專利名稱：單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對人體脂蛋白(a)進行免疫比濁定量分析的單克隆抗體。
近年來，已經(jīng)知道血清富膽固醇脂蛋白是引起包括心肌梗塞在內(nèi)之動脈硬化性疾病的危險因子。其中脂蛋白(a)是引起動脈硬化的很重要的危險因子。目前正在對脂蛋白(a)進行大量的研究。
脂蛋白(a)含有作為特異性脫輔基蛋白的脫輔基蛋白(a)，其結(jié)構(gòu)中具有血液凝固或血纖維蛋白溶解系統(tǒng)蛋白質(zhì)之特征的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。已知當血凝塊產(chǎn)生時，其可表現(xiàn)出干擾血纖維蛋白溶解系統(tǒng)的活性。因此檢測血液中的脂蛋白(a)對于在臨床上確定動脈硬化性疾病是很重要的。
作為檢測血液中脂蛋白的特征性方法，免疫檢測法是人們通常熟知的。特別是免疫比濁定量分析法，因為它能夠適于用自動分析儀進行自動化分析，并且可分析大批量樣品，所以是一種常規(guī)檢查中所使用的通用方法。在免疫比濁定量分析法中，由于在適于交聯(lián)的蛋白質(zhì)的兩個或多個抗原決定基位點上同時偶聯(lián)許多抗體而使脂蛋白(a)難于溶解，從而可對脂蛋白(a)進行免疫比濁分析。因此，一般都知道免疫比濁定量分析可應(yīng)用于普通的多克隆抗體。但是為了得到多克隆抗體，每次都必須對所得抗原進行純化。另外，所得多克隆抗體的反應(yīng)活性也因被免疫動物的個體差異而有所變化。這樣就難于每次都能準確地測定血液中的脂蛋白，而持久準確地檢測脂蛋白對于病理學估計又是很重要的。
脫輔基蛋白(a)的氨基酸結(jié)構(gòu)與血纖維蛋白溶酶原很相似，后者是一種以較高濃度存在于人血液中的蛋白質(zhì)。因此，即使使用高度純化的脫輔基蛋白(a)作免疫原由通常使用的實驗動物體內(nèi)制得抗血清，因為抗血清不可避免地與血纖維蛋白溶酶原發(fā)生交叉反應(yīng)，從而不可能由使用這種抗血清的檢測系統(tǒng)準確地測定脂蛋白(a)含量。
借助免疫吸附方法使引起交叉反應(yīng)的化合物預(yù)先與抗血清反應(yīng)，以便從抗血清中除去不必要的反應(yīng)活性，是一種本技術(shù)領(lǐng)域中已知的從這樣表現(xiàn)有交叉反應(yīng)性的抗血清中得到只具有所需之反應(yīng)活性的抗血清的方法。但由于作為脂蛋白(a)之特征性組分的脫輔基蛋白(a)與血纖維蛋白溶酶原在結(jié)構(gòu)上有高度同源性，既使是脂蛋白(a)的靶反應(yīng)性也會使吸附過程減弱。因此，該方法不適用于為在比較短的時間內(nèi)檢測目的化合物而要求抗體表現(xiàn)出強反應(yīng)性的免疫比濁定量分析。既使勉強使用，它也只能提供極低的靈敏性。所以它不可能檢測象人血液中那樣的低含量脂蛋白(a)。
因此期望開發(fā)使用有高度特異性的但與血纖維蛋白溶酶原不表現(xiàn)有交叉反應(yīng)性的單克隆抗體，進行持久準確的檢測而且有高度可重復(fù)性的脂蛋白(a)分析方法。
然而，單克隆抗體的問題是它們只能特異地識別與之反應(yīng)的抗原上的一種類型的抗原決定基。鑒于這種情況，既使反應(yīng)完成了，由反應(yīng)所產(chǎn)生的抗原-抗體產(chǎn)物也只是一個抗體分子與兩個抗原分子的復(fù)合產(chǎn)物。為此，與用多克隆抗體所得產(chǎn)物相比，這樣一個產(chǎn)物是極小的，而用多克隆抗體得到的是多個抗體的復(fù)合物并能識別許多各種不同的抗原決定基部位，而且這樣的多克隆抗體可與多個抗原反應(yīng)。因此由抗原與單克隆抗體反應(yīng)所得到的產(chǎn)物不能用常規(guī)免疫濁度檢測法檢測到?？梢?，將免疫比濁分析法應(yīng)用于一種類型的單克隆抗體是不可能的。
為此，對于使用單克隆抗體的免疫比濁法來說必須使用可識別混合物中不同抗原決定基部位的兩種或多種類型的單克隆抗體。然而正如上面提到的，因為脫輔基蛋白(a)的結(jié)構(gòu)與血纖維蛋白溶酶原十分相似，其特異性抗原決定基部位極其有限，所以就很難于得到大量能彼此協(xié)同作用以形成大分子抗原-抗體結(jié)合材料的特異性單克隆抗體?；谶@些原因，一般認為以使用單克隆抗體的免疫比濁分析法檢測人脂蛋白(a)是很困難的。沒有一種單克隆抗體能適用于這樣的免疫比濁分析法是本領(lǐng)域中已知的事實。
鑒于這種情況，本發(fā)明人已制備了大量與人脂蛋白(a)反應(yīng)的單克隆抗體，以便不僅用常規(guī)酶免疫方法，而且還用免疫比濁方法研究它們的特性。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)有幾種與人血清脂蛋白(a)單獨地發(fā)生特異性反應(yīng)的單克隆抗體產(chǎn)生了能用常規(guī)分光光度計檢測的結(jié)合產(chǎn)物。這一發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了本發(fā)明的完成。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供可與人脂蛋白(a)反應(yīng)但不表現(xiàn)與人血纖維蛋白溶酶原和脫輔基蛋白B有免疫交叉反應(yīng)性的單克隆抗體。
本發(fā)明的另一個目的是提供以至少使用一種所說的單克隆抗體的免疫比濁分析法檢測人脂蛋白(a)的方法。
可根據(jù)下面的描述更清楚地了解本發(fā)明的其它目的、特征及優(yōu)點。


圖1是圖解顯示用Western吸印方法測出的抗脫輔基蛋白(a)、脫輔基蛋白B和人血纖維蛋白溶酶原之28205號單克隆抗體的反應(yīng)性。
圖2是用于以28205號單克隆抗體檢測人脂蛋白(a)的標定曲線。
本發(fā)明的單克隆抗體特征在于它們對人脂蛋白(a)的特異反應(yīng)性，即它們與人脂蛋白(a)反應(yīng)，但不表現(xiàn)與人血纖維蛋白溶酶原及脫輔基蛋白B有免疫交叉反應(yīng)性。這樣的單克隆抗體包括那些單獨使用或聯(lián)合使用時與人脂蛋白(a)產(chǎn)生沉淀或混濁的抗體。
可使用人脂蛋白(a)作為免疫抗原，按照常規(guī)方法制備本發(fā)明的單克隆抗體。作為免疫抗原，用于制備單克隆抗體的人脂蛋白(a)是本發(fā)明人從人血清中分離并純化的脂蛋白。在制備本發(fā)明的抗體時，脂蛋白(a)不一定要純化，而可以使用含有脂蛋白(a)的粗制品。在一個制備本發(fā)明抗體的特定優(yōu)選實施例中，將用脂蛋白(a)免疫的被轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞與哺乳動物漿細胞瘤相融合，以產(chǎn)生雜交瘤。從雜交瘤中選擇識別脂蛋白(a)的克隆。然后從該克隆中得到靶單克隆抗體。
上述方法中，對于用免疫抗原即脂蛋白(a)轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞沒有限制。需要考慮的是被選擇的免疫抗原與參予融合之哺乳動物漿細胞瘤的相容性。一般較好是使用小鼠、大鼠等動物。
可按常規(guī)方法如通過靜脈內(nèi)或腹腔內(nèi)途徑給動物注射脂蛋白(a)來進行免疫。具體地講，用PBS或生理鹽水將脂蛋白(a)稀釋到適當濃度，并連同適應(yīng)的佐劑一起注射給動物，必要時可間隔2-21天重復(fù)注射幾次直至總量達到1-100μl/動物。注射時可使用常規(guī)載體。脂蛋白(a)注射完成后3天從動物體內(nèi)切除脾臟，分離脾細胞以用作免疫細胞。
可使用各種已知的骨髓瘤細胞作為與上述免疫細胞相融合的哺乳動物漿細胞瘤。例如這樣的骨髓瘤細胞包括p3(p3/×63-Ag8)〔Nature，256，495-497(1975)〕、p3-U1〔Current Topics of Microbiology and Immunology，81，1-7(1987)〕、NS-1〔Eur.J.Immunol.，6，511-519(1976)〕、MPC-11〔Cell，8，405-415(1976)〕、PS 2/0〔Nature，276，269-270(1978)〕、FO〔J.Immunol.Meth.，35，1-21(1980)〕、X63，6，5，3〔J.Immunol.，123，1548-1550(1979)〕、S194〔J.EXP.Med.，148，313-323(1978)〕以及大鼠的R 210〔Nature，277，131-133(1979)〕等。
可基本上按照已知方法如Milestein等人的方法〔Methods Enzymol.，73，3-46(1981)〕，在普通營養(yǎng)培養(yǎng)基中，并在融合加速劑存在下完成免疫細胞與漿細胞瘤的融合?？墒褂镁垡叶?PEG)、仙臺病毒(HVJ)等常規(guī)融合加速劑，并可選擇性地加入二甲基亞砜等佐劑來提高融合效率。免疫細胞與漿細胞瘤的融合比例可以是通常比例，如每個漿細胞瘤融合1-10個免疫細胞。作為融合的培養(yǎng)基，可使用適于培養(yǎng)漿細胞瘤的任何培養(yǎng)基，例如，PRMI1640培養(yǎng)基，MEM培養(yǎng)基，以及各種用于培養(yǎng)這種類型細胞的其他培養(yǎng)基。從胎牛血清(FCS)除去血清補體后所得到的血清即是一種典型的培養(yǎng)基。為進行融合，可徹底混合預(yù)定量的免疫細胞和漿細胞瘤，然后再使該混合物與加入了約30-60%(W/V)PEG(如平均分子量為1，000-6，000的PEG)并已逐漸加熱到大約37℃的培養(yǎng)基混合。在HAT培養(yǎng)基中持續(xù)培養(yǎng)足以使雜交瘤以外細胞(如未融合的細胞)死亡的時間，通常是持續(xù)培養(yǎng)幾天到幾周。對所得雜交瘤進行常規(guī)有限稀釋以檢驗產(chǎn)生抗體的靶細胞系，并使之單克隆化。
可按照通常用于檢測抗體的標準方法〔Hybridoma and Monoclonal Antibody，R & D Planning Co.，30-53，(1982)〕，如ELISA方法〔Engvall，E.，Methods Enzymol.，70，419-439(1980)〕、噬斑法、點印跡法、凝集反應(yīng)法、Ouchterlony方法以及放射免疫法(RIA)等方法檢測抗體生成細胞系。期望使用上述脂蛋白(a)作為進行這一檢測的抗原。
可在常規(guī)培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)如此得到的產(chǎn)生靶單克隆抗體的雜交瘤，并可在液氮中長期保存之。
為了從雜交瘤中收集本發(fā)明的單克隆抗體，可按常規(guī)方法培養(yǎng)雜交瘤，并以上清液形式得到單克隆抗體，或者將此雜交瘤注入可對其增殖相容的哺乳動物體內(nèi)，然后從腹水液中收集單克隆抗體。前一種方法適于制備高純度的單克隆抗體，后一種方法則適于大量生產(chǎn)單克隆抗體。
可借助鹽析、凝膠過濾、親和層析等方法純化如此得到的單克隆抗體。
可借助酶免疫檢測法(EIA)、火箭電泳法、免疫比濁法等常規(guī)免疫檢測法，使用該單克隆抗體，以簡單方式高度靈敏、準確而又特異地檢測人脂蛋白(a)。其中較好的方法是免疫比濁法，因為該方法適于自動分析，而且可以一次檢測大量樣品。具體地說，可將一種或多種本發(fā)明的單克隆抗體加入到人血清、人血漿等樣品中使之發(fā)生反應(yīng)，并在反應(yīng)前后分別測定吸光率變化以檢測樣品中脂蛋白(a)的含量。
可按本領(lǐng)域中已知的方法建立檢測系統(tǒng)并修正和應(yīng)用該系統(tǒng)。
因為本發(fā)明的單克隆抗體可與人脂蛋白(a)發(fā)生特異性反應(yīng)，而且不表現(xiàn)與血纖維蛋白溶酶原及脫輔基蛋白B的免疫學交叉反應(yīng)性，故可將它們用于免疫檢測特別是免疫比濁法中以檢測臨床樣品中的人脂蛋白(a)，從而能夠篩選各種心臟病并診斷疾病狀況。
本發(fā)明的其他方面將在下列實施例的描述中變得更加明顯，給出這些實施例是為了舉例說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。
實施例1制備抗原于室溫下溶解實驗開始前一直在-20℃保存的凍干血清，并用超離心法分離含大量脂蛋白(a)的部分(密度1.06-1.12kg/L)。將這些部分加于100×2.6Cm Sephallose CL-6B柱上并在4℃下以8ml/小時的流速用含有0.15M NaCl的0.1M Tris緩沖液(pH7.4)洗脫，以收集各部分，每管收集5ml。因為首先洗脫的是高分子化合物，所以在這些條件下測280nm處吸收值時依次出現(xiàn)的是脂蛋白(a)、LDL(低密度脂蛋白)和HDL(高密度脂蛋白)峰。用聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析各部分，以收集只呈現(xiàn)與脂蛋白(a)相應(yīng)的第一個峰的峰值部分，從而避免LDL的污染。將所得部分用作抗原溶液。
實施例2制備抗人脂蛋白(a)抗體用牛血清白蛋白溶液作為標準對照，以Lawry方法測定實施例1中制得之抗原溶液的蛋白質(zhì)濃度。使蛋白質(zhì)濃度相當于10μg的溶液與100μl完全弗氏佐劑徹底混合，并注射到BALB/C小鼠腹腔內(nèi)。同時，作為加強免疫，將蛋白質(zhì)濃度為10μg的上述溶液與不完全弗氏佐劑充分混合并經(jīng)腹腔內(nèi)注射兩次，自第一次注射后每次間隔兩周。末次注射后1周，將10μl抗原溶液與生理鹽水混合并通過尾靜脈注射。三天后切除脾臟分離脾細胞并用培養(yǎng)基(PRMI 1640)沖洗之。將如此制得的脾細胞(2.5×108)與已按同樣方法用培養(yǎng)基充分洗過的SP2/OAg14小鼠骨髓瘤細胞(2.5×107)混合。將混合物(0.25ml)緩慢滴入培養(yǎng)基〔含50%PEG(w/v)〕中?；旌?分鐘后，緩慢加入8mlGKN培養(yǎng)基稀釋PEG，以終止反應(yīng)。將所得混合物離心(1，500rpm)5分鐘，以收集細胞。用2ml培養(yǎng)基洗細胞并懸浮于30mlHAT培養(yǎng)基中。將0.1ml等分的細胞懸浮液接種到96孔微量滴定板的各小井內(nèi)，并在8%CO2環(huán)境中于37℃保溫10天。用0.2mlHT培養(yǎng)基(與HAT培養(yǎng)基相同，但不含氨基喋呤)置換各小井內(nèi)的上清液。該過程重復(fù)3次后，檢測最后得到的上清液中所含抗體的特性。檢測中，適當稀釋用于免疫的含脂蛋白(a)的抗原溶液并裝滿微量滴定板的各小井，以使之吸附到各小井表面上。加入上述上清液并保溫，然后加入用過氧化物酶標記的抗小鼠IgG，以使用保留在小井內(nèi)的過氧化物酶活性作為標準檢測抗體活性。另外，用按常規(guī)方法從人血清中制得的血纖維蛋白溶酶原和LDL充滿微量滴定板并使之吸附在小井表面上，用上述檢測抗人脂蛋白(a)抗體活性的同樣方法檢測抗這些成分的抗體活性。通過這些操作選擇只與人脂蛋白(a)反應(yīng)的小井。用有限稀釋法克隆這些小井內(nèi)的細胞并對選擇之小井的培養(yǎng)液重復(fù)進行兩次抗體活性檢測，最后得到6個能產(chǎn)生對人脂蛋白(a)有特異性之抗體的克隆。然后將這些克隆注射到已用姥鮫烷處理的BALB/C小鼠的腹腔內(nèi)。10-20天后，分幾次收集小鼠的腹水液，以從中得到單克隆抗體。檢測該單克隆抗體的分類及亞類。結(jié)果示于表1中。以硫酸銨分級分離法并使用DEAE Sephallose以離子交換層析法從腹水液中得到IgG粗制品。按下述方法針對上面分離的各部分來估計免疫比濁定量分析法的可行性。將20μl含有50mg/dl人脂蛋白(a)的血清與300μl含有3%PEG、0.15M NaCl和3%葡聚糖的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)混合。將混合物保溫5分鐘以檢測340nM處的吸光率。再向此混合物中加入濃度已調(diào)整到1mg/ml的150μlIgG粗制品，保溫5分鐘后測定340nm處的吸光率。由此最后得到的吸光率減去加入IgG部分(其加入量已根據(jù)反應(yīng)混合物的量加以校正)之前的吸光率值，如此計算出因與人脂蛋白(a)反應(yīng)而造成的吸光率增加。結(jié)果示于表2中，其中列出了幾個由于與含人脂蛋白(a)的血清樣品反應(yīng)而呈現(xiàn)吸光率之特征性增加的克隆。其中，產(chǎn)生28205號單克隆抗體的克隆已保藏在Fermentation Research Institute，Agency of Industrial Science andTechnology(FERM P-12114)。
表1抗體編號 分類 類型28203 G r，K28204 G r，K28205 G r，K28206 G r，K28207 G r，K28209 G r，K表2抗體編號 吸光率28203 0.02028204 0.00728205 0.05328206 0.01928207 0.00728209 0.004
實施例3證實抗脫輔基蛋白(a)單克隆抗體的特異性為了證實抗脫輔基蛋白(a)單克隆抗體的特異性，用Western吸印法研究了經(jīng)過篩選所得到的抗輔基蛋白(a)、脫輔基蛋白B及人血漿纖維蛋白溶酶原之單克隆抗體的反應(yīng)活性。以脫輔基蛋白(a)、脫輔基蛋白B和血纖維蛋白溶酶原作為試驗樣品，使用4-20%SDS梯度聚丙烯酰胺凝膠對含有已在1mM巰基乙醇存在下用SDS修飾的人脂蛋白(a)的血清、用SDS修飾的純化的LDL以及市售的血纖維蛋白溶酶原進行電泳分離。電泳后，使用轉(zhuǎn)印裝置以20V處理8小時，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝化纖維素濾膜上。將膜浸入1%脫脂乳中封閉后，沖洗該膜并浸入濃度已調(diào)整到約14.2mg/dl的抗體溶液中，以進行抗原-抗體反應(yīng)。徹底洗膜后，加入作為第二抗體的過氧化物酶標記的抗小鼠IgG抗體溶液。反應(yīng)后，加入底物3，3′-二氨基聯(lián)苯胺以顯色。結(jié)果示于圖1中，其中顯示28205號單克隆抗體只與在滴有含人脂蛋白(a)之血清的泳道上的具有相當于脫輔基蛋白(a)之分子量的蛋白質(zhì)反應(yīng)，而在滴加LDL或血纖維蛋白溶酶原的泳道上未出現(xiàn)色帶，從而證明28205號抗體顯示有抗脫輔基蛋白(a)的特異性抗體活性。
實施例4證實定量分析效果用生理鹽水稀釋人脂蛋白(a)含量過高的待檢血清樣品，以制備一系列稀釋的樣品。每份20μl稀釋的樣品各加入350μl含有3%PEG、0.15M NaCl和3%葡聚糖的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，并將混合物保溫5分鐘以測定340nm處的吸光率。加入50μl濃度為0.6mg/dl的實施例2中制得的含有本發(fā)明之單克隆抗體的粗制IgG溶液后，將混合物保溫5分鐘以檢測340nm處的吸光率。由最后測得的吸光率減去加入IgG部分(其加入量已根據(jù)混合物量加以校正)之前的吸光率值，算出與各不同濃度之人脂蛋白(a)相對應(yīng)的吸光率。以這些吸光率值對標準樣品中人脂蛋白濃度作圖，得到一條有良好相關(guān)性的標定曲線。
該標定曲線如圖2所示，它證明本發(fā)明的單克隆抗體可單獨用于人脂蛋白(a)的免疫比濁分析。
顯然，有可能根據(jù)上述教導(dǎo)對本發(fā)明作多方面的修改和變動。因此應(yīng)明確的是，既使不完全按照本文的具體描述亦可實踐本發(fā)明，而這些也應(yīng)包括在本發(fā)明待批權(quán)利要求之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.與人脂蛋白(a)反應(yīng)但與人血纖維蛋白溶酶原和脫輔基蛋白B不表現(xiàn)有免疫交叉反應(yīng)性的單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的單克隆抗體，其可單獨或聯(lián)合用于人脂蛋白(a)的免疫比濁定量分析。
3.檢測人脂蛋白(a)的方法，特征在于使樣品與至少一種與人脂蛋白(a)反應(yīng)但與人血纖維蛋白溶酶原和脫輔基蛋白B不表現(xiàn)有免疫交叉反應(yīng)性的單克隆抗體反應(yīng)，并檢測所得反應(yīng)混合物的吸光率。
全文摘要
可與人脂蛋白(a)反應(yīng)但與人血纖維蛋白溶酶原及脫輔基蛋白B不表現(xiàn)有免疫交叉反應(yīng)性的單克隆抗體?？墒褂弥辽僖环N本發(fā)明的單克隆抗體，以免疫比濁分析法定量分析臨床樣品中的人脂蛋白(a)。
文檔編號C12N5/10GK1065729SQ92102038
公開日1992年10月28日 申請日期1992年3月25日 優(yōu)先權(quán)日1991年3月25日
發(fā)明者真鍋滿久, 井本和彥 申請人:第一化學藥品株式會社