專利名稱:抗腫瘤的腦啡肽-干擾素融合蛋白及其制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種新型、高效的抗腫瘤的腦啡肽-干擾素融合蛋白及其制法,特別涉及在大腸桿菌中表達(dá)的重組腦啡肽-干擾素融合蛋白及其制法。
在現(xiàn)有技術(shù)中,已知干擾素是一種具有抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子,近年來(lái)已開(kāi)始應(yīng)用于治療腫瘤病、病毒病和免疫性疾患。但是現(xiàn)有的干擾素產(chǎn)品均不具有專一針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性,因而在實(shí)用中仍表現(xiàn)出有效劑量大、不同程度地?fù)p害正常細(xì)胞、以及存在相當(dāng)程度的不良副反應(yīng)等缺點(diǎn)。
本發(fā)明的目的在于提供一種將干擾素專一導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞,不會(huì)損害正常細(xì)胞,即副作用很小、有效劑量小的具有抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能的腦啡肽-干擾素融合蛋白。本發(fā)明的另一目的是提供一種腦啡肽-干擾素融合蛋白的制備方法。
本發(fā)明是這樣來(lái)實(shí)施的(1)組成方面是腦啡肽-干擾素融合蛋白,它是氨基端的腦啡肽5肽部分(Try-Gly-Gly-Phe-Met)和羧基端的干擾素166肽部分,兩者由中間連接肽3肽(Ser-Gly-Ser)相連,總分子量為21kD。這種融合蛋白的腦啡肽部分負(fù)責(zé)與腫瘤細(xì)胞表面所富含的腦啡肽受體結(jié)合,即發(fā)揮導(dǎo)向功能,而其中的干擾素部分則負(fù)責(zé)發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的功能,而中間連接肽的存在,保證了上述兩個(gè)生物大分子能獨(dú)立形成各自的立體構(gòu)象,從而保證兩者均能最大限度地發(fā)揮出各自的生理功能,成為一種“生物導(dǎo)彈”。
(2)制法方面,共分6個(gè)步驟(ⅰ)腦啡肽基因和連接肽基因的合成是在通用的DNA自動(dòng)合成儀(美國(guó)AppliedBiosystem公司381A型)上采用已知的亞磷酰胺法化學(xué)合成。合成片段的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)為T(mén)CGACATGTACGGTGGCTTTATGTCCGGATCCTGCGACCTGC,其中已包括腦啡肽和連接肽的編碼區(qū)。
(ⅱ)IFN基因的分離是采用冷凍勻漿及蛋白酶,從人的胎肝中提取染色體DNA作為模板進(jìn)行常規(guī)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),擴(kuò)增出人的干擾素-α1c基因。
(ⅲ)連接用限制性內(nèi)切酶Ddel切割干擾素-α1c基因產(chǎn)生粘端,與合成基因部分經(jīng)T4DNA連接酶連接成融合基因。隨后將融合基因經(jīng)連接酶催化連接組裝入原核表達(dá)質(zhì)粒pBV220中,經(jīng)DNA測(cè)序證明與設(shè)計(jì)相符。
(ⅳ)表達(dá)融合基因在pBV220中由PRPL串聯(lián)啟動(dòng)子控制在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白,即腦啡肽-干擾素融合蛋白。
(ⅴ)純化表達(dá)的重組腦啡肽-干擾素融合蛋白經(jīng)抗α1型干擾素單克隆抗體親和層析純化后,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳呈單一條帶。氨基酸序列測(cè)定結(jié)果表明,融合蛋白N端15個(gè)殘基序列與原設(shè)計(jì)完全符合。
下面的優(yōu)選例對(duì)本發(fā)明的腦啡肽-干擾素融合蛋白及其制法作詳細(xì)說(shuō)明,但不限制本發(fā)明的范圍。
腦啡肽-干擾素融合蛋白的基本構(gòu)成是氨基端的腦啡肽部分(Try-Gly-Gly-Phe-Met)和羧基端的干擾素166肽部分,兩者由中間連接肽3肽(Ser-Gly-Ser)相連,總分子量為21kD。
制造方法的例子是(ⅰ)腦啡肽基因和連接肽基因的合成是在通用的DNA自動(dòng)合成儀(美國(guó)AppliedBiosystem公司381A型)上采用已知的亞磷酰胺法化學(xué)合成兩條互補(bǔ)單鏈,單鏈1的序列為T(mén)CGACATGTACGGTGGCTTTATGTCCGGATCCTGCGACCTGC,單鏈2的序列GTACATGCCACCGAAATACAGGCCTAGGACGCGGACGGACT,兩片段退火后構(gòu)成包括腦啡肽和連接肽的編碼區(qū)的雙鏈。各1微克的兩條互補(bǔ)單鏈在以下條件退火pH=7.5、室溫和采用0.05mol/L三羥甲基氨基甲烷/鹽酸退火緩沖液。
(ⅱ)干擾素基因的分離是采用冷凍勻漿及蛋白酶從中國(guó)人的胎肝中提取染色體DNA,再經(jīng)苯酚和氯仿純化后的DNA作為模板,再用常規(guī)通用的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出人的干擾素-α1c基因,隨后連接到通用的質(zhì)粒pUC18中建成無(wú)性繁殖系。
(ⅲ)連接用限制性內(nèi)切酶DdeI切割干擾素基因,產(chǎn)生Ddel粘端,與合成并經(jīng)退火形成的雙鏈的DdeI粘端在T4DNA連接酶催化下連接,最終構(gòu)成編碼融合蛋白的基因片段。將該基因片段再經(jīng)T4DNA連接酶催化連接后組裝入原核表達(dá)質(zhì)粒pBV220中,經(jīng)DNA測(cè)序證明與設(shè)計(jì)相符。
(ⅳ)表達(dá)由PRPL串聯(lián)啟動(dòng)子控制在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白,其條件是,將含有表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌菌種接種到LB培養(yǎng)基,于37℃下振搖過(guò)夜,次日按1∶10體積比接種到新鮮LB培養(yǎng)基中,30℃下振搖至OD600=0.6為止,轉(zhuǎn)至42℃繼續(xù)振搖4-6小時(shí),即誘導(dǎo)表達(dá)出腦啡肽-干擾素融合蛋白。
(ⅴ)純化將上述經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的菌液在一通用的微量離心機(jī)內(nèi)以5000rpm離心10分鐘,棄去上清液,向下層沉淀物加入1/100原菌液體積的7mol/L鹽酸胍裂解液(pH8.0),在4℃下靜置過(guò)夜,次日于12000rpm離心10分鐘,取出上層清液,用磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L,pH=7.5)進(jìn)行透析,隨后過(guò)抗干擾素單克隆抗體親和層析柱,用甘氨酸緩沖液(pH=2.5)洗脫,制得本發(fā)明的特異結(jié)合的腦啡肽-干擾素融合蛋白。
將本發(fā)明的抗腫瘤多肽藥物腦啡肽-干擾素融合蛋白(1)經(jīng)濾泡性口炎病毒-人羊膜傳代細(xì)胞系統(tǒng)檢測(cè)每升表達(dá)菌液(OD600=1.0)的抗病毒活性,4次結(jié)果為9.8×10MU,7.0×10MU,8.5×10MU,7.5×10MU,平均為8.2×10MU,稍高于母體干擾素分子的抗病毒活性。
(2)采用H3-TdR摻入法測(cè)定抗腫瘤細(xì)胞增殖活性,結(jié)果如下表。
細(xì)胞系干擾素腫瘤細(xì)胞抑制率(%)濃度(U)腦啡肽干擾素單一干擾素P值結(jié)腸癌1014.23.8(HCT-8)10029.08.7<0.01100043.011.6多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤1016.82.9(BT-325)10025.57.1<0.01100036.510.0(3)采用腦啡肽受體競(jìng)爭(zhēng)劑Naloxone可阻斷上述增強(qiáng)抑制的作用,證明本發(fā)明的融合蛋白的確由腦啡肽導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞,而且上述效果與融合蛋白同腦啡肽受體的結(jié)合有關(guān)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下(1)本發(fā)明的腦啡肽-干擾素融合蛋白比單一的干擾素具有較高的腫瘤細(xì)胞抑制率,即抗腫瘤功效較佳。
(2)由于腦啡肽有把干擾素導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞的功能,故對(duì)正常細(xì)胞損害較輕,即大大減輕了副作用,同時(shí)投劑量也較單一干擾素的量少得多。
權(quán)利要求
1.一種具有高效抗腫瘤功能的腦啡肽-干擾素融合蛋白,其特征在于氨基端的腦啡肽部分和羧基端的干擾素部分,兩者由中間連接肽三肽(Ser-Gly-Ser)相連,總分子量為21KD。
2.一種具有高效抗腫瘤功能的腦啡肽-干擾素融合蛋白的制備方法,其特征在于(ⅰ)腦啡肽基因和連接肽基因的合成,是在通用的DNA自動(dòng)合成儀上采用亞磷酰胺法化學(xué)合成,合成片段的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)為T(mén)CGACATGTACGGTGGCTTTATGTCCGGATCCTGCGACCTGC,其中已包括腦啡肽和連接肽的編碼區(qū)。(ⅱ)干擾素基因的分離,采用冷凍勻漿及蛋白酶從人的胎肝中提取染色體DNA作為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),擴(kuò)增出人的干擾素基因。(ⅲ)連接用限制性內(nèi)切酶DdeI切割干擾素基因,產(chǎn)生粘端,與合成基因部分由T4 DNA連接酶催化連接成融合基因。隨后將融合基因經(jīng)連接酶催化連接組裝入原核表達(dá)質(zhì)粒pBV220中,經(jīng)DNA測(cè)序證明與設(shè)計(jì)相符。(ⅳ)表達(dá)融合基因在pBV220中由PRPL串聯(lián)啟動(dòng)子控制在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白,即重組的腦啡肽-干擾素融合蛋白。(ⅴ)純化經(jīng)抗干擾素單克隆抗體親和層析純化。
全文摘要
一種新型、高效的抗腫瘤腦啡肽-干擾素融合蛋白,它是由氨基端的腦啡肽五肽部分(Try-Gly-Gly-Phe-Met)和羧基端的干擾素部分,通過(guò)中間連接肽三肽(Ser-Gly-Ser)進(jìn)行連接,總分子量為21kD。其中腦啡肽能將具有抗腫瘤功能的干擾素專一地導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞,這樣防止了干擾素?fù)p害正常細(xì)胞,故大大減輕了原有干擾素制劑的副作用,與單一干擾素相比具有更高的腫瘤細(xì)胞抑制率。
文檔編號(hào)C12N15/19GK1076729SQ93100338
公開(kāi)日1993年9月29日 申請(qǐng)日期1993年1月18日 優(yōu)先權(quán)日1993年1月18日
發(fā)明者黎孟楓, 張沁, 曾慶, 侯云德, 張智清, 李玉英 申請(qǐng)人:中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所