專利名稱：提高了l-抗壞血酸的生物量及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有細(xì)胞內(nèi)高抗壞血酸水平的微藻生物量，其制備方法及其作為動物飼料的用途。尤其是，本發(fā)明涉及用抗壞血酸生物量強(qiáng)化的動物飼料組合物及其制備方法和其作為魚飼料的用途。
L-抗壞血酸，或維生素C，是一種廣泛分布于植物和動物界中的水溶性維生素。它在營養(yǎng)、良好健康的維持、和食品工業(yè)中是極為重要的。幾乎所有種類的動物都合成L-抗壞血酸而且在他們的食物中不需要它。然而，人類、其它靈長目、豚鼠、食果蝙蝠、某些鳥和魚如Coho大麻哈魚、彩虹真鱒魚(rainbow trout)、鯉魚，因他們?nèi)狈σ环N肝酶而不能合成此維生素。如果剝奪飲食來源的L-抗壞血酸，這些動物逐步出現(xiàn)壞血病。要克服不利于良好健康和正常生長(特別是在養(yǎng)魚業(yè)上)的少量的或大量的不足，必須使此類動物得到充分供應(yīng)的維生素C。
用于從植物、動物組織和食物分離維生素C的方法是公知的，它包括提取，提取物的純化和溶液中維生素的分析或分離。某些從其中已分離出抗壞血酸的自然資源包括紅辣椒、唐菖蒲葉、薔薇果、柿和柑橘。該維生素也可用L-木糖、L-半乳糖或更優(yōu)選地是從低價、易得的D-葡萄開始來合成。
另一種能用來產(chǎn)生L-抗壞血酸的方法是使用微生物。而已知野生型微生物僅產(chǎn)生少量的L-抗壞血酸，最近公開的US5，001，059證實，使用小球藻屬藻可使產(chǎn)量提高。
在L-Ascorbic AcidMetabolism，Biosynthesis，F(xiàn)unction，The Biochemistry of Plants，Vol.3，Academic Press，Inc.，PP，77-99，1980中，Locwus，F(xiàn).A.提出一種L-抗壞血酸的來源和生物合成的觀點。有關(guān)藻類產(chǎn)生抗壞血酸的描述可在下列文獻(xiàn)中找到Vaidya等，Science and Culture(1971)37383-384;Subbulakshmi等，Nutrition Reports International(1976)14581-591;Aaronson等，Arch.Microbiol.(1977)11257-59;Shigeoka等，J.Nutr.Sci.Vitaminal(1979)2929-307;Shigeok等，Agric.Biol.chem.(1979)432053-2058;Bayaniva和Trubachev，Brikladnaya BiokhimiyaMikrobioligyia(1981)17400-407(UDC 588.26577.16);和Ciferri，Microbiolgical Reviews(1983)47551-578。
微藻用于食物的生產(chǎn)是已知的。包括小球藻類的各種藻含有維生素(包括維生素C)也是已知的。例如，Aaronson等，Arch Microbiol.112，57-59(1977)公開了光生長的小球藻每mg重的干細(xì)胞含有高達(dá)15μg的維生素C，即占重量的1.5%。
Renstrom，Plant Sci.Letters，28299-305(1982/1983)說明了小球藻中L-抗壞血酸含量被報告是6-82μmol/g光生長細(xì)胞干重，即占重量的0.11到1.44%;Chlorella Pyrenoidosa Chick，培養(yǎng)(UTEX)號343，在添加葡萄糖的培養(yǎng)基上暗生長0.5到6天，也產(chǎn)生每g干重約3μmol的L-抗壞血酸(0.06wt%)并且在供給光線12小時時產(chǎn)量為該量的4倍(0.24wt%)，結(jié)果類似于那些早期研究所報告的。
現(xiàn)有技術(shù)的異養(yǎng)方法和微生物用于商業(yè)是不完全令人滿意的所產(chǎn)生的生物量在L-抗壞血酸方面過于不足，這是由于所使用的微生物不太有效，在所用方法的條件下碳源的利用很少。
在富含L-抗壞血酸的生物量的生產(chǎn)中，需要改進(jìn)產(chǎn)生L-抗壞血酸的微生物和改進(jìn)利用他們的方法。
一種富含L-抗壞血酸的生物量包含具有細(xì)胞內(nèi)L-抗壞血酸(L-AA)含量高于干細(xì)胞重1.5%的綠色微藻細(xì)胞，優(yōu)選至少約2%及更優(yōu)選至少約3%。
其它實施方案包括下面鑒定的新的產(chǎn)生高L-AA的被誘變處理的Chlorella pyrenoidosa微藻;微藻的產(chǎn)生高L-AA含量生物量的異養(yǎng)方法;含有富含L-AA生物量的動物飼料組合物及其作為動物飼料的用途，包括能至少供給動物每日所需維生素C的主要部分的水產(chǎn)養(yǎng)殖魚飼料。
倘若它們異養(yǎng)性地產(chǎn)生L-AA，則微生物可廣泛地變化，優(yōu)選的是產(chǎn)生L-AA的綠色微藻，特別是其所謂的高產(chǎn)者。表現(xiàn)出有作為潛在高產(chǎn)者希望的生物能夠，伴隨L-AA產(chǎn)生的用于細(xì)胞生長的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵過程來鑒定。優(yōu)選使用物理或化學(xué)誘變方法來誘變他們，如紫外(U.V)光，X-光，N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍、硫酸二甲酯或本領(lǐng)域公知的類似試劑。由此處理產(chǎn)生的誘變L-AA超量產(chǎn)生者能用氧化還原染料來確定。而且，可通過使用抗壞血酸代謝中間體的類似物或抗壞血酸合成的抑制劑，來選擇能夠在化學(xué)物干優(yōu)物存在下保持或增加L-AA產(chǎn)生的微生物。
上述過程優(yōu)選的子代是那些-提供改進(jìn)的L-AA特異形成的微生物(用每克細(xì)胞(干重)中的L-AA毫克數(shù)測量)。然后將這些子代進(jìn)一步分成單個克隆并且進(jìn)一步進(jìn)行上述過程最終獲得提供更高L-AA特異形成的生物體。
優(yōu)選的是小球藻屬的綠色微藻，尤其是Pyrenoidosa種，包括例如源于野生株如C.PyrenoidosaUTDX1663和C.Pyrenoidosa UTEX1230、C.regularis UTEX1808、C.Sorokiniana a.t.c.c.22521、Aukistrodesmus braunii A.T.C.C.12744和Profotheca zopfii UTEX 1438的L-AA高產(chǎn)突變株，UTEX是在奧斯丁的得克薩斯洲大學(xué)的藻類培養(yǎng)物收集處。一種這樣的源于UTEX1663的突變株是具有A.T.C.C.登記號53170的C.PyrenoidosaUV101-158。
其它有代表性的和優(yōu)選的L-AA高產(chǎn)者及其親代，他們本身的高產(chǎn)者和此處適用者，按誘變適用的方法列表顯示如下DAP388-19源于DAP300-4，DAP300-4依次源于UV489-5，SUV359-2，SUV296-5，SUV213-4，UV212-11，SUV9-1，UV182-2576，NA5-3，UV137-253，UV101-158，UV29-132，UV18-374，UV12-15，UV3-482和Chlorella Ppyrenoidosa Utex 1663。
UV711-1和EMS156-1源于C115-1，C115-1依次源于DAP300-5，UV489-5，SUV359-2，SUV265-5，SUV97-1，UV213-4，UV212-11，SUV9-1，UV182-2576，NA-3，UV137-253，UV101-158，UV29-132，UV18-374，UV12-15，UV3-482和Chlorella PpyrenoidosaUtex1663。
C166-4源于SUV551-3，SUV551-3依次源于DAP389-23，DAP300-5，UV489-5，SUV359-2，SUV296-5，SUV97-1，UV213-4，UV212-11，SUV9-1，UV182-2576，NA5-3，UV137-253，UV101-158，UV29-132，UV18-374，UV12-15，UV3-482和Chlorella Ppyrenoidosa Utex1663。
NA678-1，UV869-3和C284-130源于C166-4。
NA722-22源于C123-4，C123-4依次源于UV609-4，NA528-2，DAP300-6，UV489-5，SUV359-2，SUV296-5，SUV97-1，UV213-4，UV212-11，SUV9-1，UV182-2576，NA5-3，UV137-253，UV101-158，UV29-132，UV18-374，UV12-15，UV3-482和Chlorella Ppyrenoidosa Utex1663。
C325-2源于C123-2，C123-2依次源于UV609-4，NA528-2，DAP300-6，UV489-5，SUV359-2，SUV296-5，SUV97-1，UV213-4，UV212-11，SUV9-1，UV182-2576，NA5-3，UV137-253，UV101-158，UV29-132，UV18-374，UV12-15，UV3-482和Chlorella Ppyrenoidosa Utex1663。
UV872-26源于NA678-1。
DAPN1010-50源于DAP994-1，DAP994-1依次源于C360-70，C284-130，C284-130，C166-4，SUV551-3，DAP389-23，DAP300-5，UV489-5，SUV359-2，SUV296-5，SUV97-1，UV213-4，UV212-11，SUV9-1，UV182-2576，NA5-3，UV137-253，UV101-158，UV29-132，UV18-374，UV12-15，UV3-482和Chlorella Ppyrenoidosa Utex1663。
UV232-1依次源于NA28-4，NA19-3，UV165-239，UV137-253，UV101-158，UV29-132，UV18-374，UV12-15，UV3-482和Chlorella Ppyrenoidosa Utex1663。
變異株名稱的詞頭是下列用于產(chǎn)生他們的誘變處理的縮寫C＝樟腦;DAP＝2，6-二氨基嘌呤;EMS＝甲磺酸乙酯;NA＝一氧化二氮;DAPN＝DAP和NA連接;SUV＝短波長的紫外光;UV＝寬波長紫外光。
在每種情況下，誘變的子代與其親代比較是較高的L-AA產(chǎn)生者。而且，每個生物體在按下列所描述的本發(fā)明方法情況下比在常規(guī)情況下產(chǎn)生更高的L-AA的特異形成。
依賴于所使用的特定的微藻，該方法可以是一種常規(guī)異養(yǎng)發(fā)酵，其中該生物體在一種促生長培養(yǎng)基中，在有效溫度、壓力和PH下，在未限定的生長條件下生長，其中該培養(yǎng)基含有一種如葡萄糖的適當(dāng)碳源和溶于其中的分子氧(O2)，該碳源和分子氧的量對產(chǎn)生伴隨細(xì)胞內(nèi)L-AA產(chǎn)生的高細(xì)胞密度的細(xì)胞是足夠的，并且保持生長直到該細(xì)胞含有適當(dāng)高的重量成分?jǐn)?shù)的細(xì)胞內(nèi)L-AA。
優(yōu)選地，該方法包括按以上在未限定生長條件下使細(xì)胞異養(yǎng)生長到高細(xì)胞密度，其密度實質(zhì)上可以是或可以不是最大的，允許碳源變得基本上耗盡并且細(xì)胞生長基本上停止，然后以限定量恢復(fù)碳源的供應(yīng)以便使L-AA的產(chǎn)生繼續(xù)并導(dǎo)致L-AA產(chǎn)量的提高而在細(xì)胞密度上基本上沒有增加，并在溶解O2的壓力中限定量碳源下而繼續(xù)限定生長階段直到每單位重量的細(xì)胞生物量的L-AA濃度達(dá)到本發(fā)明目的的理想水平。
另一優(yōu)選的方法包括按以上在未限定生長條件下使細(xì)胞異養(yǎng)生長，即，在足夠碳源和溶解O2的存在下，在有效的溫度、壓力和PH下獲得含有細(xì)胞內(nèi)L-AA的高密度的細(xì)胞，然后降低溶解O2含量或允許它由正常細(xì)胞代謝降低到低濃度以便細(xì)胞生長基本停止而L-AA繼續(xù)產(chǎn)生而在細(xì)胞密度上基本沒有增加，并維持低O2的條件直到在生物量中獲得理想細(xì)胞內(nèi)L-AA濃度。
將會注意到，以上方法的實施方案都提供了為產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)L-AA的提高的碳源利用。
在實施所述方法時，在無菌含水營養(yǎng)培養(yǎng)基中用所選擇的微生物的活性生長培養(yǎng)物來無菌接種，其微生物的量足以導(dǎo)致在適當(dāng)生長期(在正常生長指數(shù)期間)后產(chǎn)生比較高的細(xì)胞密度。典型起始細(xì)胞密度范圍通常是每升細(xì)胞干重約0.5到0.4g。在方法的起始或進(jìn)程中按照需要可加入少量消泡劑。
培養(yǎng)基包含碳源，各種鹽且通常也包含痕量金屬。
出于經(jīng)濟(jì)的原因，優(yōu)選的碳源是葡萄糖源，包括葡萄糖，但可以是任何能原位轉(zhuǎn)變成葡萄糖的糖類或多糖類，如，糖漿、玉米糖漿等。所使用葡萄糖源的總量能信賴于特定的生物體和所期望的結(jié)果廣泛地變化。正常情況下，用如以上所描述的L-AA高產(chǎn)生物體，如不被代謝，使用的葡萄糖的總量應(yīng)當(dāng)提供約65到90，更常見的是約75到85，優(yōu)選地為約80g/L的濃度。通常，開始約加入總葡萄糖量的15到30%，將葡萄糖一般在起始時和在發(fā)酵過程中連同下列所限定的添加物一同加入。在起始葡萄糖源加入和發(fā)酵期間，它是未限定細(xì)胞生長期，其中細(xì)胞生長到較高密度，如，約20到45g/L，更常見的是約30到40g/L，相應(yīng)地為高細(xì)胞內(nèi)L-AA含量的微藻在本發(fā)明方法的控制碳或控制氧的限定細(xì)胞生長步驟期間的高的總L-AA濃度提供了基礎(chǔ)。
在發(fā)酵罐中葡萄糖源的量應(yīng)當(dāng)是一種非阻遏/非限制的量，那就是，它應(yīng)當(dāng)最令人滿意地促進(jìn)而不是抑制或過度地限制細(xì)胞生長。葡萄糖源的非阻遏最佳濃度可因生物體的不同而變化，并通過對任何特定生物體的試驗來容易地確定。例如，對C.Pyrenoidosa藻株，葡萄糖源濃度通常通過及時地加入來維持15-30g/L范圍，可見它足以促進(jìn)細(xì)胞生長而同時避免葡萄糖對生長的抑制作用。在整個過程中碳源對生物體的可利用性可用已知的方法監(jiān)測。例如葡萄糖能在上層清液中用葡萄糖氧化酶酶試驗或色譜法(HPLC)來測定。當(dāng)碳源濃度下降，它能被按需補(bǔ)充，但要保證總濃度保持低于生長阻遏水平，按葡萄糖當(dāng)量計算法(glucose-equivalent basis)，該濃度通常低于約30g/L。
理想情況下，起初，其它添加物連同葡萄糖源一起存在，這些添加劑有常見的磷、氮、鎂、鐵和痕量金屬源，它們是本技術(shù)領(lǐng)域公知的，而且他們在營養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度也通過同樣的添加物連同續(xù)加的葡萄糖源的隨后加入來連續(xù)地或周期性地增加或補(bǔ)充。這些添加物的濃度與葡萄糖源的濃度之比在發(fā)酵過程中可以是相同的或不同的。
在美國專利第5，001，059中更充分地描述了一種典型的營養(yǎng)培養(yǎng)基，它的組合物和使用，在此一并作為參考。
優(yōu)選的O2源是空氣，但可以是未稀釋的或用任意惰性的和不與發(fā)酵成分反應(yīng)的氣體稀釋的分子O2。將O2源便利地噴入發(fā)酵團(tuán)中，優(yōu)選的將其攪動而使氣體分布于培養(yǎng)基中而且促進(jìn)其中O2的溶解。O2在培養(yǎng)基中的溶解性(直到飽和濃度(100%溶解的O2))主要是O2源流速、攪動速度、培養(yǎng)基組成、溫度和壓力的函數(shù)。對于給定的培養(yǎng)基在給定溫度和壓力下溶解O2對生物的可利用性易于通過攪動速度和O2氣流速來控制。
攪動速度通常為約200到1000rpm，而充氣氣流速度范圍一般在每分鐘約0.1到0.6升(1pm)，取決于在方法的任何特定階段內(nèi)所期望的溶解O2的量。在未限定細(xì)胞生長階段內(nèi)，溶解O2濃度一般約為飽和值的20%。優(yōu)選為50%或更高。
在限定O2的方法的限定O2階段內(nèi)，以一個速度供給O2源以便濃度遠(yuǎn)低于飽和值的20%且最好保持剛好超過0%值以上，令人滿意的是1%左右。不管什么絕對值，低O2濃度應(yīng)當(dāng)在所描述的最適PH時足以低到在碳源存在不導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)L-AA含量的增加而基本上沒有導(dǎo)致細(xì)胞生長。溶解O2濃度用氧探測電極來方便地檢測。
溫度和壓力應(yīng)當(dāng)是便于促進(jìn)細(xì)胞生長和L-AA產(chǎn)生而不殺死細(xì)胞。正常情況下，溫度為20到40℃，優(yōu)選約35℃。壓力一般為大氣壓但可以是超過大氣壓的，壓力越大空氣(O2)在培養(yǎng)基中的溶解度越大。
PH能夠依賴于生物生長、產(chǎn)生和保留細(xì)胞內(nèi)L-AA(即阻止分泌進(jìn)入含水培養(yǎng)基中)的能力而廣泛變化。一般地，對于Chlordlla Pyrenoidosa及其各種株，PH范圍一般在約6.5到8，更常規(guī)地是在約6.9到7.5，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)如此比較高的PH阻止L-AA由細(xì)胞通過培養(yǎng)基，即，細(xì)胞保留比他們分泌進(jìn)入培養(yǎng)基更多的L-AA。
PH能夠按需通過加入氨氣增加PH來控制。NH3也作為營養(yǎng)氮源供應(yīng)。也可按需通過加入一種生理上相容的酸如磷酸、乙酸、乳酸、酒石酸或類似較低PH的酸來控制。另一種情況是，如果需要，由于它們固有地產(chǎn)生酸副產(chǎn)物，微生物能被允許降低代謝PH。
在本方法的高氧未限定生長階段中(其中按上述所討論的，該P(yáng)H比較高)細(xì)胞內(nèi)L-AA能夠增加到細(xì)胞干重的1到4%。細(xì)胞內(nèi)L-AA含是更進(jìn)一步增加到至少1.5%優(yōu)選至少約2%并且通過在以上描述的方法的低碳和低氧限定生長階段仍然維持高PH，細(xì)胞內(nèi)L-AA含量能再增加至少1.5%，優(yōu)選的是至少約2%，直到高達(dá)5-6%。細(xì)胞內(nèi)含量越高，生物量用作動物飼料就越好。
下列實施例用來說明本發(fā)明，而不構(gòu)成對附加權(quán)利要求范圍的限制。
實施例1培養(yǎng)基制備將0.27g一堿價磷酸鉀和0.23g二堿價磷酸鈉在600ml蒸餾水中的溶液在一個一升玻璃發(fā)酵罐中加熱滅菌，該發(fā)酵罐中裝配有攪動培養(yǎng)基和供應(yīng)營養(yǎng)成分、氧源和其它以下所述試劑的裝置。培養(yǎng)基冷卻后，經(jīng)0.2微米無菌濾器加入5ml的1.92g/L硫酸亞鐵溶液(PH2.5)。
葡萄糖-鹽的濃縮分別將下列含水營養(yǎng)成分滅菌，冷卻后合并為最終104ml的體積80ml含56g葡萄糖的溶液;11ml含0.70g檸檬酸三鈉、0.46g硫酸鎂和0.70ml96%H2SO4的溶液;10ml含1.53g一堿價磷酸鉀和1.53g二堿價磷酸鈉的溶液;以及9.4ml痕量金屬溶液，該組合物在在此一并作為參考的美國專利5，001，059中被描述。
營養(yǎng)培養(yǎng)基然后將20ml的葡萄糖一鹽濃縮液加到磷酸鹽培養(yǎng)基中。
細(xì)胞生長和L-AA產(chǎn)生將營養(yǎng)培養(yǎng)基加熱到并維持在35℃，以450rpm轉(zhuǎn)速開始攪動，以每分鐘0.1升(1pm)的速度將空氣噴入培養(yǎng)基中，用加到空氣流中的無水NH3調(diào)節(jié)PH到6.9，將Chlorella PyrenoidosaDAPN1010-50株的活性生長培養(yǎng)物接種到培養(yǎng)基中得到約0.3的起始細(xì)胞密度，即0.2g/L。
在起初的10小時中，在培養(yǎng)基中溶解O2含量有幾乎注意不到的下降并且細(xì)胞密度略有增加。在20小時時，細(xì)胞生長(g/L細(xì)胞密度)加快并且溶解O2下降到約70%。30小時后，細(xì)胞密度已增加到約5g/L并且O2含量已經(jīng)劇減到略低于20%。反映出生長細(xì)胞增加的團(tuán)對O2的強(qiáng)烈吸收。此時，將攪動速度增到近800rpm且氣流速度增到0.21pm。這樣導(dǎo)致溶解O2峰劇增到約85%，然后在此后的10小時期間減到約25%，再次反映出高細(xì)胞生長速度，細(xì)胞密度達(dá)到14g/L。
在此后的10小時期間，攪動和氣流分別保持775rpm和0.2lpm，溶解O2降至接近百分之0，細(xì)胞密度增加的速度達(dá)到最大，細(xì)胞密度為28g/L，且基本上所有的細(xì)胞內(nèi)L-AA的含量增到0.8g/L。在整個50小時生長期間，通過按需加入美國專利5，001，059中描述的葡萄糖一鹽濃縮物來使葡萄糖濃度維持過量20-30g/L。至于PH，在24小時中，它已由6.9降到6.8，在此期間，PH已用加到空氣流中的NH3維持在該水平。
簡而言之，試驗結(jié)束時，細(xì)胞內(nèi)L-AA含量(生物量)為細(xì)胞干重為2.9%(0.8/28×100)。
實施例2-12基本上按實施例1所描述的一系列試驗，而在每一試驗中用不同的微藻來重復(fù)實施例1過程。微藻及所獲得的結(jié)果列表顯示如下，所有L-AA高產(chǎn)Chlorella Pyrenoidosa突變體描述在表1中。
前4個實施例(2-5)達(dá)到20g/L左右的細(xì)胞密度，后7個實施例為40g/L左右的細(xì)胞密度。在該試驗所選擇的細(xì)胞密度時，所產(chǎn)生生物量的細(xì)胞內(nèi)L-AA含量在表1中給出。
表1實施例2-12;提高L-AA的生物量實施例號 藻株 L-AA C、D L-AAmg/l g/l% 生物量2 DAP388-19(a) 355 19 1.93 DAP388-19(b) 371 19 1.94 EMS156-1 370 18 2.05 211-1 446 18 2.06 C166-4(c) 834 34 2.47 NA678-(d) 999 38 2.68 NA722-22(d) 852 36 2.49 C225-2 1150 37 3.110 UV869-3 593 36 1.611 UV872-26(c) 769 38 2.012 C284-136 792 36 2.2(a)4次試驗的平均值(b)在14升的發(fā)酵罐中實施，其它都在1升的罐中(c)2次試驗的平均值(d)3次試驗的平均值實施例130.6L蒸餾水、0.23g二堿價磷酸鈉和0.27g一堿價磷酸鉀在1升發(fā)酵罐中滅菌。然后將11.2mg在5ml蒸餾水中的硫酸亞鐵(heptahydrate)和20ml無菌的按下列制備的被單獨滅菌并冷卻后合并的營養(yǎng)組的葡萄糖一鹽濃縮物無菌地加到磷酸鹽溶液中組1由56g葡萄糖，食品級單水合物(無水基準(zhǔn))在80ml水中組成;組2由0.7g檸檬酸三鈉二水合物、0.47g無水硫酸鎂和1ml硫酸在10ml水中組成;組3由0.65g一堿價磷酸鈉、1.3g一堿價磷酸鉀和0.6g二堿價磷酸鈉在10ml水中組成;組4由9.4ml美國專利5，001，059的痕量金屬溶液組成。
將溫度升高到35℃并以約200rpm的轉(zhuǎn)速開始攪動。以每分鐘0.2升的速度(Lpm)使空氣通過培養(yǎng)基并以約0.3g細(xì)胞/L的濃度加入50ml的Chlorella Pyrenoidosa菌株UV 101-158(A.T.C.C.登記號52170)。5小時后，攪拌速度增加到550rpm，空氣流增加到0.6lpm。按表3所標(biāo)注的，此后將攪拌速度增到700然后800rpm，而在試驗的剩余階段將空氣流速保持在0.6lpm。
下列圖表描述發(fā)酵的條件和分析的結(jié)果。
表2抗環(huán)血酸在時間 細(xì)胞密度 抗壞血酸PH 注釋 生物量中的含(小時) g/L mg/L**量(%)(千重)0 6.9 - 400rpm;
5 6.6 0.7 空氣0.4 未檢測1pm550rpm;
16 6.9 3.8 空氣0.6 未檢測1pm700rpm;
21 7.0 9.5 加20ml*未檢測800rpm;
24 6.9 14.2 加ml*未檢測葡萄糖耗盡 未檢測
40 7.1 38.6 538 加4ml+ 1.445 7.2 38.6 654 1.748 加4ml+51 7.6 38.1 775 加2ml+ 2.065 7.7 37.8 966 2.668 7.8 1050 加4ml+92 7.6 37.2 1292 3.5101 7.3 36.1 1459 4.0＊葡萄糖/鹽濃縮物+20%葡萄糖。在發(fā)酵過程中按所顯示的，定期重復(fù)加入。
＊＊細(xì)胞內(nèi)。
實施例14(最佳方式)除下列變化以外，仿效實施例13的過程(a)在起始0.6L蒸餾水裝料中用5.6mg硫酸亞鐵取代11.2mg硫酸亞鐵;(b)營養(yǎng)液的組成28g葡萄糖在40ml蒸餾水中;0.53g檸檬酸三鈉二水合物和0.2g硫酸鎂在20ml蒸餾水中;20ml各0.65g的磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉;和15ml的4.7ml痕量金屬溶液加1ml硫酸;以及(c)C.Pyrenoidosa的活性生長培養(yǎng)物是藻株UV232-1。
將溫度升高到35℃，以350rpm的轉(zhuǎn)速開始攪拌，以0.2升/分鐘(lpm)的速度使空氣通過培養(yǎng)基，用加到空氣流中的無水氨(NH3)將PH調(diào)節(jié)6.9，并且將藻株UV232-1加到培養(yǎng)基中。NH3作為營養(yǎng)氮源和PH控制劑始終供應(yīng)。6.2小時后，空氣流速增加到0.4lpm，攪拌速度增到400rpm。11.8小時時，空氣流速提高到0.6lpm，并在試驗的剩余階段保持此流速。并使攪拌速度提高到650rpm。12.4小時后，將40多毫升含有葡萄糖的營養(yǎng)液加到發(fā)酵罐中，24.4小時時再加20多ml并在26.3小時時再加15ml多。同時，在22.8小時時將攪拌速度提高到750rpm，然后在34.8小時時調(diào)到800rpm并在試驗的剩余階段保持該速度。
在31.7小時時培養(yǎng)基的葡萄糖含量變得耗盡，此時細(xì)胞密度(C、D)為19.5并且L-AA濃度為322mg/l。在41.7小時和從41.7到94.8小時中每3小時供給發(fā)酵罐葡萄糖，2ml的10%溶液。細(xì)胞密度和L-AA濃度隨時間的變化如連同計算出的生物量的L-AA含量在內(nèi)的下表所示表3時間 C、D L-AA L-AAPH 生物量注釋(小時) g/l mg/l 重量%0 6.9 -6.2 6.912.4小時11.8 6.9 40ml葡萄糖24.4小時22.8 20ml26.3小時15ml31.7 6.9 葡萄糖耗盡34.8 7.0 19.5 322 1.7
46.9 7.7 18.7 439 2.353.6 7.8 52858.6 7.8 17.9 613 3.470.8 7.9 69477.7 7.9 17.3 819 4.782.8 7.8 91594.8 7.6 17.6 945 5.4＊.在46.7小時和其后直到94.8小時的每3小時加的2ml10%葡萄糖。
基本上按描述的，重復(fù)4次以上的以上過程。一個試驗包括Maltrin的加入，在47.3和71.2小時時加入作為葡萄糖等當(dāng)量碳源的Maltrin，一種麥芽糖糊精(5g/20ml蒸餾水)。在5次試驗中，%L-AA平均為生物量干重的5.2%。
用于測定L-抗壞血酸的方法由Grun和loewus，在Analytical Biochemistry(1983)130191-198中描述。該方法是離子交換過程，使用一種7.8×300mm有機(jī)酸分析柱，HPx-87(Bio-Rad Laboratories，Richmind，CA)。條件是流動相，0.013M硝酸，流速0.8ml/min，壓力1500磅/平方英寸，檢測UV245-254nm。在以上條件下，L-抗壞血酸和異抗壞血酸分開是可能的。按以上實施例的揭示，在所描述的方法條件下所有的抗壞血酸是細(xì)胞內(nèi)的。
用如下方法測定細(xì)胞密度(每升細(xì)胞干重(g))將生物量樣品(5ml)轉(zhuǎn)移到一個稱量盤中并將5ml的離心上清液轉(zhuǎn)移到第二個稱量盤中。該盤在對流爐中干燥(105℃，3小時)。在干燥器中冷卻后，稱量該盤含量。確定每升的細(xì)胞克數(shù)(樣品重-上清液重)×200。
然而，該生物量可通過注意到了減少L-抗壞血酸成分的空氣氧化或熱降解的本領(lǐng)域公知的任何方法來干燥。
以上實施例表明本發(fā)明方法和新的L-AA高產(chǎn)微藻提供提高了其維生素C含量的生物量。維生素含量范圍由大于1.5到高達(dá)5wt%或更大，遠(yuǎn)超過現(xiàn)有技術(shù)的結(jié)果。因此，由于考慮到他們的其它公知營養(yǎng)性價值，他們單獨用作富含維生素C的動物飼料組合物或用于與其它合適飼料組合物混合是令人滿意的。這種飼料組合物的混合物每噸一般可含有從約60到2，000克的L-抗壞血酸(視被飼養(yǎng)動物而定)，更常見地約為320g/噸。
基于所描述和列舉的本發(fā)明一定程度的特殊性，應(yīng)當(dāng)意識到，下列權(quán)利要求將不應(yīng)是太受限制的而將是與權(quán)利要求及其等同物各個要素所表達(dá)的范圍相適應(yīng)的。
權(quán)利要求
1.一種生物量，包含具有細(xì)胞內(nèi)L-抗壞血酸含量大于細(xì)胞干重1.5%的綠色微藻細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的生物量，其中抗壞血酸含量至少約為細(xì)胞干重的2%。
3.權(quán)利要求1的生物量，其中抗壞血酸含量至少約為細(xì)胞重的3%。
4.權(quán)利要求1的生物量，其中微藻是小球藻屬。
5.權(quán)利要求4的生物量，其中微藻是Pyrenoidosa種。
6.權(quán)利要求5的生物量，其中微藻是一種具有A.T.C.C登記號53170的所說C.Pyrenoidosa的突變株。
7.權(quán)利要求5的生物量，其中微藻是至少一種被指定為UV187-1319，UV232-1，DAP388-19，UV711-1，EMS156-1，C166-4，NA678-1，NA722-22，C225-2，UV869-3，UV872-26，或C284-130的突變Chlorella Pyrenoidosa株。
8.權(quán)利要求7的生物量其中微藻至少是C166-4，NA678-1，NA722-22，C225-2，UV872-26，C284-130和UV232-1中的一種。
9.權(quán)利要求8的生物量，其中微藻是UV232-1。
10.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1的生物量組合物的方法，包括選擇一種能夠在氧存在下在適當(dāng)?shù)奶荚瓷袭愷B(yǎng)生長并且能潛在地產(chǎn)生至少微藻干重的1.5%(重量比)的細(xì)胞內(nèi)L-抗壞血酸的微藻，在促生長含水營養(yǎng)培養(yǎng)基中，在有效的溫度和壓力以及PH下，異養(yǎng)生長微藻細(xì)胞，在此條件下產(chǎn)生的抗壞血主要是細(xì)胞內(nèi)的，所說培養(yǎng)基含有一種合適的碳源和一種溶解分子氧源，其量足以使細(xì)胞生長并產(chǎn)生抗壞血酸，維持所說細(xì)胞生長直到細(xì)胞內(nèi)L-抗壞血酸含量相當(dāng)于至少細(xì)胞干重的1.5%(重量比)的細(xì)胞團(tuán)塊被產(chǎn)生，并由培養(yǎng)基的含水上清液中分離出細(xì)胞團(tuán)。
11.權(quán)利要求10的方法，其中繼續(xù)生長細(xì)胞直到細(xì)胞內(nèi)抗壞血酸含量至少為細(xì)胞重的2%。
12.權(quán)利要求10的方法，其中細(xì)胞生物量在基本上沒有降低抗壞血酸的含量下被干燥。
13.權(quán)利要求10的方法，其中微藻的選擇包括(a)用異養(yǎng)生長試驗鑒別產(chǎn)生L-抗壞血酸微藻潛在的高產(chǎn)株;(b)誘變至少一種這樣的潛在高產(chǎn)親代株;(c)鑒別并分離至少一種比親代產(chǎn)較高抗壞血酸的所說潛在高產(chǎn)親代的突變株;(d)如需要，以至少一種步驟C的突變株重復(fù)步驟(b)直到獲得一種能夠產(chǎn)生至少微藻細(xì)胞干重1.5%的細(xì)胞內(nèi)L-抗壞血酸的所說微藻的突變株。
14.權(quán)利要求10的方法，其中細(xì)胞生長繼續(xù)到高細(xì)胞密度，允許碳源變得耗盡，將耗盡碳源狀況保持到細(xì)胞生長基本停止并保持到恢復(fù)以控制量地供給碳源，使得細(xì)胞內(nèi)接著產(chǎn)生L-抗壞血酸而細(xì)胞密度很少或基本上沒有增加，從而按細(xì)胞干重計算的細(xì)胞內(nèi)L-抗壞血酸含量更進(jìn)一步增加。
15.權(quán)利要求10的方法，其中溫度范圍在生長持續(xù)期為約20到約40℃的范圍，壓力為足以保持促進(jìn)生長量的溶在培養(yǎng)基中的分子氧的大氣壓或超大氣壓，PH為維持生長并足以高到在細(xì)胞內(nèi)保持細(xì)胞內(nèi)L-抗壞血酸高水平的PH。
16.權(quán)利要求15的方法，其中溫度為30到40℃，壓力至少為大氣壓并且PH約為6.5到8。
17.權(quán)利要求16的方法，其中溫度為35-38℃，PH至少約為6.9。
18.權(quán)利要求10的方法，其中在產(chǎn)生的抗壞血酸主要是細(xì)胞內(nèi)的PH下在濃度足以提供高密度生長的所說碳源和分子O2存在下將細(xì)胞生長持續(xù)到高細(xì)胞密度，降低O2的濃度或使其降低到細(xì)胞生長減慢并基本停止且細(xì)胞內(nèi)L-抗壞血酸的產(chǎn)生繼續(xù)和增加而細(xì)胞密度很少或沒有增加的濃度，由此，細(xì)胞內(nèi)L-抗壞血酸占細(xì)胞干重的比例進(jìn)一步增加。
19.一種動物飼料組合物，該組合物含有權(quán)利要求1的組合物。
20.權(quán)利要求19的動物飼料組合物，與添加量的第二種動物飼料組合物混合，提供一個生理上可接受量的L-抗壞血酸。
21.權(quán)利要求20的組合物，其中每噸飼料混合物有60到2，000克的L-抗壞血酸。
22.權(quán)利要求19的組合物，其中的動物飼料組合物是一種水產(chǎn)養(yǎng)殖魚飼料。
23.一種給需要維生素C的動物提供L-抗壞血酸的方法，包括在所說動物飲食中提供足夠的權(quán)利要求1的生物量或權(quán)利要求19的動物飼料組合物，以至少供給所說動物每日所需維生素C的大部分。
24.權(quán)利要求23的方法，其中需要維生素C的動物是魚。
全文摘要
通過生長一種誘變的產(chǎn)生L-抗壞血酸的微藻來生產(chǎn)含有細(xì)胞內(nèi)高抗壞血酸水平的微藻生物量(大于細(xì)胞干重的1.5％)。此生物量可用作動物飼料和作為水產(chǎn)養(yǎng)殖魚飼料或相應(yīng)的添加劑。
文檔編號C12N1/12GK1080955SQ9310465
公開日1994年1月19日 申請日期1993年3月18日 優(yōu)先權(quán)日1992年3月18日
發(fā)明者詹姆斯·A·東琴科, 羅納德·J·赫斯, 杰弗里·A·朗寧, 托馬斯·J·斯卡特魯?shù)?申請人:生物技術(shù)資源L.P.