專利名稱：：利用紅色諾卡氏菌制造細胞壁骨架粉末的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及微生物制品，特別是關于利用由土壤中分離獲得的培養(yǎng)特征、特性與紅色諾卡氏菌(NacardiaRubra)基本相同的諾卡氏菌株(下稱“紅色諾卡氏菌PO-8”)作為生產(chǎn)菌株(菌種)來制造細胞壁骨架粉末(N-CWS)的方法。紅色諾卡氏菌與BCG(卡介苗)一樣均屬佐劑物質(zhì)，其免疫活性因子存在于細胞壁骨架上，(CeuWallSkeleton)-見《國外醫(yī)學》免疫學分冊1981年第4卷第4期P202頁周正任譯。該菌的菌體經(jīng)破碎、蛋白酶處理、溶媒提取后制得紅色諾卡氏菌細胞壁骨架(NocardiaRubra-CellWallSkeleton簡稱“N-CWS”)含有諾卡氏菌酸--多糖(阿拉拍半乳聚糖)-粘肽(丙氨酸、谷氨酸、Meso-二氨基庚二酸，葡萄糖胺和胞壁酸等)。所制得的凍干N-CWS制劑對動物腫瘤有顯著的抑制作用(見《福建醫(yī)學雜志》1983年第5期P34頁;《Natl、CancerInat》52、P95、1974;《Cann》69、P619、1978)。經(jīng)臨床上試用結果證明其具有抑制腫瘤生長，能防止腫瘤復發(fā)和轉移的功能，具有延長肺癌、胃癌、急性粒白血病及黑色素瘤患者的生存期的效果(見《KumanotoMed》36(1)151983;《CancerRes.》4330011983;《CancerRes.》4355751983)。但是以現(xiàn)有的紅色諾卡氏菌以及相應制備紅色諾卡氏菌的細胞壁骨架粉(原料藥)的工藝進行生產(chǎn)，存在培養(yǎng)基配方不合理，培養(yǎng)的產(chǎn)量低，加上在提取工藝中的提取之前需要冷凍干燥，故而造成工藝復雜、周期長，并且產(chǎn)量低，無法滿足需求。為此，本發(fā)明的目的在于尋求一株性能(特性)優(yōu)良，并且具有與紅色諾卡氏菌相同的特征的菌種，以及設計出高產(chǎn)的培養(yǎng)基和相應的培養(yǎng)、分離、酶處理、提取等工藝。本發(fā)明的技術解決方案包括菌種、培養(yǎng)基、菌體制造、菌體破碎處理、蛋白酶處理、溶媒提取、干燥后處理?，F(xiàn)分別詳述如下本發(fā)明所述的菌種是指從中國云南昆明的土壤中分離獲得的一株諾卡氏菌，是一種經(jīng)形態(tài)觀察、培養(yǎng)、特征、生理生化特征觀察和細胞壁成份的分析、鑒定，證實其特征基本上與紅色諾卡氏菌相同，但對蔗糖利用上優(yōu)于紅色諾卡氏菌，且在馬鈴薯塊生長菌落小而隆起，屬于紅色諾卡氏菌的變異種(以下簡稱“PO-8菌株”，該PO-8菌株已于1993年1月11日送交中國北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏中心登記入冊編號為CGMCCNO0187)。本發(fā)明所設計的培養(yǎng)基包括種子培養(yǎng)基與擴大培養(yǎng)基均為葡萄糖0.5～2.0%、酵母膏0.5～2.0%、PH為5.5～7.5。本發(fā)明所涉及的菌種(PO-8)、菌體培養(yǎng)與制造、菌體破碎處理、蛋白酶處理、溶媒提取、干燥后處理的工藝分別是1、菌種將PO-8菌株接種在瓊脂培養(yǎng)基斜面上，于28～37℃培養(yǎng)5～10天，置4℃保存得。2、菌體培養(yǎng)與制造包括種子培養(yǎng)、擴大培養(yǎng)菌體收集、其中種子培養(yǎng)是將PO-8菌接種于種子培養(yǎng)基(即本發(fā)明所述的培養(yǎng)基)中，于28～37℃，并采用振動培養(yǎng)或200～240r/min的旋轉培養(yǎng)30～50小時得種子培養(yǎng)液。擴大培養(yǎng)(二級培養(yǎng))是將種子培養(yǎng)液以2～10%的接種量移種入擴大培養(yǎng)基(即本發(fā)明所述的培養(yǎng)基)中，于28～37℃，并采用振動培養(yǎng)或200～240r/min的旋轉培養(yǎng)72～120小時得擴大培養(yǎng)液。菌體(細胞體)收集是將擴大培養(yǎng)液靜置沉淀，經(jīng)檢查無菌后收集，以3000r/min的轉速離心棄去上清液，水洗，并重復上述離心、水洗2～4次，將所到的濕細胞體置于低溫(-20℃)保存。3、菌體破碎處理按14～8的量向濕細胞體中加入蒸餾水，使用超聲波破碎機破碎處理至破碎率達80%以上，再經(jīng)2000～3000r/min離心，將得得的上懸液采用10000～20000r/min離心，棄去上清液，沉淀物經(jīng)蒸餾水洗滌后棄上清液即得破碎的細胞壁沉淀物(即細胞壁碎片)。4、蛋白酶處理將破碎后的細胞壁沉淀物分別經(jīng)鹽水、蒸餾水洗滌，再采用10000～20000r/min離心后得干凈的濕細胞壁碎片再進行以下蛋白酶處理以除去蛋白質(zhì)，其中(1)胰、糜蛋白酶處理為按每克濕細胞的量加入含胰蛋白酶為0.1～0.2mg/ml和糜蛋白酶為0.1～0.2mg/ml、PH為7.8的0.07M的無菌的磷酸緩沖液4～8ml，在15～30℃下進行攪拌消化處理24～48小時，經(jīng)離心得到沉淀物后，再重復加入上述含蛋白酶的磷酸緩沖液進行相同的消化處理，隨后再用上述的磷酸緩沖液洗滌、離心。(2)鏈霉蛋白酶處理是按每克濕細胞的量加入含鏈霉蛋白酶為0.1～0.2mg/ml、PH為7.2的無菌的三羥基氨基甲烷鹽酸(即Tris-HCl)緩沖液4～8ml，在15～30℃下進行攪拌消化處理24～48小時，離心、Tris-HCl緩沖液洗滌，再重復上述鏈霉蛋白酶消化處理一次，分別用Tris-HCl緩沖液、鹽水、蒸餾水洗滌、采用10000～20000r/min進行離心。5、溶媒提取對經(jīng)蛋白酶處理過的細胞壁碎片先用無水酒精浸泡，3000r/min離心沉淀，而后進行溶媒提取除去色素與脂類，其提取步驟為第一步用乙醇;第二步用乙醇與乙醚，兩者比例為1∶1(v/v);第三步用吡啶;第四步用氯仿;第五步用苯;溶媒用量為每克濕細胞壁碎片0.5～2ml，每步提取時間為4～8小時。6、真空干燥處理是將經(jīng)溶媒提取處理過的溫細胞壁碎片用甲醇、乙醚洗滌后，經(jīng)真空抽干至無溶媒氣味，研磨得白色的紅色諾卡氏菌細胞壁骨架干粉末(N-CWS)。由于本發(fā)明技術解決方案的實現(xiàn)，獲得了白色的質(zhì)量好的N-CWS并有較高的產(chǎn)量，與現(xiàn)有技術相比至少具有下述優(yōu)點其一、本發(fā)明的培養(yǎng)基配方較現(xiàn)有公知的蘇通“Soutons”培養(yǎng)基優(yōu)越。由本發(fā)明的培養(yǎng)基所產(chǎn)出的菌體量比現(xiàn)有的蘇通培養(yǎng)基產(chǎn)出的菌體量高出1～3倍，而且其細胞的破碎以及N-CWS的劑型制備更為容易。其二、由于在提取工藝中省去了復雜的冷凍干燥工藝，調(diào)整了溶媒提取順序和改變了提取方法，這不但節(jié)省了貴重的儀器及動力，還降低了成本，也使生產(chǎn)工藝縮短了約30%的時間。其三、由本發(fā)明技術解決方案制成的N-CWS經(jīng)免疫學、藥效學和毒理學的研究證實(1)試驗表明適宜量pHA+N-CWS(7.5μg/ml)，與對照組比較，淋巴細胞轉化率提高到40%(P＜0.001)。小鼠腹腔注射N-CWS3mg/kg時，能使胸腺重量增加到42.23±4.79mg(對照組為32.55±8.76mg)(P＜0.05)，白血球總數(shù)有非常顯著的上升(P＜0.001)。小鼠腹腔注射N-CWS200μg/只，試驗后說明有明顯提高腹腔巨噬細胞的抗腫瘤活性(P＜0.05)。(2)通過實驗動物Lewis瘤、黑色素瘤、艾氏腹水瘤和S180的抑瘤或免疫治療試驗表明N-CWS有顯著抑制動物腫瘤生長和延長生存期的效果。(3)N-CWS具有很低的毒性小白鼠皮下注射LD50小于500mg/kg，腹腔注射LD50為373mg/kg。大白鼠皮內(nèi)注射LD50小于14mg/kg。狗皮下注射N-CWS400μg/只，其呼吸、血壓、心率和EBG均在正常范圍內(nèi)。大白鼠長期毒性試驗，皮內(nèi)注射N-CWS400μg/只、286μg/只和200μg/只，給藥6個月，其生長、體重、食欲、心電圖、心率、外周血象、肝、腎功能檢測均無影響。其實質(zhì)性臟器光鏡組織學檢查，未見明顯的病理變化。實施例1按本發(fā)明上述的培養(yǎng)基配方分別取葡萄糖0.5%、酵母膏1%制成總體積為2500ml的培養(yǎng)液(A)，葡萄糖2%、酵母膏0.5%制成總體積為2500ml的培養(yǎng)液(B)，葡萄糖0.5%、酵母膏2%制成總體積為3000ml的培養(yǎng)液(C)，葡萄糖1%、酵母膏1%制成總體積為3000ml的培養(yǎng)液(D)，葡萄糖1.5%、酵母膏0.5%制成總體積為3000ml的培養(yǎng)液(E)，并分別按本發(fā)明上述技術解決方案進行培養(yǎng)、破碎處理、蛋白酶處理、溶媒提取，真空干燥處理，其各步得率量見表1所記載的內(nèi)容。(表1)<tablesid="table1"num="001"><tablealign="center">培養(yǎng)液編號培養(yǎng)液量(ml)濕細胞量N-CWS粉(g)收率g/100mg(濕細胞)g/100mlABCDE2500250030003000300045426860761.801.702.262.002.501.451.801.901.802.203.204.282.793.002.90平均X±S2.052±0.333.234±0.603</table></tables>將按本發(fā)明上述方法制出的N-CWS干粉原料藥按日本藤制藥公司的配方制成安瓿針劑成品，用于臨床試驗，其試驗情況如下實施例2用于胃癌，其654例，其中用藥組(手術+化療+N-CWS)362例，對照組(手術+化療)292例。生存率對照見表2。(表2)三年生存率用藥組較對照組提高16%(P＜0.05)，五年生存率用藥組較對照組都有提高17%，對根治性及非根治性病例，三年生存率用藥組較對照組都有提高，且均有統(tǒng)計學意義。免疫指標中性顆粒細胞吞噬功能的測定，用藥組比對照組吞噬指數(shù)有提高(P＜0.05);用藥組的淋巴細胞轉化由50%提高到61%(P＜0.05)。實施例3用于成骨肉瘤，其中用藥組(N-CWS+轉移因子)為32例，對照組(轉移因子)為11例，結果見表3實施例4用于淋巴瘤，其中用藥組(N-CWS+化療)為30例，對照組(化療)為22例，結果見表4實施例5用于膀胱癌，用藥組(手術+N-CWS)25例，對照組(手術+抗癌藥物)，其結果見表權利要求1.一種利用紅色諾卡氏菌(保藏號CGMCCNo0187)菌種，經(jīng)培養(yǎng)基進行菌體培養(yǎng)與制備、菌體破碎、蛋白酶處理、溶媒提取、真空干燥處理制造具有抗腫瘤活性的紅色諾卡氏菌體細胞壁骨架粉末(N-CWS)的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基包括種子培養(yǎng)基與擴大培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基與擴大培養(yǎng)基均為含葡萄糖為0.5～2.0%、酵母膏0.5～2.0%、PH為5.5～7.5的培養(yǎng)基；所述的菌體培養(yǎng)與制造是在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)30～50小時，再將種子培養(yǎng)液以2～10%的接種量移種入擴大培養(yǎng)基中培養(yǎng)72～120小時，上述培養(yǎng)中采用200～240r/min旋轉培養(yǎng)或采用振動培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28～37℃，隨后擴大培養(yǎng)液經(jīng)靜置沉淀，經(jīng)檢查無菌后、收集、3000r/min的離心，棄去上清液、水洗、離心重復2-4次，得濕細胞體；所述的菌體破碎是按1∶4～8的量向濕細胞體中加入蒸餾水，采用超聲波破碎處理至破碎率達80%以上，經(jīng)2000～3000r/min離心，取上懸液用10000～20000r/min離心，棄去上清液，蒸餾水洗滌后棄上清液即得細胞壁碎片；所述的蛋白酶處理是將細胞壁碎片經(jīng)鹽水、蒸餾水洗滌，離心后再進行胰糜蛋白酶處理和鏈霉蛋白酶處理，其中胰、糜蛋白酶處理為按每克濕細胞的量加入無菌的含胰蛋白酶為0.1～0.2mg/ml、糜蛋白酶為0.1～0.2mg/ml、濃度為0.07M、PH為7.8的磷酸緩沖液4～8ml，并置于15～30℃進行攪拌消化處理24～48小時，再經(jīng)離心后再重復上述胰、糜蛋白酶消化處理一次，離心，用上述的磷酸緩沖液洗滌，離心，鏈霉蛋白酶處理為按每克濕細胞的量加入無菌的含鏈霉蛋白酶為0.1～0.2mg/ml、PH為7.2的三羥基氨基甲烷鹽酸緩沖液4～8ml，在15～30℃下進行攪拌消化處理24～48小時，離心，再經(jīng)上述的三羥基氨基甲烷鹽酸緩沖液洗滌，再重復上述鏈霉蛋白酶消化處理一次，再分別經(jīng)三羥基氨基甲烷鹽酸緩沖液、鹽水、蒸餾水洗滌、離心，上述蛋白酶處理過程中各次離心均采用10000～20000r/min；所述的溶媒提取分別為乙醇提取，乙醇與乙醚為1∶1提取，吡啶提取，氯仿提取，苯提取，其中溶媒用量按每克濕細胞量為0.5～2ml的量加入，每步提取4～8小時。全文摘要本發(fā)明是一種利用紅色諾卡氏菌制造具有抗腫瘤活性的細胞壁骨架粉末的方法。該方法包括有以葡萄糖、酵母膏為培養(yǎng)基進行菌體培養(yǎng)、菌體制備以及細胞破碎、蛋白酶處理、溶媒提取、真空干燥處理工藝。由本發(fā)明方法制出的細胞壁骨架粉末經(jīng)試驗表明毒副作用低、免疫活力強，能抑制移植性腫瘤生長，具有防止腫瘤復發(fā)和阻止腫瘤轉移的功能，能延長胃癌、大腸癌、成骨肉瘤和黑色素瘤患者生命生存期。文檔編號C12N1/20GK1094288SQ93104969公開日1994年11月2日申請日期1993年4月23日優(yōu)先權日1993年4月23日發(fā)明者洪金基,王清波,陳君玉,張祝蘭,陳必興,肖征恭申請人:福建省微生物研究所