專利名稱:性狀轉(zhuǎn)變的抗稻屬葉條紋病病毒性稻屬及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及編碼稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的基因以及引入這種基因的對(duì)稻屬葉條紋病病毒感染具有抵抗性的稻屬及其制造方法。
作為植物病毒,過(guò)去已知有以煙草花葉病病毒和黃瓜花葉病病毒為首的許多病毒。這些植物病毒成為使農(nóng)作物受病害而大量減收的因素。在這些病毒中,稻屬葉條紋病病毒分布在日本、中國(guó)、蘇聯(lián)、韓國(guó)等地,使這些國(guó)家的稻屬作物大量受害。在日本每年平均約有10%的稻屬受到稻屬葉條紋病病毒危害。
但是,由于實(shí)用的抗病毒劑極少,其防除多半是依賴去除感染源植物和驅(qū)除媒介蟲(chóng)。除了這樣的物理的或化學(xué)的防除手段外,作為生物耕種手段,可以舉出弱毒病毒和抵抗性品種的利用。利用弱毒病毒的防除法是利用若預(yù)先在植物中接種病癥弱的病毒,則往后即使感染具有強(qiáng)病癥的強(qiáng)毒株,也能抑制其繁殖而不發(fā)病這一事實(shí)。此法對(duì)于煙草花葉病病毒(TMV)等一部分病毒正逐步實(shí)用(Ann.Rev.Phytopathol.14(1976);Phytopathol.57,1347(1976);PlantDiseaseReport64,538(1980))。這樣的現(xiàn)象很早就知道,稱作交叉保護(hù)作用。
另一方面,由雜交育種產(chǎn)生的抗病毒性品種也用稻屬、大豆屬、黃瓜屬、蘿卜屬、煙草、番茄屬等培育出,例如,已知把抗稻屬葉條紋病毒性基因引入稻屬栽培種的方法(中國(guó)農(nóng)試報(bào)A16,39)。
近年來(lái),已報(bào)道將編碼病毒外殼蛋白質(zhì)的基因引入植物中,使其在植物體內(nèi)表達(dá),培育出抗病毒性植物(Ann.Rev.Phytopathol.28,451(1990))。另外,已報(bào)道利用將黃瓜花葉病病毒的隨體RNA引入植物而得到抗病毒性植物(Nature328,799(1985)),再有,利用反意RNA的病毒防除法(Proc.Natr.Acad.SciUSA86,6949(1989))。在稻屬中,本發(fā)明人等將編碼稻屬葉條紋病病毒的基因組RNA3的稻屬葉條紋病病毒的外殼蛋白質(zhì)基因引入稻屬,成功地培育出耐稻屬葉條紋病病毒性稻屬(平成3年日本植物病理學(xué)會(huì)大會(huì)講演要旨集p193;Proc.Natl.Acad.SciUSA89,(1992))。
最近,將編碼煙草花葉病病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(54kD蛋白質(zhì))的基因引入煙草,培育出具有強(qiáng)抗煙草花葉病病毒性植物。關(guān)于其抗毒理有許多不明之處,另外,關(guān)于其他病毒,沒(méi)有報(bào)道用這樣的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)培育出抗病毒性植物。本發(fā)明要解決的問(wèn)題是,在稻屬中表達(dá)其效果迄今未知的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì),賦予稻屬抗病毒性。
稻屬葉條紋病病毒具有分節(jié)粒子結(jié)構(gòu),屬于植物的細(xì)瘦病毒類。在病毒粒子內(nèi)包含4種2條鏈RNA和4種1條鏈RNA(分別稱作2條鏈或1條鏈RNA1、RNA2、RNA3和RNA4)。2條鏈RNA1-4對(duì)應(yīng)于各自的1條鏈RNA1-4復(fù)制物(J.gen.Virol.70,505(1989))。在病毒粒子中已看到單一外殼蛋白質(zhì)和RNA聚合酶。另一方面,在稻屬葉條紋病病毒感染稻屬中,除外殼蛋白質(zhì)和RNA聚合酶外,還檢測(cè)出由病毒基因組來(lái)的感染特異蛋白質(zhì)(MicrobiologicalSciences3,347(1986))。感染特異蛋白質(zhì)的分子量因病毒分離株而異(Proc.Assoc.P1.Pro.Kyushu56,423(1990)),關(guān)于這種蛋白質(zhì)的生理作用還不清楚。已報(bào)道稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)由RNA4編碼,外殼蛋白質(zhì)由RNA3編碼(Virology177,371(1990))。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn),用編入含稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)基因的cRNA的載體DNA,改變稻屬性狀,通過(guò)表達(dá)這樣的基因,能夠培育出具有抗稻屬葉條紋病病毒的稻屬,從而完成了本發(fā)明。
也就是說(shuō),本發(fā)明的要點(diǎn)是,在禾本科植物中起作用的啟動(dòng)子下流引入編碼稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的基因及末端為特征的載體、用這一載體轉(zhuǎn)變性狀的稻屬及其制造方法。
雖然按照下述那樣能夠完成本發(fā)明,但只要不超過(guò)其范圍,就不限于以下所述。
還有,雖然下面作為本發(fā)明的一個(gè)例子就稻屬作了描述,但是作為本發(fā)明的禾本科植物,除稻屬外,可列舉出黑麥屬、大麥屬、小麥屬、燕麥/燕麥屬、狗尾草/狗尾草屬、稗屬、馬唐、結(jié)縷草屬、狗尾草/芒屬、甘蔗屬、玉米屬和薏苡屬等。
病毒和病毒RNA的提取、精制例如,將感染稻屬葉條紋病病毒分離株T(J.gen.Virol,70,505-511(1989),的稻屬葉在磷酸緩沖液(10mM二乙基氨荒酸鹽、0.1M磷酸氫二鈉,PH7.2)中粉碎后,加入1/5量的三氟三氯代乙烷進(jìn)行澄清化,然后在20%蔗糖緩沖器中間層,以123000×g離心分離1.5小時(shí)。將得到的沉淀溶入10mmol磷酸緩沖液(PH7.5)中,以4000×g離心分離10分鐘。接著加入硫酸銨并攪拌5分鐘使上清液成為35%飽和,然后以4000xg離心分離5分鐘。將上清液稀釋成4倍后,加入聚乙二醇并攪拌1小時(shí)以上,以使最終濃度為8%。以30000×g將其離心分離30分鐘后,借助加上蔗糖密度梯度離心分離(10-40%、100000×g、2.5小時(shí))沉淀物,能夠精制病毒粒子。用這種方法分離成B、M、nB(從上層至下層)三種成分而得到病毒粒子。本發(fā)明中使用的RNA4含有全成分。
由精制的病毒提取全成分病毒RNA例如用SDS-苯酚法提取。即在精制的病毒懸浮液中加入SDS(2%)、膨潤(rùn)土(12.5mg/ml)和EDTA(2.5mM),再等量加入苯酚而除去蛋白質(zhì),然后按照常規(guī)方法反復(fù)進(jìn)行乙醇沉淀,就能離析精制RNA。用蔗糖密度梯度分離從所得的nB部分可以提取RNA1-4的混合液。從B和M部分能提取RNA2-4的混合液。
由精制的RNA合成cDNA用由B或M部分得到的RNA2-4的混合液合成cDNA。首先,由RNA4的3’末端堿基順序(J.gen.Virol.71,2817(1990))合成在RNA4中具有特異順序的引物(5'GGGCATATCTTTTGAGATTA3';順序表順序號(hào)3)。使用這樣的引物,以全RNA作為模板,按照Gubler-Hoffman的方法(Gene25,263(1983))合成cDNA。所得到的cDNA是1條鏈,所以將其作為模板再合成2條鏈cDNA。
cDNA的克隆及順序下面,以下述實(shí)施例所示的方法、例如使用一千順序用的缺失元件(寶酒造制),將來(lái)自選擇的RNA4的克隆制成克隆的欠缺變異株。以從100至200堿基程度的比例選拔具有欠缺的變異株,然后以Sanger等人的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA74,5463(1977))決定各變異株的堿基順序。接著,由所得的堿基順序,合成引物(5'CCAACTTTCAACATACTTGTT3';順序表順序號(hào)4),作成覆蓋RNA4鏈全長(zhǎng)的cDNA。按與上述相同的方法進(jìn)行克隆來(lái)決定堿基順序。這樣就能夠決定RNA4的全堿基順序。
培育性狀轉(zhuǎn)變植物稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)從RNA4(2157堿基)的第55堿基至第591堿基被編碼(順序表的順序號(hào)2)。以所得的RNA4的cDNA為基,例如用逆反引物(寶酒造制)和合成引物(5'TAATGCTAGCACTCGTGG3';順序表順序號(hào)5)、利用Saiki等人的PCR法(Nature324,126(1986)使也含媒介物PUC19(Gene33,103(1985))的克隆細(xì)胞,而使1-633堿基順序放大,例如插入pUC19的SmaI部位。例如用限制酶SalI和EcoRI切出這樣的基因,編入在禾本科植物中表達(dá)的起動(dòng)子和末端、或者根據(jù)需要編入具有內(nèi)含子的胞質(zhì)遺傳體載體。
所使用的動(dòng)子,可以列舉例如來(lái)自CaMV35s(pBI221EMBO.J.6,3901-3907,1987)等的菜花花葉病病毒的起動(dòng)子、rbcs(ribulosel.5-bisphosphatecarboxylase)、Cab(chlorophylla/bbindingprotein)等(Science,244,174,1989)已確認(rèn)在植物中表達(dá)的起動(dòng)子。
作為末端,可列舉出例如來(lái)自菜花花葉病病毒的末端、來(lái)自NOS(藍(lán)曙紅合成酶)基因的末端等。
另外,在起動(dòng)子和結(jié)構(gòu)基因之間配置內(nèi)含子的載體也能作為高表達(dá)的載體使用,所述的內(nèi)含子例如可列舉出玉米Adhl(乙醇脫氫酶)的第一內(nèi)含子(Genes&Development,1,1183-1200,1987)、蓖麻Cat(過(guò)氧化氫酶)的第一內(nèi)含子(Tanaka等人,NucleicAcidsResearch,18,6767-6770,1990)等。
在本發(fā)明中,還使用從潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因和β-葡糖苷酸酶基因等中選擇的2種以上外來(lái)基因,而且,其中一種最好是使用當(dāng)選擇作為目的的菌落時(shí)有效的所謂選擇標(biāo)記基因。作為這樣的選擇標(biāo)記基因,潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶是理想的。
在本發(fā)明中,可以使用在同一胞質(zhì)遺傳體中有選擇標(biāo)記基因和其它外來(lái)基因的細(xì)胞遺傳體,也可以組合使用具有選擇標(biāo)記基因的胞質(zhì)遺傳體和具有其它外來(lái)基因的胞質(zhì)遺傳體。
載體可用于使禾本科植物性狀轉(zhuǎn)變。也就是將由禾本科植物來(lái)的原生質(zhì)體懸浮在液體介質(zhì)中,外加電脈沖引入該載體后,用含有稻屬培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基培養(yǎng),形成集群,從該集群再生植物的方法(Shimamotoetal,Nature,337,274-276,1989)。原生質(zhì)體可以按以下所述調(diào)制。例如,用R2培養(yǎng)基等通常使用的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)取自日本晴、Koshipikali、Sasanishiki等栽培稻屬的成熟和末成熟種子、幼葉、根組織的懸浮細(xì)胞或愈傷組織,然后按照常規(guī)方法,例如在含纖維素酶和胞壁質(zhì)酶等細(xì)胞壁分解酶的酶液中,以25-30℃、0-50每分鐘沖程次數(shù)的條件進(jìn)行酶處理3-16小時(shí)。酶處理結(jié)束后,過(guò)濾除去未消化物,在濾液中加入2-5倍量的KMC液(0.118M氯化鉀、0.081M氯化鎂、0.085M氯化鈣,pH6.0)(Theor.Appl.Genet.,53,57-63,1978),然后離心分離,能夠得到精制的原生質(zhì)體。
將含有上述調(diào)整過(guò)的基因的表達(dá)載體(例如1-100ug/ml)和來(lái)源于上述植物的原生質(zhì)體(例如(2-10)×106個(gè)/ml)懸浮在含30-200mM氯化鉀、0-50mM氯化鎂和0.2-0.6M甘露醇的緩沖液等液體介質(zhì)中,對(duì)其施加電脈沖將胞質(zhì)遺傳體引入原生質(zhì)體中。適宜的電脈沖處理是使用100-1000μF的電容器、以所產(chǎn)生的200-1000V/cm的初期電壓的直流脈沖、脈沖持續(xù)時(shí)間1-50ms的條件進(jìn)行(參照特開(kāi)平1-181791號(hào)公報(bào))。
將上述電脈沖處理過(guò)的原生質(zhì)體懸浮在例如含R2培養(yǎng)基(Plant.Cell.Physiol.,14,1113,1973)的無(wú)機(jī)成分和MS培養(yǎng)基(Murash igeandskoog,15,473-497,1962)的維生素混合液的液體培養(yǎng)基(R2/MS)或者M(jìn)S培養(yǎng)基,最好作為氮源含0.2-0.5%硝酸鉀的培養(yǎng)基中,將其與含1.0-3.0%左右的瓊脂糖的R2/MS或MS培養(yǎng)基等量反復(fù)混合,然后迅速在培養(yǎng)皿中擴(kuò)展而薄薄地凝固。此時(shí)最好是使原生質(zhì)體的濃度為約(5-50)×105個(gè)/ml。
將固化的瓊脂糖切成5-20mm大小,在上述液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。此時(shí),在使用來(lái)自禾本科植物的原生質(zhì)體時(shí),最好使稻屬培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)基中以大約100-300mgFW/培養(yǎng)皿共存,一邊以20-50rpm的旋轉(zhuǎn)慢慢振動(dòng),一邊在暗條件下于23-27℃進(jìn)行培養(yǎng)。與稻屬培養(yǎng)細(xì)胞共存的方法除上述的方法外,還有將含原生質(zhì)體的液體培養(yǎng)基放入底部設(shè)置有膜濾器的容器內(nèi)、然后將該容器與稻屬培養(yǎng)細(xì)胞一起浸入裝有液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中而共存的方法。這里所述的稻屬培養(yǎng)細(xì)胞最好是由旺盛分裂的細(xì)小細(xì)胞塊組成的。這樣的培養(yǎng)細(xì)胞按照下述公知方法很容易得到,即將例如由稻屬植物的種子、莖、根或藥得到的愈傷組織在液體培養(yǎng)基中中間培養(yǎng),選拔分裂速度快的細(xì)胞。
在培養(yǎng)后2-4周,形成0.5-1mm程度的集群。此時(shí),例如在作為外來(lái)基因引進(jìn)也是選擇標(biāo)記基因的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph)時(shí),如果培養(yǎng)開(kāi)始后7-20天在10-100μg/ml程度的培養(yǎng)液中添加潮霉素,再繼續(xù)培養(yǎng),就能夠有效地進(jìn)行目的為性狀轉(zhuǎn)換細(xì)胞的選擇。接著將這種集群加入增殖培養(yǎng)基上、在照明下(1000-4000米燭光)、于23-27℃培養(yǎng)2-4周,得到φ3-6mm的愈傷組織。上述增殖培養(yǎng)基例如是在R2培養(yǎng)基中添加植物激素,如添加約2mg/升的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、0.1-1.0%的瓊脂糖的瓊脂培養(yǎng)基。單獨(dú)分離各個(gè)愈傷組織,并且在作為外來(lái)基因引入hph基因時(shí),置床在含潮霉素20-50μg/升的同增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng),確定潮霉素的耐受性。
將這種愈傷組織若用例如含0.5-1.5%瓊脂糖的R2/MS培養(yǎng)基(0.1-1%吲哚乙酸、0.5-2%玉米素)、在23-27℃、2000-4000米燭光條件下培養(yǎng),結(jié)果在2-10周看到形成不定胚或不定芽。用不含激素的R2/MS培養(yǎng)基再培養(yǎng)2-3周,得到能移植的植物幼體。這樣得到的植物幼體如果移植到在侄石等中使之成長(zhǎng),就能夠得到性狀轉(zhuǎn)變的稻屬植物體。
抗葉條紋病病毒感染性的確認(rèn)由再生的稻屬的葉提取蛋白質(zhì),用Western印跡分析確認(rèn)表達(dá)稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的性狀轉(zhuǎn)變稻屬。這樣的性狀轉(zhuǎn)變稻屬和作為對(duì)照物使用的未表達(dá)稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的稻屬與正常稻屬一起放入裝有一定數(shù)的病毒蟲(chóng)(小褐稻虱)的培育箱中使之感染。經(jīng)過(guò)3-5天后,清除蟲(chóng),用殺蟲(chóng)劑殺死殘留的蟲(chóng),然后在隔離溫室中觀察至發(fā)病。此后,由性狀轉(zhuǎn)變體和對(duì)照物的病毒病的感染率測(cè)定抵抗性。
實(shí)施例下面雖然列舉實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明,但只要不超出本發(fā)明的范圍,本發(fā)明不限于下面的實(shí)施例。
實(shí)施例1病毒粒子和病毒RNA的精制將帶有稻屬葉條紋病毒(J.gen.Virol.70,505(1989))的小褐稻虱接種在小麥上,使病毒繁殖一周后凍結(jié)。將這樣凍結(jié)的感染葉在磷酸緩沖液(10mM二乙基氨荒酸鹽、0.1M磷酸氫二鈉,PH7.2)中粉碎后,加入1/5量的三氟三氯代乙烷,澄清后在20%蔗糖緩沖器中間層,以123000×g離心分離1.5小時(shí)。將沉淀溶解在10mM磷酸緩沖液(PH7.5)中,以4000xg離心分離10分鐘。接著加入硫酸銨并攪拌5分鐘使上清液成為35%飽和,然后以4000×g離心分離5分鐘。將上清液稀釋約4倍后,加入聚乙二醇并攪拌1小時(shí)使最終濃度為8%。將其以30000xg離心分離30分鐘后,對(duì)沉淀進(jìn)行蔗糖密度梯度離心分離(10-40%、100000×g、2.5小時(shí))。病毒粒子被分離成B、M、nB(從上層至下層)三部分。通過(guò)離心分離(123000×g、3小時(shí))含病毒的各層,精制病毒粒子。本發(fā)明中使用的RNA4包含全成分。
用SDS-苯酚法從精制的病毒中提取全病毒RNA。也就是在精制的病毒懸浮液中加入SDS(2%)、膨潤(rùn)土(12.5mg/ml)和EDTA(2.5mM),再加入等量的苯酚除去蛋白質(zhì),然后按照常規(guī)方法反復(fù)進(jìn)行乙醇沉淀,離析精制出RNA。按照這種方法從蔗糖密度離心分離得到的B和M部分能提取RNA2-4的混合液。
實(shí)施例2cDNA的合成和克隆用RNA2-4的混合液合成cDNA。首先,由直接順序決定RNA4的3’末端堿基順序(J.gen.Virol71,2871(1990)),然后合成引物(5'GGGCATATCTTTTGAGATTA3';順序表順序號(hào)3)。以RNA2-4作為模板使用逆轉(zhuǎn)錄酶、按照Gubler-Hoffman的方法(上述)合成cRNA。所得到的cRNA是一條鏈,因此以它作為模板再合成兩條鏈cRNA。將兩條cRNA連接在細(xì)胞遺傳體pUC19(Gene33,103-119,(1985))的SmaI部位上,用大腸桿菌DH5α進(jìn)行性狀轉(zhuǎn)換,實(shí)現(xiàn)克隆。為了調(diào)查對(duì)應(yīng)3個(gè)RNA中的哪一個(gè),所得的克隆從各個(gè)克隆的兩末端以200堿基程度作順序決定堿基順序。將這些與已記載的某種RNA4的3’末端堿基順序(J.gen.Virol.71,2817(1990))進(jìn)行比較,根據(jù)與RNA4的3’末端約50堿基的相同性,判斷由RNA4來(lái)的克隆,然后選擇這樣的克隆。用Sanger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA74,5463(1977)的方法確定這樣的克隆的堿基順序后,合成對(duì)于在5’端附近具有適當(dāng)順序區(qū)域的引物(5'CAACTTTCAACATACTTGTT3';順序表順序號(hào)4),用引物伸長(zhǎng)法合成RNA4整個(gè)區(qū)域的cRNA。
實(shí)施例3cDNA的順序和稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)基因的決定在上面,使用寶酒造制的一千順序用的缺失元件將來(lái)自選擇的RNA4的克隆制作成克隆欠缺變異株。以100至200堿基程度的比例選拔保持欠缺的變異株,按照Sanger等人的方法(上述雙去氧法)決定各變異株的堿基順序。可以看出,RNA4由2157個(gè)堿基構(gòu)成,與在病毒RNA的5’端有178個(gè)氨基酸(順序表的順序號(hào)1),分子量為20541的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域,和在病毒RNA中是在互補(bǔ)的RNA的5’端有286個(gè)氨基酸、分子量為32474的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域?qū)?yīng)的RNA(J.gen.Virol.,73,1309-1312(1992))。接著,用計(jì)算機(jī)分析(GENETYX,SoftwareDevelopmentCo.),求出由RNA4編碼的蛋白質(zhì)的推斷氨基酸順序。另一方面,用PICO·TAG法(Waters)分析由感染稻屬精制的稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的氨基酸組成。將所得結(jié)果與由稻屬葉條紋病病毒編碼的、被認(rèn)為是稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域推定的氨基酸組成比較,看到98%的相同性。因此確定了分子量約20000的蛋白質(zhì)是稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì),而且這樣的區(qū)域是編碼稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的基因。該堿基順序示于順序表的順序號(hào)2中。另外,在本發(fā)明中,在能夠?qū)Φ緦儋x予抗病毒性的范圍內(nèi),除去一部分氨基酸或堿基,進(jìn)行置換或者追加等的改變,也包括在本發(fā)明中。
實(shí)施例4性狀轉(zhuǎn)變用胞質(zhì)遺傳體的構(gòu)筑作為性狀轉(zhuǎn)變用載體,將pIG221(PlantCellPhysiol.31,805(1990))的β-葡糖苷酸酶的編碼區(qū)域與潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶交換,利用缺失內(nèi)含子上流的ATG的稻屬高表達(dá)潮霉素耐性載體(pIZI)。在這樣的pIZI載體中,具有菜花花葉病病毒的355起動(dòng)子和由蓖麻的過(guò)氧化氫酶來(lái)的內(nèi)含子、由土壤桿菌的合酶基因來(lái)的末端。
用實(shí)施例2和實(shí)施例3使含有由選擇的RNA4來(lái)的cDNA而來(lái)的稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的基因,使用逆反引物(寶酒造制)和引物(5'TAATGCTAGCACTCGTGG3';順序表的順序號(hào)5)用PCR法放大,用T4聚合酶(寶酒造制)處理成平滑末端后,插入pUC19(上述)的SmaI的部位。用限制酶EcoRI切斷這樣的克隆后,用T4聚合酶形成平滑末端,再用限制酶SalI切斷,回收含有編碼稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的基因的片段。用EcoRI和SalI切斷pIZI載體,除去潮霉素耐性基因(hph)。此時(shí)EcoRI部位用T4聚合酶形成平滑末端。使用DNAラィゲ一シヨンキット(寶酒造制),使這樣得到的菜花花葉病病毒的355起動(dòng)子和具有蓖麻過(guò)氧化氫酶的內(nèi)含子、ノパリンシンタ一ゼ的末端的載體及編碼稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的基因環(huán)狀化。用大腸桿菌DH5α進(jìn)行性狀轉(zhuǎn)換,用氨芐青霉素選拔,得到性狀轉(zhuǎn)換用胞質(zhì)遺傳體pLAN160。
實(shí)施例5利用電泳激法進(jìn)行稻屬原生質(zhì)體性狀轉(zhuǎn)換(1)稻屬原生質(zhì)體的離析本發(fā)明中使用的來(lái)源于稻屬植物的原生質(zhì)體是取自栽培稻屬日本晴的成熟種子,它是按以下所述方法得到的。將成熟種子的懸浮細(xì)胞在R2培養(yǎng)基中培養(yǎng)后,用含4%纖維素酶RS、1%胞壁質(zhì)酶R10和0.4M甘露醇的酶液(PH5.6)在30℃處理3-4小時(shí)。過(guò)濾酶處理液后,在濾液中加入4倍量的KMC液(KCl0.118M、CaCl20.085M、MgCl20.081M,PH6.0,上述),用離心分離收集沉降的原生質(zhì)體,然后再用KMC液洗滌2次。
(2)電脈沖處理將上述(1)中調(diào)整的原生質(zhì)體懸浮在EP3緩沖液(含70mM Kcl、5mM MgCl2、0.4M甘露醇、0.1%MES的緩沖液(PH5.8))中,形成4×106個(gè)/ml的懸浮液。在這種懸浮液中添加上述實(shí)施例4中得到的胞質(zhì)遺傳體pLAN160(60g/ml)及作為選拔標(biāo)記具有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的胞質(zhì)遺傳體pIZI(60ug/ml),在4℃冷卻5分鐘后,移入減菌的塑料小室中,用平行電極施加直流電脈沖。此時(shí),用800u F電容器加上300V/cm的初期電壓,脈沖持繼時(shí)間是10ms。施加脈沖后在4℃冷卻10分鐘,然后與等量的R2/MS原生質(zhì)體瓊脂糖培養(yǎng)基(Mol.Gen.Gent.,206,408(1987))混合,固化形成0.7mm厚。此時(shí)的細(xì)胞密度是約3×106個(gè)/ml。
(3)原生質(zhì)體的培養(yǎng)將含有進(jìn)行過(guò)上述(2)的電脈沖處理的原生質(zhì)體的瓊脂糖切成1cm四方形的大小,然后放入加有5mlR2/MS液體原生質(zhì)體培養(yǎng)基的φ6cm的盤中,再加入約100mg(新鮮重量)作為培養(yǎng)細(xì)胞的稻屬細(xì)胞。
這樣的稻屬培養(yǎng)細(xì)胞按以下所述進(jìn)行調(diào)制。即,將來(lái)自成熟胚的愈傷組織在液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培植1周,使用存在于制作懸浮培養(yǎng)液中的分裂旺盛的細(xì)小(φ1mm以下)細(xì)胞塊作為培養(yǎng)細(xì)胞。
原生質(zhì)體的培養(yǎng)是在約25℃進(jìn)行大約10天,在暗處邊振動(dòng)(50rpm)邊培養(yǎng)。在這種培養(yǎng)之后,洗出培養(yǎng)細(xì)胞。再培養(yǎng)3-4天后在培養(yǎng)基中加入潮霉素B,使形成30μg/ml,然后培養(yǎng)2-3周。此后,將瓊脂糖片放置在N6軟瓊脂糖(2mg/12,4D、0.5mg/l芐基氨基嘌呤、6%蔗糖、0.25%瓊脂糖,PH5.6)中,取出變大的集群,轉(zhuǎn)移到R2繁殖培養(yǎng)基(2mg/l2,4D、6%蔗糖、0.5%瓊脂糖,PH5.6)中繁殖2-3周。耐性愈傷組織的出現(xiàn)頻度相對(duì)于生成的集群是約0.5%。
(4)植物體的再生將(3)中得到的愈傷組織放置在R2/MS再生培養(yǎng)基(1mg/l玉米素、0.5mg/l吲哚乙酸、3%山梨糖醇、2%蔗糖、1%瓊脂糖,pH5.8)中,在亮處培養(yǎng)3-10周,出現(xiàn)芽及根。在芽長(zhǎng)成2cm程度時(shí),移至含相同培養(yǎng)基的品紅箱,使之長(zhǎng)成幼小植物。再移移到侄石箱中生長(zhǎng)發(fā)育,便得到性狀轉(zhuǎn)變體稻屬。
(5)性狀轉(zhuǎn)變植物的解析首先,按照Richards方法(CurrentProtocolinMolecularBiology2.3.1(1987))從上述(3)中得到的愈傷組織提取DNA,用由35S起動(dòng)子上流側(cè)的堿基順序合成的引物(5’CTCAGAAGACCAAAGGG3’,順序表的順序號(hào)6)和由稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)基因下流側(cè)的堿基順序合成的引物(5’TAATGCTAGCACTCGTGG3’,順序表的順序號(hào)5)進(jìn)行PCR。將外來(lái)基因片段利用PCR放大的愈傷組織作為性狀轉(zhuǎn)換體愈傷組織,移到N6再生培養(yǎng)基(1mg/l玉米素、0.5mg/l吲哚乙酸、3%山梨糖醇、2%蔗糖、pH5.8)。在這個(gè)階段引入外來(lái)基因的愈傷組織的比例是潮霉素耐性愈傷組織的約90%。
接著,從PCR正愈傷組織再生的性狀轉(zhuǎn)變體中采集一部分幼葉,在含1%SDS、1mM碘乙酸的Tris緩沖液中磨碎,在100℃熱處理5分鐘。利用15000×g離心分離10分鐘進(jìn)行澄清化,用含1%SDS的10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳,將蛋白質(zhì)電移到尼龍膜(Immobilon,微孔)中后,用抗稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)抗體和堿磷酸酶結(jié)合二次抗體進(jìn)行Western印跡分析,證實(shí)了表達(dá)稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的性狀轉(zhuǎn)變體。在再生的7個(gè)克隆中,有4個(gè)克隆中證實(shí)了稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的表達(dá)。
再有,用Chomczynski和Sacchi的方法(Annal.Biochem.162,156(1987))從性狀轉(zhuǎn)變體的葉中提取RNA。按照阿馬夏目公司的報(bào)告書,用含2.2M的甲醛的1%瓊脂糖對(duì)10μg的RNA進(jìn)行電泳。用真空抽吸裝置轉(zhuǎn)移到尼龍膜(ハィボンドN、アマシヤム),以稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)基因的編碼區(qū)域作為探針進(jìn)行Northern印跡分析,證實(shí)表達(dá)了mRNA。此時(shí),探針使用多級(jí)標(biāo)定儀器(阿馬夏目),以32P-dCTP標(biāo)記。
實(shí)施例6性狀轉(zhuǎn)變體的抗葉條紋病病毒性的證實(shí)使用帶有稻屬葉條紋病病毒的害蟲(chóng)(小褐稻虱),對(duì)經(jīng)過(guò)實(shí)施例5中所述Northern和Western印跡分析證實(shí)表達(dá)了稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的性狀轉(zhuǎn)變稻屬、4個(gè)克隆(22個(gè)體)進(jìn)行感染試驗(yàn)。作為對(duì)照物使用了未表達(dá)稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的性狀轉(zhuǎn)變稻屬和非性狀轉(zhuǎn)變稻屬。
將這樣的供試驗(yàn)個(gè)體放入光飼育箱中,在該箱中,以10個(gè)帶病毒的小褐稻虱對(duì)1個(gè)稻屬個(gè)體的比例感染稻屬葉條紋病病毒,經(jīng)過(guò)3-5天后,清除附在稻屬上的蟲(chóng),再用殺蟲(chóng)劑殺死殘存的害蟲(chóng),然后轉(zhuǎn)移到隔離溫室中觀察至發(fā)病。比較性狀轉(zhuǎn)變體與作為對(duì)照物用的2種稻屬的稻屬葉條紋病病毒病發(fā)病率。表達(dá)稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的稻屬的性狀轉(zhuǎn)變體的稻屬葉條紋病病毒病發(fā)率是9%,作為對(duì)照物用的2種稻屬的稻屬葉條紋病病毒發(fā)病率總共是83%。由此證實(shí)了,表達(dá)稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的性狀轉(zhuǎn)變稻屬對(duì)稻屬葉條紋病病毒是具有抵抗性的。
實(shí)施例7向稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的下代遺傳的證實(shí)采集表達(dá)稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的性狀轉(zhuǎn)變體的種子并使之發(fā)芽,該蛋白質(zhì)是在實(shí)施例6中所示的對(duì)稻屬葉條紋病病毒顯示抵抗性。用與實(shí)施例5中所述相同的方法進(jìn)行Western印跡分析,調(diào)查在性狀轉(zhuǎn)變中使用的基因是否遺傳給下一代并表達(dá)。觀察2個(gè)系統(tǒng)的性狀轉(zhuǎn)變體,表達(dá)稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的比例分別是22/25(88%)、23/27(85%),可以證實(shí)該基因遺傳給了下一代。
按照本發(fā)明,將病毒外殼蛋白質(zhì)以外的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的稻屬葉條紋病病毒的感染特異蛋白質(zhì)基因引入稻屬中,在稻屬中表達(dá)稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)或者這種基因的mRNA,能夠培育出抗稻屬葉條紋病病毒感染性稻屬。
順序表順序號(hào):1順序長(zhǎng)度:178順序類型:氨基酸布局:直鏈狀順序種類:蛋白質(zhì)來(lái)源:稻屬葉條紋病病毒順序
順序號(hào):2順序長(zhǎng)度:537順序類型:核酸鏈數(shù):一條鏈布局:直鏈狀順序種類:其他核酸來(lái)源:稻屬葉條紋病病毒順序
順序號(hào):3順序長(zhǎng)度:20順序類型:核酸鏈數(shù):一條鏈布局:直鏈狀順序種類:其他核酸順序GGGCATATCT TTTGAGATTA20順序號(hào):4順序長(zhǎng)度:20順序類型:核酸鏈數(shù):一條鏈布局:直鏈狀順序種類:其他核酸順序CAACTTTCAA CATACTTGTT20順序號(hào):5順序長(zhǎng)度:18順序類型:核酸鏈數(shù):一條鏈布局:直鏈狀順序種類:其他核酸順序TAATGCTAGC ACTCGTGG18
順序號(hào):6順序長(zhǎng)度:537順序類型:核酸鏈數(shù):一條鏈布局:直鏈狀順序種類:其他核酸順序CTCAGAAGAC CAAAGGG17附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明
圖1是在實(shí)施例中得到的性狀轉(zhuǎn)變用胞質(zhì)遺傳體pLAN160的模式圖。
權(quán)利要求
1.載體,其特征是,它是在禾本科植物中起作用的起動(dòng)子下流引入編碼稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的基因和末端而成。
2.權(quán)利要求1所述的載體,其特征在于,編碼稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的基因是編碼以順序表的順序號(hào)1中記載的氨基酸順序表示的蛋白質(zhì)的基因,所述氨基酸順序如下
3.權(quán)利要求2所述的載體,其特征在于,編碼稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的基因是以順序表的順序號(hào)2中記載的堿基順序表示,所述堿基順序如下
4.禾本科植物,它是將權(quán)利要求1-3中所述的載體引入禾本科植物的原生質(zhì)體,形成集群后由該集群再生出植物體而得到的。
5.稻屬,它是將權(quán)利要求1-3中所述的載體引入稻屬的原生質(zhì)體,形成集群后從該集群再生出植物體而得到的。
6.禾本科植物的制造方法,其特征在于,將權(quán)利要求1-3中所述的載體和由禾本科植物得來(lái)的原生質(zhì)體懸浮在液體介質(zhì)中,施加電脈沖引入該載體,然后用含有稻屬培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基培養(yǎng),使形成集群,由該集群使植物體再生。
7.編碼順序表的順序號(hào)1中所記載的氨基酸順序表示的稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的稻屬葉條紋病病毒基因組RNA4基因,所述氨基酸順序如下
8.由順序表的順序號(hào)2中記載的堿基順序表示的稻屬葉條紋病病毒基因組RNA4基因,所述堿基順序如下
全文摘要
用在禾本科植物中起作用的起動(dòng)子下流引入編碼稻屬葉條紋病病毒感染特異蛋白質(zhì)的基因和末端的載體,使稻屬性狀轉(zhuǎn)變,通過(guò)表達(dá)這樣的基團(tuán),培育出具有抗稻屬葉條紋病病毒性的稻屬。使用這種方法,利用過(guò)去已知的稻屬葉條紋病病毒外殼蛋白質(zhì)以外的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì),能夠培育出抗該病毒性的稻屬。
文檔編號(hào)C12N15/40GK1075335SQ9211517
公開(kāi)日1993年8月18日 申請(qǐng)日期1992年12月2日 優(yōu)先權(quán)日1991年12月2日
發(fā)明者朱亞峰, 早川孝彥, 鳥(niǎo)山重光 申請(qǐng)人:三菱商事株式會(huì)社, 三菱化成株式會(huì)社, 農(nóng)林水產(chǎn)省農(nóng)業(yè)環(huán)境技術(shù)研究所