專利名稱：棉花的再生和轉(zhuǎn)化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及棉花，特別是陸地棉(Gossypium hirsutum L.)品種的植株再生和轉(zhuǎn)化。
近年來，屬于不同分類群之植物的許多不同起源的組織都已經(jīng)被作為離體組織培養(yǎng)物。也已確定了某些控制這類培養(yǎng)物生長(zhǎng)和分化的因素。各類植物激素，和直接或間接，單獨(dú)或協(xié)同起作用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑之間微妙的相互作用的確立，已經(jīng)使得對(duì)細(xì)胞、組織和器官之間可能存在的某些相互關(guān)系有了某種程度的認(rèn)識(shí)。然而資料并不完全。
已知有時(shí)可將植物細(xì)胞培養(yǎng)物無限期地維持在未分化增殖狀態(tài)。然而，只是在最近才發(fā)現(xiàn)可用實(shí)驗(yàn)方法誘使組織、器官或整個(gè)植物體重分化。Skoog等人在Symp.Soc，Exp，Biol，11∶18-130“Chemical re gulation of growth and organ formation in plant tissues cu ltured in vitro”一文(列為本文的參考文獻(xiàn))中論證了細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的相對(duì)比例可決定煙草木髓組織中器官發(fā)生的性質(zhì)。愈傷組織培養(yǎng)物的再組織或再生包括枝條原基或胚的形成，二者最終均導(dǎo)致植物幼株在體外發(fā)育。
器官發(fā)生與胚發(fā)生的趨向仍取決于所涉及的品種和某些化學(xué)性和/或物理性觸發(fā)因素的存在。
1902年，Haberlandt“Kulturversuche mit isolierten pflanzenzellen，”Mat.K I.Ksia.Akad，Wiss.Wien 111∶62(列為本文的參考文獻(xiàn))假定植物細(xì)胞具有產(chǎn)生整個(gè)植物的能力并預(yù)言總有一天可在細(xì)胞培養(yǎng)物中證實(shí)這一點(diǎn)。1965年，Reinert“Untersuchungen uber die morphogenese an Gewebekulturen，∶Ber.dt.Bot.Ges.71∶15，and Steward et al，”Growth and organized developmentof cultured cells/I I.Organization in cultures grown from freely suspended cells”，Am.J.Bot.45∶705-708各自分別進(jìn)一步證實(shí)了離體體細(xì)胞胚發(fā)生的存在。這兩篇文獻(xiàn)均列為本文的參考文獻(xiàn)。在用實(shí)驗(yàn)操縱體細(xì)胞胚發(fā)生時(shí)，據(jù)信培養(yǎng)基的兩種成分，即生長(zhǎng)素和氮源，起著關(guān)鍵性作用。
還證明了體細(xì)胞胚發(fā)生的過程有兩個(gè)階段第一階段，在高濃度生長(zhǎng)素存在下誘發(fā)形成具有胚發(fā)生能力的細(xì)胞;第二階段，在無或低濃度生長(zhǎng)素存在下胚細(xì)胞團(tuán)塊發(fā)育成胚。
誘導(dǎo)器官發(fā)生或胚發(fā)生可產(chǎn)生獨(dú)特的愈傷組織結(jié)構(gòu)。對(duì)若干植物品種的詳細(xì)研究使得能夠做出有關(guān)導(dǎo)致枝條，芽或胚發(fā)育的發(fā)育途徑的某些概括。
應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)使植物通過器官發(fā)生或胚發(fā)生而再生仍可能是形態(tài)發(fā)生方面的基礎(chǔ)研究對(duì)商業(yè)化應(yīng)用的最重要的貢獻(xiàn)。
1971年Beasley報(bào)導(dǎo)了在棉花胚珠培養(yǎng)物中愈傷組織的形成(見“In vitro culture of fertilized cotton ovules，”Bioscience21∶906∶907，1971，列為本文的參考文獻(xiàn))。此后，Hsu等人觀察到因向培養(yǎng)基中加入CPA和赤霉酸刺激了得自胚珠的愈傷組織的生長(zhǎng)｛見“Callus induct ion by[2-chlorethyl]phosphonic(CPA)acid in cultured cotton ovules，”Physiol.Plant 36∶150-153，1976列為本文的參考文獻(xiàn)｝。對(duì)于Gossypium hirsutum和G.aboreum，已經(jīng)建立了來自其它外植體的愈傷組織培養(yǎng)物，例如(a)葉子｛見Davis et al.，“In vitro culture of callus tissues and cell suspensions from okra[Hibiscus esculentus]and cotton(Gossypium hirsutum)”，In vitro 9∶395-398，1974，列為本文的參考文獻(xiàn)｝;(b)胚軸(見Schenk et al.“Medium and technique for induct ion and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cellcultures，”Can.J.Bot.50∶199-204，1972，列為本文的參考文獻(xiàn));和(c)子葉(見Rani et al.“Estabilishment of Tissue Cultures of Cotton”，Plant Sci.Lett.7∶163-169，1976，列為本文的參考文獻(xiàn))。
Katterman等人觀察到來自G.barbadense子葉的致密的愈傷組織形成根，并且還獲得了一例完整的植物再生(見“The influence of a strong reducing agent upon initiation of callus from the germinating seedlings of Gossypium barbadense”，Physiol.Plant 40∶98-101，1977，列為本文的參考文獻(xiàn))。Smith等人確定了G.arboreum胚軸衍生愈傷組織的建立和繼代培養(yǎng)的條件(見Definedco nditions for the initiation and growth of cotton callus in vi tro，Gossypium arboreum，”In vitro13∶329-334，1977，列為本文的參考文獻(xiàn))。后來，Price等人規(guī)定了來自棉屬五個(gè)種的愈傷組織的建立和繼代培養(yǎng)條件[見“Callus cultures of six species of cotton(Gossypium L)on defined media，”Pl.Sci.Lett.8∶115-119，1977，and“Tissue culture of Gossypium species and itspo tential incotton genetics and crop improvement，”Beltwide cotton Produc-tion Research Conference Proc.pp.51-55，1977，of the National Cotton Council，Memphis，均為本文的參考文獻(xiàn))。
在建立許多植物品種培養(yǎng)物方面的共同問題之一是培養(yǎng)基中外植體的“褐變”。在棉花中，通過用葡萄糖代替蔗糖，和每隔10天將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中克服了多酚的這種瀝濾。在添加葡萄糖的培養(yǎng)基中培育3-4次后，褐變完全消失并可將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)回到加有蔗糖的培養(yǎng)基中。雖然對(duì)于棉屬的某些品種來說已經(jīng)克服了在繼代培養(yǎng)期間愈傷組織的誘導(dǎo)，褐變和維持的困難，但對(duì)從愈傷組織培養(yǎng)物再生植物的所有嘗試都未曾獲得成功或包括若干費(fèi)時(shí)的步驟。Davidonis和Hamilton報(bào)導(dǎo)了在培養(yǎng)開始兩年后，最終形成胚(見“Plant Regeneration from Callus Tissue of Gossypium hirsutum”，L.Plant Sci.Lett.32∶89-93，1983，列為本文的參考文獻(xiàn))。
盡管許多生長(zhǎng)物質(zhì)，如天然植物激素和合成的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)化合物都已被用于組織培養(yǎng)基以在體外使植物再生，但尚未概括出不同物質(zhì)對(duì)植物再生的影響，更不必說細(xì)節(jié)了。實(shí)際上，當(dāng)將同樣的物質(zhì)施用于不同的植物品種時(shí)，可以抑制生長(zhǎng)，增進(jìn)生長(zhǎng)，或?qū)χ参锷L(zhǎng)無任何影響。因此，除了某些標(biāo)準(zhǔn)程序以外，要獲得使任何新品種植物再生的操作方案必定仍是一個(gè)艱巨的任務(wù)并且完成植物轉(zhuǎn)化是更加艱巨的任務(wù)。
本發(fā)明提供一種從自籽苗切下的片段使棉花植株迅速再生的方法。該方法具有高度的可重復(fù)性和可靠性并可實(shí)現(xiàn)棉花植株的基因轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明提供從體細(xì)胞使棉花植株再生，有時(shí)可伴隨著植物轉(zhuǎn)化的方法。
將種子滅菌并在暗處長(zhǎng)成籽苗。籽苗是外植體(通常是胚軸和子葉)的一個(gè)來源。另一個(gè)來源是正在發(fā)育的果實(shí)的未成熟合子胚。將外植體分成幾塊并在第一愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基(含有葡萄糖)中培養(yǎng)一段時(shí)間使培養(yǎng)基中的外植體發(fā)育成愈傷組織，愈傷組織可抑制酚的分泌和刺激外植體細(xì)胞分裂和增殖。愈傷組織在經(jīng)過酚的分泌階段之后，被轉(zhuǎn)移到新鮮的愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基(含有蔗糖)中，使之發(fā)育為胚發(fā)生愈傷組織。然后可將胚繼代培養(yǎng)以產(chǎn)生更多的胚發(fā)生愈傷組織或?qū)⑴咿D(zhuǎn)移到另一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基(植物萌發(fā)培養(yǎng)基)中并培養(yǎng)一段時(shí)間以發(fā)育成植物幼株，經(jīng)過另一段生長(zhǎng)期，將植物幼株轉(zhuǎn)移到溫室中，然后移植到田間長(zhǎng)成成熟的植物，從成熟的植物上可收獲種子。
也可懸浮培養(yǎng)胚。在該程序中，在生長(zhǎng)期以后，將含有胚發(fā)生塊(其大小約為600微米以上，最好約為800微米以上)的胚分離出來并用來產(chǎn)生植物。將較小的愈傷組織再循環(huán)到愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基中使之長(zhǎng)成形成植物的愈傷組織，或作為胚的來源。
轉(zhuǎn)化可發(fā)生在外植體，愈傷組織或懸浮發(fā)育階段。轉(zhuǎn)化包括使外植體，愈傷組織和/或胚發(fā)生愈傷組織受到土壤桿菌載體的作用，土壤桿菌載體含有異源于棉花的可表達(dá)的基因序列，作用時(shí)間應(yīng)足以使基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，然后用一種對(duì)土壤桿菌有毒性的抗生素殺滅剩余的土壤桿菌。然后選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞和/或胚發(fā)生愈傷組織用于發(fā)育成轉(zhuǎn)化植物幼株。在懸浮培養(yǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)化和/或選擇可在從細(xì)胞和不能成胚的未成熟愈傷組織分離胚發(fā)生愈傷組織之前或之后發(fā)生。
可以獲得具有獨(dú)特的表型特征的植物，并提供新的對(duì)通?？梢种浦参锛?xì)胞生長(zhǎng)的抗生素具有抗性的棉花植株;對(duì)除草劑，真菌病原體具有增強(qiáng)的抗性或耐受性的棉花植株和具有較高的產(chǎn)量和更好的纖維質(zhì)量的棉花植株。


圖1 圖解顯示了通過組織培養(yǎng)技術(shù)使種子發(fā)育成棉花植株的優(yōu)選步驟，同時(shí)顯示了移植生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化區(qū)。
圖2 是不同發(fā)育階段的具有體細(xì)胞胚(12)的棉花胚發(fā)生愈傷組織(10)，包括葉(14)和根(16)的照片。
圖3 是分離的形成圖2 所示的胚發(fā)生愈傷組織培養(yǎng)物的晚球形期棉花體細(xì)胞胚的照片。
圖4 (參照?qǐng)D2)是在胚萌發(fā)培養(yǎng)基上發(fā)育的棉花胚和幼小植物(18)的照片。
圖5 是棉花懸浮培養(yǎng)物中胚細(xì)胞小團(tuán)塊的照片。
圖6 是懸浮培養(yǎng)物中球形期胚的照片。
圖7 顯示了得自懸浮培養(yǎng)物的萌發(fā)胚，顯示了形成的葉(14)和跟(16)。
圖8 顯示了在胚萌發(fā)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的小棉花植株的發(fā)育情況。
圖9-15 顯示了棉花的基因轉(zhuǎn)化，圖9顯示了含有卡那霉素抗性基因的轉(zhuǎn)化棉花細(xì)胞集落(20)的發(fā)育情況。
圖10顯示了在添加抗生素的培養(yǎng)基上由所選的抗生素抗性細(xì)胞(圖9)發(fā)育成的體細(xì)胞胚。
圖11顯示了含有對(duì)除草劑草甘膦具有抗性的基因的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞胚的萌發(fā)胚。
圖12顯示了由圖11的胚發(fā)成的小棉花植株。
圖13顯示了發(fā)育了葉(14)和根(16)的轉(zhuǎn)化為對(duì)鱗翅目昆蟲具有抗性的萌發(fā)體細(xì)胞胚。
圖14顯示了由圖13的胚發(fā)育成的小植株。
圖15顯示了由具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化胚發(fā)育成的Siokra種小植株。
圖16表明含有Bt前毒素基因5′末端的質(zhì)粒mp19/bt的構(gòu)建。
圖17表明含有與Bt前毒素編碼序列5′末端融合的Ca MV基因VI啟動(dòng)子的質(zhì)粒mp19/bt ca/del的構(gòu)建。
圖18表明具有與Ca MV轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)融合的前毒素3′編碼區(qū)的質(zhì)粒p702/bt的構(gòu)建。
圖19表明含有側(cè)接有Ca MV啟動(dòng)子和終止區(qū)序列的完整前毒素編碼序列的質(zhì)粒p BR322/bt 14的構(gòu)建。
圖20表明 pRK252/Tn 903/Bgl II的構(gòu)建。
圖21表明 p C IB5的構(gòu)建。
圖22和23表明 p C IB4的構(gòu)建。
圖24表明 pC IB2的構(gòu)建。
圖25表明 p C IB10(含有T-DNA兩臂和植物選擇基因的廣宿主范圍質(zhì)粒)的構(gòu)建。
圖26表明 pC I B10/19 sbt的構(gòu)建。
圖27表明 p C I B710的構(gòu)建。
圖28表明 p C IB10/710的構(gòu)建。
圖29表明 pC IB10/35 sbt的構(gòu)建。
圖30表明 pC IB10/35 sbt(Kpn I)的構(gòu)建。
圖31表明 pC IB10/35 sbt(Bcl I)的構(gòu)建。
圖32表明 p C IB10/35sbt(607)的構(gòu)建。
圖33表明載體DEI PEP10的構(gòu)建。
圖34是由種植在輪枝孢侵染田中的棉花再生體組成的試驗(yàn)田的照片。
圖35是圖34所示的試驗(yàn)田中的再生S J4植物子代的照片。箭頭表明對(duì)輪枝孢真菌的耐受性增強(qiáng)的體細(xì)胞克隆變種。
本發(fā)明涉及用組織培養(yǎng)的方法由體細(xì)胞使棉花植株，特別是陸地棉(Gossypium hirsutum)屬的植株再生，然后在田間繁殖。還可以將細(xì)胞轉(zhuǎn)化使之含有外源遺傳信息。
各種適用于本發(fā)明的生長(zhǎng)培養(yǎng)基如下種子萌發(fā)生長(zhǎng)培養(yǎng)基改良懷德氏儲(chǔ)備溶液的組成(Phytomorphology 11∶109-127，1961，列為本文的參考文獻(xiàn))成分 每1000ml的濃度 注釋Mg SO4·7H2O 3.6g 溶解并使終體積達(dá)1000ml(懷Na2SO42.0 g 德氏A儲(chǔ)備溶液)。1升培養(yǎng)Na H2PO4·H2O 1.65g 基用100ml。
Ca(NO3)2·4H2O 2.6g 溶解并使終體積達(dá)1000ml(懷KNO3800mg 德氏B儲(chǔ)備溶液)。1升培養(yǎng)KCl 650mg 基用100ml。
Na2Mo O4·4H2O 2.5mg 溶解并使終體積達(dá)100ml(懷
Co Cl2·6H2O 2.5mg 德氏C儲(chǔ)備溶液)。1升培養(yǎng)Mn SO4·H2O 300mg 基用1.0ml。
Zn SO4·7H2O 50mgCu SO4·5H2O 2.5mgH3BO350mgFe EDTA 1升MSFe EDTA用10ml有機(jī)物 1升MS有機(jī)物用10ml。
愈傷組織生長(zhǎng)/維持培養(yǎng)基MURASH IGE & SKOOG(MS)儲(chǔ)備溶液的組成(Physiol.Plant 15∶473-497，1962，列為本文的參考文獻(xiàn))成分 每1000ml儲(chǔ)液 注釋中的濃度NH4NO341.26g 溶解并使終體積達(dá)1000ml。
KNO347.50g 每升培養(yǎng)基用40ml。
Ca Cl2·2H2O 11.00gMg SO4·7H2O 9.25gKH2PO44.25g
KI 83mg 溶解并使終體積達(dá)1000ml。
H3BO3620mg (MS-微量物)Mn SO4·H2O 1690mg 每升培養(yǎng)基用10ml。
Zn SO4·7H2O 860mgNa2Mo O4·2H2O 25mgCu SO4·5H2O 2.5mgCo Cl2·6H2O 2.5mg
煙酸 50mg 溶解并使終體積達(dá)1000ml。
維生素B鹽酸鹽 50mg (MS-有機(jī)物)冷凍10ml等鹽酸硫胺素 10mg 分試樣。每升培養(yǎng)基用10ml。
Fe·EDTA 2.78g 將2.78g Fe SO4·7H2O溶Fe SO4·7H2O 3.73g 于大約200ml去離子水中。在Na2EDTA·2H2O 另一燒杯中,將3.73g Na2EDTA·2H2O(乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物)溶于200m去離子水中。在電爐上將Na2EDTA溶液加熱大約10分鐘。
在連續(xù)攪拌下,將Fe SO4溶液加入到Na2EDTA溶液中。
將溶液冷卻至室溫并使終體積達(dá)1000ml(MSEDTA)。
用箔蓋上瓶口并貯存于冰箱中。
1升培養(yǎng)基用10ml。
鹽酸硫胺素 50.00mg 溶解并使終體積達(dá)500ml。
(MS-硫胺素)。1升培養(yǎng)基用4.0ml。依需要而定。
肌醇 10.00g 溶解并使終體積達(dá)1000ml。
甘氨酸 0.20g (MS-甘氨酸/肌醇)。
每升培養(yǎng)基用10ml。
植物萌發(fā)培養(yǎng)基BEASLEY & TING氏儲(chǔ)備溶液(Am.J.Bot.60∶130-139，1973，列為本文的參考文獻(xiàn))成分 每1000ml中的濃度 注釋KH2PO42.72g 溶解并使終體積達(dá)100mlH3BO361.83mg (B&T-A儲(chǔ)液)。
Na2Mo O4·2H2O 2.42mg 每升培養(yǎng)基用10ml。
Ca Cl2·2H2O 4.41g 溶解并使終體積達(dá)100ml。
KI 8.3mg (B&T-B儲(chǔ)液)。
Co Cl2·6H2O 0.24mg 每升培養(yǎng)基用10ml。
Mg SO4·7H2O 4.93g 溶解并使終體積達(dá)100ml。
Mn SO4·H2O 169.02mg (B&T-C儲(chǔ)液)。
Zn SO4·7H2O 86.27mg 每升培養(yǎng)基用10ml。
Cu SO4·5H2O 0.25mg
KNO325.275g 溶解并使終體積達(dá)200ml(B&T-D儲(chǔ)液)。
每升培養(yǎng)基用40ml。
煙酸 4.92mg 溶解并使終體積達(dá)100ml。
維生素B鹽酸鹽 8.22mg (B&T-有機(jī)物)。
鹽酸硫胺素 13.49mg 每升培養(yǎng)基用10ml。
Fe EDTA 每升MSFe EDTA用10ml肌醇 每升培養(yǎng)基用100mg。
NH4NO3(15μM)每升培養(yǎng)基用1200.6mg。
對(duì)于上述任一種溶液，都可采用下列程序制備1升培養(yǎng)基。以200ml去離子水為基礎(chǔ)，加入各種儲(chǔ)備溶液至規(guī)定體積(1升)。例如，如果在最終培養(yǎng)基中使用10ml儲(chǔ)備溶液，則將10ml儲(chǔ)備溶液加到200ml蒸餾水中。為了保證鹽留在溶液中，一般按上述配方所示的順序加入儲(chǔ)備溶液。充分混勻后，補(bǔ)加去離子水到混合液中使之達(dá)到所需的500ml，并將混合液的pH值調(diào)至大約5.8到6.0。使終體積達(dá)1，000ml并通常加入組織培養(yǎng)基瓊脂，或其等同物至大約0.8%(重量)。這是為了減緩溶液流動(dòng)而使之略呈固態(tài)。然后在15-21磅/英寸的壓力下將混合物高壓滅菌5-20分鐘，以殺死任何污染物，貼上適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽并作為無菌培養(yǎng)基貯存起來。
簡(jiǎn)言之，將棉花種子滅菌并在適宜的種子萌發(fā)培養(yǎng)基(如基礎(chǔ)瓊脂培養(yǎng)基)上暗處萌發(fā)一段時(shí)間以產(chǎn)生籽苗。正常生長(zhǎng)期大約達(dá)4周，典型的是7-14天。
從籽苗上切下外植體片段，外植體最好來自胚軸或子葉。另外，人們同樣可以用得自溫室或田間生長(zhǎng)的棉花植株的正在發(fā)育的果實(shí)的未成熟胚作為外植體。將外植體片段在適宜的第一愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，較好的培養(yǎng)基是含有葡萄糖的完全Murashige & Skoog(MS)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，通過在大約25-35℃，大約16小時(shí)光照和大約8小時(shí)無光的光/暗交替條件下使外植體生長(zhǎng)。在培養(yǎng)步驟中，應(yīng)隨著營(yíng)養(yǎng)物的消耗和持續(xù)培養(yǎng)大約3-4周后定期更換培養(yǎng)基，或到形成未分化的愈傷組織為止。將愈傷組織轉(zhuǎn)移到第二愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，最好是添加有萘乙酸(NAA)和以蔗糖作為碳源的MS培養(yǎng)基并培養(yǎng)3-4個(gè)月，產(chǎn)生胚。
然后將胚維持在第二愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基中備用或?qū)⑴咿D(zhuǎn)移到種子萌發(fā)培養(yǎng)基(如Beasley & Ting氏培養(yǎng)基，最好含有酪蛋白水解物和銨源)中培養(yǎng)2-3周，長(zhǎng)出植物幼株。
在高濕度條件下將植物幼株移栽到土壤中，然后移植到溫室中的大盆里，最后轉(zhuǎn)移到田間使之發(fā)育成熟。
本文簡(jiǎn)述的方法已被成功地用于通過組織培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)陸地棉(Gossypium hirsutum)棉花品種體細(xì)胞胚形成，最后從包括S J2，S J4，S J5，B1644，B1810，B2724，GC510和Cl的陸地棉Acala變種和非Acala“采摘”Siokra及“剝離”變種FC2017胚軸和子葉衍生的愈傷組織培養(yǎng)物得到成熟植物。這些培養(yǎng)物已被轉(zhuǎn)化為具有新特性的正常植物。
具體地講，首先要將棉花種子滅菌。可通過將種子浸泡在95%乙醇中2-3分鐘，在無菌水中漂洗一次或多次，然后將種子放在15%次氯酸鈉溶液中泡15-20分鐘，并用無菌水沖洗數(shù)次來適當(dāng)滅菌。
然后將經(jīng)滅菌的種子轉(zhuǎn)移到第一培養(yǎng)基(稱為種子萌發(fā)培養(yǎng)基)中。種子萌發(fā)培養(yǎng)基是一種鹽含量正常的培養(yǎng)基。適宜的萌發(fā)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)瓊脂培養(yǎng)基，包括懷德氏培養(yǎng)基或半強(qiáng)度MS培養(yǎng)基(成分的強(qiáng)度為1/2)。一般在暗處，經(jīng)過大約12-14天時(shí)間萌發(fā)。
最好從萌發(fā)的種子上切下胚軸和/或子葉，分成幾塊或切成片段并在第一愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基(添加有生長(zhǎng)物質(zhì)的MS培養(yǎng)基)上培養(yǎng)。目前較好的培養(yǎng)基為添加有大約0.4mg/l鹽酸硫胺素，大約30g/l葡萄糖，大約2mg/l萘乙酸，大約1mg/l激動(dòng)素(普通生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑)，和大約100mg/l肌醇和瓊脂的MS培養(yǎng)基。鹽酸硫胺素的濃度范圍一般為0.1～大約0.5mg/l，葡萄糖大約為20-30g/l，萘乙酸大約為1-10mg/l，激動(dòng)素大約為1-2mg/l，肌醇大約為50～100mg/l。
在大約25-35℃，大約30℃較好，大約16小時(shí)光照和大約8小時(shí)無光的光/暗交替條件下維持培養(yǎng)物。光強(qiáng)度為大約2000-4000勒較好，大約3000-4000勒更好。
每隔3-4周將形成的愈傷組織定期繼代培養(yǎng)并轉(zhuǎn)移到新鮮的第一愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)外植體的過程中，培養(yǎng)基變暗表明從外植體中分泌出酚類化合物，在這種情況下，應(yīng)不斷更換培養(yǎng)基。通過每10天更換一次培養(yǎng)基已避免了變暗現(xiàn)象的發(fā)生。一般在更換3-5次培養(yǎng)基之后，酚的分泌消失。此時(shí)，可用含有蔗糖的新鮮愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基代替第一愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基或向第一愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基中補(bǔ)加蔗糖作為碳源。
培養(yǎng)3-4周后，在外植體的切面上發(fā)育出活性愈傷組織。然后將該愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮的第二愈傷組織生長(zhǎng)維持培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基最好是含有大約1-10mg/l(大約1-5mg/l較好)NAA的MS培養(yǎng)基。細(xì)胞分裂素的使用濃度為0到大約1g/l。愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基的特征在于它是一種含鹽量比種子萌發(fā)培養(yǎng)基高10倍之多的高鹽含量培養(yǎng)基。第一和第二愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基的主要差別在于碳源。在酚分泌期使用葡萄糖。當(dāng)停止分泌時(shí)使用蔗糖。愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基的其它成分可保持不變，也可改變。
將愈傷組織以固定的時(shí)間間隔轉(zhuǎn)移到新鮮的愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，一般大約在轉(zhuǎn)移5-7次后或直到在部分愈傷組織中顯見花色素苷色素沉著為止，發(fā)育出淡黃-白色胚發(fā)生愈傷組織。
然后有選擇地繼代培養(yǎng)胚發(fā)生愈傷組織并通過正常傳代來維持。胚發(fā)生愈傷組織含有不同發(fā)育期的體細(xì)胞胚。有些可能已達(dá)到能成長(zhǎng)為小植株的發(fā)育點(diǎn)。但大多數(shù)需進(jìn)一步發(fā)育，有些可能提前萌發(fā)。另一些可作為胚的來源待以后使用。
圖2 表明含有不同大小的體細(xì)胞胚12的Acala棉花愈傷組織10的這一發(fā)育期，其中有些胚已長(zhǎng)出葉14和根16。圖3表明在晚球形期分離出的體細(xì)胞胚。
圖4 表明通過將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到胚萌發(fā)培養(yǎng)基(在此稱為第三生長(zhǎng)培養(yǎng)基)中可實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的發(fā)育，胚萌發(fā)培養(yǎng)基富含氮，通常為銨或其等同物的形式。適宜的培養(yǎng)基包括Beasley & Ting氏培養(yǎng)基，最好添加約為500mg/l的酪蛋白水解物。
從體細(xì)胞胚萌發(fā)，一般2-3周內(nèi)就可形成長(zhǎng)有6片葉子并具有良好根系的發(fā)育完全的植物幼株18。
在這一階段，將小植物叢移栽到土壤中并在高濕度條件下于標(biāo)準(zhǔn)溫箱中生長(zhǎng)。溫度一般維持在大約25-30℃(見圖7)經(jīng)過一段時(shí)間的生長(zhǎng)之后，將小植物轉(zhuǎn)移到溫室中的大盆中，以后再移植到田間并發(fā)育成熟。所有再生植物無論是在溫室中還是在野外條件下生長(zhǎng)最好都是自花傳粉，收集種子，然后使種子萌發(fā)并將4-5周齡的籽苗轉(zhuǎn)移到田間進(jìn)行子代行栽試驗(yàn)和其它標(biāo)準(zhǔn)植物育種試驗(yàn)。采用上述步驟，在大約6-8個(gè)月內(nèi)，約35%的外植體產(chǎn)生的棉花植株成活。
用懸浮培養(yǎng)法使棉花胚細(xì)胞增殖使生長(zhǎng)的胚發(fā)生愈傷組織發(fā)育成植物的另一種方法是可將愈傷組織切成小塊并采用懸浮培養(yǎng)技術(shù)使之進(jìn)一步發(fā)育。
在這個(gè)程序中，懸浮液的濃度通常為8ml愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基(如第二愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基，即添加NAA的MS培養(yǎng)基)中含有大約750～1000mg愈傷組織碎塊，使愈傷組織碎塊在懸浮液中生長(zhǎng)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將愈傷組織懸浮液置于T-管中并在約16小時(shí)光和約8小時(shí)暗的條件下將T-管放在輥式轉(zhuǎn)鼓上以大約1.5轉(zhuǎn)/分的速度旋轉(zhuǎn)。生長(zhǎng)大約3～4周。
大約每3～4周后，將懸浮液過濾除去胚發(fā)生愈傷組織的大細(xì)胞團(tuán)塊(見圖5)并在圖6所示的晚球形期進(jìn)行分離。將濾液放回到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3～4周。反復(fù)重復(fù)這一步驟，同時(shí)每隔大約3～4周收集一次大細(xì)胞團(tuán)塊，在此期間，用新鮮的愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基全部或部分取代原培養(yǎng)基。最好將大約4體積或更多的新鮮培養(yǎng)基加到約1體積的殘余懸浮液中。目前較好的濾器篩目大小約為600微米以上，800微米以上更好，因已觀察到粒度小于600微米的細(xì)胞團(tuán)塊不能發(fā)育成植物，而大于600微米(大于800微米更好)的細(xì)胞團(tuán)塊已充分分化為胚細(xì)胞并能發(fā)育成活植物。
也可通過將胚發(fā)生愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有液體胚生長(zhǎng)培養(yǎng)基(約20mlMS，NAA濃度為2.0mg/l)的培養(yǎng)瓶(如De Long瓶或錐形瓶)中開始懸浮培養(yǎng)。將培養(yǎng)瓶置于轉(zhuǎn)動(dòng)搖床上以大約100～110沖程/分鐘的速度振搖。3～4周后，該懸浮液適用于如上所述的過濾以除去大細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)行植物發(fā)育。
一般說來，傳代3或4次之后，將“T”管或De Long或錐形瓶中的細(xì)胞懸液放入含有NAA(2.0mg/l)的瓊脂固化的MS培養(yǎng)基或含有酪蛋白水解物(500mg/l)和氮源的Beasley & Ting氏培養(yǎng)基中。3～4周內(nèi)，明顯可見具有發(fā)育胚的胚發(fā)生愈傷組織。同樣，較大的細(xì)胞團(tuán)塊置于上述培養(yǎng)基時(shí)也發(fā)生具有發(fā)育胚的胚發(fā)生塊。
在兩種懸浮生長(zhǎng)法中，都用MS培養(yǎng)基促進(jìn)和/或供養(yǎng)胚，而用萌發(fā)培養(yǎng)基使植物迅速發(fā)育。
需要的話，可將籽苗外植體轉(zhuǎn)化。在這個(gè)步驟中，可使用滅菌種子的子葉和/或胚軸片段。最好用子葉。
將這些片段放在含有土壤桿菌載體的培養(yǎng)基中一段足夠時(shí)間以使載體將基因轉(zhuǎn)移到外植體細(xì)胞中，該載體含有一個(gè)例如對(duì)抗生素(如卡那霉素)具抗性的密碼(遺傳標(biāo)志物)。一般接觸時(shí)間為1分鐘到24小時(shí)并可伴隨著間歇攪拌或輕度攪拌。然后取出外植體并放在瓊脂固化的愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基(如添加有NAA(2mg/l)的MS培養(yǎng)基)上，在25～35℃，最好30℃，16小時(shí)光/8小時(shí)暗條件下溫育大約15～200小時(shí)。
溫育后，將外植體轉(zhuǎn)移到添加抗生素頭孢噻肟(濃度最好為200mg/l)的同樣培養(yǎng)基中。加入頭孢噻肟的目的是防止任何殘余土壤桿菌繁殖和植物組織過度生長(zhǎng)。另外，可用添加有NAA(2mg/l)的MS培養(yǎng)基沖洗外植體并于沖洗前再溫育4～28天，然后溫育含有頭孢噻肟的同樣培養(yǎng)基。在新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～5周末，將發(fā)育的愈傷組織，即初級(jí)愈傷組織與初級(jí)外植體組織的殘余物分離并轉(zhuǎn)移到含有NAA(2mg/l)，頭孢噻肟(200mg/l)和抗生素(如硫酸卡那霉素(50mg/l)的MS培養(yǎng)基中。根據(jù)初級(jí)愈傷組織在抗生素(卡那霉素)存在時(shí)的生長(zhǎng)能力鑒定轉(zhuǎn)化的初級(jí)愈傷組織，挑選出轉(zhuǎn)化的愈傷組織，使胚發(fā)育，萌發(fā)，經(jīng)過上述步驟獲得植物。
實(shí)現(xiàn)細(xì)胞懸液的轉(zhuǎn)化也是可行的。在7～14天(通常為7～10天)正常繼代培養(yǎng)生長(zhǎng)周期之后，使細(xì)胞沉降，移出上清液?？蓪堄嗟臐饪s懸浮細(xì)胞在4000xg下離心5分鐘，棄去過量的培養(yǎng)基。將濃縮懸浮培養(yǎng)物重新懸浮于8ml含有土壤桿菌的同樣培養(yǎng)基中。將懸液轉(zhuǎn)移至“T”管中并適當(dāng)攪拌進(jìn)行溫育。
在溫育大約2～24小時(shí)，最好3～5小時(shí)以使細(xì)菌附著和DNA轉(zhuǎn)移之后，取出懸浮液使細(xì)胞沉降。棄去含有細(xì)菌的上清液并用新鮮培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞。需要的話，可將懸浮液離心約5分鐘并除去上清液。在任一種情況下，都將細(xì)胞重新懸浮于同樣培養(yǎng)基中并轉(zhuǎn)移到“T”管或培養(yǎng)瓶中，重新開始懸浮繼代培養(yǎng)。其目的是減少留在細(xì)胞懸液中的未附著土壤桿菌載體的量。
大約15～200小時(shí)，一般15～72小時(shí)，最好18～20小時(shí)后，將懸浮液過濾除去大細(xì)胞團(tuán)塊并用新鮮液體培養(yǎng)基洗滌，使細(xì)胞沉降。將懸浮物重新懸浮于含有頭孢噻肟(200mg/l)的新鮮液體培養(yǎng)基中，然后置于培養(yǎng)皿中的固化培養(yǎng)基上。
另外，可將懸浮物重新懸浮于含有頭孢噻肟的新鮮培養(yǎng)基中并在置于培養(yǎng)皿中的固化培養(yǎng)基之前再生長(zhǎng)4～28天。細(xì)胞濃度為1體積懸浮細(xì)胞加3體積含有頭孢噻肟的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中卡那霉素含量為10～300mg/l，大約20～200mg/l較好，大約40～80mg/l更好，用來選擇可表達(dá)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT)基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在選擇性濃度卡那霉素中增殖的細(xì)胞和胚如上所述進(jìn)一步生長(zhǎng)為成熟的體細(xì)胞胚，后者按本文所述方法能萌發(fā)和再生為完整的植物。
采用上述步驟并參照?qǐng)D9，可以看出變異的細(xì)胞集落是轉(zhuǎn)化的結(jié)果。存在對(duì)卡那霉素具有抗性的棉花細(xì)胞20。參照?qǐng)D10，可以看出轉(zhuǎn)化的愈傷組織在抗生素MS培養(yǎng)基中發(fā)育成體細(xì)胞胚。圖11表明經(jīng)轉(zhuǎn)化的體細(xì)胞胚建立了對(duì)卡那霉素的抗性和對(duì)除草劑草甘膦的抗性。圖12表明從圖11的胚長(zhǎng)成的植物。圖13表明生長(zhǎng)在MS培養(yǎng)基上的細(xì)胞轉(zhuǎn)化后對(duì)鱗翅目昆蟲具有抗性。圖14表明將圖13的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Beasley & Ting氏培養(yǎng)基中。圖15表明圖14的植物幼株進(jìn)一步發(fā)育成更加成熟的小植物。
棉花再生實(shí)例1由子葉外植體開始的植物再生陸地棉Acala棉品種S J2的種子用95%乙醇接觸，滅菌3分鐘，然后用無菌水沖洗兩次，并用15%次氯酸鈉浸泡15分鐘，再用無菌水沖洗。滅菌后的種子在暗室中于基礎(chǔ)瓊脂培養(yǎng)基上萌發(fā)約14天，產(chǎn)生籽芽。將芽的子葉切成2～4mm的片段，將其在無菌條件下移到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基由Murashige和Skoog(MS)主鹽和副鹽組成，附加有0.4mg/l鹽酸硫胺素、30g/l葡萄糖、2.0mg/l萘乙酸(NAA)、1mg/l激動(dòng)素、100mg/l間-肌醇和瓊脂(0.8%)。在Percival恒溫箱中采用光強(qiáng)度為約2000～4000勒克司的瑩光燈(冷日光)于約30℃下進(jìn)行溫育，光照下溫育16小時(shí)，無光照(黑暗)下溫育8小時(shí)。
在3至4周之內(nèi)，培養(yǎng)的組織片段上形成愈傷組織，且由白色變?yōu)榛揖G色。愈傷組織每3至4周在含有100mg/l間-肌醇、20g/l蔗糖、2mg/l萘乙酸和瓊脂的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。在將組織外植體置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上4至6個(gè)月之后，形成體細(xì)胞胚。每3至4周在新鮮愈傷組織培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，維持愈傷組織和體細(xì)胞胚的成長(zhǎng)。
組織片段上形成的體細(xì)胞胚或是移到新鮮愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，或是移到Beasley和Ting培養(yǎng)基(胚萌發(fā)培養(yǎng)基)上。
由體細(xì)胞胚形成的體細(xì)胞小植物移到Beasley和Ting培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有1200mg/l硝酸銨和500mg/l酪蛋白水解物作為有機(jī)氮源。培養(yǎng)基用固化劑(Gelrite)固化，將體細(xì)胞小植物置于Magenta箱中。
體細(xì)胞胚在大約三個(gè)月內(nèi)發(fā)展成為體細(xì)胞小植物。體細(xì)胞小植物生根，具有6～8片葉，約3～4英寸高，將其移到土壤中，于高濕度的保溫箱中保持3～4周，然后移至溫室。硬化之后，也可將植物移至田間。
實(shí)例2重復(fù)實(shí)例1的步驟，但采用一半強(qiáng)度的MS培養(yǎng)基，即所有培養(yǎng)基組分的濃度減至實(shí)例1所述的一半。取得了基本上相同的結(jié)果。
實(shí)例3重復(fù)實(shí)例1和2的步驟，不同的是外植體是胚軸片斷。取得了相同的結(jié)果。
實(shí)例4重復(fù)實(shí)例1和2的步驟，不同的是外植體是未成熟的合子胚。取得了基本上相同的結(jié)果。
實(shí)例5使用Acala棉花變種S J4、S J5、S J 2C-1、G C510、B1644、B2724、B1810、采摘變種Siokra和剝離變種F C2017重復(fù)實(shí)例1和2的程序，都成功地進(jìn)行了再生。
實(shí)例6將實(shí)例1的步驟重復(fù)至得到能形成體細(xì)胞胚的愈傷組織。將約750～1000mg成長(zhǎng)中的胚發(fā)生愈傷組織懸浮于T-管中以8ml為單位的液體懸浮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基包括MS主鹽和副鹽，補(bǔ)加有0.4mg/l鹽酸硫胺素、20g/l蔗糖、100mg/l肌醇和萘乙酸(2mg/l)，然后將其置于以1.5轉(zhuǎn)/分輥式轉(zhuǎn)鼓中，以16小時(shí)光照、8小時(shí)無光照進(jìn)行培養(yǎng)。用瑩光燈(冷日光)提供光強(qiáng)度為約2000～4500勒克司的光照。
4周以后，用840μm的尼龍網(wǎng)過濾懸浮液，除去較大的細(xì)胞團(tuán)塊。使小于840μm的部分沉淀，用20～25ml新鮮懸浮培養(yǎng)基洗滌一次。將該懸浮液移至T-管(每管2ml)，用6ml新鮮懸浮培養(yǎng)基稀釋。以10～12天的間隔重復(fù)上述步驟保持培養(yǎng)物。即，將懸浮液過濾，僅將含有小于840μm細(xì)胞團(tuán)塊的部分移入新鮮懸浮培養(yǎng)基中。在所有情況下，含有大于840μm細(xì)胞團(tuán)塊的部分都被置于愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基以得到成熟的體細(xì)胞胚。
將愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基上形成的體細(xì)胞胚移至胚萌發(fā)培養(yǎng)基并按實(shí)例1的步驟萌發(fā)、長(zhǎng)成小苗，然后成為田間生長(zhǎng)植物。
實(shí)例7重復(fù)實(shí)例6的步驟，不同的是將750～1000mg胚發(fā)生愈傷組織移到含有15～20mlM S液體培養(yǎng)基(含有2mg/l NAA)的De Long燒瓶中，形成懸浮培養(yǎng)物。將含有培養(yǎng)物的燒瓶置于旋轉(zhuǎn)搖床以100～110沖程/分振搖。3周以后，用840μm尼龍網(wǎng)過濾懸浮液，除掉較大的細(xì)胞團(tuán)塊用于植物生長(zhǎng)，如實(shí)例4所述。使小于840μm的懸浮物沉淀，用MS液體培養(yǎng)基洗滌并重新懸浮于2～5ml MS液體培養(yǎng)基中。將懸浮液移至含有1～2ml懸浮液和15ml新鮮MS液體基的De Long燒瓶中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。以7至10天的間隔重復(fù)這一步驟保持培養(yǎng)。每次繼代培養(yǎng)后，僅將小于840 μm懸浮液進(jìn)行繼代培養(yǎng)，將大的團(tuán)塊(840μm或更大)用作植物生長(zhǎng)。
實(shí)例8采用實(shí)例6和7的懸浮培養(yǎng)步驟進(jìn)行3或4次繼代培養(yǎng)后，將T-管和De Long燒瓶中的1.5～2.0ml細(xì)胞懸浮液置于用瓊脂固化的含有2mg/l NAA的MS培養(yǎng)基和含有500mg/l酪蛋白水解物的Beasley和Ting培養(yǎng)基上。3至4周內(nèi)，可見到帶有發(fā)育中胚的胚發(fā)生愈傷組織。同樣，840μm或較大的團(tuán)塊置于愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，生成帶有發(fā)育中胚的胚發(fā)生團(tuán)塊，最終長(zhǎng)成植物。
棉化轉(zhuǎn)化實(shí)例9用土壤桿菌LBA4434進(jìn)行轉(zhuǎn)化以形成腫瘤表型在T-管中繼代培養(yǎng)Acala棉懸浮培養(yǎng)物3～4個(gè)月，7～10天更換一次培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，含有2mg/l NAA)。每次更換培養(yǎng)基后，可使細(xì)胞沉淀并收集用于轉(zhuǎn)化。將上清液用吸管移出，細(xì)胞用土壤桿菌株LBA4434菌株轉(zhuǎn)化。土壤桿菌LBA4434在菌株Hoekema，A等人的“Nature”303∶179-180(1983)中有述(這里引用該文獻(xiàn)作參考)，它含有一個(gè)Ti質(zhì)粒衍生的二位制植物轉(zhuǎn)化體系。在該二位制體系中，一個(gè)質(zhì)粒含有Ti-質(zhì)粒的T-DNA，第二個(gè)質(zhì)粒含有Ti-質(zhì)粒的vir-區(qū)。兩個(gè)質(zhì)粒配合以完成植物轉(zhuǎn)化。在LBA4434菌株中，T-DNA質(zhì)粒(pAL1050)含有pTi Ach5的TL，這是一種章魚堿Ti-質(zhì)粒;vir-質(zhì)粒(pA L4404)含有完整的p Ti Ach5致毒區(qū)(Ooms，G.et al.Plasmid 7∶15-29，1982，引入本文作參考)。L BA4434菌株可由荷蘭Leiden大學(xué)生化系Robert Schilperoort博士提供。
用于轉(zhuǎn)化的土壤桿菌菌株自甘油儲(chǔ)備培養(yǎng)中取出，接種到少量過夜培養(yǎng)物中，由此第二天再接種50ml培養(yǎng)物。土壤桿菌在YEB培養(yǎng)基(于水中并用Na OH調(diào)節(jié)pH至7.2，含有5g牛肉膏/l、1g酵母膏/1、5g胨/l、5g蔗糖)上生長(zhǎng)。高壓滅菌后，加入1ml 2 M Mg Cl2，此后，如有必要?dú)⑺榔渌辏偌尤肟咕?。記?0ml過夜培養(yǎng)物在600nm的吸光值，將培養(yǎng)物離心，形成的小團(tuán)粒重新懸浮于植物細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(M S培養(yǎng)基+2mg/lNAA)，使其最終600nm的吸光值為0.5。
在除去上清液之后，將8ml該土壤桿菌LBA4434的細(xì)菌懸浮液加到每一含有懸浮植物細(xì)胞的T-管。攪拌含有植物和細(xì)菌細(xì)胞的T-管使細(xì)胞重新懸浮，回置于轉(zhuǎn)鼓上3小時(shí)，使土壤桿菌攻擊植物細(xì)胞。然后使細(xì)胞沉淀，除去存留的上清液。向T-管中加入等分的新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基，使懸浮液在轉(zhuǎn)鼓上在殘留的土壤桿菌存在下培養(yǎng)18～20小時(shí)。此后，再使細(xì)胞沉淀，除去上清液，用含有頭孢噻肟(200μg/ml)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基溶液洗滌兩次。然后，每一T-管中的細(xì)胞再懸浮于含有頭孢噻肟(200 μg/ml)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，將懸浮液以1ml等分涂敷于陪氏培養(yǎng)皿上。
在未加入任何植物激素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，感染的細(xì)胞生長(zhǎng)、建立組織，接收到T-DNA中野生型植物激素基因。細(xì)胞發(fā)育成腫瘤，進(jìn)一步表明了培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)化。
實(shí)例10棉花轉(zhuǎn)化形成抗卡那霉素非腫瘤表型使用含有含T-DNA二位制載體pC I B10(Rothstein，S.J.et al.Gene 53∶153-161，1987，引入本文作參考)以及p A L4404vir-質(zhì)粒的土壤桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)例9所得的懸浮培養(yǎng)物。pC I B10的T-DNA含有一嵌合基因，該基因由來源于nopaline合成酶的啟動(dòng)子、來源于Tn5的編碼新酶素磷酸轉(zhuǎn)移酶的編碼區(qū)以及來源于nopaline合成酶的終止區(qū)組成。含有pC I B10的土壤桿菌在含有卡那霉素(50 μg/ml)的YEB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)化以與實(shí)例9相同的方式完成，不同的是將1ml等分細(xì)胞和土壤桿菌懸浮液立即涂敷于含有卡那霉素(50 μg/ml)或G418(25 μ/ml)的選擇性培養(yǎng)基上。轉(zhuǎn)化的植物組織中nos/neo/nos嵌合基因的表達(dá)使得這種組織在兩種抗生素存在下具有選擇性。轉(zhuǎn)化的組織存在2～4周，在選擇皿上變?yōu)槊黠@。未感染的組織以及增加的對(duì)比組織未顯示出生長(zhǎng)，變棕色且死去。轉(zhuǎn)化的組織在卡那霉素和G418兩者的存在下生長(zhǎng)良好。
此時(shí)，將生長(zhǎng)良好的組織碎片用新鮮選擇性培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)。在這些組織碎片上形成了體細(xì)胞胚，將其移植于新鮮非選擇性養(yǎng)基。當(dāng)胚開始分化和萌芽時(shí)，即在其開始形成根和生出2～3片葉時(shí)，將其移到含有實(shí)例1所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的Magenta箱中。使其繼續(xù)生長(zhǎng)至成為具有6～8片葉的小植物，此時(shí)將其從瓊脂培養(yǎng)基中移出。
將小植物移栽于盆土，用大燒杯罩著以保持濕度，放入Percival保溫箱中4～8周。然后將罩杯移開，將植物移植于溫室。植物在溫室中生長(zhǎng)、開花并結(jié)籽。
實(shí)例11重復(fù)實(shí)例10的步驟，不同的是采用的轉(zhuǎn)化土壤桿菌含有T-DNA載體DEI PEP10以及pA L4404vir-質(zhì)粒。如圖33所示，DEIPE P10采用兩個(gè)來自根瘤土壤桿菌(C-58菌株)、用BamH I再分以在植物基因組中整合的T-DNA Pst I酶解右臂序列，一個(gè)過客玉米磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Pepcase基因)和一個(gè)能在植物中表達(dá)且提供對(duì)抗生素卡那霉素和G418有抗性的嵌合基因(NOS｜NPT｜TK)。這一嵌合基因采用nopaline合成酶啟動(dòng)子，編碼區(qū)來自Tn5的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ編碼區(qū)，來自單純性皰疹病毒胸苷激酶基因的終止區(qū)。轉(zhuǎn)化以后，胚發(fā)生愈傷組織和胚在卡那霉素(50mg/l)上選擇獲得。由在此程度(50mg/l)的卡那霉素上的對(duì)比組得到無抗性的愈傷組織。
實(shí)例12轉(zhuǎn)化棉花懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為耐草甘膦表型重復(fù)實(shí)例10的步驟，不同的是使用的轉(zhuǎn)化土壤桿菌含有T-DNA載體p PMG85/587(Fillatti，J.et al.，Mol Gen.Genet.206∶192-199，1987，引入本文作參考)以及pAL4404 vir質(zhì)粒。質(zhì)粒p PM G85/587攜帶三個(gè)能在植物中表達(dá)的嵌合基因。兩個(gè)基因密碼為對(duì)抗生素卡那霉鼠傷寒沙門氏菌和G418有抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT)。第三個(gè)嵌合基因含有S.typhimurium突變aro A基因，提供了對(duì)除草劑草甘膦的耐受性(Comai，et al.，Science 221∶370-371，1983，引入本文作參考)。含有p PMG85/587的土壤桿菌在含有卡那霉素(100 μg/l)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)化以與實(shí)例10所述的方式完成，不同的是使懸浮物生長(zhǎng)28天，此時(shí)將1ml等分涂敷于含有選擇性抗生素的培養(yǎng)基。NPT嵌合基因在轉(zhuǎn)化植物組織中的表達(dá)使得這種組織對(duì)兩種抗生素有選擇性。在此種情形下，選擇性抗生素是卡那霉素(50 μg/l)。
在2～4周中，轉(zhuǎn)化組織在選擇皿上變?yōu)槊黠@。然后將植物組織、單胚和愈傷組織置于含有除草劑草甘膦1mM的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)化組織繼續(xù)良好生長(zhǎng)。對(duì)愈傷組織和胚的蛋白提取和分析證實(shí)存在草甘膦耐性基因產(chǎn)物。
實(shí)例13轉(zhuǎn)化棉花懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為潮霉素抗性非腫瘤表型重復(fù)實(shí)例10的步驟，不同的是使用含有T-DNA二位制載體pCI B715(Rothstein，S.J.et al.Gene 53∶153-161，1987)以及vir-質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化土壤桿菌。p C I B715的T-DNA含有由花菜嵌合性病毒(Ca MV)35 S轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子和終止區(qū)組成的嵌合基因(Odell et al，Nature 313810-812，1985，引入本文作參考)和潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼序列(Gritz，L.and J.Davies，Gene 25∶179～188，引入本文作參考)。含有p C IB715的土壤桿菌在含有卡那霉素(50 μg/l的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
轉(zhuǎn)化仍按實(shí)例10所述方式進(jìn)行，不同之處在于立即將1ml等分涂敷于含有50 μg/ml潮霉素作為選擇抗生素的培養(yǎng)基上。轉(zhuǎn)化植物組織中嵌合潮霉素基因的表達(dá)使含有潮霉素培養(yǎng)基上的這種組織具有選擇性。轉(zhuǎn)化的組織以實(shí)例8所述的方式在選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，證實(shí)轉(zhuǎn)化已經(jīng)發(fā)生。
實(shí)例14轉(zhuǎn)化棉花懸浮培養(yǎng)細(xì)胞使之具有鱗翹目害蟲抗性重復(fù)實(shí)例10的步驟，其不同之處如下所述。使用了不同的土壤桿菌。此外，植物組織在抗生素上選擇出轉(zhuǎn)化材料后，如本文所述，要繼續(xù)選擇BT基因表達(dá)。
使用的土壤桿菌含有T-DNA載體pC IB10(Rothstein et al，，Gene 53∶153-161(1987)，引入本文作參考)，其中插入了下述的嵌合蘇云金芽孢桿菌內(nèi)毒素基因(“BT基因”)
為制備土壤桿菌載體，將Ca MV基因Ⅵ啟動(dòng)子和前毒素編碼序列融合。先構(gòu)建了噬菌體載體mp19(Yanish-Perron et al.，1985)衍生物。步驟如圖16、17所示。首先，將含有前毒素編碼區(qū)5′端大約155個(gè)核苷酸和編碼序列中相鄰的大約1346個(gè)核苷酸的DNA片段插到mp19。噬菌體mp19 ds rf(雙鏈復(fù)制型)DNA用限制性核酸內(nèi)切酶Sac Ⅰ和Sma I酶解，在經(jīng)低凝膠溫度瓊脂糖電泳后，大約7.2-kbp載體片段用標(biāo)準(zhǔn)步驟純化。由瑞士Basle，C IBA-Geigy公司J.Nueesch博士得到了含有大約10kbp(千個(gè)堿基對(duì))蘇云金芽孢桿菌DNA的質(zhì)粒pKU25/4，包括前毒素基因。質(zhì)粒pKU25/4中的前毒素基因的核苷酸序列示于下面式1。質(zhì)粒pKU25/4DNA用核酸內(nèi)切酶Hpa Ⅰ和Sac Ⅰ酶解，純化含有式1核苷酸2～1505的1503bp片段。這一片段含有大約155bp細(xì)菌啟動(dòng)子序列和大約1346bp前毒素編碼序列開始部分。然后將大約100ng每一片段混合，加入T4DNA連接酶，于15℃過夜培養(yǎng)。所得混合物轉(zhuǎn)入大腸桿菌HB101菌株與指示菌大腸桿菌JM101混合，涂于平皿上。使用一種噬菌體(mp/19bt)繼續(xù)下面的構(gòu)建。
然后，將含有Ca MV基因Ⅵ啟動(dòng)子和基因Ⅵ的某些編碼序列的DNA片段插入mp19/bt。噬菌體mp19/bt rf DNA用BamH Ⅰ酶解，用DNA多聚酶大片段處理，產(chǎn)生平末端，并用核酸內(nèi)切酶Pst I再切割。較大的載體片段用前述方式電泳進(jìn)行純化。Paszkowski等人在EM BO J.3，2717-2722(1984)中描述了質(zhì)粒p ABD1，這里引用該文作參考。質(zhì)粒pABD1 DNA用Pst Ⅰ和Hind Ⅲ酶解。純化大約465bp長(zhǎng)、含有Ca MV基因Ⅵ啟動(dòng)子和大約75bp基因Ⅵ編碼序列的片段。兩個(gè)片段用前述的方法處理。所得的一個(gè)重組的噬菌體mp19/btca含有Ca MV基因Ⅵ啟動(dòng)子序列，部分基因Ⅵ編碼序列，大約155bp前毒素編碼序列上游蘇云金芽孢桿菌DNA和大約1346bp前毒素編碼序列。為使Ca MV啟動(dòng)子序列準(zhǔn)確地融合到前毒素編碼序列，通過對(duì)mp19/btca DNA的寡核苷酸的誘變除去間隔DNA。采用Applied Biosystems DNA合成儀通過常規(guī)步驟合成具有(5′)TTCGGATTGTTATCCATGGTTGGAGGTCTGA(3′)序列的DNA寡核苷酸。這一寡核苷酸與在Ca MV啟動(dòng)子(uncleot ides 5762 to 5778 in Hohn，Current Topics，in Microbiology and Immunology，96，193-235(1982)，引入本文作參考)3′端和前毒素編碼序列開始部分(上式中核苷酸156-172)的噬菌體mp191/btca的序列互補(bǔ)。誘變的一般程序如Zoller和Smith在Meth，Enzym，100，468-500(1983)中所述，這里引用該文作參考。大約5μg單鏈?zhǔn)删wmp19/btca DNA與0.3mg磷酸化寡核苷酸混合，體積為40 μl?；旌衔锛訜嶂?5℃，5分鐘后冷卻至50℃，然后緩慢冷卻至4℃。此后，加入緩沖劑、核苷酸三磷酸化物、ATP、T4DNA連接酶和大片段DNA多聚酶，于15℃過夜培養(yǎng)，如(Zoller and Smith Meth.Enzym.，100，468～500(1983)，引入本文作參考)所述。瓊脂糖凝膠電泳后，純化環(huán)狀雙鏈DNA，并將其轉(zhuǎn)染大腸桿菌JM101菌株。篩選所得噬菌斑與32-P標(biāo)記寡核苷酸雜交的序列，噬菌體用DNA限制性核酸內(nèi)切酶分析法分析。在得到的噬菌體克隆中有準(zhǔn)確地除掉了Ca MV基因Ⅵ啟動(dòng)子和前毒素編碼序列間的不需要序列間的不需要序列的噬菌體克隆。這種噬菌體稱為mp19/btca/del(見圖17)。
此后，構(gòu)建了一種質(zhì)粒，其中前毒素基因3′編碼區(qū)與Ca MV轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)融合。步驟如圖18所示。首先，質(zhì)粒pA BDI DNA用核酸內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ酶解，分離含有Ca MV轉(zhuǎn)錄終止區(qū)序列的0.5kbp片段。然后，質(zhì)粒pU C19(Yanisch-Perron et al.，Gene，33，103-119(1985)，引入本文作參考)用BamH Ⅰ酶解，與0.5kbp片段混合，與T4DNA連接酶一起培育。在DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌H B101菌株后，得到了具有圖18所示結(jié)構(gòu)的一種克隆，稱為質(zhì)粒p702。此后，質(zhì)粒p702用核酸內(nèi)切酶Sac Ⅰ和Sma Ⅰ切割，用凝膠電泳分離較大的、大約3.2kbp的片段。質(zhì)粒p KU25/4DNA用核酸內(nèi)切酶AhaⅢ和Sac Ⅰ酶解，凝膠電泳后分離出含有前毒素編碼序列3′部分(nt1504-3773)的2.3kbp片段(式1中核苷酸1502-3773)。將這兩種DNA片段混合，用T4DNA連接酶培育，轉(zhuǎn)入大腸桿菌H B101菌株。結(jié)果得到的質(zhì)粒是p702/bt(圖18)。
最后，部分噬菌體mp19/btca/del DNA和質(zhì)粒p702/bt相接，產(chǎn)生含有完整的前毒素編碼序列、由Ca MV啟動(dòng)子和終止區(qū)序列側(cè)接的質(zhì)粒(見圖18)。噬菌體mp19/btca/del DNA用核酸內(nèi)切酶Sac Ⅰ和Sph Ⅰ酶解，瓊脂糖凝膠電泳后純化約1.75kbp片段。同樣，質(zhì)粒p702/bt DNA用核酸內(nèi)切酶Sac Ⅰ和SalⅠ酶解，分離約2.5kbp片段。最后，質(zhì)粒p BR322DNA(Bolivar et al.，Gene，2，95-113(1977)，引入本文作參考)用Sal Ⅰ和Sph Ⅰ酶解，分離4.2kbp較大的片段。將這三個(gè)DNA片段混合，用T4DNA連接酶溫育并轉(zhuǎn)入大腸桿菌H B101菌株。結(jié)果得到的質(zhì)粒p BR322/bt14是p B R322衍生的，含有Ca MV基因Ⅵ啟動(dòng)子和融合于蘇云金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白編碼序列的翻譯起始信號(hào)，接著是Ca MV轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(見圖19)。
載體pC IB10是適用于經(jīng)根瘤土壤桿菌將嵌合基因轉(zhuǎn)移到植物的Ti-質(zhì)粒衍生載體。該載體由寬范圍宿主質(zhì)粒p RK252(可由圣路易斯(Mo.)華盛頓大學(xué)W.Barnes博士提供。衍生該載體還含有由Tn903提供的植物中卡那霉素抗性基因，和來自Ti質(zhì)粒p Ti T37的左右T-DNA端序列。在兩臂序列之間有來自質(zhì)粒p U C18的多連接子和提供植物中卡那霉素抗性的嵌合基因。
首先，修飾質(zhì)粒p RK252，用來自轉(zhuǎn)位子T903的卡那霉素抗性基因取代四環(huán)素抗性基因(Oka，et al.，J.Mol.Biol.，147，217-226(1981)，引入本文作參考)，且還對(duì)其進(jìn)行修飾，用Bgl Ⅱ位點(diǎn)取代pRK252中單一Eco R Ⅰ位點(diǎn)(見圖20對(duì)這些修飾的總結(jié))。質(zhì)粒pRK252首先用核酸內(nèi)切酶Sal Ⅰ和Sma Ⅰ酶解，然后用DNA多聚酶大片段處理，產(chǎn)生平末端，大的載體片段用瓊脂糖凝膠電泳純化。繼之，質(zhì)粒p368用核酸內(nèi)切酶BamH Ⅰ酶解，用DNA多聚酶大片段處理，瓊脂糖凝膠電泳后分離出大約1050-bp片段，這一片段含有來自轉(zhuǎn)位子Tn903的基因，使之具有對(duì)抗生素卡那霉素抗性(OKa et al.，J.Mol.Biol.，147，217-226(1981)，引入本文作參考)。然后將兩個(gè)片段用DNA多聚酶大片段處理，產(chǎn)生平末端。將兩個(gè)片段混合，用T4DNA連接酶于15℃過夜溫育。在轉(zhuǎn)入大腸桿菌H B101菌株和選擇卡那霉素抗性菌落之后，得到質(zhì)粒pRK2521/Tn903(見圖19)。
質(zhì)粒pRK252/Tn903在其Eco R Ⅰ位點(diǎn)被酶解，接著用大腸桿菌DNA多聚酶大片段處理，產(chǎn)生平末端。將這一片段加到合成Bgl Ⅱ限制性位點(diǎn)連接體，用T4DNA連接酶過夜溫育。所得DNA用過量Bgl Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶酶解，較大的載體片段用瓊脂糖凝膠電泳純化。所得片段再用T4DNA連接酶溫育，經(jīng)其新加的Bgl Ⅱ粘性末端重新成環(huán)。轉(zhuǎn)入大腸桿菌H B101菌株之后，得到質(zhì)粒pRK252/Tn903/Bgl Ⅱ(見圖20)。
構(gòu)建了含有Ti質(zhì)粒T-DNA兩臂、質(zhì)粒pUC19的多連接子和植物中卡那霉素抗性可選擇基因的質(zhì)粒p BR322的衍生物(見圖21)。質(zhì)粒pBR325/Eco29含有來自nopaline Ti質(zhì)粒pTi T37的1.5-kbp Eco R Ⅰ片段。這一片段含有T-DNA左端序列(Yadav et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6322-6326(1982)，引入本文作參考)。為用Hind Ⅲ端取代這一片段的EcoR Ⅰ端，質(zhì)粒pBR325/Eco29 DNA用Eco R Ⅰ酶解，然后用核酸酶Sl酶解，接著用DNA多聚酶大片段溫育產(chǎn)生平末端，最后與合成Hind Ⅲ連接物混合，以及用T4DNA連接酶溫育。所得DNA用核酸內(nèi)切酶Cla Ⅰ和過量Hind Ⅲ酶解，得到的含有T-DNA左端的1.1-kbp片段用凝膠電泳純化。此后，質(zhì)粒p UC19的多連接子通過用核酸內(nèi)切酶Eco R Ⅰ和Hind Ⅲ酶解質(zhì)粒DNA分離，用瓊脂糖凝膠電泳分離較小的片段(大約53bp)。此后，質(zhì)粒pBR322用核酸內(nèi)切酶Eco R Ⅰ和Cla Ⅰ酶解，與另外的兩個(gè)分離的片段混合，用T4DNA連接酶溫育并轉(zhuǎn)入大腸桿菌H B101菌株。得到的質(zhì)粒p C IB5含有多聚連接子和質(zhì)粒p BR322衍生物中的T-DNA左臂。
構(gòu)建了含有植物中卡那霉素抗性表達(dá)基因的質(zhì)粒(見圖22和23)。由英國(guó)劍橋大學(xué)植物育種學(xué)院M.Bevan博士得到了質(zhì)粒Bin6。Bevan在Nucl.Acids Res.，12，8711-8721(1984)中描述了這一質(zhì)粒，該文引入本申請(qǐng)作參考。質(zhì)粒Bin6 DNA用Eco R Ⅰ和Hind Ⅲ酶解，瓊脂糖凝膠電泳后分離并純化了含有嵌合新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的大約為15kbp的片段。這一片段與已用核酸內(nèi)切酶Eco R Ⅰ和Hind Ⅲ切割的質(zhì)粒p U C18 DNA混合。用T4DNA連接酶溫育后，得到的DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌H B101菌株。所得質(zhì)粒稱為p U C18/neo。這一質(zhì)粒DNA在新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和nopaline合成酶終止區(qū)序列之間含有不想要的BamH Ⅰ識(shí)別序列(見Bevan，Nucl.Acids Res.，12，8711-8721(1984)，引入本文作參考)。為除掉這一識(shí)別序列，質(zhì)粒p U C18/neo用核酸內(nèi)切酶BamH Ⅰ酶解，接著用DNA多聚酶大片段處理，產(chǎn)生平末端。然后將片段用T4DNA連接酶溫育使片段重新成環(huán)，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌H B101菌株。得到的質(zhì)粒p UC18/neo(Bam)失去了BamH Ⅰ識(shí)別序列。
然后將T-DNA右端序列相鄰加到嵌合NPT基因上(見圖24)。質(zhì)粒pBR325/Hind23含有質(zhì)粒p Ti T37的3.4-kbp Hind Ⅲ片段。這一片段含有T-DNA右端序列(Bevan et al.，Nuel，Acids Res.，Ⅱ，369-385，引入本文作參考)。質(zhì)粒p BR325/Hind 23DNA用核酸內(nèi)切酶Sac Ⅱ和Hind Ⅲ切割，瓊脂糖凝膠電泳后分離并純化了含有右端的1.0kbp片段。質(zhì)粒pUC18/neo(Bam)DNA用核酸內(nèi)切酶Sac Ⅱ和Hind Ⅲ酶解，用瓊脂糖凝膠電泳分離4.0kbp載體片段。將兩個(gè)片段混合，用T4DNA連接酶溫育并轉(zhuǎn)入大腸桿菌HB101菌株。得到的質(zhì)粒pCI B4(圖23所示)含有T-DNA右端和質(zhì)粒p U C18衍生物中卡那霉素抗性植物選擇標(biāo)記。
繼之，構(gòu)建了同時(shí)含有T-DNA左臂和右臂，植物選擇性卡那霉素抗性基因和pUC18多連接子在兩臂之間的質(zhì)粒(見圖28)。質(zhì)粒pCI B4DNA用核酸內(nèi)切酶Hind Ⅲ酶解，然后用DNA多聚酶大片段處理，產(chǎn)生平末端，最后用核酸內(nèi)切酶Eco R Ⅰ酶解。通過瓊脂糖凝膠電泳分離含有嵌合卡那霉素抗性基因和T-DNA右端的2.6-kbp片段。質(zhì)粒p C IB5 DNA用核酸內(nèi)切酶Aat Ⅱ酶解，用T4聚合酶處理產(chǎn)生平末端，然后用核酸內(nèi)切酶Eco R Ⅰ切割。通過瓊脂糖凝膠電泳純化較大的載體片段，與pC IB4片段混合，與T4DNA連接酶一起溫育，轉(zhuǎn)入大腸桿菌HB101菌株。得到的質(zhì)粒pC I B2(圖24所示)是在T-DNA兩臂之間含有所需序列的質(zhì)粒p B R322的衍生物。
下述步驟完成了載體p C IB10的構(gòu)建，如圖25所示。質(zhì)粒pC IB2 DNA用核酸內(nèi)切酶Eco R V酶解，并如上所述將含有Bgl Ⅱ識(shí)別位點(diǎn)的合成連接子加入。經(jīng)過量Bgl Ⅱ核酸內(nèi)切酶酶解后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離大約2.6-kbp片段。上述的質(zhì)粒p RK252/Tn903/Bgl Ⅱ(見圖20)用核酸內(nèi)切酶Bgl Ⅱ酶解，然后用磷酸處理防止再環(huán)化。將這兩個(gè)DNA片段混合，用T4DNA連接酶保溫，轉(zhuǎn)入大腸桿菌H B101菌株。得到的質(zhì)粒是完整的載體pC IB10。
將嵌合前毒素基因插入載體p C IB10的步驟如圖26所示。質(zhì)粒pB R322/bt14 DNA用核酸內(nèi)切酶Pvu Ⅰ和Sal Ⅰ酶解，然后用核酸內(nèi)切酶Bam H Ⅰ部分酶解。通過瓊脂糖凝膠電泳分離含有嵌合基因尺寸為大約4.2kbp的BamH Ⅰ-Sal Ⅰ片段，與已經(jīng)用核酸內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶解的質(zhì)粒p C IB10 DNA混合。用T4DNA連接酶溫育并轉(zhuǎn)入大腸桿菌HB101菌株后，圖26所示的質(zhì)粒在質(zhì)粒載體p C IB10中含有嵌合前毒素基因。
為了將質(zhì)粒pC IB10/19sbt由大腸桿菌H B101菌株轉(zhuǎn)移入土壤桿菌，使用了中間體大腸桿菌宿主菌株S17-1。這一菌株由Agrigenetics Research Corp.，Boulder，Co.可得，具有遷移功能，能將質(zhì)粒p C IB10經(jīng)過連接直接移到土壤桿菌，由此避免了必須將裸露的質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)入土壤桿菌(關(guān)于菌株S17-1，請(qǐng)參見Simon et al.，“Molecular Genetics of the Bacterial-Plant Interaction”，APuhler，ed，Springer Verlag，Berlin，pp.98-106，1983)。首先，將質(zhì)粒p C IB10/19Sbt DNA引入到氯化鈣處理過的S17-1細(xì)胞。此后，將轉(zhuǎn)化的S17-1細(xì)胞培養(yǎng)物和根瘤土壤桿菌菌株LBA4404(Ooms et al.，Gene，14，33-50(1981)，引入本文作參考)混合，室溫下涂于N瓊脂(Difco)平皿上過夜。將1鉑環(huán)所得細(xì)菌劃線接種于AB基本培養(yǎng)基上(Chilton et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，7347-7351(1974)，引入本文作參考)，以50 μg/l卡那霉素涂敷，于28℃溫育。菌落重新劃線接種于相同的培養(yǎng)基，然后劃線接種于NB瓊脂平皿上。采集緩慢生長(zhǎng)的菌落，重新劃線接種于含有卡那霉素的基本培養(yǎng)基，分離單一菌落。這一程序選擇含有p CI B10/19sbt質(zhì)粒的土壤桿菌。
如圖27所示，通過對(duì)Ca MV35 S啟動(dòng)子暗盒質(zhì)粒pC I B710的構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)了構(gòu)建帶有Ca MV35 S啟動(dòng)子的蘇云金芽孢桿菌前毒素嵌合基因。這一質(zhì)粒含有Ca MV啟動(dòng)子和35S RNA轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止序列(covey，S.N.，Lomonossoff，G.P.and Hull，R.，Nucleic Acids Research vol.9，6735-6747(1981)，引入本文作參考)。用如前所述的制備性瓊脂糖凝膠電泳由質(zhì)粒pLV Ⅲ分離Ca MV DNA1149-bp BglⅡ限制性片段(Hohn et al.，Current Topics in Microbiolog and Immunology，96，194-220 and Appendices A to G(1982)，引入本文作參考。(由California-San Diego大學(xué)S.Howell博士可得，此外，這一片段也可直接從Ca MV DNA分離))，并與用BamH Ⅰ切割的質(zhì)粒pU C19 DNA混合，用T4DNA連接酶處理，轉(zhuǎn)入大腸桿菌。所得質(zhì)粒中BamH Ⅰ限制位點(diǎn)被Bgl Ⅲ粘性末端與BamH Ⅰ粘性末端的連接破壞。得到的質(zhì)粒稱為pU C19/35 S，之后用于寡核苷酸定向的離體誘變，將BamH Ⅰ識(shí)別序列GGATCC插在緊接Hohn文獻(xiàn)中Ca MV核苷酸7483之后。得到的質(zhì)粒p C IB710含有由BamH Ⅰ限制位點(diǎn)隔開的Ca MV35S啟動(dòng)子區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。插入該BamH Ⅰ位點(diǎn)的DNA序列將通過Ca MV轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列在植物中表達(dá)。pC IB710在轉(zhuǎn)錄的開始部分和BamH Ⅰ位點(diǎn)之間不含有任何ATG翻譯起始密碼子。
通過圖29所示步驟將Ca MV35S啟動(dòng)子/終止盒插入p CIB10。用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶解質(zhì)粒p C IB10和p C IB710 DNA，混合，連接。產(chǎn)生的質(zhì)粒p C IB10/710含有已被插到植物轉(zhuǎn)化載體p C IB10的Ca M V35S啟動(dòng)子/終止盒。Ca MV35S序列位于p C IB10的T-DNA兩端之間，且在植物轉(zhuǎn)化過程中將被插入植物基因組。
通過圖29所示的步驟，將紫云金芽孢桿菌前毒素基因插入p C IB10/710。用BamH Ⅰ和Nco Ⅰ酶解作為前毒素基因來源的質(zhì)粒p C IB10/19sbt，通過制備性凝膠電泳分離出含有前毒素基因的3.6kb片段。然后將該片段與帶有序列5′-CATGGCCGGATCCGGC-3′的合成Nco I-BamH Ⅰ連接物混合，再用BamH Ⅰ酶切。該步驟使得前毒素片段的兩端均變?yōu)檎承阅┒?。再將這一片段插入被BamH Ⅰ切割的p BIC10/710。產(chǎn)生的質(zhì)粒p C IB10/35sbt如圖29所示，在Ca MV35S啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列之間含有前毒素基因。
如上所述將質(zhì)粒p C IB10/35sbt轉(zhuǎn)移至根瘤土壤桿菌LBA4404菌株。
通過在Kpn Ⅰ限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)(它位于式Ⅰ所示序列的2325位)進(jìn)行切割而除去基因的C-末端部分，構(gòu)建出含有大約725個(gè)氨基酸的缺失紫云金芽孢桿菌前毒素基因，也構(gòu)建出含有這一缺失基因(它攜帶Ca MV35S啟動(dòng)子)的嵌合基因。用BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切質(zhì)粒p C IB10/35sbt(圖29)，通過制備性瓊脂糖凝膠電泳分離含有缺失前毒素基因的大約2.2kbp的BamH I/Kpn Ⅰ片段。為了將3′-端的Kpn Ⅰ位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為BamH Ⅰ位點(diǎn)，將該片段與Kpn I/BamH Ⅰ連接物寡核苷酸混合并連接。然后將這一片段與被BamH Ⅰ切割的p C IB10/710(圖28)混合。
通過在Bcl Ⅰ限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)(它位于式Ⅰ所示序列的2090位)切割以除去基因的C-末端部分，而產(chǎn)生含有大約645個(gè)氨基酸的缺失前毒素基因。用BamH Ⅰ和Bcl Ⅰ酶解質(zhì)粒p C IB10/35sbt(圖29)，且通過制備性瓊脂糖凝膠電泳分離出含有缺失前毒素基因的約1.9kbp BamH I/Bc Ⅱ片段。由于Bcl Ⅰ象BamH Ⅰ一樣能夠產(chǎn)生粘性末端，因此在將該片段連接到BamH Ⅰ切割的p B IC10/710(圖28)之前無需進(jìn)一步處理。在卡那霉素上篩選所產(chǎn)生的質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有圖31所示的結(jié)構(gòu)p C IB10/35sbt(Bcl Ⅰ)。
所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體[稱作p C IB10/35sbt(Kpn Ⅰ)且表示于圖30]含有約725個(gè)氨基酸的缺失前毒素基因。在卡那霉素上篩選這些轉(zhuǎn)化體。
通過引入BamH Ⅰ切割位點(diǎn)(GGATCC)而產(chǎn)生缺失前毒素基因。它是通過克隆含有得自p C IB10/35sbt的前毒素序列的BamH Ⅰ片段至mp18且使用上面所述的標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸誘變方法而完成的。誘變之后，從M13克隆制備雙鏈復(fù)制型DNA，然后用BamH Ⅰ將其酶解。將含有缺失前毒素基因的約1.9kbp片段插入BamH Ⅰ切割的p C IB10/710，在卡那霉素上篩選所產(chǎn)生的質(zhì)粒，其結(jié)構(gòu)p C IB10/35sbt(607)如圖32所示。
使用p C IB10/sbt607。按實(shí)施例7所述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。不同之處在于，將1ml等份試樣立即置于含有選擇性抗生素的培養(yǎng)基中。這一選擇培養(yǎng)基含有卡那霉素(50 μg/ml)或G418(25 μg/ml)。由于NPT嵌合基因在兩種轉(zhuǎn)化的植物組織中的表達(dá)，使得在任一種抗生素上都能夠篩選該組織。
在2-4周，轉(zhuǎn)化的組織在選擇平板上變得明顯。在卡那霉素或G418上篩選植物材料。然后用緩沖液提取植物組織(不管是各個(gè)胚還是愈傷組織)，用ELISA測(cè)定法檢測(cè)BT基因產(chǎn)物的表達(dá)。提取條件如下每100mg 組織，在0.1ml含有50m MNa CO3(p H9.5)、0.05% Triton、0.05% Tween、100nM Nacl、10m MEDTA、1mM leupeptine及1mM PMSF的提取緩沖液中均化。leupeptine和PWSF在使用前立即從100X原液中加入。用一電動(dòng)研杵研磨該組織。提取之后，加進(jìn)2M Tris(p H7)，以調(diào)整p H至8.0-8.5，然后在Beckman微型離心機(jī)12中以12，000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心(于4℃離心10分鐘)，將其上清液用于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(“ELISA”)。
作為常規(guī)工具的ELISA技術(shù)已由M、F、Clark等在“Methods in Enzymology”118∶742-766(1986)上加以敘述，在此引用以作參考。
利用標(biāo)準(zhǔn)方法已完成對(duì)Bt毒素的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，且將其用于分析轉(zhuǎn)移基因植物材料的Bt序列的表達(dá)。對(duì)于該方法，用乙醇對(duì)ELISA平板進(jìn)行預(yù)處理，向平板中加入濃度為3 μg/ml的親和純化的抗Bt抗血清(50 μl)(存在于硼酸鹽緩沖鹽水中)(見下述)。將其于4℃保溫過夜?？寡迨窃趯?duì)用經(jīng)梯度純化的Bt結(jié)晶免疫兔子應(yīng)答中產(chǎn)生的(Ang，B，J.& Nickerson，K.W.;Appl.Environ.Microbiol.36∶625-626(1978)，在此作為參考文獻(xiàn)引入]，用十二烷基磺酸鈉將其溶解，且用ELISA洗滌緩沖液(見下述)洗滌。再用阻斷緩沖液(見下述)將其于室溫下處理1小時(shí)，用ELISA洗滌緩沖液洗滌。加入植物提取物以提供50 μg蛋白質(zhì)(這通常大約為5 μl提取物)。使用商業(yè)上可得到的試劑盒(由Bio-Rad，Richmond，California生產(chǎn))，通過Bradford的方法(Bradford，M.Anal.Bio-chem.72∶248(1976)，在此引用以作參考]測(cè)定作為蛋白質(zhì)的葉片提取物緩沖液。若葉片提取物需要稀釋，則使用ELISA稀釋劑(見下述)。讓其在4℃過夜保溫，用ELISA洗滌緩沖液洗滌之后，以3 μg/ml蛋白質(zhì)(存在于ELISA稀釋劑中)的濃度加進(jìn)50 μl親和純化的山羊抗Bt抗血清。于37℃保溫2小時(shí)，再用ELISA洗滌緩沖液洗滌。在ELISA稀釋劑中將結(jié)合至堿性磷酸酶(商業(yè)上可得自Sigma Chemicals St.Louis，Mo.)的50 μl兔抗山羊抗體以1∶500稀釋，且于37℃保溫1小時(shí)，再用ELISA洗滌緩沖液洗滌。加入50 μl底物
，于室溫下保溫30分鐘。通過加入50 μl3M Na OH終止反應(yīng)。于改進(jìn)的ELISA讀數(shù)器[Hewlett Packard，Stanford，Ca.]上405nm處讀取吸收值。
當(dāng)用這一ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)被p C IB10/35s Bt(BCl Ⅰ)轉(zhuǎn)化的植物組織顯示出陽性反應(yīng)，表明Bt基因被表達(dá)。
EPBS(ELISA磷酸鹽緩沖鹽水)10m M磷酸鈉Na2HPO44.68克/4升Na H2PO4H2O 0.976克/4升140mM Na Cl Na Cl 32.7克/4升pH應(yīng)大約為7.4硼酸鹽緩沖鹽水100mM硼酸25mM硼酸鈉75mM Na Cl
需要時(shí)用HCl或Na OH將pH調(diào)至8.4-8.5。
ELISA阻斷緩沖液存在于EPBS中，1%BSA0.02%疊氮化鈉ELISA洗滌緩沖液10m M Tris-HCl，pH8.00.05% Tween 200.02% 疊氮化鈉2.5 M TrisELISA稀釋劑存在于EPBS中0.05% Tween 201% BSA0.02%疊氮化鈉ELISA底物緩沖液500ml中，48ml二乙醇胺24.5mg Mg Cl2用HCl調(diào)pH至9.8
ELISA底物15mg對(duì)硝基苯磷酸鹽存在于25ml底物緩沖液中。
為了進(jìn)行生物測(cè)定，首先從抗生素抗性細(xì)胞培養(yǎng)物(通過用這些土壤桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化而獲得)制備細(xì)胞懸浮液。將其在補(bǔ)加G418(25mg/l)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔7-10天移種至含有抗生素的新鮮培養(yǎng)基中。將該培養(yǎng)物的樣品用于生物測(cè)定，以測(cè)試對(duì)于鱗翅目昆蟲的毒性。將20ml該培養(yǎng)物的等份試樣沉淀(細(xì)胞體積＝3-4ml)，再懸浮于無抗生素的培養(yǎng)基中。將懸浮液在該培養(yǎng)中再培養(yǎng)兩天，以排除任何剩余抗生素的細(xì)胞。將兩圈濕Whatman 2.3cm濾紙置于3/4盎司分部杯的底部。將0.2cm厚的轉(zhuǎn)化懸浮培養(yǎng)細(xì)胞層置于濾紙圓片上。向每一分部杯中放進(jìn)新孵化的煙草天蛾或美洲菸夜蛾的幼蟲。對(duì)照為在非轉(zhuǎn)化懸浮培養(yǎng)細(xì)胞上飼養(yǎng)的幼蟲。每隔2天(或根據(jù)需要)填滿圓片。天蛾幼蟲通常需要多種植物材料。與從非轉(zhuǎn)化細(xì)胞為食物的幼蟲的生長(zhǎng)率相比，以轉(zhuǎn)化細(xì)胞為食物的幼蟲的生長(zhǎng)率及死亡率在5天后開始計(jì)數(shù)，且清楚地證實(shí)了轉(zhuǎn)化棉花細(xì)胞中的BT基因產(chǎn)物的毒性。
實(shí)施例15置于干酪包布單上的美洲菸夜蛾卵得自北卡羅來納洲立大學(xué)，煙草昆蟲防治實(shí)驗(yàn)室(Raleigh，North Carolina)。將干酪包布單轉(zhuǎn)入一個(gè)大的帶蓋的玻璃燒杯中，用一濕紙巾于29℃將其保溫，以保持濕度。該卵在3天內(nèi)孵化。孵化之后盡快地將幼蟲(每杯一個(gè)幼蟲)轉(zhuǎn)入帶蓋的3/4盎司塑料杯。每杯含有棉花圓葉片。用細(xì)毛涂料刷轉(zhuǎn)移幼蟲。
從棉花植物的葉子打出直徑1厘米的圓葉片，將其放入含有幼蟲的杯中濕濾紙圈上。至少要測(cè)試來自每一植物的6-10個(gè)圓葉片，它們分別代表嫩葉及老葉。每隔2天(或根據(jù)需要)置換圓葉片，以喂養(yǎng)幼蟲。將以轉(zhuǎn)化植物葉子為食物的幼蟲的生長(zhǎng)率(大小或所有復(fù)制蟲的組合重量)和死亡率與以非轉(zhuǎn)化棉葉為食物的幼蟲的生長(zhǎng)率和死亡率進(jìn)行比較。
與對(duì)照相比，以用p C IB10/35 SB5(Bcl Ⅰ)轉(zhuǎn)化的棉花圓葉片為食物的幼蟲的生長(zhǎng)率下降，而死亡率增加。
已發(fā)現(xiàn)，作為本發(fā)明再生方法的結(jié)果，一定數(shù)量的本發(fā)明的再生植物(5-10%)已用遺傳方法獲得了可遺傳的表型變異。這種變異已知為體細(xì)胞克隆變異。下面的實(shí)施例說明了如何將作為本發(fā)明再生方法結(jié)果的體細(xì)胞克隆變異用于給棉花變種帶來商業(yè)上有用的新特性。
實(shí)施例16 對(duì)真菌病原體具有耐受力的棉花再生體接著實(shí)施例1 的步驟，將得自變種S J5和S J4的再生棉花植物硬化，放入土壤。這些植物自花傳粉。收集代表F1代的種子。
為了獲得對(duì)輪枝孢屬具有更大耐受性的再生體(體細(xì)胞克隆變種)，將F1代種入被輪枝孢菌感染的土壤，以進(jìn)行子代行栽分析。將變種S J4和S J5的種子種入地中以作對(duì)照。通過對(duì)整個(gè)植物活力、產(chǎn)量以及缺乏與疾病相關(guān)的葉片癥狀進(jìn)行評(píng)價(jià)而在幾個(gè)子代行(5%)中鑒定出比其親代變種更加耐受輪枝孢屬真菌的體細(xì)胞克隆變種。圖33顯示了種于被輪枝孢屬感染的地上的再生體的子代行。圖34顯示了能夠耐受輪枝孢屬的變種S J4的體細(xì)胞克隆變種。已表現(xiàn)這種對(duì)真菌病原體耐受性的改進(jìn)可穩(wěn)定遺傳，且傳給以后的各代。
實(shí)施例17 改變了生長(zhǎng)習(xí)性的棉花再生體采用實(shí)施例13的方法，不同之處在于F1代不是種于感染病害的土壤中，而是種于棉花育種苗圃。將F1再生子代的全部生長(zhǎng)習(xí)性與對(duì)照變種的生長(zhǎng)習(xí)性進(jìn)行比較。鑒定出比親代變種生長(zhǎng)習(xí)性更均勻且更矮的體細(xì)胞克隆變種。在本發(fā)明人的試驗(yàn)中稱作Phy6的一個(gè)SJ5再生體，其高度比親代變種矮20%。這種生長(zhǎng)習(xí)性對(duì)于在窄行(30″行矩)培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的棉花來說是適宜的。已發(fā)現(xiàn)這些特性可穩(wěn)定遺傳，且代給以后的各代。
實(shí)施例18 改進(jìn)了纖維特性的棉花再生體采用實(shí)施例13的方法，不同之處在于再生體的F1子代是種于棉花育種苗圃，且讓其結(jié)果。棉桃成熟之后，收集棉花，對(duì)幾種纖維質(zhì)量特性進(jìn)行分析，其中包括長(zhǎng)度、均勻性、抗張強(qiáng)度、彈性以及纖維細(xì)度。鑒定出在一個(gè)或多個(gè)這些特性方面比親代變種有明顯改進(jìn)的體細(xì)胞克隆變種。從F2子代(F1的細(xì)胞傳粉)獲得的代表性數(shù)據(jù)已收入下面的表1。用星號(hào)標(biāo)明的數(shù)據(jù)代表S J5再生體的改進(jìn)，它在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的，且已發(fā)現(xiàn)它能夠在以后的各代中真實(shí)繁育。
表1變種或品系 長(zhǎng)度 均勻指數(shù) 抗張強(qiáng)度 彈性 纖維細(xì)度SJ5 1.13 48.7 24.7 6.8 4.273SP16 1.27* 51.2 24.6 8.0* 4.10*3SP20 1.28* 53.1* 23.1 7.6* 4.13*5SP10 1.11 53.2* 25.7* 6.2 4.555SP17 1.18 51.7 26.7* 7.1 4.43實(shí)施例19 改進(jìn)了產(chǎn)量的棉花再生體采用實(shí)施例13的方法，不同之處在于變種S J4再生體的F1子代在同樣的產(chǎn)量試驗(yàn)中是與非再生的對(duì)照種在一起。一個(gè)顯示了更均勻的生長(zhǎng)習(xí)性和更加有活力的生長(zhǎng)習(xí)性的變種的產(chǎn)量比同一試驗(yàn)中的親代變種增加4%。數(shù)據(jù)見下面的表2。
表2變種或品系 每塊試驗(yàn)田的 平均產(chǎn)量 增加百分?jǐn)?shù)平均產(chǎn)量(磅) 磅/英畝SJ4 28.0 3049Phy4 29.1 3169 4%*＊這一差別在95%的置信度上是明顯的。
對(duì)于加州的普遍棉花種植者來說，產(chǎn)量增加4%將意味著每英畝幾乎獲得20美元，在那里每年種植一百萬英畝以上的棉花。
實(shí)施例20 對(duì)除草劑(卡那霉素)具有耐性的棉花再生體按實(shí)施例5的方法獲得棉花變種B1644的懸浮培養(yǎng)物。然后將該懸浮培養(yǎng)物置于如實(shí)施例6所述的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，但補(bǔ)加了除草劑(抗生素)卡那霉素(25mg/l)。群體中的大部分細(xì)胞死亡，但有幾個(gè)(1-5%)具有耐受性，從而存活。將這幾個(gè)存活細(xì)胞在瓊脂固化的培養(yǎng)基中選擇性地繼代培養(yǎng)，不斷提高補(bǔ)加的卡那霉素的濃度，直至最終濃度達(dá)到50mg/l。從這一愈傷組織形成胚，且那些抗性胚萌發(fā)成卡那霉素抗性植物。
權(quán)利要求
1.一種通過懸浮培養(yǎng)而再生棉花的方法，其中a)通過組織培養(yǎng)在含有葡萄糖的第一固體愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)棉花外植體使愈傷組織生長(zhǎng)足夠時(shí)間，以便從可形成愈傷組織的外植體中分泌酚而形成胚發(fā)生愈傷組織；b)酚的分泌結(jié)束后將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有蔗糖作為碳源的第二固體愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基中并在第二固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基上將愈傷組織培養(yǎng)足夠時(shí)間，以使可提供至少一個(gè)胚的胚發(fā)生愈傷組織發(fā)育；c)將在含有蔗糖的第二固體愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基中形成的胚發(fā)生愈傷組織分成幾塊，且懸浮于含有蔗糖的液體愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基中并在所說的懸浮培養(yǎng)物中從所述愈傷組織發(fā)育成大小至少為600微米的胚發(fā)生塊；d)從液體愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基中回收大于600微米的胚發(fā)生塊；e)在植物萌發(fā)培養(yǎng)基中將大于600微米的胚發(fā)生塊培養(yǎng)足夠時(shí)間，以從這些胚發(fā)生塊形成小植物。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中將小于600微米的胚發(fā)生塊再懸浮于新鮮第二液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，以使胚發(fā)生塊進(jìn)一步生長(zhǎng)。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中從懸浮液中移出大于800微米的胚發(fā)生塊，以形成小植物。
4.權(quán)利要求1-3所述的方法，其中生長(zhǎng)開始時(shí)的懸浮培養(yǎng)物為每8ml液體胚生長(zhǎng)培養(yǎng)基中含有750-約1000mg愈傷組織部分。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中外植體選自胚軸、子葉及其混合物，以及未成熟的合子胚。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中至少胚發(fā)生愈傷組織通過在大約25-35℃的溫度下，約16小時(shí)光照和約8小時(shí)無光的光照-無光交替條件下培養(yǎng)而發(fā)育的。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中光照期間的光強(qiáng)度為約2，000-4，000勒。
8.權(quán)利要求6所述的方法，其中光照期間的光強(qiáng)度為約3，000-4，000勒。
9.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中在酚分泌結(jié)束之前，至少每隔10天更換一次含有葡萄糖的固體愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
10.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中第一生長(zhǎng)培養(yǎng)基是Murashige-Skoog氏培養(yǎng)基。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中第一生長(zhǎng)培養(yǎng)基含有萘乙酸。
12.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中第二固體愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基為Murashige-Skoog氏培養(yǎng)基。
13.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中第二固體愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基為含有萘乙酸的Murashige-Skoog氏培養(yǎng)基。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中第二固體愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基含有大約1至5mg/l萘乙酸和0至大約1mg/l細(xì)胞分裂素。
15.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中胚萌發(fā)培養(yǎng)基含有銨源。
16.權(quán)利要求14所述的方法，其中植物萌發(fā)培養(yǎng)基是富含氮源的Beasley-Ting氏培養(yǎng)基。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中胚萌發(fā)培養(yǎng)基為含有至多約500mg/l的酪蛋白水解物及至多約1200mg/l硝酸銨的Beasley-Ting氏培養(yǎng)基。
18.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的棉花的再生方法，其中再生按下列步驟進(jìn)行a)提供一種選自衍生于棉花籽苗的胚軸、子葉或其混合物及未成熟胚的外植體;b)在第一固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基，即補(bǔ)加有鹽酸硫胺素、葡萄糖、萘乙酸、激動(dòng)素及肌醇的Murashige-Skoog氏生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)該外植體，培養(yǎng)是在溫度約25-35℃、約16小時(shí)光照(光強(qiáng)度約為2，000-4，000勒)與約8小時(shí)無光照的光照-無光交替條件下進(jìn)行的，直至足以使從可形成愈傷組織的外植體中酚的分泌結(jié)束并從外植體形成未分化的愈傷組織;c)在酚的分泌結(jié)束后，將愈傷組織從第一固體愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至第二固體愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基，即含有蔗糖及約1-10mg/l萘乙酸的Murashige-Skoog氏培養(yǎng)基中，且在溫度約為25-35℃、約16小時(shí)光照(光強(qiáng)度約為2，000-4，000勒)與約8小時(shí)無光照的光照-無光交替條件下培養(yǎng)愈傷組織足夠時(shí)間，直至形成胚發(fā)生愈傷組織;d)將胚發(fā)生愈傷組織部分以每8ml第二胚生長(zhǎng)培養(yǎng)基約750-1，000mg愈傷組織部分的濃度懸浮于液體愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，且讓胚生長(zhǎng)足夠時(shí)間，形成大小約大于800微米的胚發(fā)生塊;e)將小于800微米的胚發(fā)生塊與大于800微米的胚發(fā)生塊分離;f)將大于800微米的胚發(fā)生塊轉(zhuǎn)移至富含氮源的萌發(fā)培養(yǎng)基中，將胚培養(yǎng)成小植物。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中將小于800微米的胚發(fā)生塊再懸浮于液體愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，重復(fù)步驟d)、e)和f)。
20.權(quán)利要求18或19所述的方法，其中a)通過組織培養(yǎng)在第一固體愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)棉花外植體使愈傷組織生長(zhǎng)足夠時(shí)間以便從外植體分泌酚結(jié)束并發(fā)育成胚發(fā)生愈傷組織;b)在酚的分泌結(jié)束時(shí)將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有蔗糖作為碳源的第二固體愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基中并在第二固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)愈傷組織足夠時(shí)間以使可至少提供一個(gè)胚的胚發(fā)生愈傷組織發(fā)育;c)將胚發(fā)生愈傷組織分成幾塊并懸浮于第二生長(zhǎng)培養(yǎng)基中以形成懸浮培養(yǎng)物，培養(yǎng)所述愈傷組織以形成大小至少為600微米的胚發(fā)生塊;d)濾出大于600微米的胚發(fā)生塊;e)在植物萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)大于600微米的胚發(fā)生塊足夠時(shí)間以由這些發(fā)生塊發(fā)育成小植物。
21.權(quán)利要求18-20任一項(xiàng)所述的方法，其中第一固體愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基在從可形成愈傷組織的外植體分泌酚期間約每10天更換1次，直至酚分泌停止。
22.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中在第二固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)外植體大約3至4周。
23.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括下列步驟在高濕度條件下將小植物轉(zhuǎn)移至土壤中一段足以長(zhǎng)成植物的時(shí)間，從而保證將其轉(zhuǎn)移至溫室，然后轉(zhuǎn)移到田間生長(zhǎng)至最終成熟。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從外植體(它為胚軸、子葉或其混合物)開始通過組織和懸浮培養(yǎng)而再生棉花的方法。也介紹了通過選擇培養(yǎng)轉(zhuǎn)化棉花以改進(jìn)棉花的方法。
文檔編號(hào)C12N5/04GK1070309SQ9211027
公開日1993年3月31日 申請(qǐng)日期1992年9月4日 優(yōu)先權(quán)日1987年11月18日
發(fā)明者瑟福麥爾·斯瑞尼瓦薩·蘭安, 大衛(wèi)·莫里斯·安德森, 卡恩尼阿·雷亞塞卡蘭, 瓊·威廉·格魯拉, 理查德·李·延奧斯基, 理查德·洛恩·赫茲佩思 申請(qǐng)人:泛多金公司