專利名稱：一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，即一種將梭菌轉(zhuǎn)化成同步的具有特定長(zhǎng)度的細(xì)胞或折光性的內(nèi)生孢子的方法。該菌可用來(lái)生產(chǎn)產(chǎn)溶媒細(xì)胞、酶、抗菌素、有用的毒素蛋白以及折光性的內(nèi)生孢子梭菌屬細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，并可大量地轉(zhuǎn)化成為特定長(zhǎng)度的產(chǎn)溶媒細(xì)胞。
在誘導(dǎo)折光性內(nèi)生孢子形成的過(guò)程中，可實(shí)現(xiàn)上述轉(zhuǎn)化。更詳細(xì)地說(shuō)，在售有選擇性的阻止細(xì)胞任意生長(zhǎng)的、可緩慢代謝的碳源培養(yǎng)基中，再次培養(yǎng)使該菌在細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量上可以同步化。同步化的細(xì)胞最少延長(zhǎng)到營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的三倍，此時(shí)，細(xì)胞就成為產(chǎn)溶媒的。通過(guò)在培養(yǎng)基中添加某一二價(jià)陽(yáng)離子，其濃度不得少于0.01M左右，就可以穩(wěn)定細(xì)胞在質(zhì)量和數(shù)量上的同步化。如果要使細(xì)胞保持產(chǎn)生溶媒，必須通過(guò)化學(xué)或物理的方法使得細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。如果需要制備產(chǎn)生酶、抗生素或毒素蛋白的細(xì)胞，可通過(guò)抑制細(xì)胞分裂即DNA復(fù)制，細(xì)胞生長(zhǎng)可限制在被選擇的生長(zhǎng)時(shí)期中而不進(jìn)入產(chǎn)溶媒時(shí)期。
梭菌屬的某些厭氧的、嗜熱的、形成內(nèi)生孢子的細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，或者限于酶、抗生素、毒素蛋白，或者通過(guò)丙酮-丁醇-乙醇(ABE)發(fā)酵局限于溶媒。該屬這種特殊的能力主要?dú)w結(jié)于它們?cè)谶z傳學(xué)上的多樣性，只有在特殊的生理學(xué)上的條件下，內(nèi)生孢子才有效的產(chǎn)生。內(nèi)生孢子具有抵抗摧毀營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的極端條件的能力，梭菌細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上所表現(xiàn)出的改變與細(xì)胞酶活性的變化有關(guān)，根據(jù)培養(yǎng)條件，這些細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中或者能進(jìn)入產(chǎn)酸時(shí)期，或者能進(jìn)入產(chǎn)溶媒時(shí)期。這樣，孢子形成過(guò)程的全面調(diào)控是商品化生產(chǎn)細(xì)胞代謝產(chǎn)物必須的先決條件。
梭菌屬的某些種能夠直接將廉價(jià)的生物廢料，如木聚糖或其它的戊糖聚合體不經(jīng)預(yù)先的產(chǎn)物降解就能轉(zhuǎn)化成溶媒，依據(jù)某些梭菌是嗜熱厭氧的事實(shí)，利用該屬菌的工業(yè)發(fā)酵過(guò)程可以直接從發(fā)酵窗口中蒸餾。發(fā)酵產(chǎn)品的回收所需的能量就更省，真空回收產(chǎn)品也解決了溶媒對(duì)發(fā)酵細(xì)胞的毒害的問(wèn)題，由于減少了產(chǎn)物在反映器里的殘留時(shí)間，梭菌就具有高的反映率，因而終產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的比率也就提高了，總的生物反應(yīng)也就提高到最大程度。除此之外，在嗜熱系統(tǒng)中利用簡(jiǎn)單培養(yǎng)基和接種大量純化的細(xì)胞，從而確保了反映系統(tǒng)更難于受到污染。因此，原材料的滅菌可以省去。
細(xì)菌發(fā)酵過(guò)程中所利用的最低廉且最豐富的原料，是含木質(zhì)纖維素的生物原料，它具有三種主要的組成份晶體纖維素，半纖維素和木質(zhì)素，每種組成成份必須分別處理。用酸或酶做催化劑可將纖維素水解成葡萄糖，然而酸催化劑會(huì)繼續(xù)降解反應(yīng)產(chǎn)物葡萄糖，而且，酶處理還沒(méi)有很好地發(fā)展起來(lái)，其經(jīng)濟(jì)效益不是很高。半纖維素大部分由木聚糖組成，容易水解但是利用發(fā)酵技術(shù)很難發(fā)酵成為乙醇。木質(zhì)素不是糖的聚合物，因此不能發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，但通過(guò)熱化學(xué)的方法可把它轉(zhuǎn)化為可利用的液體燃料添加劑。
在本世紀(jì)二十年代，就有人開(kāi)始以甘蔗的糖蜜為原料利用厭氧丙酮丁醇梭菌來(lái)生產(chǎn)工業(yè)溶媒，然而獲得的最佳溶媒產(chǎn)量只有1.87%左右，甚至這個(gè)產(chǎn)量因丙酮丁醇梭菌對(duì)噬菌體的敏感性而不穩(wěn)定、不可靠。此項(xiàng)發(fā)明能夠控制產(chǎn)品形成的產(chǎn)率和產(chǎn)量，并能夠利用更廉價(jià)的木質(zhì)纖維素為原料。在特別選擇的形式下，該項(xiàng)發(fā)明利用梭菌屬的嗜熱微生物，正因?yàn)樵撐⑸锞哂性诟邷叵律L(zhǎng)的能力，從而使得該發(fā)明的方法在節(jié)能上更有效。此外，嗜熱梭菌不易受噬菌體的感染。
該項(xiàng)發(fā)明的作者之一，EdwardJ.Hsu在《孢子研究》的一章中描述了熱解糖梭菌的同步化延長(zhǎng)。該文由AcademicPress出版(London、1976、PP.223～242)，但是，文中沒(méi)有提到在增殖的過(guò)程中，二價(jià)陽(yáng)離子的存在能夠使同步化生長(zhǎng)的細(xì)胞穩(wěn)定下來(lái)。
產(chǎn)生乙醇的熱解糖梭菌的突變體，在美國(guó)專利NO.4，652，526中，由該項(xiàng)發(fā)明者之一Edwardsu描述過(guò)。該項(xiàng)專利沒(méi)有提及到在生長(zhǎng)基培養(yǎng)中的同步化生長(zhǎng)的細(xì)胞在加入二價(jià)陽(yáng)離子的條件下穩(wěn)定下來(lái)。
Hartmanis在Applied Microbiology and Biotechnolgy、Vol.23(1986)、PP.369～371中描述了℃lostridium acetobutylium在含有大量二價(jià)陽(yáng)離子的培養(yǎng)基中的重復(fù)再次培養(yǎng)。在起始培養(yǎng)體中含有少量的鈣可阻止細(xì)胞在另有三次轉(zhuǎn)接后的退化。這樣添加℃a℃O3后，在多達(dá)十次的轉(zhuǎn)接中不會(huì)發(fā)生退化。因此，添加鈣就排除了為制備起始培養(yǎng)體而進(jìn)行復(fù)雜的熱休克處理的需要。然而，細(xì)胞在數(shù)量和有效質(zhì)量上的同步化的生長(zhǎng)不能產(chǎn)生大量的同源細(xì)胞群體。作者們描述了如下的過(guò)程每次接種培養(yǎng)在有二十四小時(shí)以上的間隔就會(huì)產(chǎn)生抗熱性的孢子，及在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入少量的鈣就會(huì)提高孢子的抗熱性。
Ishida等申請(qǐng)的美國(guó)專利No.4，778，760描述了少量的鈣(4PPM)對(duì)穩(wěn)定核菌網(wǎng)中產(chǎn)生某種熱穩(wěn)定的a-淀粉酶的嗜熱厭氧細(xì)菌的效果。然而，鈣不能做為生長(zhǎng)培養(yǎng)基的組成份而被細(xì)菌細(xì)胞利用。
本發(fā)明的目的是用廉價(jià)飼料原料做為制備特殊的細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，將梭菌屬的細(xì)菌制備用來(lái)選擇性地生產(chǎn)溶媒，諸如乙醇和丁醇，大大地提高其產(chǎn)量，并使溶媒回收率達(dá)到大約11%左右，并且可選擇地生產(chǎn)酶或抗生素，在細(xì)胞制備的方法可選擇地完全形成孢子的過(guò)程中進(jìn)行，全部過(guò)程比以前的方法更為有效。
這種方法包括大量厭氧梭菌細(xì)胞在數(shù)量和質(zhì)量上同步化生長(zhǎng)到某一特定長(zhǎng)度。細(xì)胞在分批培養(yǎng)中以廉價(jià)的碳源培養(yǎng)基生長(zhǎng)，產(chǎn)生的同步細(xì)胞是處于分裂循環(huán)中的相同時(shí)期，細(xì)胞個(gè)體和它所代表的過(guò)程被稱為“準(zhǔn)備狀態(tài)”，根據(jù)所需要的終產(chǎn)物，細(xì)胞可以被收獲并儲(chǔ)存起來(lái)，即上述過(guò)程通過(guò)加入二價(jià)離子來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞而使其繼續(xù)下去，從而在細(xì)胞濃度達(dá)到109時(shí)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。產(chǎn)生的細(xì)菌能繼續(xù)代謝一段長(zhǎng)的時(shí)期。
可以從這種細(xì)胞中分離的最終代謝產(chǎn)物包括溶媒，分解糖類的酶、蛋白酶、脂酶、核酸酶、抗生素、不規(guī)則狀蛋白質(zhì)晶體，以及其它的毒素蛋白，例如像用做有機(jī)釘蟲(chóng)劑那樣的毒素蛋白。
選擇性的生長(zhǎng)培養(yǎng)型是某種微生物特殊的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含有大約0.1～15%(w/v)的慢代謝碳源基質(zhì)。細(xì)菌在這種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)率應(yīng)比它在最適培養(yǎng)基中所表現(xiàn)的最大生長(zhǎng)率Km小10～90%。更可取的碳源是戊糖聚全物如木聚糖，這種糖能很方便地從小麥桿、稻草、稻殼、玉米莖、玉米棒、果皮、半纖維以及來(lái)自紙廠廢料纖維素殘留物或其它合適的有機(jī)農(nóng)業(yè)、工業(yè)、城市廢料中獲得。
細(xì)胞通過(guò)一種或多種的方法達(dá)到同步化。這些方法有反復(fù)稀釋、離心的方法和膜過(guò)濾方法，每種方法須經(jīng)反復(fù)培養(yǎng)。細(xì)胞在其最適生長(zhǎng)溫度的-20℃到+10℃某一溫度上生長(zhǎng)，生長(zhǎng)的時(shí)間限制在約1.0～1.5代，即1.0～1.5倍于復(fù)制的時(shí)間，也就是培養(yǎng)體擴(kuò)大2～3倍于初濃度所需要的時(shí)間，為了使細(xì)胞同步，至少需要3～4個(gè)分離的生長(zhǎng)周期分別分散于2～3次稀釋、離心或膜過(guò)濾中來(lái)除去代謝廢物。在最佳方案中，同步化的細(xì)胞基本上都具有同樣的特定長(zhǎng)度，其范圍至少三倍于標(biāo)準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的長(zhǎng)度;甚至于4倍到20倍。然而，細(xì)胞可延長(zhǎng)到營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)度的100倍。
延長(zhǎng)后的同步化的細(xì)胞經(jīng)再次培養(yǎng)，以便讓它們進(jìn)一步增殖一到十二代，這就是說(shuō)，需要使培養(yǎng)體的濃度增加2到4，096倍所需的時(shí)間，在含有二價(jià)離子℃a、Mg、Mn、Fe、Zn來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞活性并阻止它們死亡，裂解或聚集的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，細(xì)胞再次培養(yǎng)，通過(guò)加入不少于0.01M左右的二價(jià)陽(yáng)離子到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，可獲得好的結(jié)果。
大量的二價(jià)陽(yáng)離子可被利用，這樣，在培養(yǎng)基中就超過(guò)了它的溶解度，隨著過(guò)量的二價(jià)化合物做為二價(jià)離子源的溶解，便構(gòu)成了進(jìn)行增殖細(xì)胞的組成份。如果二價(jià)陽(yáng)離子的濃度可保持在不少于0.01M～0.2M之間的某一水平，就可得到更好的結(jié)果。因?yàn)楦扇〉亩r(jià)陽(yáng)離子嘗試是不少于0.1M左右的。
有三種培養(yǎng)基可以利用(1)以木聚糖為唯一碳源，并以二價(jià)陽(yáng)離子補(bǔ)充木聚糖;(2)木聚糖和另外的碳源一起提供，這種另外的碳源必須是有機(jī)酸的二價(jià)鹽的碳源;(3)有機(jī)酸的二價(jià)鹽做為唯一碳源。推廣的有機(jī)鈣化合物有葡萄糖酸鈣、乳酸鈣、丙酸鈣、丁酸鈣或甲酸鈣，即使在生長(zhǎng)抑制劑存在的條件下，用葡萄糖酸鈣穩(wěn)定的同步化細(xì)胞能夠維持六個(gè)月。
葡萄糖酸鈣是最可靠的二價(jià)陽(yáng)離子源，因?yàn)樗粌H提供所需要的鈣離子，而且，還可做為極好的碳源，其分解方式類似于葡萄糖，只是速率慢許多。
在一種含有緩慢代謝的碳源培養(yǎng)基中，經(jīng)連續(xù)轉(zhuǎn)接(不少于兩次接種培養(yǎng))而獲得同步化的培養(yǎng)體，產(chǎn)生了限制細(xì)胞分裂的某種類型。以前，任何種類的細(xì)胞包括梭菌細(xì)胞還沒(méi)有這方面的報(bào)導(dǎo)。依照該項(xiàng)發(fā)明，細(xì)胞延長(zhǎng)16倍至20倍，并形成一隔膜把細(xì)胞按一種不尋常的方式進(jìn)行分裂，以致于絲狀體相等地分配到兩細(xì)胞中，該細(xì)胞仍是延長(zhǎng)的。對(duì)新形成的8倍到10倍長(zhǎng)的細(xì)胞的膜進(jìn)行觀察時(shí)，它或者再次把細(xì)胞進(jìn)行等分裂，或者最終形成孢子的隔膜。因此，延長(zhǎng)到16倍的細(xì)胞等分裂成兩個(gè)8倍長(zhǎng)的細(xì)胞，隨后，分裂成4倍長(zhǎng)的四個(gè)細(xì)胞(特定長(zhǎng)度)。
可緩慢代謝的碳源的合適來(lái)源包括苦杏仁苷、阿拉伯糖、纖維二糖、豐乳糖、糖原、蜜二糖、α-甲基葡萄糖、β-甲基蕕萄糖苷、棉子糖、水楊苷、淀粉、海藻糖、木聚糖、乙酸鈣、丁酸鈣、檸檬酸鈣、甲酸鈣、葡萄糖酸鈣和乳酸鈣。
以前試圖生產(chǎn)沒(méi)有折光性孢子的熱解糖梭菌(C.thermosac-cha-rolyticum)的相對(duì)同源性的群體一直沒(méi)有成功，本發(fā)明的方法包括引起下述培養(yǎng)條件發(fā)生，即允許營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞完全分化到100%沒(méi)有折光性孢子的培養(yǎng)條件發(fā)生。
如果所需的終生物是做為商品出售的細(xì)胞，它們可以被收獲并通過(guò)反復(fù)離心、重新縣浮或通過(guò)濾來(lái)洗滌，再在4℃下儲(chǔ)存起來(lái)。在另一方面，如果所需終產(chǎn)物是孢子，穩(wěn)定培養(yǎng)的溫度更可取地升高或降低到超過(guò)培養(yǎng)生長(zhǎng)的溫度范圍，例如，最適生長(zhǎng)溫度的-20℃至約+10℃。盡管在這種溫度下細(xì)胞的分裂將會(huì)停止，但是細(xì)胞的分化，孢子的形成和代謝將會(huì)繼續(xù)下去。如果所需的終產(chǎn)物是由延長(zhǎng)了的正在形成孢子的細(xì)胞中所產(chǎn)生的一種產(chǎn)物，如溶媒，產(chǎn)生同步化的、穩(wěn)定的細(xì)胞的生長(zhǎng)更可聚地通過(guò)溫度限制，或通過(guò)利用抗微生的化學(xué)試劑如抗生素和染料來(lái)抑制，孢子的形成和細(xì)胞的分裂因加入這類物質(zhì)而停止，但代謝過(guò)程如溶媒的產(chǎn)生卻繼續(xù)進(jìn)行。
通過(guò)這種方法制作成的溶媒回收水平在11%時(shí)丁醇和乙醇回收比為2∶1;當(dāng)溶媒回收水平在6.5%時(shí)，乙醇回收率可增加到1∶1。大大地高于以往溶媒回收率，以往溶媒回收率一般不超過(guò)1～2%。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的工藝方法作進(jìn)一步的說(shuō)明
圖1通過(guò)圖解的方式描述了可選擇的途徑只生產(chǎn)孢子、生產(chǎn)孢子和產(chǎn)溶媒細(xì)胞或只生產(chǎn)產(chǎn)溶媒細(xì)胞;
圖2以圖解的方式描述了純培養(yǎng)在補(bǔ)充葡萄糖酸鈣加富的木聚糖基礎(chǔ)培養(yǎng)中，同步生長(zhǎng)與溶媒產(chǎn)量及利用石油的相互關(guān)系(分別由曲線A、B和C表示);
圖3描述了在木聚糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充葡萄糖酸鈣后，同步培養(yǎng)體的個(gè)體細(xì)胞結(jié)合鈣的情況;
圖4描述了在木聚糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充碳酸鈣后，同步培養(yǎng)體的個(gè)體細(xì)胞的結(jié)合鈣的情況;
圖5描述了在葡萄糖酸鈣培養(yǎng)基中，同步培養(yǎng)的細(xì)胞個(gè)體結(jié)合鈣的情況。
參風(fēng)圖1，易于調(diào)控、經(jīng)誘導(dǎo)后延長(zhǎng)的同步生長(zhǎng)的細(xì)胞可選擇地用來(lái)實(shí)現(xiàn)分別稱之為途經(jīng)A，B，C的代謝過(guò)程。如果細(xì)胞用來(lái)實(shí)現(xiàn)途徑A，延長(zhǎng)的細(xì)胞是產(chǎn)溶媒的并且當(dāng)細(xì)胞分裂被抑制時(shí)，溶媒可產(chǎn)生相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)期。如果通過(guò)物理的方法如溫度的交替使細(xì)胞分裂受到抑制，并繼續(xù)培養(yǎng)的話，孢子就開(kāi)始形成，最終成為主要的產(chǎn)物。如果用抗微生物試劑抑制生長(zhǎng)，即使延長(zhǎng)培養(yǎng)的時(shí)間，溶媒卻仍然是主要產(chǎn)物。當(dāng)細(xì)胞用來(lái)實(shí)現(xiàn)途徑B時(shí)，產(chǎn)物主要是孢子。當(dāng)細(xì)胞用來(lái)實(shí)現(xiàn)途徑℃時(shí)，產(chǎn)物主要是溶媒。
依照推的程序，通過(guò)補(bǔ)充液體蛋白胨-酵母膏來(lái)制備1號(hào)基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基，或者是制備含常用成分及緩慢代謝的碳源的其它培養(yǎng)基，細(xì)菌在推廣的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度至少比它在最適培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度Km小10%，在這方面被推廣的生長(zhǎng)培養(yǎng)基是以戊糖為原料如木聚糖。為了得到0.5%(w/v)戊聚糖，必須加足木聚糖。
木聚糖是一種普遍存在于植物細(xì)胞壁和木頭組織中的一種戊聚糖，可以通過(guò)磨碎麥桿或大量的農(nóng)業(yè)、工業(yè)和城市有機(jī)廢料來(lái)獲得。木聚糖可以未經(jīng)處理并以粉末的形式加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。木聚糖可用熱稀酸或其他的酸水解成木糖，木糖是一種結(jié)晶的醛糖，其通式為C5H10O5。木聚糖也可以通過(guò)聯(lián)合培養(yǎng)一種水解纖維的微生物獲得。例如，在本方法中以纖維素做基礎(chǔ)培養(yǎng)基將C.ther-mocellum與C.thermosac-charolyticum一起培養(yǎng)。
將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的梭菌屬的細(xì)胞接種到合適的肉湯培養(yǎng)基中，例如用豌豆肉湯來(lái)制備原培養(yǎng)基，特別可取的梭菌類型是熱水解多糖(thermosaccharolyticum)的種類ATCC7956.N℃A3814.然而，可以利用的種類有perfrinqensAT℃℃＃13124.thermocel-lumATCC＃27405，thermohydrosulfuricumATCC＃35045，ace-tobutylicumATCC＃824，thermosulfurigenesATCC＃33743，thermoaceticumDSN＃521，thermoautotrophicumDSM＃1974，beijerinckiiATCC＃25752和butyricumATCC＃19398。
通過(guò)常規(guī)的系列稀釋、過(guò)濾或離心技術(shù)，生長(zhǎng)著的細(xì)胞可以達(dá)到同步化。隨后，在最適生長(zhǎng)的溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)的時(shí)間是梭菌最少達(dá)到1×106個(gè)/ml所需的時(shí)間，大約一個(gè)體積的原培養(yǎng)體接種于10個(gè)體積的木聚糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基，后者做為分批培養(yǎng)，在圖1中它稱為1號(hào)基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
含有梭菌的1號(hào)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，做為分批培養(yǎng)，直到增加2～3倍的濃度，即大約1.0～0.5代，當(dāng)然，對(duì)于不同的梭菌培養(yǎng)時(shí)間和溫度都不相同。
然后制備2號(hào)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，它的成分與1號(hào)培養(yǎng)基相同，大約一個(gè)體積的1號(hào)培養(yǎng)基中的梭菌分批培養(yǎng)體轉(zhuǎn)移到10個(gè)體積的2號(hào)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再做為分批培養(yǎng)來(lái)培養(yǎng)。相似地，這種培養(yǎng)體在最適合生長(zhǎng)的溫度下培養(yǎng)，直到培養(yǎng)體濃度增加2到3倍，最少約每毫升2～3×105個(gè)細(xì)胞即在約1.0～0.5代。
用來(lái)維持細(xì)胞按照代謝途徑A或B進(jìn)行代謝的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，是通過(guò)像先前描述過(guò)的木聚糖培養(yǎng)基中補(bǔ)充無(wú)機(jī)的或有機(jī)的二價(jià)離子來(lái)制備的。代謝途徑℃所需的培養(yǎng)基含有蛋白胨-酵母膏培養(yǎng)基，并補(bǔ)充有機(jī)酸的二價(jià)鹽做為唯一碳源，為了使細(xì)胞不至于死亡、裂解和聚集而保持穩(wěn)定，必須使用上述陽(yáng)離子推廣的二價(jià)離子有Mg、Mn、Fe、Zn和Ca，最好的離子來(lái)源包括有機(jī)鈣化合物中提供的鈣。
如果要生產(chǎn)溶媒細(xì)胞和孢子，可用途徑A，最好的穩(wěn)定劑是葡萄糖酸鈣，通過(guò)補(bǔ)充至少4.3%(w/v)(0.1)的葡萄糖酸鈣于木糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中來(lái)制備3號(hào)生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
約1個(gè)體積的2號(hào)培養(yǎng)基中的分批培養(yǎng)體接種到100個(gè)體積的3號(hào)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。這稀釋的1∶100倍的接種物做為分批培養(yǎng)來(lái)培養(yǎng)，直到細(xì)胞在質(zhì)量和數(shù)量上再次表現(xiàn)出同步，并且延長(zhǎng)至少4倍于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的長(zhǎng)度。這些細(xì)胞的細(xì)胞分裂受到限制，致于子細(xì)胞仍然延長(zhǎng)到特定長(zhǎng)度，同步細(xì)胞的二分裂通過(guò)物理的方法如升高或降低溫度來(lái)抑制。這種受抑制的同步的培養(yǎng)體再經(jīng)培養(yǎng)就會(huì)產(chǎn)生抗菌素、酶、不規(guī)則蛋白晶體，最終具有折光性的、成熟的自由孢子，而溶媒的比例很小。
如果所需終產(chǎn)物只是產(chǎn)溶媒細(xì)胞，最好的代謝途徑是圖1中的℃號(hào)途徑，這種途徑利用5號(hào)培養(yǎng)基做為生長(zhǎng)培養(yǎng)基。其制作方法是將有機(jī)鈣化物做為唯一的、緩慢代謝的碳源補(bǔ)充于含有通常組成份的液體蛋白胨-酵母膏培養(yǎng)基，最好的有機(jī)鈣化合物是濃度不小于4.3%(w/v)(0.1)葡萄糖酸鈣.
2號(hào)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的一個(gè)體積的分批培養(yǎng)體接種于100個(gè)體積的5號(hào)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，這1∶100稀釋的5號(hào)接種物做為分批培養(yǎng)體來(lái)培養(yǎng)，直到細(xì)胞在質(zhì)量和數(shù)量上表現(xiàn)出同步化，并且通過(guò)限制細(xì)胞分裂，使細(xì)胞延長(zhǎng)到營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)度的四倍而達(dá)到特定長(zhǎng)度。此后可收獲到含有少量孢子的同步產(chǎn)溶酶的細(xì)胞。如果以代謝途徑℃生產(chǎn)溶媒做為目的，通過(guò)物理的方法，如溫度的交替，或通過(guò)利用抗微生物試劑，可以抑制DNA的復(fù)制和細(xì)胞分裂，再繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)體直到溶媒從大量產(chǎn)生到產(chǎn)生量很小為止。
途徑A，B，及C的代謝產(chǎn)物可依據(jù)各種常規(guī)的方法來(lái)收回。例如，如果產(chǎn)物是高溫下產(chǎn)生的溶媒，這就是說(shuō)，在50℃以上，可用下述兩種真空發(fā)酵的方法回收，一種方法是D.L.Pavia等寫(xiě)的“實(shí)驗(yàn)室有機(jī)物導(dǎo)論，一種現(xiàn)代方法”第548～552頁(yè)，(W.B/Saun-der.1976);另一種是Cysewski和Wilke提出的“用真空的快速乙醇發(fā)酵及細(xì)胞回收”(生物技術(shù)和工程19卷1125～1143頁(yè)，1977)。如果產(chǎn)物是在50℃以下產(chǎn)生的溶媒，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的蒸餾過(guò)程來(lái)回收。酶，例如糖水解酶是胞外產(chǎn)物，可通過(guò)過(guò)濾或離心除去細(xì)胞碎片來(lái)回收。如果酶需要進(jìn)一步純化?？砂凑誅.I.C.wang等在“發(fā)酵和酶技術(shù)”中的第238～310頁(yè)(Johnwiley&Sons，1979)介紹的方法回收?；煸阪咦又械牟灰?guī)則狀蛋白顆粒和有用的毒素蛋白，可通過(guò)反復(fù)離心或過(guò)濾來(lái)回收。細(xì)胞經(jīng)兩次離心或過(guò)濾重新懸浮后，再次離心或過(guò)濾而收集。然后回收純化而干燥的孢子。如果產(chǎn)物是抗菌素，可用有機(jī)溶劑如丙酮或丁乙酸萃取的常規(guī)方法回收，這種方法由Crueger及℃rueger在生物技術(shù)工業(yè)微生物學(xué)課本的第99～103頁(yè)中描述過(guò)。
在上述的過(guò)程中，1號(hào)和2號(hào)木聚糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基可代替5號(hào)生長(zhǎng)培養(yǎng)基。上述步驟的其他方面包括最終把培養(yǎng)體以1∶100的稀釋比例稀稀釋到5號(hào)生長(zhǎng)培養(yǎng)基仍保持不變。稀釋的接種物做為分批培養(yǎng)體培養(yǎng)到前面所述的細(xì)胞延長(zhǎng)。同步和限制細(xì)胞分裂為止。最終可收獲到同步的產(chǎn)溶媒的細(xì)胞。里面的孢子數(shù)幾乎可以忽略不計(jì)。
做為另外一種可選擇的步驟，抑制同步產(chǎn)溶媒的細(xì)胞的生長(zhǎng)，可把細(xì)胞的能量引導(dǎo)到代謝上而不是用在細(xì)胞分裂上，并且可收獲它們?cè)诖艘院蟮拇x產(chǎn)物。細(xì)胞及其生長(zhǎng)培養(yǎng)基的溫度可增加到最適生長(zhǎng)溫度以上10度或降低到最適生長(zhǎng)溫度以下20℃，或者通過(guò)加入半致死劑量的抗微生物試劑來(lái)控制。當(dāng)抑制的培養(yǎng)體繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)，就可產(chǎn)生溶媒，里面伴隨的孢子可忽略不計(jì)。在一定的時(shí)期之后，這個(gè)時(shí)期隨著菌種的不同而不同。所產(chǎn)生的溶媒比例從6%到12%變化，而丁醇和乙醇比例都在1∶1到2∶1之間變化。
在其它的具體方案中，可以重復(fù)在第二個(gè)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)的步驟，并且于轉(zhuǎn)移到第三種生長(zhǎng)培養(yǎng)基之前，重復(fù)向新鮮培養(yǎng)基中稀釋的步驟。最初，向新鮮培養(yǎng)基中稀釋的比例可以從1∶2變化到1∶100，這個(gè)步驟可以重復(fù)，最后稀釋比例可以從1∶2到1∶500變化。做為使培養(yǎng)體同步化的方法，重復(fù)離心或膜過(guò)濾，重復(fù)縣浮可代替系列稀釋。
在所有試驗(yàn)過(guò)的具體的方案中，為了使產(chǎn)生溶媒具有較長(zhǎng)時(shí)期，延長(zhǎng)的同步細(xì)胞常常需要一種緩慢代謝的碳源，正常的細(xì)胞分裂必須通過(guò)溫度的交替或添加化學(xué)生長(zhǎng)抑制劑來(lái)阻止。以及細(xì)胞必須與鈣結(jié)合。圖3-5把單個(gè)同步化的Clostridiumthermosac-charolyticum細(xì)胞結(jié)合鈣的情況下典型的異步的，短的，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞與鈣結(jié)合的情況進(jìn)行了比較。正像圖3-5中曲線A1-A4所例舉的那樣，鈣的結(jié)合穩(wěn)定了產(chǎn)溶媒細(xì)胞，并保護(hù)其免受隨后產(chǎn)生高濃度溶媒的影響。相反，每個(gè)圖中曲線B所代表的細(xì)胞，在加入過(guò)量鈣之前不是同步化的，仍然保持典型的，短的，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，它們不與高濃度的鈣結(jié)合，主要是產(chǎn)酸細(xì)胞。然而，即使在這些產(chǎn)酸的細(xì)胞中，當(dāng)在45小時(shí)通過(guò)變溫到35℃使細(xì)胞分裂停止時(shí)，細(xì)胞閔延長(zhǎng)，產(chǎn)生溶媒，同時(shí)會(huì)出現(xiàn)鈣結(jié)合的增加。
具體地說(shuō)，在利用某種碳源可選擇性地生產(chǎn)下列代謝終產(chǎn)物溶媒、酶、抗菌素、有用的毒素蛋白或孢子時(shí)可按下列方法進(jìn)行第一種方法向每毫升含有1×106數(shù)的梭菌屬細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中提供一種緩慢的代謝碳源，在預(yù)先決定的條件下，該菌普遍能夠分解這種碳源產(chǎn)生下列代謝產(chǎn)物如溶媒、酶、抗菌素、蛋白質(zhì)、孢子等中的某一種;
提供至少0.01M左右的二價(jià)陽(yáng)離子來(lái)穩(wěn)定上述細(xì)胞;
在使得上述細(xì)胞在數(shù)量上同步化生長(zhǎng)的同時(shí)，通過(guò)下列方法誘導(dǎo)細(xì)胞至少延長(zhǎng)三倍而達(dá)到某一特定長(zhǎng)度a)在上述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)細(xì)胞使其濃度有限地只增加到起始的2～3倍，在培養(yǎng)的過(guò)程中，培養(yǎng)基保持在該菌最適生長(zhǎng)溫度的-20℃～+10℃范圍內(nèi);b)此后，讓細(xì)胞再次培養(yǎng)使其濃度比先前濃度增大2～3倍，培養(yǎng)時(shí)所用的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的溫度保持在步驟a)范圍內(nèi)的某一溫度，這徉就不會(huì)產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，從而不會(huì)干擾上述細(xì)胞的同步生長(zhǎng);c)之后，在步驟b)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中補(bǔ)充至少0.01M的二價(jià)陽(yáng)離子來(lái)穩(wěn)定上述細(xì)胞，即在這種培養(yǎng)基中，使細(xì)胞再次培養(yǎng)，使其濃度比先前濃度再增加至少二倍;
使由c)步產(chǎn)生的細(xì)胞處于抑制細(xì)胞分裂的狀態(tài)。
為了使細(xì)胞的延長(zhǎng)和細(xì)胞在數(shù)量和有效質(zhì)量上同步化生長(zhǎng)可通過(guò)下列步驟來(lái)完成重復(fù)上述方法中的步驟b)代替步驟c);為了穩(wěn)定上述細(xì)胞，在添加一種陽(yáng)離子的同時(shí)，再次重復(fù)上述方法中的步驟b)，此后，再次培養(yǎng)細(xì)胞使其細(xì)胞濃度至少增加到先前的兩倍左右;最后使最終產(chǎn)生的細(xì)胞易于處于抑制細(xì)胞分裂的狀態(tài)。
第二種方法向每毫升不小于1×106個(gè)梭菌屬的細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中提供一種緩慢的代謝碳源，在預(yù)先決定的條件下，細(xì)菌普遍具有分解這種碳源產(chǎn)生上述溶媒的能力;
在使得上述細(xì)菌在數(shù)量和有效質(zhì)量上同步化生長(zhǎng)的同時(shí)，通過(guò)下列方法誘導(dǎo)細(xì)胞延長(zhǎng)到至少三倍而達(dá)到某一特定長(zhǎng)度a)、再次培養(yǎng)，使細(xì)胞在上述培養(yǎng)基中的濃度增加到不少于2×10個(gè)/ml～3×10個(gè)/ml左右，在培養(yǎng)的過(guò)程中，培養(yǎng)基的溫度保持在該菌最佳生長(zhǎng)溫度的-20℃～+10℃范圍內(nèi)的某一溫度;b)、取出一部分含有上述細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并用新鮮生長(zhǎng)的培養(yǎng)基從1∶2稀釋至1∶100左右，此后，使細(xì)胞再進(jìn)一步增殖到其濃度至少約為2×10個(gè)/ml～3×10個(gè)/ml，在增殖時(shí)，培養(yǎng)基的溫度保持在步驟a)的溫度范圍內(nèi);c)重復(fù)步驟b)，此時(shí)稀釋度為1∶2至1∶500左右，同時(shí)添加至少0.01M左右的二價(jià)陽(yáng)離子來(lái)穩(wěn)定上述細(xì)胞，此后使細(xì)胞進(jìn)一步增殖到其濃度為2×10個(gè)/ml左右;
使由步驟c)產(chǎn)生的細(xì)胞處于抑制細(xì)胞分裂的狀態(tài)。
為了使細(xì)胞的延長(zhǎng)和細(xì)胞在數(shù)量和有效質(zhì)量上的同步化生長(zhǎng)，可通過(guò)下列步驟來(lái)完成重復(fù)步驟b)代替步驟c)，及再次重復(fù)步驟b)，此時(shí)，稀釋度從1∶2～1∶500左右，同時(shí)增加二價(jià)陽(yáng)離子源來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞，此后，使進(jìn)一步增殖到濃度不少于2×10個(gè)/ml左右;最后，使產(chǎn)生的細(xì)胞處于抑制細(xì)胞分裂狀態(tài)。
或者，從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分離上述細(xì)胞，并重新懸浮于一定量的新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，然后，使細(xì)胞進(jìn)一步增殖到其濃度不少于4×10個(gè)/ml到6×10個(gè)/ml左右，在增殖時(shí)，培養(yǎng)基的溫度保持在步驟a)的范圍;并重復(fù)上述步驟，直到其細(xì)胞濃度至少為4×10個(gè)/ml左右。
第三種方法向每毫升不小于1×106個(gè)梭菌屬的細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中提供一種緩慢的代謝碳源，在預(yù)先決定的條件下，細(xì)菌在遺傳上能代謝這種碳源，可產(chǎn)生一代謝產(chǎn)物，包括溶媒、酶、抗抗拒菌素、蛋白質(zhì)或孢子等;
細(xì)菌在數(shù)量和有效質(zhì)量上同步化生長(zhǎng)的同時(shí)，通過(guò)毓的再次培養(yǎng)和稀釋來(lái)誘導(dǎo)同步化的細(xì)菌細(xì)胞的延長(zhǎng)而達(dá)到至少三倍的某一特定長(zhǎng)度，毓的再次培養(yǎng)和稀釋時(shí)的溫度控制，在菌的最適生長(zhǎng)溫度為-20℃-+10℃范圍內(nèi)的某一種溫度，每次培養(yǎng)的時(shí)間不得超過(guò)細(xì)胞增殖2-3倍吉原始濃度所需的時(shí)間;
最后，在細(xì)胞增殖的最后階段，加入不少于0.01M左右的二價(jià)陽(yáng)離子把細(xì)胞穩(wěn)定下來(lái)。
在利用某種碳源在細(xì)菌發(fā)醉過(guò)程中生產(chǎn)包括乙醇在內(nèi)的有機(jī)溶媒時(shí)，采用如下工藝方法向每毫升不少于1×106個(gè)梭菌屬的細(xì)菌的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中提供一種緩慢代謝的碳源，在預(yù)先決定的條件下，上述細(xì)菌在遺傳上具有分解這種碳源產(chǎn)生上述溶媒的能力;
細(xì)胞在數(shù)量和有效質(zhì)量上同步化生長(zhǎng)的同時(shí)，可通過(guò)下列步驟來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞延長(zhǎng)至少三倍而達(dá)到某一特定長(zhǎng)度a)、再次培養(yǎng)細(xì)胞，使其在上述培養(yǎng)基中增殖約1.0～1.5代，增殖時(shí)，培養(yǎng)基的溫度保持在該菌最適生長(zhǎng)的溫度的-20℃～+10℃左右的范圍內(nèi);b)、此后，再次培養(yǎng)細(xì)胞使其在某一生長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)一步增殖1.0～1.5代左右，增殖時(shí)，生長(zhǎng)培養(yǎng)基的溫度保持在步驟a)的范圍內(nèi)，這樣就不會(huì)產(chǎn)生大量的細(xì)胞內(nèi)代謝物，從而不干擾上述細(xì)胞的同步化生長(zhǎng);c)重復(fù)步驟b)，同時(shí)至少添加0.01M左右的二價(jià)陽(yáng)離子來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞，此后使細(xì)胞進(jìn)一步增殖至少約一代;
最后，使由步驟c)產(chǎn)生的細(xì)胞處于抑制細(xì)胞分裂的狀態(tài)。
上面的各種工藝方法中所提及到的碳源、細(xì)菌的濃度、培養(yǎng)基、二價(jià)陽(yáng)離子、細(xì)菌的最適生長(zhǎng)溫度及細(xì)胞的保持等在前面已作了途述，在此不再描述。
下面結(jié)合各種范例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明范例1此范例提出了使得生長(zhǎng)者的細(xì)胞在數(shù)量和質(zhì)量上的同步化過(guò)程，并改變了野生型ClostridiumthermosaccharolyticumATCC＃7956菌株在純培養(yǎng)中的細(xì)胞分裂。
1、豌豆肉湯培養(yǎng)基六顆干燥的阿拉斯加種豌豆加入10ml2%蛋白胨溶液中，滅菌15分鐘，立即用2ml無(wú)菌的vaspar覆蓋。
2、原種培養(yǎng)處于以數(shù)生長(zhǎng)的C.thermosaccharolyticum的培養(yǎng)體接種于豌豆肉湯掊養(yǎng)基中，隨后在56℃下接著8小時(shí)。接著原種培養(yǎng)儲(chǔ)存于4℃。每間隔3～6個(gè)月，轉(zhuǎn)接原種培養(yǎng)。原種培養(yǎng)在56℃培養(yǎng)12小時(shí)即被活化。
3、分批培養(yǎng)1毫升活化后的培養(yǎng)種體接種于10毫升新鮮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中做為分批培養(yǎng)。
4、基礎(chǔ)培養(yǎng)基0.2%蛋白棟;0.5%的酵母膏;0.01%CaCl2·2HO0.1%(NH4)2SO4;0.01%MgSO4;0.01%MnSO4.H2O;0.0005%ZnSO4·7H2O;0.0005%CuSO54H020.0.0001%(NH4)6MO7O244HO;0.000002%對(duì)氨基苯甲酸p-aminobenzoic acid;0.0001%鹽酸硫胺thiamine hy-drochloride;0.0000001%生物素biotin溶于1公升水中鹽酸硫胺素和生物素經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌，再加入來(lái)菌后的培養(yǎng)基中，0.5%(w/v)木聚糖加入培養(yǎng)基做為碳源。培養(yǎng)基用1M氫氧化鈉調(diào)至pH7后滅菌。接種前培養(yǎng)基在56℃預(yù)溫，并在一天內(nèi)使用。
5、步驟所有的步驟均采用Hungate方法在無(wú)菌條件下進(jìn)行。原種培養(yǎng)活化后，轉(zhuǎn)接于預(yù)溫的含有0.5%木聚糖做為碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，接著在56℃下培養(yǎng)六小時(shí)，此時(shí)細(xì)胞的濃度大約為每毫升三億，1毫升的這種液體培養(yǎng)體無(wú)菌地轉(zhuǎn)接于10毫升預(yù)溫的新鮮木聚糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再讓它做為分批培養(yǎng)在56℃下生長(zhǎng)。
四小時(shí)后，接著體中的細(xì)胞濃度大約為每毫升一億。1毫升這種液體培養(yǎng)體無(wú)菌地轉(zhuǎn)接于100毫升預(yù)溫的新鮮木聚糖培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基至少補(bǔ)充4.3%(0.01M)葡萄糖酸鈣。培養(yǎng)體保持在稀釋的瓶中，并用40毫升無(wú)菌礦物油覆蓋，以確濃度達(dá)到每毫升二十億。
這些產(chǎn)溶媒的細(xì)胞按下述方法收獲在22，000xg下離心30分鐘，重新懸浮于無(wú)菌蒸餾水中，此過(guò)程重復(fù)一次，然后再以上述速度離心30分鐘，此時(shí)細(xì)胞易于靜止并在4℃下儲(chǔ)存起來(lái)。
上述細(xì)胞用PertroffHausser計(jì)數(shù)器在顯微鏡下進(jìn)行差別計(jì)數(shù)，以確定細(xì)胞總數(shù)、單個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)度、孢子囊數(shù)目、及折光性孢子數(shù)目。上述觀察是利用放大400倍olypus的位相差顯微鏡，而形態(tài)學(xué)的測(cè)定則在一千倍下進(jìn)行。
培養(yǎng)體的上清液用氣-液色譜分析，這種色譜Hewlett-Packard氣-液色譜，裝有火焰檢測(cè)器和strip-chart記錄儀，最初的代謝物在不銹鋼柱(0.31cm×1.82m)中分離，柱內(nèi)填充吸附有10%SP-1000/1%HPO的100-120hromosorbWAW擔(dān)體(Supelco，Inc).柱在200℃條件下處理48小時(shí)，分析時(shí)進(jìn)樣口溫度為200℃，檢測(cè)器溫度為250℃。預(yù)先純化的氮?dú)鉃檩d氣，流速為40ml/min.這樣打入10ml樣品后，恒溫在80℃保持2分鐘，接著以每分鐘8℃程序升溫到170℃，隨后保持2分鐘，從參考的標(biāo)準(zhǔn)峰面積可以計(jì)算出代謝物的百分比并換算成毫摩爾濃度。
為計(jì)數(shù)和氣-液色譜分析，獲得的樣品在2200g速率下進(jìn)一步離心30分鐘以便從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，將這些細(xì)胞再懸浮在無(wú)菌蒸餾水中，經(jīng)聲波打散到90%，這可通過(guò)位相差顯微鏡來(lái)檢驗(yàn)。配備有hewlett-Pac-Kard9000計(jì)算機(jī)和autosampler的模型為400的Dionex離子色譜用來(lái)進(jìn)行離子色譜分析。陽(yáng)離子在CS-1柱上分離。鈉、銨、鉀的洗脫物是8mM鹽酸加上1mM2，3-二氨基丙銅酸，其流速為2ml/min鎂，錳和鈣的洗脫物是48mM的鹽酸加上8mM的2，3-二氨基丙酮酸，流速為0.8ml/min.陰離子AS4A柱上分離，洗脫物為1.92mM碳酸鈉加上2.4mM碳酸氫鈉，流速為2ml/min。
6、結(jié)果重復(fù)轉(zhuǎn)移到木聚糖培養(yǎng)基生長(zhǎng)在六小時(shí)內(nèi)而同步化的培養(yǎng)體，進(jìn)一步在含有過(guò)量葡萄糖酸鈣的木聚糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)45小時(shí)，證明了細(xì)胞在數(shù)量和質(zhì)量上均有高度的同步化。差別計(jì)數(shù)表明了細(xì)胞質(zhì)量上的同步化可達(dá)69.3%。數(shù)量上的上述同步化可達(dá)76.7%。90%以上的同步化的產(chǎn)溶媒的細(xì)胞至少延長(zhǎng)四倍，并且顯示一種修飾過(guò)的細(xì)胞分裂保持在至少4倍于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)度的特定長(zhǎng)度上。折光性的孢子幾乎可以忽略不計(jì)。
范例2除下列步驟外，其它步驟同范例1。第一次將原種培養(yǎng)以1∶10的稀釋培養(yǎng)，緊接著這種培養(yǎng)體以1∶10的稀釋于預(yù)溫的新鮮木聚糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行第二次培養(yǎng)。這樣稀釋物再在56℃下做為分批培養(yǎng)來(lái)培養(yǎng)。四小時(shí)之后，細(xì)胞濃度可達(dá)大約一億。這個(gè)步驟插入之后再進(jìn)行范例1中的其他步驟，90%以上的同步細(xì)胞延長(zhǎng)至四倍，并且展示一種修飾過(guò)的細(xì)胞分裂保持在至少四倍子營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)度的特定長(zhǎng)度上。折光性孢子的數(shù)目可忽略不計(jì)。
范例3重復(fù)范例I的步驟，但到45小時(shí)培養(yǎng)之后，培養(yǎng)體放于冰浴中使其溫度下降到35℃，再轉(zhuǎn)移到35℃的旋轉(zhuǎn)器中，培養(yǎng)135小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間為180小時(shí))。180小時(shí)后，培養(yǎng)體的細(xì)胞濃度可達(dá)到每毫升約二十億，通過(guò)這種方式制備的細(xì)胞可產(chǎn)生10.6%的溶媒，丁醇與乙醇比為2∶1。
圖5表明了同步化的細(xì)胞數(shù)量與相應(yīng)的溶媒濃度之間的關(guān)系。曲線A表明了總的細(xì)胞數(shù)，并附注有同步化的百分比在括符內(nèi)。曲線B表明所產(chǎn)溶媒的絕對(duì)濃度，并注有體積對(duì)體積的酒精濃度在括符內(nèi)。溶媒的總的毫摩爾的濃度等于各種溶媒丙酮、丁醇、乙醇、民丙醇和甲醇濃度的總和。
盡管從發(fā)酵的開(kāi)始就有溶媒的產(chǎn)生，但是正如曲線B所表示的那樣，總的毫摩爾數(shù)量是相當(dāng)?shù)偷?，此時(shí)細(xì)胞正處于曲線A所表示的同步化生長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)。培養(yǎng)45小時(shí)之后，將溫度變?yōu)?5℃時(shí)，被捕捉到的延長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)入溶媒產(chǎn)量增加的時(shí)期。以致于在115小時(shí)總濃度度達(dá)到3.6%，130小時(shí)濃度達(dá)到6.3%，145小時(shí)濃度進(jìn)一步增加到9.8%，在175小時(shí)濃度達(dá)到最高，為10.6%。
范例4
除下述步驟外，其他過(guò)程同范例3。在例3中56℃下培養(yǎng)45小時(shí)后，接著降低培養(yǎng)溫度，使培養(yǎng)體在35℃下繼續(xù)培養(yǎng)155小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間為200小時(shí))，200小時(shí)之后，細(xì)胞濃度達(dá)到大約每毫升20億。按這種方式制備的細(xì)胞，其溶媒產(chǎn)量可達(dá)6.5%，其中丁醇與乙醇之比為1∶1。
范例5除下述步驟外，其他過(guò)程同范例3，例3中56℃下培養(yǎng)45小時(shí)后，接著降低培養(yǎng)溫度，使培養(yǎng)體在35℃下繼續(xù)培養(yǎng)200小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間為245小時(shí))，245小時(shí)后，細(xì)胞濃度可達(dá)到大約每毫升二十億，按這種方式制備的細(xì)胞可產(chǎn)生大量的抗菌素，如多粘菌素、桿菌素、醣類水解酶、如淀粉酶、蛋白酶、脂及酶、核酸酶、不規(guī)則狀-蛋白晶體、以及有折光性的成熟的自由孢子。
范例6除下例步驟外，其它過(guò)程同范例1，范例1培養(yǎng)45小時(shí)后，接蓍將培養(yǎng)體轉(zhuǎn)移到溫度為70℃，使培養(yǎng)體在70℃再培養(yǎng)135小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間為180小時(shí))。180小時(shí)后，細(xì)胞濃度可達(dá)到大約每毫升二十億。按這種方式制備的細(xì)胞可產(chǎn)生10.6%的溶媒，其中丁醇與乙醇之比為2∶1。
范例7除下列步驟外，其它過(guò)程同范例6，培養(yǎng)器中溫度升到70℃后，使培養(yǎng)體70℃下再培養(yǎng)155小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間為200小時(shí))，200小時(shí)后，培養(yǎng)體的濃度達(dá)到每毫升二十億，按照這種方式制備的細(xì)胞可產(chǎn)生6.5%溶媒，其中丁醇與乙醇之比為1∶1。
范例8除下列步驟外，其他過(guò)程同范例6，范例6中溫度變?yōu)?0℃后，使培養(yǎng)體在70℃下再培養(yǎng)200小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間為245小時(shí))，245小時(shí)后細(xì)胞濃度可達(dá)到大約每毫升二十億，按照這種方式制備的細(xì)胞可產(chǎn)生抗菌素、醣水解酶、不規(guī)則狀蛋白晶狀，以及折光性的成熟的自由孢子。范例9除下列步驟外，其他過(guò)程同范例1。范例1中培養(yǎng)45小時(shí)后，為了抑制細(xì)胞分裂，向培養(yǎng)體中加終濃度為20mM的氯微素。培養(yǎng)體再培養(yǎng)27小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí))。72小時(shí)后細(xì)胞濃度為可達(dá)到大約為每毫升二十億。按這種方式制備的細(xì)胞可產(chǎn)生10.6%的溶媒，其中丁醇與乙醇之比為2∶1。
范例10除下列步驟外，其他過(guò)程同范例9，例9中加入氯微素后，培養(yǎng)體培養(yǎng)42再小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間為87小時(shí))。87小時(shí)后，細(xì)胞濃度可達(dá)到大約每毫升二十億。按這種方式制備的細(xì)胞可產(chǎn)生6.5%溶媒，其中丁醇與乙醇之比為1∶1。
圖3表明了在含有葡萄糖酸鈣的木聚糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的單個(gè)同步化的細(xì)胞結(jié)合鈣的情況。正像曲線A1-A4表示的那樣，溶媒產(chǎn)量最高的時(shí)候也是鈣結(jié)合最高的時(shí)候。曲線A1，(A2，A3，A4)中，通過(guò)加氯微素，曲線A2加萘啶酮酸、曲線A3加絲裂微素、曲線A4加吖啶橙，細(xì)胞分裂在45小時(shí)處停止。曲線A2中用萘啶酮處理的細(xì)胞在72小時(shí)處可產(chǎn)生7。1%的溶媒，這與最高鈣結(jié)合，3.162毫微摩爾相對(duì)應(yīng)。曲絲4表示同樣培養(yǎng)基中加入吖啶橙至已同步化細(xì)胞，溶媒濃度可達(dá)到8.1%，此時(shí)結(jié)合鈣為1.163毫微摩爾。曲線B代表在同樣培養(yǎng)基中非同步化的細(xì)胞個(gè)體結(jié)鈣的情況。
范例11除下列步驟外，其他過(guò)程同范例1。例1中所用培養(yǎng)基改為含有1.1%(0.1M)碳酸鈣的木聚糖孢子形成培養(yǎng)基，45小時(shí)后，細(xì)胞在數(shù)量和質(zhì)量上表現(xiàn)出高度的同步化。細(xì)胞的差別計(jì)數(shù)表明細(xì)胞在質(zhì)量上48.8%同步化。數(shù)量上有56.3%同步化。90%以上的這些同步化產(chǎn)溶媒細(xì)胞至少延長(zhǎng)四倍，并展示一種修改過(guò)的細(xì)胞分裂保持至少四倍于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)度的特定長(zhǎng)度上。折光性的、成熟自然孢子可忽略不計(jì)。
范例12除下列步驟外，其他過(guò)程同范例11。例11中培養(yǎng)到45小時(shí)后，把培養(yǎng)體放入冰浴中使其溫度降至35℃并轉(zhuǎn)于35℃下旋轉(zhuǎn)的培養(yǎng)器。培養(yǎng)體在35℃下再培養(yǎng)200小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間為245小時(shí))。245小時(shí)后細(xì)胞濃度可達(dá)到每毫升約二十億。按這種方式制備的細(xì)胞可產(chǎn)生抗菌素、醣水解酶、不規(guī)則狀蛋白晶體，以及折光性的、成熟的自由孢子。
范例13除下列步驟外，其他過(guò)程同范例12。例12中培養(yǎng)45小時(shí)后，把培養(yǎng)體轉(zhuǎn)移到70℃的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器中使其溫度增加至70℃，培養(yǎng)體在70℃下再培養(yǎng)200小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間為245小時(shí))。245小時(shí)后，細(xì)胞濃度可達(dá)每毫升二十億，按這種方式制備的細(xì)胞可產(chǎn)生抗菌素、醣水解酶、不規(guī)則狀蛋白晶體，以及折光性的，成熟的自由孢子。
范例14除下列步驟外，其他過(guò)程同范例11。例11中培養(yǎng)到45小時(shí)后，為了抑制細(xì)胞繼續(xù)分裂，加入終濃度為20mM的萘啶酮酸。培養(yǎng)體再培養(yǎng)27小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí))，72小時(shí)后細(xì)胞濃度可達(dá)到大約每毫升二十億，按這種方式制備的細(xì)胞產(chǎn)生可以忽略不計(jì)的溶媒，但可產(chǎn)生抗菌素、醣水解酶、不規(guī)則狀蛋白晶體以及有折光性的成熟的自由孢子。
圖4表明了培養(yǎng)在含有碳酸鈣木聚糖培養(yǎng)基中單個(gè)同步化細(xì)胞結(jié)合鈣的情況。盡管這些細(xì)胞不產(chǎn)生高含量的溶媒，但正像曲線A1-A4所表示的那樣，最高溶媒產(chǎn)量(0.2～0.4%)與最高結(jié)合鈣相互關(guān)聯(lián)。通過(guò)加入氯微素，萘啶酮酸，絲裂微素，吖啶橙，細(xì)胞分裂在45小時(shí)停止，見(jiàn)曲線A1，A2，A3，A4。曲線A2中用萘啶酮酸抑制的同步細(xì)胞在72小時(shí)結(jié)合12.492毫微摩爾的鈣，并且40-50%的細(xì)胞表現(xiàn)出末端膨大的跡象，這表示孢子的形成從第Ⅳ期進(jìn)入第Ⅴ期。相反的，曲線A4用吖啶橙抑制的生長(zhǎng)在相同培養(yǎng)基中的同步化細(xì)胞只結(jié)合754毫微摩爾的鈣，產(chǎn)生0.4%的溶媒。曲線B代表培養(yǎng)在相同培養(yǎng)基非同步化的單個(gè)細(xì)胞結(jié)合鈣的情況。
范例15除下列步驟外，其他過(guò)程同范例1，將例1中所用培養(yǎng)基改為含有4.3%萄糖酸鈣做為叭一碳源的孢子形成培養(yǎng)基，培養(yǎng)45小時(shí)后，細(xì)胞濃度可達(dá)到大約每毫升二十億，按這種方式制備的細(xì)胞是高度延長(zhǎng)并產(chǎn)生溶媒的。折光性的、成熟的自由孢子及折光性的孢子產(chǎn)生很少。
范例16除下列步驟外，其他過(guò)程同范例15。范例15中培養(yǎng)到45小時(shí)后，接著把培養(yǎng)體放入冰浴中后溫度降至35℃并轉(zhuǎn)移于35℃旋轉(zhuǎn)的培養(yǎng)器來(lái)將溫度降到35℃。在35℃再繼續(xù)培養(yǎng)135小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間為180小時(shí))，經(jīng)180小時(shí)后，細(xì)胞濃度可達(dá)到大約每毫升二十億，按這種方式制備的細(xì)胞可產(chǎn)生10.6%的溶媒，其丁醇與乙醇的比為2∶1。
范例17除下列步驟外，其他過(guò)程同范例16，例16中溫度降低后，細(xì)胞培養(yǎng)155小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間為200小時(shí))，200小時(shí)后，細(xì)胞濃度可達(dá)到大約每毫升二十億，按這種方式制備的細(xì)胞可產(chǎn)生6.5%的溶媒，其丁醇與乙醇之比為1∶1。
范例18除下列步驟外，其他過(guò)程同范例15，例15中培養(yǎng)45個(gè)小時(shí)后，接著把培養(yǎng)體轉(zhuǎn)移到70℃的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器中使培養(yǎng)溫度增加至70℃，在70℃再培養(yǎng)135小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間為180小時(shí))，180小時(shí)后，細(xì)胞濃度可達(dá)到大約每毫升二十億，按這種方式制備的細(xì)胞可產(chǎn)生10.6%的溶媒，其丁醇與乙醇之比為2∶1。
范例19除下列步驟外，其他過(guò)程同范例18。例18中增加溫度后，再在70℃下培養(yǎng)155小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間195小時(shí))。195小時(shí)后，細(xì)胞濃度可達(dá)到大約每毫升二十億，按這種方式制備的細(xì)胞可產(chǎn)生6.5%的溶媒，其丁醇與乙醇之比為1∶1。
范例20除下列步驟外，其他過(guò)程同范例15。范例15中培養(yǎng)45小時(shí)后，為了阻止細(xì)胞進(jìn)一步分裂，向培養(yǎng)基中加終濃度為20mM的氯微素。培養(yǎng)體再培養(yǎng)27個(gè)小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí))。27小時(shí)后，細(xì)胞濃度可達(dá)到大約每毫升二十億，按這種方式制備的細(xì)胞，可產(chǎn)生10.6%的溶媒，其丁醇與乙醇之比為2∶1。
范例21除下步驟外，其他過(guò)程同范例15，例15中培養(yǎng)45小時(shí)后接著加入氯微素，培養(yǎng)體再繼續(xù)培養(yǎng)42小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間為87小時(shí))，87小時(shí)后細(xì)胞濃度可達(dá)到大約每毫升為二十億，按這種方式制備的細(xì)胞可產(chǎn)生6.5%的溶媒，其丁醇與乙醇之比為1∶1。
圖5表明了培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖酸鈣與培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)的單個(gè)細(xì)胞結(jié)合鈣的情況。曲線A1-A4表示溶劑產(chǎn)生的高峰與結(jié)合鈣之間的相互關(guān)系。通過(guò)加入氯微素(萘啶酮，絲裂酶素，吖啶橙)細(xì)胞分裂在26小時(shí)停止(分見(jiàn)曲線A1，A2，A3，A4)。用萘啶酮酸處理過(guò)的同步化細(xì)胞在72小時(shí)處產(chǎn)生9.1%的溶媒(見(jiàn)曲線A2)，與1.940毫微摩爾的結(jié)合鈣相對(duì)應(yīng)。曲線B代表培養(yǎng)在相同培養(yǎng)基中的非同步化單個(gè)細(xì)胞結(jié)合鈣的情況。
范例22除了下列步驟外，其它過(guò)程同范例1。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，利用葡萄糖酸鈣做為唯一碳源，其濃度至少4.3%，培養(yǎng)26個(gè)小時(shí)后，培養(yǎng)體的細(xì)胞濃度可達(dá)到每毫升二十億左右。通過(guò)這種方式制作的細(xì)胞是高度延長(zhǎng)和產(chǎn)溶的。所產(chǎn)生的折光性的、成熟自由孢子或折光性的孢子襄的數(shù)量甚少。
范例23除了下例步驟外，其它過(guò)程同范例7。培養(yǎng)26個(gè)小時(shí)后，將培養(yǎng)體放入冰浴中使溫度降到35度并轉(zhuǎn)移到35度的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器中繼續(xù)培養(yǎng)135個(gè)小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間為180個(gè)小時(shí))。180個(gè)小時(shí)后，培養(yǎng)體的細(xì)胞濃度可達(dá)到二十億左右。通過(guò)這各方式制作的細(xì)胞可產(chǎn)生10.6%的溶媒，其丁醇與乙醇的比例為2∶1。
范例24除了下例步驟外，其它過(guò)程同范例22。溫度降低后，細(xì)胞再培養(yǎng)155個(gè)小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間為200個(gè)小時(shí))。之后培養(yǎng)體的細(xì)胞濃度為二十億。通過(guò)這種方式制作的細(xì)胞可產(chǎn)生6.5%的溶媒，其丁醇與乙醇之比為1∶1。
范例25除了下列步驟外，其它過(guò)程同范例22。培養(yǎng)26個(gè)小時(shí)后，培養(yǎng)體轉(zhuǎn)移到70度下的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)中使溫度嗇到70度。之后，培養(yǎng)體再在35度培養(yǎng)135個(gè)小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間為180個(gè)小時(shí))。180個(gè)小時(shí)后，培養(yǎng)體的細(xì)胞濃度可達(dá)到二十億左右。通過(guò)這種方式制作的細(xì)胞產(chǎn)生10.6%的溶媒，其中丁醇與乙醇的比例為1∶1。
范例26除下列步驟外，其它過(guò)程同范例22。溫度增加后，培養(yǎng)體在70度下再培養(yǎng)155個(gè)小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間為195個(gè)小時(shí))。195個(gè)小時(shí)后，培養(yǎng)體的細(xì)胞濃度可達(dá)到二十億左右。通過(guò)這種方式制作的細(xì)胞產(chǎn)生6.5%的溶媒，其中丁醇與乙醇的比例為1∶1。
范例27除下列步驟外，其它過(guò)程同范例22。培養(yǎng)26個(gè)小時(shí)，為了阻止細(xì)胞進(jìn)一步分裂，向培養(yǎng)基中加入微素，其終濃度為20UM。培養(yǎng)體再培養(yǎng)27個(gè)小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間為72個(gè)小時(shí))。72個(gè)小時(shí)后，培養(yǎng)體的細(xì)胸濃度達(dá)到二十億左右。通過(guò)這種方式制作的細(xì)胞產(chǎn)生10.6%的溶媒，其中丁醇與乙醇的比例為2∶1。
范例28除下列步驟外，其它過(guò)程同范例22。添加氯霉素后，培養(yǎng)體再培養(yǎng)42個(gè)小時(shí)(總培養(yǎng)時(shí)間為87個(gè)小時(shí))。之后，培養(yǎng)體的細(xì)胞濃度可達(dá)二十億左右。通過(guò)這種方式制作的細(xì)胞可產(chǎn)生6.5%的溶媒，其丁醇與乙醇之比為1∶1。
在細(xì)胞增殖過(guò)程中，利用油質(zhì)原料做為生長(zhǎng)培養(yǎng)基的覆蓋層，此油層具有保持厭氧和提供第二種碳源的雙重功能，飽和烴如蠟油是好的油劑，主要是因?yàn)樗鼉r(jià)廉易得。因此，利用石蠟油做為生長(zhǎng)培養(yǎng)基的覆蓋物質(zhì)為一般的容器進(jìn)行發(fā)酵提供了條件，從而避免了必須利用昂貴的發(fā)酵設(shè)備，而這種設(shè)備常由冷卻、通氣和攪拌工具組成。在上述過(guò)程中，在沒(méi)有干擾排氣、油層粘性的條件下，對(duì)生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行適當(dāng)?shù)木徛龜噭?dòng)即可。頂端具有開(kāi)口的水泥容器，金屬容器或木容器都可。這樣就允許利用現(xiàn)有的結(jié)構(gòu)。
同樣地，基于唯一需要的外界能量是使生長(zhǎng)培養(yǎng)基的溫度增加到某一需要水平，如熱解糖梭菌大約在56℃，在許多情況下，從太陽(yáng)能獲得的熱能就夠了。尤其是，生長(zhǎng)培養(yǎng)基裝在太陽(yáng)下的金屬容器里。如果碳源是來(lái)自紙槳工廠里廢棄的槳狀物，而這些槳狀物通常來(lái)自至少90℃左右溫度下的工廠，那么，在開(kāi)始上述發(fā)酵工藝之前只須要冷卻到所需溫度。
綜上所述，本發(fā)明能充分利用現(xiàn)有的條件設(shè)備達(dá)到比較好的效果，可普遍用于細(xì)胞及代謝物的生長(zhǎng)過(guò)程中。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，采用這種方法利用某種碳源可選擇性地生產(chǎn)下列代謝終產(chǎn)物溶媒、酶、抗菌素、有用的毒素蛋白或孢子，其特征在于這種制作特殊的細(xì)菌的方法，包括如下的工藝步驟向每毫升含有1×106數(shù)的梭菌屬細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中提供一種緩慢的代謝碳源，在預(yù)先決定的條件下，該菌普遍能夠分解這種碳源產(chǎn)生下列代謝產(chǎn)物如溶媒、酶、抗菌素、蛋白質(zhì)、孢子等中的某一種；提供至少0.01M左右的二價(jià)陽(yáng)離子來(lái)穩(wěn)定上述細(xì)胞；在使得上述細(xì)胞在數(shù)量上同步化生長(zhǎng)的同時(shí)，通過(guò)下列方法誘導(dǎo)細(xì)胞至少延長(zhǎng)三倍而達(dá)到某一特定長(zhǎng)度a)在上述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)細(xì)胞使其濃度有限地只增加到起始的2～3倍，在培養(yǎng)的過(guò)程中，培養(yǎng)基保持在該菌最適生長(zhǎng)溫度的-20℃～+10℃范圍內(nèi)；b)此后，讓細(xì)胞再次培養(yǎng)使其濃度比先前濃度增大2～3倍，培養(yǎng)時(shí)所用的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的溫度保持在步驟a)范圍內(nèi)的某一溫度，這樣就不會(huì)產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，從而不會(huì)干擾上述細(xì)胞的同步生長(zhǎng)；c)之后，在步驟b)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中補(bǔ)充至少0.01M的二價(jià)陽(yáng)離子來(lái)穩(wěn)定上述細(xì)胞，即在這種培養(yǎng)基中，使細(xì)胞再次培養(yǎng)，使其濃度比先前濃度再增加至少二倍；使由c)步產(chǎn)生的細(xì)胞處于抑制細(xì)胞分裂的狀態(tài)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于上述方法中的步驟c)中包括添加至少0.01M到0.2M的上述陽(yáng)離子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于上述方法中的步驟3)中包括添加至少0.01M的上述二價(jià)陽(yáng)離子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于上述方法中的細(xì)胞的延長(zhǎng)和細(xì)胞在數(shù)量和有效質(zhì)量上同步化生長(zhǎng)通過(guò)下列步驟來(lái)完成重復(fù)上述方法中的步驟b)代替步驟c);為了穩(wěn)定上述細(xì)胞，在添加一種陽(yáng)離子的同時(shí)，再次重復(fù)上述方法中的步驟b)，此后，再次培養(yǎng)細(xì)胞使其細(xì)胞濃度至少增加到先前的兩倍左右;最后使最終產(chǎn)生的細(xì)胞易于處于抑制細(xì)胞分裂的狀態(tài)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法其特征在于為了使上述方法中的步驟c)產(chǎn)生的細(xì)胞易于處于抑制細(xì)胞分裂狀態(tài)，通過(guò)加入某種抗微生物試劑來(lái)完成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于所說(shuō)的抗微生物試劑可從氯霉素、絲裂霉素、萘啶酮酸和吖啶橙中選擇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于為了使上述方法中的步驟產(chǎn)生的細(xì)胞易于處于抑制細(xì)胞分裂狀態(tài)，可通過(guò)使上述細(xì)胞溫度降低到低于步驟a)所注明的溫度范圍來(lái)完成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于為了使上述方法中的步驟產(chǎn)生的細(xì)胞易于處于抑制細(xì)胞分裂狀態(tài)，可通過(guò)使上述細(xì)胞溫度增加到高于步驟a)所注明的溫度范圍來(lái)完成。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的碳源是一種該菌的生長(zhǎng)速度為在最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基中所具有的最大生長(zhǎng)速度的90%的碳源。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于生長(zhǎng)培養(yǎng)基包括大量比例的戊糖聚合體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于生長(zhǎng)培養(yǎng)基包括大量比例的緩慢代謝的碳源，這種碳源從下列物質(zhì)中選擇苦杏仁苷，阿拉伯糖，纖維二糖，半乳糖，蜜二糖，a甲基葡萄糖苷，b甲基葡萄糖苷、棉子糖、水楊苷、淀粉、海藻糖、木聚糖、乙酸鈣、丁酸鈣、檸檬酸鈣、甲酸鈣、葡萄糖酸鈣和乳酸鈣。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于生長(zhǎng)培養(yǎng)基是一種含有大量比例的原始材料，這種材料可從下列物質(zhì)中選擇麥桿、稻草、稻殼、玉米莖、玉米棒、鋸沫、木屑，纖維素和纖維素殘?jiān)?br>
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于所述的二價(jià)陽(yáng)離子可從下列陽(yáng)離子中選擇鎂、錳、鐵、鋅和鈣。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于所述的二價(jià)陽(yáng)離子從下列物質(zhì)中選擇葡萄糖酸鈣、乳酸鈣、乙酸鈣、丁酸鈣、甲酸鈣、碳酸鈣、硫酸鈣。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于所述的二價(jià)陽(yáng)離子為葡萄糖酸鈣或由機(jī)鈣化合物來(lái)提供。
16.一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，采用這種方法利用某種碳源可選擇性地生產(chǎn)下列代謝終產(chǎn)物溶媒、酶、抗菌素、有用的毒素蛋白或孢子，其特征在于這種制作特殊的細(xì)菌的方法，包括如下的工藝步驟向每毫升不小于1×10個(gè)梭菌屬的細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中提供一種緩慢的代謝碳源，在預(yù)先決定的條件下，細(xì)菌普遍具有分解這種碳源產(chǎn)生上述溶媒的能力;在使得上述細(xì)菌在數(shù)量和有效質(zhì)量上同步化生長(zhǎng)的同時(shí)，通過(guò)下列方法誘導(dǎo)細(xì)胞延長(zhǎng)到至少三倍而達(dá)到某一特定長(zhǎng)度a)、再次培養(yǎng)，使細(xì)胞在上述培養(yǎng)基中的濃度增加到不少于2×105個(gè)/ml～3×105個(gè)/ml左右，在培養(yǎng)的過(guò)程中，培養(yǎng)基的溫度保持在該菌最佳生長(zhǎng)溫度的-20℃～+10℃范圍內(nèi)的某一溫度;b)、取出一部分含有上述細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并用新鮮生長(zhǎng)的培養(yǎng)基從1∶2稀釋至1∶100左右，此后，使細(xì)胞再進(jìn)一步增殖到其濃度至少約為2×106個(gè)/ml～3×106個(gè)/ml，在增殖時(shí)，培養(yǎng)基的溫度保持在步驟a)的溫度范圍內(nèi);c)重復(fù)步驟b)，此時(shí)稀釋度為1∶2至1∶500左右，同時(shí)添加至少0.01M左右的二價(jià)陽(yáng)離子來(lái)穩(wěn)定上述細(xì)胞，此后使細(xì)胞進(jìn)一步增殖到其濃度為2×106個(gè)/ml左右;使由步驟c)產(chǎn)生的細(xì)胞處于抑制細(xì)胞分裂的狀態(tài)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于上述方法中的步驟c)中包括添加至少0.01M～0.2M的上述陽(yáng)離子源。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于上述方法中的步驟c)中包括添加至少0.1M左右的上述陽(yáng)離子源。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于上述方法中的細(xì)胞的延長(zhǎng)和細(xì)胞在數(shù)量和有效質(zhì)量上的同步化，可通過(guò)下列步驟來(lái)完成d)重復(fù)步驟b)代替步驟c)，及e)、再次重復(fù)步驟b)，此時(shí)，稀釋度從1∶2～1∶500左右，同時(shí)增加二價(jià)陽(yáng)離子源來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞，此后，使進(jìn)一步增殖到濃度不少于2×106個(gè)/ml左右;最后，使由步驟e)產(chǎn)生的細(xì)胞處于抑制細(xì)胞分裂的狀態(tài)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于上述細(xì)胞的延長(zhǎng)和細(xì)胞在數(shù)量和有效質(zhì)量上的同步化生長(zhǎng)，可通過(guò)下列步驟來(lái)完成f)從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分離上述細(xì)胞，并重新懸浮于一定量的新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，然后，使細(xì)胞進(jìn)一步增殖到其濃度不少于4×106個(gè)/ml到6×106個(gè)/ml左右，在增殖時(shí)，培養(yǎng)基的溫度保持在步驟a)的范圍;重復(fù)步驟e)，直到其細(xì)胞濃度至少為4×10個(gè)/ml.
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于所說(shuō)的細(xì)胞的分離可通過(guò)離心分離方法來(lái)完成。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于所說(shuō)的細(xì)胞分離可通過(guò)膜過(guò)濾的方法來(lái)完成。
23.一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，可采用對(duì)細(xì)菌進(jìn)行特殊的制備方法，使細(xì)菌在發(fā)酵過(guò)程中生產(chǎn)包括已醇在內(nèi)的有機(jī)溶媒，其特征在于其工藝方法如下向每毫升不少于1×106個(gè)梭菌屬的細(xì)菌的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中提供一種緩慢代謝的碳源，在預(yù)先決定的條件下，上述細(xì)菌在遺傳上具有分解這種碳源產(chǎn)生上述溶媒的能力;細(xì)胞在數(shù)量和有效質(zhì)量上同步化生長(zhǎng)的同時(shí)，可通過(guò)下列步驟來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞延長(zhǎng)至少三倍而達(dá)到某一特定長(zhǎng)度a)、再次培養(yǎng)細(xì)胞，使其在上述培養(yǎng)基中增殖約1.0～1.5代，增殖時(shí)，培養(yǎng)基的溫度保持在該菌最適生長(zhǎng)的溫度的-20℃～+10℃左右的范圍內(nèi);b)、此后，再次培養(yǎng)細(xì)胞使其在某一生長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)一步增殖1.0～1.5代左右，增殖時(shí)，生長(zhǎng)培養(yǎng)基的溫度保持在步驟a)的范圍內(nèi)，這樣就不會(huì)產(chǎn)生大量的細(xì)胞內(nèi)代謝物，從而不干擾上述細(xì)胞的同步化生長(zhǎng);c)重復(fù)步驟b)，同時(shí)至少添加0.01M左右的二價(jià)陽(yáng)離子來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞，此后使細(xì)胞進(jìn)一步增殖至少約一代;最后，使由步驟c)產(chǎn)生的細(xì)胞處于抑制細(xì)胞分裂的狀態(tài)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于上述方法中的步驟C)中包括添加0.01M-0.2M左右的上述二價(jià)陽(yáng)離子源。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于上述方法中的步驟℃)中包括添加0.1M左右的上述二價(jià)陽(yáng)離子源。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于上述細(xì)胞的延長(zhǎng)及細(xì)胞在數(shù)量和有效質(zhì)量上同步化生長(zhǎng)，可通過(guò)下列步驟來(lái)完成重復(fù)步驟b)代替步驟c)，及重復(fù)步驟b)，同時(shí)加入二價(jià)陽(yáng)離子來(lái)穩(wěn)定上述細(xì)胞;最后，使產(chǎn)生的細(xì)胞處于抑制細(xì)胞分裂狀態(tài)。
27.一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，通過(guò)這種方法可利用某種碳源選擇性地生產(chǎn)下列代謝終產(chǎn)物溶媒、酶、抗菌素、有用的毒素蛋白或孢子，其特征在于其工藝由下列步驟組成向每毫升不小于1×106個(gè)梭菌屬的細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中提供一種緩慢的代謝碳源，在預(yù)先決定的條件下，細(xì)菌在遺傳上能代謝這種碳源，可產(chǎn)生一代謝產(chǎn)物，包括溶媒、酶、抗抗拒菌素、蛋白質(zhì)或孢子等;細(xì)菌在數(shù)量和有效質(zhì)量上同步化生長(zhǎng)的同時(shí)，通過(guò)毓的再次培養(yǎng)和稀釋來(lái)誘導(dǎo)同步化的細(xì)菌細(xì)胞的延長(zhǎng)而達(dá)到至少三倍的某一特定長(zhǎng)度，毓的再次培養(yǎng)和稀釋時(shí)的溫度控制，在菌的最適生長(zhǎng)溫度為-20℃-+10℃范圍內(nèi)的某一種溫度，每次培養(yǎng)的時(shí)間不得超過(guò)細(xì)胞增殖2-3倍吉原始濃度所需的時(shí)間;最后，在細(xì)胞增殖的最后階段，加入不少于0.01M左右的二價(jià)陽(yáng)離子把細(xì)胞穩(wěn)定下來(lái)。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于處于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中增殖的細(xì)胞的厭氧條件，可通過(guò)覆蓋油層于培養(yǎng)基上來(lái)實(shí)現(xiàn)，此油層可作為第二種碳源。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于上述的油層物質(zhì)是一種石蠟油。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的一種生產(chǎn)特種細(xì)菌的工藝方法，其特征在于細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中增殖的同時(shí)，包括機(jī)械地?cái)噭?dòng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的步驟，不致攪動(dòng)大氣中的氧氣，也不致防礙上面油層的完整。
全文摘要
本文揭示了利用特殊狀態(tài)的梭菌生產(chǎn)溶煤、酶、抗生素、毒素蛋白或孢子的一種方法。用一種經(jīng)濟(jì)的、易得的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，通過(guò)控制條件經(jīng)再次培養(yǎng)使細(xì)胞在數(shù)量和有效質(zhì)量上進(jìn)行同步化生長(zhǎng)，從而產(chǎn)生大量同源化的細(xì)胞，最終使細(xì)胞延長(zhǎng)至少約三倍而達(dá)到特定長(zhǎng)度。不少于0.01M左右的二價(jià)陽(yáng)離子如鈣加入到特定長(zhǎng)度的同步化的細(xì)胞來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞使其不致于死亡、裂解或聚集。并且最后，可讓細(xì)胞繼續(xù)形成孢子直到整個(gè)細(xì)胞群體中大部分是折光性的、成熟的自由孢子為止。這些孢子可收獲并儲(chǔ)起來(lái)用做他用。
文檔編號(hào)C12P7/04GK1083108SQ9210953
公開(kāi)日1994年3月2日 申請(qǐng)日期1992年8月20日 優(yōu)先權(quán)日1992年8月20日
發(fā)明者愛(ài)德華·J·許, 珊珠·I·蘭米士特 申請(qǐng)人:安徽財(cái)貿(mào)學(xué)院