合成接頭(SEQ ID NO1)是(NcoI) (StyI)C ATG CTG AGA GTT CTG CAC CGG GCG GCG TCC GCGAC TCT CAA GAC GTG GCC CGC CGC AGG CGG AAC用限制性酶StyⅠ和BamHⅠ消化質(zhì)粒pCM145后從中分離長度為0.57Kb的BamHⅠ(4)-StyⅠ(2)片段(在已公開的DNA序列中，StyⅠ酶切位點(diǎn)位于氨基酸11至13區(qū)域內(nèi))。將該片段和上述接頭連接到已用NcoⅠ和BamHⅠ切割過的質(zhì)粒pTrc99A中，得到丟失了NcoⅠ酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒T297。
另外，從質(zhì)粒pCM145中分離1.5Kb SalⅠ片段(SalⅠ(6)-SalⅠ(9))和0.34Kb Bam HⅠ-SalⅠ片段并克隆到已用SalⅠ和Bam HⅠ切開的載體pUC18中。如此即得到經(jīng)檢查有正確SalⅠ(6-9)片段之插入方向的質(zhì)粒T306。用限制性酶Bam HⅠ和HindⅢ切割質(zhì)粒T306，從中分離-2.1Kb片段(其含有Bam HⅠ(4)至SalⅠ(9)位點(diǎn)的片段)。將該片段連接到已用Bam HⅠ和HindⅢ切開的載體T297中，得到質(zhì)粒T307(圖2)。以其轉(zhuǎn)化大腸桿菌，于28℃下發(fā)酵2天后GA產(chǎn)率達(dá)到260單位/升。在改良的發(fā)酵條件下(詳見下述實(shí)施例)，這一產(chǎn)率可提高到780單位/升以上。
在37℃下用IPTG誘導(dǎo)該系統(tǒng)可導(dǎo)致被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株死亡，這顯然是由于使用了高拷貝數(shù)載體T307。因此要在低于30℃的溫度下進(jìn)行發(fā)酵。
實(shí)施例5用大腸桿菌克隆進(jìn)行GA發(fā)酵可在無機(jī)鹽和復(fù)合培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌克隆DH1 T105和TG1 T307，并使之在對(duì)數(shù)生長期產(chǎn)生GA。在靜止期達(dá)到最大GA滴度。這表明GA產(chǎn)生依賴于生長速率。使用兩克隆所產(chǎn)生的酶有50-60%在胞漿中，40-50%在周質(zhì)中，最多有10%是在培養(yǎng)物濾液中。
為了完全釋放GA，必須用超聲波、French壓碎機(jī)或Dyno研磨器破碎細(xì)胞?？墒褂檬榛谆然@或甲苯等去污劑溶解周質(zhì)GA。加入EDTA和溶菌酶以提高效率。對(duì)最適發(fā)酵參數(shù)的初步研究表明，這些克隆可在25℃-37℃的溫度范圍內(nèi)生長并產(chǎn)生GA。但在30℃以上的溫度時(shí)，須使氧分壓保持在5%以下。在GA產(chǎn)生所需的28℃生長溫度下發(fā)酵時(shí)，可使細(xì)胞倍增時(shí)間增加到2小時(shí)以上;在這些條件下，GA生產(chǎn)不再依賴于低氧分壓(pO2)。已發(fā)現(xiàn)基于體積的GA生產(chǎn)率(單位/升培養(yǎng)物)和生物量濃度(克/升)之間存在著特殊的相互關(guān)系。
實(shí)施例6在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中產(chǎn)生GA克隆TG1 T307在YT一甘油培養(yǎng)基中于-18℃下保存甘油 17.0%酵母浸膏 0.7%細(xì)菌胰酶解胨 0.4%NaCl 0.4%氨芐青霉素 50μg/ml由此懸浮液制備含同樣培養(yǎng)基的瓊脂平皿并于28-37℃下保溫24小時(shí)，經(jīng)接種單個(gè)菌落后進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。
pC培養(yǎng)基細(xì)菌胰酶解胨 1%酵母浸膏 0.5%NaCl 0.5%氨芐青霉素 50μg/ml(pH7.2)將100ml該營養(yǎng)液加于300ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，接菌后于28℃和以220rpm旋轉(zhuǎn)保溫24小時(shí)。保溫后培養(yǎng)物的OD578nm為3.0。
用2%預(yù)培養(yǎng)物接種下列主培養(yǎng)物(25ml營養(yǎng)液/300ml培養(yǎng)瓶)并以220rpm在28℃下保溫24-74小時(shí)無機(jī)鹽培養(yǎng)基(重量%)NaH2PO41.110Na2HPO43.680KCl 0.100(NH4)2SO40.325MgSO4·7H2O 0.200檸檬酸 0.390甘油或葡萄糖 4.000Fe2(SO4)·3H2O 0.0250微量元素溶液 0.1000pH 6.0-6.5微量元素溶液 (重量%)H3BO30.208(NH4)6MO7O240.080ZnSO4·7H2O 0.160MnSO4·4H2O 0.160CuSO4·5H2O 0.160KI 0.04850小時(shí)后，生物量濃度為11克/升;GA產(chǎn)率為39單位/升。
實(shí)施例7在復(fù)合培養(yǎng)基中生產(chǎn)GA菌株維持和預(yù)培養(yǎng)同實(shí)驗(yàn)例6，但其中用5升發(fā)酵罐接種下列復(fù)合培養(yǎng)基(3升)復(fù)合培養(yǎng)基細(xì)菌胰酶解胨 1%酵母浸膏 0.5%NaCl 0.5%(pH7.2)發(fā)酵參數(shù)28℃，400rpm;0.5vvm發(fā)酵時(shí)間24-72小時(shí)72小時(shí)后生物量濕重7克/升72小時(shí)后GA460單位/升培養(yǎng)液;
66單位/克濕重在補(bǔ)充含量的復(fù)合培養(yǎng)基中生產(chǎn)GA按實(shí)施例7所述的相似方法，在下列培養(yǎng)基中培養(yǎng)克隆TG1 T307復(fù)合培養(yǎng)基細(xì)菌胰酶解胨 2%酵母浸膏 1.0%NaCl 0.5%pH 7.2發(fā)酵參數(shù)28℃，500rpm;0.8vvm53小時(shí)后生物量溫重15克/升63小時(shí)后GA780單位/升培養(yǎng)液
52單位/克濕重本實(shí)施例顯示了生物量增加與以體積為基礎(chǔ)之生產(chǎn)率增加之間的關(guān)系。
按實(shí)施例7所述的相似方法培養(yǎng)菌株DH1 T104，70小時(shí)后生物量濃度為11克濕重/升培養(yǎng)液，GA活性(以體積為基礎(chǔ))為1040單位/升培養(yǎng)液(97單位/克濕重)。此與大約1單位/毫克蛋白質(zhì)的比活性相當(dāng)。
實(shí)施例8GA生產(chǎn)的可誘導(dǎo)性在對(duì)數(shù)生長后期，用IPTG(終濃度為1-5mM)誘導(dǎo)克隆TG1 T307，在5-10小時(shí)內(nèi)產(chǎn)率增加60%。
實(shí)施例9質(zhì)粒T347用DraⅠ酶完全消化從菌株TG1(T307)中分離的質(zhì)粒DNA，從用于分離各片段的0.6%瓊脂糖凝膠中電洗脫分離含復(fù)制原點(diǎn)和處于Trc啟動(dòng)子控制下之GA基因的較大片段。
用限制性酶HaeⅡ消化載體pACYC184(Chang and Cohen，J.Bacteriol.134，1141-1156，1978)，從中釋放含有CAT基因和其調(diào)節(jié)區(qū)的約1.3Kb的DNA片段。在瓊脂糖凝膠中分離后，經(jīng)電洗脫得到該片段。用限制性酶HaeⅡ切割，在該片段的兩端產(chǎn)生不適于與帶有平頭的上述DraⅠ載體片段連接的3′突出未端。因此須用核酸外切酶S1切掉HaeⅡ片段的突出末端，然后在4種三磷酸脫氧核苷酸存在下用DNA聚合酶Ⅰ處理之。
借助DNA聚合酶將以這種方法制得的HaeⅡ片段與DraⅠ載體片段連接在一起，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MC 1061中。根據(jù)氯霉素抗性和GA酶的合成選擇適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌重組體克隆。用Schibuja檢測(cè)法檢測(cè)GA的產(chǎn)生量。重組體克隆含有質(zhì)粒T347，其限制性酶切圖如圖3所示。CAT基因在載體中的定位對(duì)GA的表達(dá)水平并不嚴(yán)格。
實(shí)施例10質(zhì)粒T363業(yè)已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)延長大腸桿菌MC1061(T347)的發(fā)酵時(shí)間時(shí)，在用IPTG誘導(dǎo)GA表達(dá)后攜帶質(zhì)粒之細(xì)胞的數(shù)目有不同程度的降低。推測(cè)這種不穩(wěn)定性的原因可能是由于剪短了包括大約69個(gè)氨基酸并含有信號(hào)肽的β-內(nèi)酰胺酶蛋白質(zhì)，而且通過β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶之殘基仍然存在。因?yàn)椴荒芡ㄟ^在CAT基因克隆來阻止其表達(dá)，這樣就可能導(dǎo)致陰性選擇壓力，即質(zhì)粒丟失。為了得到在整個(gè)發(fā)酵期間能穩(wěn)定保存的質(zhì)粒，用限制性酶SspⅠ和DraⅠ雙重消化質(zhì)粒T307。在0.6%瓊脂糖凝膠中電泳分離后，以電洗脫法得到兩最大的片段，其一方面含有復(fù)制原點(diǎn)，另一方面又含有連同其Trc啟動(dòng)子部分的GA基因。按實(shí)施例9中所述方法制備含有CAT基因的HaeⅡ片段并借助DNA連接酶將其與上述兩片段組裝在一起。將此連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株MC 1061中?；谄湓诼让顾卮嬖谙律L及產(chǎn)生GA酶的能力選擇重組體克隆。
用攜帶質(zhì)粒T363的重組體大腸桿菌克隆達(dá)到了最佳產(chǎn)率。質(zhì)粒T363的限制性酶切圖示于圖4中。
實(shí)施例11大腸桿菌菌株W3110(T347)和W3110(T363)的發(fā)酵培養(yǎng)條件除可變參數(shù)外，所有培養(yǎng)物均在下述條件下培養(yǎng)，這些條件對(duì)于兩克隆都相同克隆在XT-甘油培養(yǎng)基中于-18℃下維持甘油 17.0%酵母浸膏 0.7%細(xì)菌胰酶解胨 0.4%NaCl 0.4%氯霉素 25μg/ml由此懸浮液制成含同樣培養(yǎng)基的瓊脂平皿并于28℃保溫24小時(shí)，用單一菌落接種預(yù)培養(yǎng)物(pC)。
pC培養(yǎng)基細(xì)菌胰酶解胨 0.1%(NL5295)酵母浸膏 0.5%NaCl 0.5%氯霉素 25μg/mlpH 7.2在300ml培養(yǎng)瓶內(nèi)加入100ml該營養(yǎng)液，接種后以220rpm于28℃下保溫24小時(shí)。保溫后培養(yǎng)物的OD578nm為6.0-8.0。
用5-10%該預(yù)培養(yǎng)物(基于PC OD578nm＝3.0)接種下述主培養(yǎng)物(MC)MC培養(yǎng)基NL5292+1ml Desmophen20.0g/L酵母浸膏(Oxoid)1.2g/L NaH2PO4·H2O8.5g/L Na2HPO4·2H2O1.0g/L KCl2.0g/L MgSO4·7H2O(單獨(dú)高壓滅菌)0.25g/L 檸檬酸5.0g/L NH4Cl4.0ml/L SLA 50290.005g/L硫胺素→過濾除菌(5mg/10ml→0.5/50ml N1)pH＝6.5發(fā)酵條件溫度28℃體積3.5Lvvm0.75rpm500(r＝7cm)pH7.0±0.2(用25%NH4OH維持恒定)分批進(jìn)料甘油溶液525克甘油(99%)/升MC
培養(yǎng)基(無酵母浸膏和NH4Cl)進(jìn)料速率3.4ml/升·小時(shí)，連續(xù)加入(發(fā)酵罐中最大甘油濃度0.2%)或分次加入給料開始在pO2＝40-50%，或發(fā)酵約7小時(shí)后，OD578nm＝7-9時(shí)進(jìn)料持續(xù)時(shí)間40-60小時(shí)pO2穩(wěn)定在大約40%誘導(dǎo)發(fā)酵約20小時(shí)后且生物量濃度達(dá)到70-80克濕重/升后用IPTG(終濃度1mM)誘導(dǎo)。
甘油進(jìn)料應(yīng)在此后持續(xù)4-40小時(shí)。
收獲誘導(dǎo)后24-48小時(shí)收獲。
在大腸桿菌T347中表達(dá)GA在使用克隆T347時(shí)進(jìn)行分批進(jìn)料發(fā)酵，目的不僅是為了增加生物量，而且旨在證明GA的可誘導(dǎo)性。為此，研究了甘油進(jìn)料的各種方式及其對(duì)IPTG誘導(dǎo)作用的影響
上表說明生物量的增加與GA增加之間密切相關(guān)，而且顯示IPTG提高GA表達(dá)水平不受銨的限制，但受濃度在0.2%以上之甘油和葡萄糖的阻遇。已證明IPTG作為誘導(dǎo)劑濃度在1mM足以發(fā)揮作用。最適誘導(dǎo)的時(shí)間是當(dāng)培養(yǎng)物進(jìn)入生長靜止期時(shí)。
對(duì)該構(gòu)建體之質(zhì)粒穩(wěn)定性的研究表明，在誘導(dǎo)時(shí)(發(fā)酵約40小時(shí))只有60%的克隆含有質(zhì)粒，并且在加入誘導(dǎo)劑后24小時(shí)內(nèi)丟失質(zhì)粒。在連續(xù)培養(yǎng)中檢測(cè)質(zhì)粒半壽期大于50小時(shí)。
在大腸桿菌T363中表達(dá)GA在發(fā)酵72小時(shí)后，克隆T363具有仍存在于所有細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒。使用該克隆可在發(fā)酵后達(dá)到明顯更高的GA濃度。在上述最適分批進(jìn)料條件下，在大約20小時(shí)內(nèi)每升培養(yǎng)液可達(dá)到100克生物量(濕重)和7，000-12，000單位GA。此GA活性最多有40%是在胞漿中。
為了闡明影響誘導(dǎo)作用的各因素，詳細(xì)研究了下列參數(shù)1)發(fā)酵溫度在25-28℃的溫度范圍內(nèi)，基于體積的產(chǎn)率達(dá)到最高，同時(shí)達(dá)到最大比活性。在37℃條件下，克隆生長明顯減緩而減少了生物量，且表達(dá)最大只有20單位GA/升。誘導(dǎo)時(shí)將溫度由37℃改為28℃也不會(huì)導(dǎo)致GA表達(dá)。
2)復(fù)合氮源就保證基于體積的GA生產(chǎn)率來說，有可能用Bio Bprnger或Marcor提供的酵因浸膏代替得自O(shè)xoid的。使用其他復(fù)合氮源，如Sheffield提供的NZ胺A、B、E和L，以及乳清蛋白、大豆蛋白胨、Bacto胨，仍可提供50-70%基于體積的活性。就GA比活性來說，使用NZ胺、乳清蛋白和Bacto胨通?？蛇_(dá)到更高值。
迄今酵母浸膏(15-30g/L)是最好的復(fù)合氮源。
3)誘導(dǎo)劑濃度用1-10mM IPTG所作的研究表明，1mM誘導(dǎo)劑即是以引起最好的GA表達(dá)，但更高濃度時(shí)未見有不利影響。
4)氧供應(yīng)在誘導(dǎo)時(shí)，大腸桿菌T363產(chǎn)生了大約占其80%的生物量需氧量約為50mmol/升。小時(shí)。為此須使pO2保持在40%飽和度。pO2對(duì)誘導(dǎo)本身中只起小部分作用，只要能保持在10%飽合度以上即可。
實(shí)施例12大腸桿菌K12(GA)的發(fā)酵菌株大腸桿菌KR W3110M8δM15Lac IqpT363/33。
菌株維持于-74℃(深凍)下在安瓶(16.67甘油原料加在2×LB培養(yǎng)基中)儲(chǔ)存。
2×LB培養(yǎng)基Bacto胰酶群胨(Difco)20g/LBacto酵母浸膏(Difco)10g/LNaCl 5g/L振蕩培養(yǎng)用安瓶內(nèi)容物接種1000ml含有25mg氯霉素(培養(yǎng)基滅菌后通過除菌濾器加入)的2×LB培養(yǎng)基(在2升鋼瓶中)于28℃下在振蕩器(250rpm，動(dòng)幅1.25cm)上保溫4-5小時(shí)，直到OD值為1.0。
預(yù)發(fā)酵階段用1升振蕩培養(yǎng)物(OD 1.0)接種DT發(fā)酵罐(有效容積200升)。生長約6小時(shí)后，OD值達(dá)到3-4即轉(zhuǎn)移到主發(fā)酵階段。
預(yù)發(fā)酵培養(yǎng)基酵母浸膏(Bio Springer) 20.00g/LNa2HPO40.24g/LNaH2PO41.70g/LKCl 0.20g/LMgSO4·7H2O 0.40g/L檸檬酸 0.05g/L(NH4)2SO41.00g/L硫胺素/HCl 1.00mg/L微量元素溶液5029 0.03ml/LDesmophen 3600 0.18ml/L微量元素溶液5029CoCl2·6H2O 2.00g/LNiCl2·2H2O 0.08g/LCuCl2·2H2O 0.08g/LZnCl20.80g/LH3BO34.00g/LNa2MoO4·2H2O 2.40g/L
FeSO4·7H2O 1.60g/L用HCl將pH調(diào)至2.5EDTA 0.40g/L在預(yù)發(fā)酵階段保持下列條件溫度28℃;壓力1.0巴;空氣輸入量7m3CSTP/小時(shí);轉(zhuǎn)速最大175rpm;pH用NH2氣維持在7.2(接種前，培養(yǎng)基的pH從大約3.0-3.5提高到7.2)。
主發(fā)酵階段用DT培養(yǎng)液接種ET發(fā)酵罐(有效容量2m3(10%)。發(fā)酵時(shí)間為60-80小時(shí)。
主發(fā)酵培養(yǎng)基酵母浸膏(Bio Springer) 20.00g/LNa2HPO41.20g/LNaH2PO48.50g/LKCl 1.00g/LMgSO4·7H2O 2.00g/L檸檬酸 0.25g/L(NH4)2SO45.00g/L硫胺素/HCl 5.00mg/L微量元素溶液5029 0.50ml/LDesmophen 3600 0.30ml/L發(fā)酵條件如下
溫度28℃;壓力1.0巴;功率輸入2.5KW/m3;轉(zhuǎn)速120rpm(渦輪攪拌器直徑600mm);空氣輸入量80m3(STP)/小時(shí)(0.67vvm)pH7.2(由繼后加入的葡萄糖控制)誘導(dǎo)用1mM IPTG，在OD為50時(shí)加入繼后加入葡萄糖(30%溶液);6-8小時(shí)后加入;加入量0.5克/升。小時(shí)至2.5克/升。小時(shí)(根據(jù)pH改變而定)。
在生長初期，菌株先利用酵母浸膏，當(dāng)開始供入葡萄糖時(shí)，繼續(xù)呈指數(shù)生長，直到OD值為50。同時(shí)，氧分壓降到30-10%。為了在指數(shù)生長期提供足夠的氧，可通過增加轉(zhuǎn)速和/或增加空氣輸入量使功率輸入提高到3.5KW/m3或更高。
在此第一發(fā)酵期內(nèi)，經(jīng)逐步或連續(xù)定量供入葡萄糖使pH保持在7.2。
第二發(fā)酵期開始后，向培養(yǎng)液(OD＝50，約20-24小時(shí))內(nèi)加入1mM IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)產(chǎn)物生成。
在繼后發(fā)酵過程中，以150-200單位/升。小時(shí)的平均速率合成產(chǎn)物(戊二酰酰胺酶)。此期間菌株改為線性生長。然后限定的葡萄糖加入量減少到大約0.5克/升·小時(shí)，以維持pH恒定(7.2)。
持續(xù)60-80小時(shí)后，當(dāng)生物量已達(dá)到80-100克/升(濕重)(干重22-25克/升)，且產(chǎn)物生成量達(dá)到7000-10，000單位/升時(shí)即可停止發(fā)酵。
SEQ ID NO1序列類型伴有相應(yīng)蛋白質(zhì)的核苷酸序列長度各33個(gè)堿基鏈型帶截短之識(shí)別序列的雙鏈拓樸結(jié)構(gòu)線性片段類型N-末端片段(信號(hào)序列)來源合成DNAC ATG CTG AGA GTT CTG CAC CGG GCG GCG TCC GCGAC TCT CAA GAC GTG GCC CGC CGC AGG CGG AACMet Leu Arg Val Leu His Arg Ala Ala Ser Ala Leu-29 -25 -20 -18
權(quán)利要求
1.在大腸桿菌中制備戊二酰酰基轉(zhuǎn)移酶(GA)的遺傳工程方法，其包括引起包含在質(zhì)粒PCM145(DSM6409)中之GA基因的表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中GA基因是在大腸桿菌啟動(dòng)子控制下表達(dá)的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的方法，其中啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的方法，其中誘導(dǎo)發(fā)生在對(duì)數(shù)生長期。
5.根據(jù)權(quán)利要求4中所述的方法，其中誘導(dǎo)發(fā)生在對(duì)數(shù)生長后期。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5之一或多項(xiàng)中所述的方法，其中GA基因存在于低拷貝數(shù)載體中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5之一或多項(xiàng)中所述的方法，其中GA基因存在于表達(dá)載體中，所說的表達(dá)載體不含作為選擇基因的表達(dá)定位于周質(zhì)中之分泌型酶的基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的方法，其中表達(dá)載體是高拷貝數(shù)載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至5之一或多項(xiàng)中所述的方法，其中GA基因存在于高拷貝數(shù)載體中，且其中選擇基因的表達(dá)是受到嚴(yán)格控制的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9之一或多項(xiàng)中所述的方法，其中表達(dá)在大約25至30℃的發(fā)酵溫度下進(jìn)行。
11.質(zhì)粒pCM145(DSM6409)。
12.包含在質(zhì)粒pCM145(DSM6409)中的GA基因。
13.含有權(quán)利要求12中所述基因的基因構(gòu)建體。
全文摘要
本發(fā)明涉及在大腸桿菌中制備戊二酰?；D(zhuǎn)移梅(GA)的遺傳工程方法，其包括引起包含在質(zhì)粒PCM145(DSM6409)中之GA基因的表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1065292SQ9210178
公開日1992年10月14日 申請(qǐng)日期1992年3月17日 優(yōu)先權(quán)日1991年3月18日
發(fā)明者K-P·考雷爾, G·J·里斯, W·阿列茨 申請(qǐng)人:赫徹斯特股份公司