專利名稱：蛋白質c衍生物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于人類醫(yī)學領域，特別是血凝固紊亂的治療。最具體地說，本發(fā)明涉及人蛋白質C分子的衍生物、使用這些衍生物的方法以及含有這些蛋白質C衍生物的藥物組合物。
蛋白質C是一種依賴于維生素K的血漿蛋白，該蛋白質主要以無活性的二硫鍵結合雜二聚體形式進行循環(huán)。該雜二聚體由一條約25千道爾頓的輕鏈和一條約41千道爾頓的重鏈組成。重鏈含有絲氨酸蛋白酶區(qū)域及其N末端活化肽，而輕鏈含有γ-羧基谷氨酸殘基區(qū)，該區(qū)域對于依賴于鈣的膜結合和功能活性是必需的。借助于凝血酶/凝血調理素復合物的作用可將無活性的人蛋白質C酶原轉變?yōu)榛罨牡鞍踪|C。所述復合物的作用是切下活化肽(循環(huán)酶原的158至169位殘基或前原酶原的200至211位殘基)形成活化的蛋白質C。
蛋白質C作為治療劑的作用已得到充分的認識(參見例如，Bang等人的美國專利4，775，624公開了編碼人蛋白質C酶原的DNA序列;Bang等人的美國專利4，992，373公開了制備活化人蛋白質C的方法)。一種命名為FLIN的人蛋白質C衍生物由Gerlitz等人在歐洲專利申請91301450.2中公開。該FLIN衍生物在活化肽的167位(前原酶原的206位)含有Phe殘基而不是Asp殘基，在重鏈內的172位(前原酶原的214位)含有Asn殘基而不是Asp殘基。該該FLIN衍生物比野生型人蛋白質C酶原更容易受凝血酶的激活。Gerlitz等人在歐洲專利申請91301446.0中公開了其他人蛋白質C衍生物，命名為Q313和Q329。Q313衍生物在野生型酶原313位上含有一個Gln殘基而不是Asn殘基，而Q329衍生物在野生型酶原329位上含有一個Gln殘基而不是Asn殘基。這些Q313和Q329衍生物缺少一般情況下與野生型分子的這些位點上的Asn殘基相結合的碳水化合物結構，因此這些衍生物的酰氨水解活性和功能活性增強。
本發(fā)明涉及經過修飾的人蛋白質C的衍生物，這些修飾作用是將天然人蛋白質C分子的313位氨基酸從天冬酰胺改變?yōu)楣劝滨０?將天然人蛋白質C分子的第167位氨基酸從天冬氨酸改變?yōu)楸奖彼?將天然人蛋白質C分子的172位氨基酸從天冬氨酸改變?yōu)樘於０?。也可以通過將天然人蛋白質C分子的329位上的野生型天冬酰胺殘基改變?yōu)楣劝滨０窔埢揎椷@些分子。329位殘基的變化只能與313位殘基的變化同時發(fā)生，或者也可以與167位和172位殘基的變化同時發(fā)生。所說的人蛋白質C衍生物比野生型人蛋白質C分子或任何其他人蛋白質C衍生物更易受凝血酶激活，并具有更強的功能活性。
本發(fā)明也公開并要求保護用于制備新的人蛋白質C衍生物的重組DNA構建體、載體和轉化體。此外，還公開和請求保護含有有效量的本發(fā)明人蛋白質C衍生物和一種或多種可藥用賦形劑的藥物組合物，以及使用這些衍生物治療和預防疾病的方法。
為了在本文中公開和請求保護的本發(fā)明的目的，下列術語和簡寫定義如下。
Q313-一種人蛋白質C衍生物，其中已將天然人蛋白質C分子313位上的天冬酰胺殘基改變?yōu)楣劝滨０窔埢?br> Q329-一種人蛋白質C衍生物，其中已將天然人蛋白質C分子329位上的天冬酰胺殘基改變?yōu)楣劝滨０窔埢?。蛋白質C衍生物Q313和Q329由Gerlitz等人(歐洲專利申請91301446.0)和Grinnell等人(J.Biol.Chem.2269778-9785，1991)公開，這些文獻的內容引入本文作為參考。
Q3Q9-一種人蛋白質C衍生物，其中已將天然人蛋白質C分子313位的天冬酰胺殘基改變?yōu)楣劝滨０?將天然人蛋白質C分子的329位的天冬酰胺殘基改變?yōu)楣劝滨０窔埢?br> F167-一種人蛋白質C衍生物，其中已將天然人蛋白質C分子167位的天冬氨酸殘基改變?yōu)楸奖彼?。蛋白質C衍生物F167由Bang等人(歐洲專利申請88312201.2)和E hrlich等人(EMBO J.92367-2373，1990)公開，這些文獻引入本文作為參考。
LIN-一種人蛋白質C衍生物，其中天然人蛋白質C分子172位的天冬氨酸殘基已改變?yōu)樘於０窔埢?br> FLIN-一種人蛋白質C衍生物，其中天然人蛋白質C分子167位的天冬氨酸殘基已改變?yōu)楸奖彼釟埢?天然蛋白質C分子172位的天冬氨酸殘基已改變?yōu)樘於０窔埢?。蛋白質C衍生物LIN和FLIN已由Gerlitz等人(歐洲專利申請91301450.2)和Grinnell等人(《蛋白質C和相關抗凝劑》，Bruley，D.和Drohan，W.編，第13-46頁，Gulf Publishing Co.，Houston，1990)公開，這些文獻引入本文作為參考。
FLIN-Q313-一種人蛋白質C衍生物，其中已將天然人蛋白質C分子167位的天冬氨酸殘基改變?yōu)楸奖彼釟埢?將天然蛋白質C分子172位的天冬氨酸殘基改變?yōu)樘於０窔埢?將天然蛋白質C分子313位的天冬酰胺殘基改變?yōu)楣劝滨０窔埢?br> FLIN-Q3Q9-一種人蛋白質C衍生物，其中已將天然人蛋白質C分子167位的天冬氨酸殘基改變?yōu)楸奖彼釟埢?將天然蛋白質C分子172位的天冬氨酸殘基改變?yōu)樘於０窔埢?將天然蛋白質C分子313位的天冬酰胺殘基改變?yōu)楣劝滨０窔埢?將天然蛋白質C分子329位的天冬酰胺殘基改變?yōu)楣劝滨０窔埢?br> GBMT轉錄單位-一種經修飾的轉錄控制單位，它包括靠近腺病毒主要晚期啟動子(MLTF)上游調控成分的BK病毒P2增強子、腺病毒-2主要晚期啟動子、一個其定位能刺激所說啟動子的多聚GT成分，以及一個含有腺病毒拼接三重前導序列的DNA序列。
新生蛋白質-由mRNA轉錄本經轉譯產生的尚未進行任何轉譯后修飾的多肽。但是，在蛋白質從mRNA轉錄本全部轉譯前可能已開始進行如谷氨酸殘基的γ-羧基化以及天冬氨酸殘基的羥基化這樣一些轉譯后修飾。
蛋白質C活性-負責蛋白水解、酰氨水解、酯水解和生物學(抗凝或血纖維蛋白原溶解)活性的任何人蛋白質C的特性。用于檢測蛋白質抗凝活性的方法是本領域內熟知的，即見Grinnell等人，Bio/Technology 51189-1192，1987。
酶原-蛋白質水解酶的無酶活性的前體。本文所用的蛋白質C酶原一詞，是指已分泌的非活性形式的蛋白質C，無論是一條鏈還是兩條鏈。
本公開中使用的所有氨基酸縮寫都是由美國專利和商標局按37C.F.R.§1.822(b)(2)(1990)的規(guī)定得到認可的縮寫。
本發(fā)明提供了已改變了糖基化模式并且還改變了活化區(qū)的人蛋白質C衍生物。具體地說，這些衍生物包括Q3Q9、FLIN-Q313和FLIN-Q3Q9。Q3Q9衍生物在蛋白質C分子的313和329位上含有谷氨酰胺殘基(而不是通常在這些位置上存在的天冬酰胺殘基)。FLIN-Q313衍生物在該分子的167位含有苯丙氨酸殘基;在該分子的172位含有天冬酰胺殘基(而不是通常在這些位置上存在的天冬氨酸殘基);并且在313位含有谷氨酰胺殘基(而不是通常在這些位置上存在的天冬酰胺殘基)。在FLIN-Q3Q9衍生物中，已將167位的殘基由天冬氨酸改變?yōu)楸奖彼?172位的殘基由天冬氨酸改變?yōu)樘於０?313位的殘基由天冬酰胺改變?yōu)楣劝滨０?329位的殘基由天冬酰胺改變?yōu)楣劝滨０贰?br> FLIN-Q313和FLIN-Q3Q9衍生物由凝血酶單獨活化時顯示出極高的活化速率。再者，與其他野生型人蛋白質C不同，FLIN-Q313和FLIN-Q3Q9兩種衍生物都可由人血漿凝固時產生的凝血酶激活，從而抑制進一步形成凝塊。這種由凝塊激活的酶原比天然蛋白質C的活化形式具有明顯較大的比活性和明顯較長的半存留期。因此本發(fā)明的衍生物可用作為位點激活的抗血栓形成劑，除在有顯著量的凝血酶生成的情況下，它沒有抗凝活性。
本發(fā)明還提供了用于制備蛋白質C衍生物的DNA化合物。這些DNA化合物包含人蛋白質C輕鏈的編碼序列，該序列的位置緊接野生型蛋白質C酶原的前原肽序列的下游，并與之共處于轉譯閱讀框內。這些DNA序列也編碼在蛋白質C分子的成熟期間進行加工的Lys-Arg二肽，以及活化肽和蛋白質C分子的重鏈。在167位、172位和313位上氨基酸殘基的變化改變了該分子的活化過程，而在313和329位上氨基酸殘基的變化則改變了該分子的碳水化合物含量。
本領域技術人員將會認識到，由于遺傳密碼的簡并性，許多種DNA化合物都可以編碼上述多肽。Bang等人的美國專利4，775，624(其全部內容引入本文作參考)公開并要求保護編碼野生型人蛋白質C分子的DNA序列。據此，技術人員可以容易地確定，DNA序列中的哪些變化可用于構建能編碼本發(fā)明所公開的具體多肽的另一些DNA順序，本發(fā)明并不限于通過保藏而公開的特定的DNA序列。因而，下文中和所附實施例中描述的本發(fā)明優(yōu)選的DNA化合物、載體以及轉化體的構建，僅是為了說明而不限制發(fā)明范圍。另外，在313位和329位用Gln置換Asn是為了說明而不限制發(fā)明范圍，因為除Cys或Pro外也可使用其他氨基酸置換。
本發(fā)明中所有的DNA化合物都是通過將人蛋白質C基因進行定位誘變制備的。然后將經誘變的酶原編碼分子插入到真核表達載體中，使GBMT轉錄單位能驅動酶原基因的表達。將這些載體轉化到大腸桿菌K12 AG1細胞中，并于1992年1月14日保藏在美國北方地區(qū)研究實驗室(Peoria，Illinois 61604)并構成該保藏機構永久性原種培養(yǎng)物的一部分。具體的培養(yǎng)物及保藏號列于下表Ⅰ中。
表Ⅰ培養(yǎng)物 保藏號大腸桿菌K12 AG1/pGT-h-Q3Q9 NRRL B-18938大腸桿菌K12 AG1/pGT-h-FLIN-Q313 NRRL B-18939大腸桿菌K12 AG1/pGT-h-FLIN-Q3Q9 NRRL B-18940
利用常規(guī)方法獲得這些培養(yǎng)物并分離出質粒，然后可直接轉染到真核宿主細胞中用于制備人蛋白質C衍生物。優(yōu)選將質粒轉染到能表達腺病毒E1A最早期基因產物的宿主細胞中，因為GBMT轉錄控制單位中存在的BK增強子在E1A存在下可最有效地增強表達。Berg等人在歐洲專利申請91301451.0中對GBMT轉錄控制單位進行了更詳細的描述，該文獻的全部內容引入本文作為參考。技術人員可以認識到，許多宿主細胞都表達或可以使之表達大DNA病毒的最早期基因產物。用于表達本發(fā)明人蛋白質C衍生物的最優(yōu)選的細胞系是人腎293細胞系，該細胞系已由Bang等人在美國專利4，992，373中公開，該文獻的全部內容引入本文作為參考。在該細胞系中表達之后，利用Yan的美國專利4，981，952的方法，從細胞培養(yǎng)上清液中純化這些衍生物，上述文獻的全部內容引入本文作為參考。
利用化學方法，或通過將限制性片段組合，或將本領域內的已知技術聯合使用，可合成本發(fā)明的DNA序列?？衫矛F有的DNA合成儀合成本發(fā)明的DNA化合物。
本發(fā)明的示例性載體包含GBMT轉錄單位，其定位可通過腺病毒晚期啟動子刺激編碼序列的轉錄。本領域技術人員明白，許多真核啟動子、增強子和表達載體都是本領域內已知的，并可用于表達DNA序列以制備本發(fā)明的蛋白質C衍生物。本領域技術人員還明白，在沒有增強子成分時真核表達載體也能起作用。本發(fā)明的關鍵方面并不在于用于表達衍生物的特定增強子或啟動子，而在于新的DNA序列和從這些序列制備的相應蛋白質。
可將本發(fā)明的載體轉化至各種各樣的真核尤其是哺乳動物宿主細胞中并在其中表達。
在北方地區(qū)研究實驗室保藏的載體都含有潮霉素抗性基因。但是，可方便地構建不含選擇性標記的載體，并可將其用于進行瞬時性檢測分析，或將其與其他含選擇性標記的載體一起共轉化至細胞系中。本發(fā)明的載體還可包含能在大腸桿菌中進行復制的序列，因為在大腸桿菌中比在其他宿主有機體中制備質粒DNA通常更為有效。
可以對本發(fā)明的示例性DNA序列和質粒進行許多修飾和改變。例如，遺傳密碼的簡并性允許在整個多肽編碼區(qū)和轉譯終止信號內進行核苷酸置換而不會改變所編碼的多肽編碼序列?？蓮娜说鞍踪|C的已知氨基酸或DNA序列推導出這些可置換的序列，并且可用下列常規(guī)合成方法或定位誘變方法構建這些序列?？梢曰旧习凑誌takura等人(Science 1981056，1977)和Crea等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 755765，1978)的步驟完成合成方法。因此，本發(fā)明決不僅限于具體例舉的DNA序列和質粒。
用于將酶原形式的人蛋白質C活化為活化人蛋白質C衍生物的方法是本領域內熟知的老方法。蛋白質C可由凝血酶單獨激活，或由凝血酶/凝血調理素復合物，或用Russell′s蝰蛇毒液或采用各種其他手段激活。在用凝血酶激活后，可利用總酰氨水解分析或抗凝分析測定人蛋白質C衍生物的活性。凝血酶激活試驗和蛋白質C分析試驗(酰氨水解和抗凝)是按照Grinnell等人(Bio/Technology 51187-1192，1987)的方法完成的，該文獻的全部內容引入本文作為參考。
可用本發(fā)明的重組人蛋白質C衍生物預防和治療各種各樣的涉及血管內凝血的獲得性疾病，包括深層靜脈血栓形成、肺栓塞、外周動脈血栓形成、起源于心臟或外周動脈的血栓、急性心肌梗塞、血栓形成性中風、不穩(wěn)定性心絞痛、外周血管手術、器官移植和傳播性血管內凝血。這些蛋白質C衍生物也可有效地用于治療大量表現出陣發(fā)性深層靜脈血栓形成的雜合蛋白質C缺陷癥患者，以及用于治療患有暴發(fā)性紫癜的純合蛋白質C缺陷癥患者?；罨鞍踪|C衍生物的另一種治療應用是預防目前用低劑量肝素治療的深層靜脈血栓形成和肺栓塞。
按照已知方法可以將本發(fā)明的衍生物及其活化形式配制成可藥用的組合物，使本發(fā)明的人蛋白質C衍生物或活化的蛋白質C衍生物與可藥用的載體混合。合適的載體及其配制，包括其他人蛋白質(如人血清白蛋白)，由Remington′s Pharmace utical Sciences(1980年第16版，Mack Publishing Co.，Osol等人編，引入本文作為參考)作了描述。這樣的組合物含有有效量的蛋白質C衍生物或其活化形式，以及適量的載體，以便制備適于有效給予宿主的可藥用組合物。蛋白質C衍生物組合物可非腸道給藥，或者通過可確保以有效形式釋放到血流中的其他方法給藥。
下面提供的實施例作為說明本發(fā)明的手段，不要誤認為是限制本發(fā)明。
實施例1人蛋白質C衍生物的制備基本上按照Bang等人的美國專利4，992，373(引入本文作為參考)的方法，從大腸桿菌細胞中分離本發(fā)明的表達載體，然后轉化到293細胞中，在37℃下選擇轉化體，然后培養(yǎng)，以制備人蛋白質C衍生物?；旧习凑誝an的美國專利4，981，952(引入本文作為參考)的方法從細胞培養(yǎng)上清液中純化出衍生物。
實施例2抗凝活性按照Parkinson等人(J.Biol.Chem.26512602-12610，1990，引入本文作為參考)的描述，用10nM凝血酶與可溶性重組人凝血調理素TMD-75的復合物激活，獲得完全激活的蛋白質C。利用活化的部分凝血致活酶時間凝血分析法測定活化分子的抗凝活性。結果列于表Ⅱ中。
表Ⅱ蛋白質C 抗凝活性 相對活性(單位/mg)野生型 325+/-65 1Q313 577+/-17 1.8LIN 289+/-13 0.8F167 283+/-27 0.9FLIN 313+/-65 1FLIN-Q313 552+/-37 1.7實施例3活化速率在含有20mM Tris pH7.4、0.15M NaCl、0.1mg/ml BSA和3mM CaCl2的反應混合物中，用人凝血酶(10nM)測定活化速率。在活化反應中純化蛋白質C(野生型和衍生物)的濃度是0.81至1.61μM。在不同的時間點從活化反應混合物中移出等份樣品到96孔平板上測定活化速率，在加入終濃度為0.75mM的生色底物(S-2366)后，按在ThermoMax動力學微量滴定平板讀數器(Molecular Devices)上405nm處光吸收單位/分的變化測定酰氨水解活性。利用測得的每一種蛋白質的比活性，將光密度/分鐘變化值換算為活化蛋白質C的生成量，并相對于活化時間作圖，從而測出活化速率。在所有試驗中活化蛋白質C的生成量低于總起始材料的10%。結果列于表Ⅲ中。
表Ⅲ蛋白質C 由凝血酶 相對活化速度率活化的速率(ng/分)野生型 0.53+/-0.1 1Q329 0.23a0.4Q313 1.1+/-0.2 2Q3Q9 1.62a3.3LIN 2.2+/-0.4 4F167 6.3+/-1.0 12FLIN 15.9+/-4.0 30FLIN-Q313 32.3+/-6.4 61FLIN-Q3Q9 45.0a84a.沒有標準偏差的速率來自n＝2的實驗另外，用凝血酶和凝血調理素以相同的分析系統(tǒng)測定了相對活化速率。所使用的凝血調理素分子是Parkinson等人(見上文)的可溶性人凝血調理素。結果列于表Ⅳ中。
表Ⅳ蛋白質C 由凝血酶和凝血調理素活化的相對速率野生型 1aQ313 2.6+/-0.6LIN 2.1+/-0.2F167 3.5+/-0.8FLIN 2.7aFLIN-Q313 9.2+/-1.0a.沒有標準偏差的速率來自n＝2的實驗實施例4在人血漿凝固中的抗凝活性以20nM的濃度將野生型人蛋白質C和FLIN-Q313衍生物與Helena標準APTT試劑一起加入到人血漿中，并在37℃保溫5分鐘。加入終濃度為8mM的CaCl2啟動血漿的凝固，并測定凝固時間。在同時進行的平行實驗中，將能中和活化蛋白質C活性的單克隆抗體加入到對照血漿以及含有野生型蛋白質C酶原或FLIN-Q313的血漿中。結果列于表Ⅴ。
表Ⅴ蛋白質C 凝固時間(秒)+Ab -Ab無(對照) 30+/-4 32+/-3野生型 36+/-4 32+/-5FLIN-Q313 36+/-4 75+/-5通過改變野生型人蛋白質C和FLIN-Q313衍生物的濃度測定在血漿凝固中誘導的凝固活性水平，數據以延長的凝固時間來表示。該分析中的基礎凝固時間為27至33秒。結果列于表Ⅵ中。
表Ⅵ蛋白質C 劑量(nM) 延長的凝固時間(秒)野生型 8 0+/-3FLIN-Q313 8 20+/-6野生型 16 0+/-5FLIN-Q313 16 37+/-+6野生型 32 0+/-6FLIN-Q313 32 77+/-6野生型 64 0+/-5FLIN-Q313 64 235+/-6實施例5相對半存留期的測定通過用100nM活化人蛋白質C、活化FLIN-Q313或酶原(非活化)FLIN-Q313與正常人血漿(加了檸檬酸鹽)共同保溫，測定血漿中人蛋白質C的抑制。在最終反應中血漿濃度為90%(V/V)，其余體積由含有3mM CaCl2、150mM NaCl、20mM Tris pH7.4和1mg/ml BSA的緩沖液組成。在所選擇的時間點取等份樣品，用終濃度為1mM的S-2366測定活化蛋白質C的酰氨水解活性，或通過活化部分凝血致活酶時間來測定活化蛋白質C活性。按照實施例4中描述的方法測定FLIN-Q313的凝塊激活活性水平。在約25分鐘后，活化蛋白質C和活化FLIN-Q313的活性損失都在50%以上，而酶原FLIN-Q313在45分鐘后仍保留至少80%活性。
權利要求
1.一種人蛋白質C衍生物，它選自Q3Q9、FLIN-Q313和FLIN-Q3Q9。
2.權利要求1的人蛋白質C衍生物，它是Q3Q9。
3.權利要求1的人蛋白質C衍生物，它是FLIN-Q313。
4.權利要求1的人蛋白質C衍生物，它是FLIN-Q3Q9。
5.一種重組DNA分子，它編碼權利要求1的人蛋白質C衍生物。
6.權利要求5的重組DNA分子，它編碼蛋白質C衍生物Q3Q9。
7.權利要求5的重組DNA分子，它編碼蛋白質C衍生物FLIN-Q313。
8.權利要求5的重組DNA分子，它編碼蛋白質C衍生物FLIN-Q3Q9。
9.權利要求5的重組DNA分子，它是一種質粒。
10.權利要求9的重組DNA分子，它選自pGT-h-Q3Q9質粒(NRRL B-18938)、pGT-h-FLIN-Q313質粒(NRRL B-18939)、pGT-h-FLIN-Q3Q9質粒(NRRL B-18940)。
11.一種宿主細胞，它已用權利要求9的重組DNA質粒轉化。
12.權利要求11的宿主細胞，它選自293細胞和大腸桿菌細胞。
13.權利要求12的宿主細胞，它是293/pGT-h-Q3Q9、293/pGT-h-FLIN-Q313、293/pGT-h-FLIN-Q3Q9、大腸桿菌K12 AG1/pGT-h-Q3Q9(NRRL B-18938)、大腸桿菌K12 AG1/pGT-h-FLIN-Q313(NRRL B-18939)和大腸桿菌K12 AG1/pGT-h-FLIN-Q3Q9(NRRL B-18940)。
14.一種藥物制劑，它含有作為活性成分的選自Q3Q9、FLIN-Q313和FLIN-Q3Q9的蛋白質C衍生物，以及一種或多種可藥用的載體、賦形劑或稀釋劑。
全文摘要
描述了具有高活性并且對凝血酶活化作用的依賴性較低的人蛋白質C衍生物。這些衍生物在其較高的活化速率、功能活性和碳水化合物結構方面與天然形式的人蛋白質C不同。還描述了用于制備這些衍生物的DNA化合物、轉移載體、表達載體以及轉化體。
文檔編號C12N1/21GK1080658SQ9310621
公開日1994年1月12日 申請日期1993年5月20日 優(yōu)先權日1992年5月21日
發(fā)明者B·E·杰里茨, B·W·格林內爾 申請人:伊萊利利公司