專利名稱：分離和克隆有酪氨酸-磷酸酶活性的蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及跨膜酪蛋白磷酸酶，其編碼DNA，生產(chǎn)和鑒定這些蛋白質(zhì)的方法，以及篩選能夠結(jié)合和抑制或刺激磷酸酶酶促活性之化合物的方法。
蛋白質(zhì)酪氨酸殘基的磷酸化狀態(tài)在細(xì)胞生長控制中起著重要作用。通過調(diào)整兩種相反作用的蛋白質(zhì)-酪氨酸激酶和酪氨酸磷酸酶的相對活性來控制細(xì)胞磷酸酪氨酸水平。
幾種生長因子受體，以及胰島素受體都是酪氨酸特異性蛋白質(zhì)激酶。
受體酪氨酸激酶的活化是通過與它們各自的生長因子或細(xì)胞激活素如FGF、EGF、PDGF、GM-CSF和IL-1的相互作用介導(dǎo)的，并通常誘導(dǎo)有絲分裂和生長(Yarden，Yand Ullrich，A，Annual Rev.Biochem.57443-478，1988)。發(fā)現(xiàn)許多致癌基因產(chǎn)物也可作為酪氨酸激酶并與已知的多肽生長因子受體分享廣泛的順序同源性，從而進(jìn)一步支持酪氨酸磷酸化作用和細(xì)胞增殖之間關(guān)聯(lián)的觀點。這些觀察結(jié)果提示，蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶因其能夠選擇性地抵消酪氨酸激酶的作用，而可能在控制細(xì)胞生長和活化中起到重要作用。因此，已證明酪氨酸磷酸酶抑制劑能夠“可逆地轉(zhuǎn)化”細(xì)胞，并且已提出在惡性增殖過程中可能包括PTP酶(PTPase)活性的改變，而形成蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶可能作為腫瘤抑制物的概念(Klarlund，J.K.(1985)Cell41∶707-717)。
雖然關(guān)于酪氨酸激酶的許多工作已集中在生長調(diào)節(jié)作用上，但最近中樞神經(jīng)系統(tǒng)的非增殖細(xì)胞中的發(fā)現(xiàn)證明了相對大量的酪氨酸激酶活性的存在。例如，胰島素的受體存在于腦的特定區(qū)域中，并在配體刺激后發(fā)生特異地自動磷酸化。目前已經(jīng)證明，大鼠腦中胰島素受體的分布是與磷酸酪氨酸的分布密切相關(guān)的，此提示這種激酶具有體內(nèi)活性并參予成年動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能(Moss，A.M.，Unger，J.W.，Moxley，R.T.and Livingston，J.Proc.Natl.Acad.Sci.87∶4453-4457，1990)。
另一方面，最近已報導(dǎo)幾種酪氨酸磷酸酶在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中得以選擇性地表達(dá)，提示它們可能參予調(diào)節(jié)腦中的酪氨酸激酶活化作用。
如果這些酶參予控制酪氨酸磷酸化途徑，則它們的活性可能是酪氨酸激酶的活性應(yīng)在對特異性細(xì)胞過程或配體相互作用的反應(yīng)中受到調(diào)節(jié)。確定，迄今已分離出的某些磷酸酶顯示有假定的受體型結(jié)構(gòu)，此提示它們的活性是受精細(xì)調(diào)節(jié)的級聯(lián)過程中的外在配體調(diào)節(jié)的。很顯然，酪氨酸磷酸化配體的分離可代表抑制不受控制的細(xì)胞生長(如在惡性增生情況下)的一個重要步驟。
基于它們的結(jié)構(gòu)組織，可將蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTP酶)分為三類。Ⅰ類含有其中帶有單一催化區(qū)域的低分子量非受體分子，其中具有一個單一的催化區(qū)域并包括胎盤PTP酶1B(Charbonneau，H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.86∶5252-5256，1989;Chernoff，J.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.87∶2735-2789，1990)、T細(xì)胞TPT酶(Cool，D.E.et al.，Proc，Natl.Acad.Sci.86∶5257-5261，1989)和大鼠腦PTP酶(Guan，K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.87∶1501-1505，1990)。Ⅱ和Ⅲ類PTP酶則是受體樣跨膜受體。雖然迄今已描述的Ⅱ類的單獨成員(HPTPβ和DPTP10D)具有單一的胞漿催化區(qū)(Kreuger，N.X.et al.∶EMBOJ.，9∶3241-3252，1990;Shin-Shay，T.et al.，∶Cell 67∶675-685，1991)，但Ⅲ類成員卻在分子的胞漿區(qū)域中具有兩個重復(fù)的假定催化區(qū)。Ⅲ類包括白細(xì)胞共同抗原(LCA)(Ralph，S.J.，EMBO J.，6∶1251-1257，1987;Charbonneau，H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.85∶7182-7186，1988)、LCA相關(guān)蛋白質(zhì)，LAR(Streuli，M.et al.，J.Exp.Med.，168∶1523-1530，1988)、LAR相關(guān)果蠅屬蛋白質(zhì)DLAR和DPTP(Streuli，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.86∶8698-8702，1989)和人(Krueger，N.X.，Streuli，M.and Saito，H.，EMBO J.9∶3241-3252，1990;Kaplan，R.et al.，Proc，Natl.Acad.Sci.，87∶7000-7004，1990)及小鼠(Sap，J.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，87∶6112-6116，1990;Mathews，R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，87∶4444-4448，1990)蛋白質(zhì)HPTPα、HPTPγ、HPTPδ、HPTPξ。
在不同的磷酸酶的催化區(qū)域之間和同一PTP酶內(nèi)的重復(fù)的區(qū)域1和2之間有著顯著的氨基酸同源性和進(jìn)化的保守性。具體地說，氨基酸順序VHCSXG(一字母代碼，X優(yōu)先代表A或D)似乎是酶之活性位點的一個部分(Streuli，M.，Krueger，N.X.，Thai，T.，Tang，M.and Saito，H.，EMBOJ.，9∶2399-2407，1990)。
n個PTP酶具有由粘連蛋白型(FN)單獨重復(fù)順序(HPTPβ)或由免疫球蛋白區(qū)域和FN共同重復(fù)順序(LAR、DLAR和DPTP)組成的粘附分子樣細(xì)胞外區(qū)域，此提示它們可能將細(xì)胞-細(xì)胞識別與酪氨酸磷酸化作用相偶聯(lián)。確實已顯示細(xì)胞生長的密度依賴性抑制作用包括了受調(diào)節(jié)的酪氨酸磷酸酶活性升高，從而支持了這種活性可能在控制細(xì)胞生長、分化和腫瘤生成中起作用的概念。
從酪氨酸磷酸酶在細(xì)胞控制機(jī)制中的作用即作為在新發(fā)現(xiàn)的跨膜信號傳遞機(jī)制中作為潛在抗致癌基因劑和效應(yīng)物來看，我們已對可能參予這些過程中的其他磷酸酶進(jìn)行了研究。
因此，本發(fā)明提供了哺乳動物受體型蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTP酶)，其細(xì)胞外區(qū)域包括Arg-Gly-Asp順序及其功能衍生物。
這樣的PTP酶的例子是Ⅱ類PTP酶。Ⅱ類PTP酶可能是具有跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的新的PTP酶PTP35。已分離了兩種不同形式的PTP35，它們具有共同的結(jié)構(gòu)特征并且只是在其N末端順序上有所差異。重要的是，PTP35的細(xì)胞外區(qū)域與迄今描述的任何其他受體型磷酸酶無關(guān)，并且含有Arg-Gly-Asp(RGD)順序。PTP35的表達(dá)似乎在腦內(nèi)特別有意義，提示它可能在控制中樞神經(jīng)系統(tǒng)代謝和分化中具有重要作用。此外，當(dāng)在培養(yǎng)成纖維細(xì)胞中研究PTP35時，它似乎參予了控制細(xì)胞增殖。還有，磷酸酶PTP35之mRNA的水平似乎可因在加有堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)或其他細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)物中刺激3T3細(xì)胞而特異性地增加。
通過使用重組DNA方法，本發(fā)明已鑒定了新的受體型蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶。在DNA水平上并基于推測的蛋白質(zhì)之氨基酸結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，表明此蛋白質(zhì)缺少重復(fù)催化區(qū)，屬于Ⅱ類蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTP酶)，故代表了這一特殊類別之磷酸酶的新的例子。
本文描述的不同形式的PTP35分享共同的特征。基于推測的氨基酸順序，可以識別出各種不同的功能性區(qū)域?；谑杷?見

圖1a和1b)的存在，將PTP35分類為包含細(xì)胞外區(qū)域N末端至疏水段，和細(xì)胞內(nèi)區(qū)域C末端至疏水段的跨膜蛋白質(zhì)。迄今已分離的不同形式的PTP35中推測的蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)部是完全相同的，其由表現(xiàn)出與先前描述的跨膜磷酸酶的細(xì)胞內(nèi)催化區(qū)有顯著同源性的獨特區(qū)域組成。已有人提出，保守的氨基酸順序IIVHCSDGAGRTG(單字母代碼)是磷酸酶催化區(qū)的一部分，并且也存在于PTP35中(見圖1a和1b)。最大程序的同源性見于小鼠LRPA(Matthews，R.J.，Cahir，E.D.and Thomas，M，L.，Proc，Natl，Acad.Sci.，87∶4444-4448，1990;Sap。J.et al，Proc，Natl.Acad.Sci.，87∶6112-6116，1990)和小鼠CD45(Charbonneau，H.，Tonks，N.，Walsh，K.and Fischer，E.，Proc.Natl.Acad.Sci.，85∶7182-7186，1988)酪氨酸磷酸酶中。
相反，如Swissprot數(shù)據(jù)庫顯示的，已知的細(xì)胞外區(qū)域順序則沒有顯著的同源性。也許細(xì)胞外區(qū)域的最令人感興趣的特征是存在Arg-Gly-Asp(RGD)順序，該順序是參予細(xì)胞識別和粘附機(jī)制的許多蛋白質(zhì)，包括粘連蛋白、胞外粘連蛋白(Vitrone-ctin)、血纖維蛋白原、Von Willebrand因子和蛋白質(zhì)GPIIⅢa所共有的。上述各蛋白質(zhì)的RGD順序是由負(fù)責(zé)細(xì)胞固著相關(guān)過程的，稱為整合蛋白(integrin)的結(jié)構(gòu)上相關(guān)受體之家族中的至少1個成員識別的。PTP35是發(fā)現(xiàn)有RGD順序的第一個酪氨酸磷酸酶蛋白質(zhì)，所說的順序可能具有重要的生物學(xué)作用。PTP35之細(xì)胞外區(qū)域的其他相關(guān)特征包括存在2個潛在的N連接的糖基化位點。
因此本發(fā)明包括稱為PTP35的新的哺乳動物受體型蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTP酶)，其細(xì)胞外區(qū)域包括一個Arg-Gly-Asp順序，或其任何功能衍生物。就其細(xì)胞外區(qū)域來說，PTP35與其他已知的PTP酶間沒有明顯的同源性。圖1a和1b中顯示了兩種形式的PTP35的順序。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是天然來源的，或者也可能是以化學(xué)或重組方法制備的。如果分子是天然來源的，可用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)以含有PTP酶的細(xì)胞、組織或液體中制得基本上沒有其他與PTP酶存在天然聯(lián)系之蛋白質(zhì)的制劑。
純化技術(shù)中有代表性的例子是親和純化技術(shù)，其中使用能與PTP酶的酶促區(qū)域或各自受體區(qū)域結(jié)合的固相底物或配體。另外，亦可結(jié)合使用硫酸銨沉淀、分子篩層析及離子交換層析等幾種標(biāo)準(zhǔn)方法完成純化步驟。
可用生物化學(xué)方法從各種組織和細(xì)胞系中純化本發(fā)明的PTP酶。其中優(yōu)選的材料是小鼠腦和NIH-3T3細(xì)胞系。
本發(fā)明包括含有與載體多肽融合之本發(fā)明PTP酶或其衍生物的融合蛋白質(zhì)。
如前所述，按上述方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)基本上沒有其他蛋白質(zhì)。“基本上沒有其他蛋白質(zhì)”是指該蛋白質(zhì)中至少90%，甚至至少95%不含其他蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)純度最好在98%或98%以上。所說的“其他蛋白質(zhì)”包括在細(xì)胞中與PTP酶有天然聯(lián)系的蛋白質(zhì)及存在于重組宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。
“功能衍生物”是指保留PTP酶之至少一部分功能如磷酸酶酶促活性或使細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合配體之功能的PTP酶如PTP35的任何片段、變體、類似物或化學(xué)衍生物。功能性衍生物基本上是由細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外區(qū)域，或圖1中核苷酸279至2874編碼的氨基酸順序組成的。
“片段”是指分子的任何小部分，即較短的肽。
“變體”是指基本上相似于完整肽或其片段的分子。天然變體包括除小鼠以外的不同種哺乳動物(即已分離出PTP35的其他動物源)中的PTP35的同系物?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的方法直接化學(xué)合成或在編碼PTP酶的DNA中插入適當(dāng)?shù)耐蛔円缘玫絇TP酶的合成變體如PTP35。例如，如此得到的變體包括殘基的缺失、插入或取代，以及延伸產(chǎn)物。
變體可至少50%，至少70%，至少90%，至少95%，或至少98%同源于PTP酶如PTP35或其片段。缺失、插入、延伸或取代可以是N末端、C末端或內(nèi)部順序且包括1個或多個氨基酸，如1個、2個、3個、5個、10個、20個、30個或40個氨基酸。延伸可以是較長的并可構(gòu)成載體蛋白質(zhì)。取代通常是保守取代，其中各被取代氨基酸是由生物學(xué)上相似的氨基酸取代的。例如，各氨基酸可被有相似大小、疏水性、電荷和/或化學(xué)官能團(tuán)的氨基酸取代。侯選取代是A取代G或反之;
V被A、L或G取代;
K被R取代;
S被T取代或反之;
E取代D或反之;以及Q被N取代或反之。
“類似物”是指基本上相似于完整分子或其片段的非天然分子。
PTP酶的“化學(xué)衍生物”如PTP35含有附加的不是肽之正常部分的化學(xué)部分?；瘜W(xué)修飾的例子包括肽的共價修飾，用雙官能試劑衍生及C末端羧基基團(tuán)的酰胺化。如此洗生的部分可改善PTP酶的物理-化學(xué)特性或生物學(xué)活性。
本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案是基本上具有如圖1a或1b中所示氨基酸順序的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一個實施方案是基本上由編碼PTP酶或其功能衍生物的核苷酸順序組成的DNA分子。DNA順序可以是CDNA或基因組DNA形式的。適宜的順序是PTP35或其衍生物的順序。
可通過各種本領(lǐng)域中專家熟知的方法和Maniatis et al.，Molecular Cloning∶A Laboratory Manual Second Edition，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbour NY(1989)中描述的方法生產(chǎn)本發(fā)明的重組DNA分子。
可用互補(bǔ)于PTP酶家族之保守區(qū)域的單鏈全簡并寡核苷酸探針來篩選由能夠表達(dá)PTP酶基因的細(xì)胞系衍生的DNA、cDNA或RNA制劑。優(yōu)選的探針應(yīng)是針對編碼本發(fā)明PTP酶之至少5個氨基酸殘基的核苷酸順序的。已按照這一技術(shù)或相似技術(shù)克隆了各種基因，例如人醛脫氫酶(Hm，L.C.，et al.，Proc。Natl.Acad.Sci.USA 823771-3775，1985)，纖維粘連蛋白(fibronectin)(Suzuki，S.et al.，EMBO J.4∶2519-2524，1985)、組織型血纖維蛋白溶酶原活化劑(Pennico，D.et al.，Nature 301∶214-221，1983)。
在使用選擇性擴(kuò)增技術(shù)后，即使是很小量的得自某個體的DNA也能用這些方法進(jìn)行克隆。長時間以來便已了解了能夠擴(kuò)增純化之核酸片段的重組DNA方法學(xué)。
這些方法學(xué)一般包括將核酸片段引入DNA或RNA載體中，克隆擴(kuò)增該載體，并回收已擴(kuò)增的核酸片段。這些方法學(xué)的例子可參見Cohen等人的美國專利No.4，237，224和Maniatis等人的上述文獻(xiàn)(已列為本文參考文獻(xiàn))。
最近已描述了能夠增加上述所需核酸分子之濃度的體外酶學(xué)方法。該方法被稱為“聚合酶鏈反應(yīng)”或“PCR”(Mullis，K.et al，Cold Spring Harbor Symp，Ouant.Biol.51∶263-273，1986;Erlich，H.et al，歐州專利EP50，424;EP84，796，EP258，017，EP237，362;Mullis，K.，EP201，184;Mullis，K.et al.，美國專利US4，683，202;Erlich，H.美國專利US4，582，788和Saiki，R.et al，US4，683，194)。
聚合酶鏈反應(yīng)提供了即使以前特定核酸順序未被純化并且只以單一拷貝存在于特定樣品中時亦可選擇性地增加該順序之濃度的方法。該方法可用于擴(kuò)增單股或雙股DNA。該方法實質(zhì)包括使用兩個寡核苷酸探針作為引物，以對所需核酸分子進(jìn)行模板依賴性聚合酶介導(dǎo)的復(fù)制。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了基本上由編碼如上限定之PTP35的功能衍生物的核苷酸順序組成的DNA分子。DNA分子可編碼本發(fā)明PTP酶的變體。這樣的DNA分子是可至少40%，至少60%，至少80%，至少90%，至少95%或至少98%同源于圖1中所示順序的分子或其片段。DNA分子可編碼具有上述缺失、插入、延伸或取代的本發(fā)明的PTP酶。
可用針對編碼多肽分子之DNA中核苷酸的位點針對性誘變方法(如參見Adelman et al.，DNA2∶183，1983)制備這樣的DNA分子，從而產(chǎn)生編碼衍生物的DNA，然后在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)該DNA。
為了表達(dá)本發(fā)明的天然PTP酶或其功能衍生物，必須在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中克隆編碼不同順序的各DNA。表達(dá)載體是由于其中存在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯控制順序而能夠表達(dá)已克隆到其中的DNA分子并因而能產(chǎn)生多肽的載體。載體可以是質(zhì)粒或病毒載體。
將表達(dá)載體引入適當(dāng)宿主細(xì)胞后即可表達(dá)已克隆的順序。如果使用原核表達(dá)載體，則適宜的宿主細(xì)胞應(yīng)是任何能表達(dá)已克隆之順序的原核細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞。同樣，如果使用真核表達(dá)載體，則適宜的宿主細(xì)胞應(yīng)是任何能表達(dá)已克隆之順序的真核細(xì)胞。可使用酵母宿主如釀酒酵母細(xì)胞。另外，可使用昆蟲細(xì)胞，在這種情況下，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是適用的。另一個可選用的宿主是哺乳動物細(xì)胞系，如中國倉鼠卵細(xì)胞。
可按常規(guī)技術(shù)使編碼本發(fā)明PTP酶或其功能衍生物的DNA順序與載體DNA重組，包括造成適于連接的平頭末端或交錯終止的末端、進(jìn)行限制性酶消化以提供適當(dāng)?shù)哪┒?、必要時充填粘性末端、用堿性磷酸酶處理以避免不期望的連接，并用適當(dāng)?shù)倪B接酶進(jìn)行連接?？捎肕aniatis等人(文獻(xiàn)同上)公開的或本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行這些操作。
如上所述，適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體含有能指導(dǎo)和控制基因在適當(dāng)宿主中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)信息。這些順序被可操作地連接到待表達(dá)的基因上，并包括啟動子(指導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄開始)、Shine-Dalgarno順序、加帽順序、CAAT順序等(均參予轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯的起始過程)。
本發(fā)明的啟動子順序可以是原核、真核或病毒的。適當(dāng)?shù)脑隧樞虻睦影é耸删w的PR和PL啟動子(The Bacteriophage Lambda，Hershey，A.D.，Ed.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1973;Lambcda Ⅱ，Hendrix，R.W。，Ed.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1980)、大腸桿菌的trp、recA、熱休克和1acZ啟動子以及SV40早期啟動子(Benoist，C。et al。，Nature 290∶304-310，1981)。
就Shine-Dalgarno順序來說，優(yōu)選的適用調(diào)節(jié)順序的例子是以噬菌體MS-2之復(fù)制酶基因和噬菌體λ之基因cⅡ的Shine-Dalgarno為代表的。Shine-Dalgarno順序可直接接在編碼PTP35的DNA之后并導(dǎo)致成熟PTP35蛋白質(zhì)的表達(dá)。
另外，編碼PTP35或其遺傳變體的DNA可以以編碼載體肽順序的DNA順序為先導(dǎo)。在這種情況下，可產(chǎn)生其中PTP35的N末端與載體肽相融合的融合蛋白質(zhì)，所說的載體肽可幫助提高蛋白質(zhì)表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性，并提供簡單的純化手段。優(yōu)選的載體肽包括葡萄球菌蛋白A的一個或多個IgG結(jié)合區(qū)。包含蛋白A之IgG結(jié)合區(qū)的融合蛋白質(zhì)很容易用親和層析法(如在IgG偶聯(lián)的Sepharose上)純化成均質(zhì)物。編碼原核生物酶如腸激酶、因子X或溶膠原酶(Procollagenase)之識別位點的DNA順序可直接接在編碼PTP35或其變體之DNA順序的前面，以允許裂解融合蛋白質(zhì)而得到成熟的PTP35蛋白質(zhì)。
另外，適用的表達(dá)載體還包含適當(dāng)?shù)脑试S篩選被轉(zhuǎn)化之宿主細(xì)胞的標(biāo)志。這樣的標(biāo)志一般是抗生素抗性基因，其可賦予被轉(zhuǎn)化宿主以在含有基因賦予抗性之抗生素的選擇性培養(yǎng)基上生長的能力。
使用Maniatis等人(文獻(xiàn)同上)所述的本領(lǐng)域?qū)＜沂熘募夹g(shù)來轉(zhuǎn)化所選擇的宿主。
因此本發(fā)明的再一個實施方案是涉及含有編碼本發(fā)明PTP酶或其功能衍生物之DNA順序的適當(dāng)表達(dá)載體。編碼PTP35或其變體的DNA順序可以以編碼載體肽的順序為先導(dǎo)，以得到融合蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的再一個實施方案是涉及用所說的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的，并能在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下產(chǎn)生本發(fā)明之PTP酶或其功能衍生物的原核或真核宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明PTP酶蛋白質(zhì)或其功能衍生物的方法，包括(ⅰ)提供處于使PTP酶或其功能衍生物得以表達(dá)之條件下的適當(dāng)?shù)乃拗鳎?ⅱ)純化如此得到的PTP酶或其功能衍生物。
按下述方法適當(dāng)?shù)刂苽渌拗?a)分離基本上由編碼PTP酶或其功能衍生物的核苷酸順序組成的DNA分子;
(b)將所說的DNA分子插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中;和(c)用所說的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗鳌?br> 本發(fā)明的PTP酶和其功能衍生物可用于試驗?zāi)芴岣呋蛞种屏姿崦富钚缘幕衔锏姆椒ㄖ?。本發(fā)明還可用于診斷涉及本發(fā)明PTP酶的疾病。
可在體外系統(tǒng)中試驗?zāi)潮辉嚮衔镄揎椓姿崦富钚缘哪芰?，其中將試驗化合物加到純化的PTP酶蛋白質(zhì)或其酶促活性衍生物中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)酶學(xué)方法檢測對酶活性的影響。
另外，可使用活的或固定的細(xì)胞，或者使用得自活的或固定的細(xì)胞的膜部分，在全細(xì)胞制劑中檢測化合物對PTP酶活性的作用。該方法可用于篩選通過蛋白質(zhì)的細(xì)胞外受體部分起作用的化合物，以及直接作用于蛋白質(zhì)之酶促部分的化合物。將試驗化合物與大量表達(dá)本發(fā)明PTP酶的細(xì)胞如NIH-3T3細(xì)胞，或與由之得到的膜制劑一起保溫。
然后使用本領(lǐng)域已知的方法(Honegger，A.M.et al.，Cell 50∶199-209，1987;Margolis，B.et al.，Cell 57∶1101-1107，1989)檢測細(xì)胞磷酸酪氨酸的量。將結(jié)果與在沒有試驗化合物，或有或沒有已知的R-PTP酶活化劑條件下獲得的結(jié)果相比較。在這些研究中，也可在酪氨酸激酶活化劑存在下檢測試驗化合物的作用。
刺激PTP酶活性的化合物將會凈減少磷酸酪氨酸的量，而抑制PTP酶活性的化合物則導(dǎo)致磷酸酪氨酸量的凈增加。
就作為酪氨酸激酶的生長因子受體如表皮生長因子(EGF)和血小板衍生的生長因子(PDGF)的受體來說，酪氨酸磷酸化作用是與細(xì)胞生長和致癌基因轉(zhuǎn)化相聯(lián)系的?；罨疨TP酶以導(dǎo)致其去磷酸化，將作為反向調(diào)節(jié)機(jī)制以阻止或抑制細(xì)胞生長，并可作為內(nèi)源性調(diào)節(jié)機(jī)制對抗腫瘤。因此，該受體/酶系統(tǒng)的突變或失調(diào)可增進(jìn)對腫瘤的易感性。
胰島素受體也是一種酪氨酸激酶，并且酪氨酸在攜帶胰島素受體之細(xì)胞內(nèi)的磷酸化作用是與正常生理功能聯(lián)系在一起的。與細(xì)胞生長和腫瘤生長的情況相反，活化PTP酶將抵消胰島素的作用。亞正常PTP酶水平或酶促活性可消除正常的反向調(diào)節(jié)機(jī)制。
雖然如此，但也許更為重要的是，可預(yù)料如果PTP酶活性過高或受到不適當(dāng)?shù)幕罨?，則將會抑制或完全阻止胰島素對細(xì)胞的作用，而導(dǎo)致糖尿病(或胰島素抗性改變)。
因此，對糖尿病的易感性可能與PTP酶失調(diào)有關(guān)聯(lián)。另外，將胰島細(xì)胞中表達(dá)的酪氨酸磷酸酶識別為自家抗原，可作為由自家免疫機(jī)制引起之細(xì)胞破壞的后果，導(dǎo)致糖尿病。在這種情況下，可使用這些磷酸酶的重組細(xì)胞外區(qū)域阻斷自家抗體與胰島細(xì)胞表面上表達(dá)之磷酸酶的結(jié)合，從而提供直接的治療效果。
因此，本發(fā)明的檢測與細(xì)胞或組織相關(guān)聯(lián)之PTP酶活性量的方法，可以作為鑒定機(jī)體對于與細(xì)胞磷酸酪氨酸代謝改變相關(guān)聯(lián)之腫瘤、糖尿病、或其他疾病的易感性的方法。從在腦中特別是在分化中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中特異性表達(dá)PTP35的角度來看，PTP35活性的調(diào)節(jié)作用可能在神經(jīng)元細(xì)胞分化和存活中是很重要的。因為已報導(dǎo)腦中的胰島素受體分布與酪氨酸殘基磷酸化的蛋白質(zhì)的定位相對應(yīng)，所以在腦中特異性表達(dá)的酪氨酸磷酸酶如PTP35的作用，可能在調(diào)節(jié)該組織內(nèi)胰島素受體酪氨酸激酶中有著重要意義。
基于上述考慮，本發(fā)明一個實施方案是關(guān)于鑒定能夠刺激或抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)之酶促活性之化合物的方法，其包括(a)化合物與純形式的，或膜制劑形式的，或呈活的或固定化全細(xì)胞形式的蛋白質(zhì)接觸;
(b)將步驟(a)中的混合物保溫足夠時間;
(c)檢測蛋白質(zhì)的酶促活性;
(d)將此酶促活性與在不加化合物保溫時測得的蛋白質(zhì)的酶促活性相比較，從而確定化合物是否可刺激或抑制該活性。
本發(fā)明包括能夠與本發(fā)明的PTP酶或其衍生物結(jié)合的抗體?？贵w可以是單克隆或多克隆的。該抗體可用于診斷涉及本發(fā)明PTP酶的疾病。
生產(chǎn)單克隆和多克隆抗體的方法是已知的。生產(chǎn)多克隆抗體的方法包括用本發(fā)明的PTP酶或其衍生物免疫適當(dāng)?shù)乃拗鲃游锶鐚嶒瀯游?，并從免疫血清中分離免疫球蛋白。因此，可用PTP酶或衍生物接種動物，然后從動物體內(nèi)采血并純化IgG部分。生產(chǎn)單克隆抗體的方法包括使產(chǎn)生所需抗體的細(xì)胞永久存活?？墒贡唤臃N之實驗動物的脾細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞(Kohler andMilstein，Nature 256∶495-497，1975)。
可用常規(guī)方法選擇能產(chǎn)生所需抗體的永久存活的細(xì)胞?？墒闺s交瘤生長于培養(yǎng)物中或經(jīng)腹腔注射到宿主體內(nèi)以形成腹水或注入同種異型宿主或免疫感受宿主的血流中。可在體外免疫人淋巴細(xì)胞，然后用Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞以制備人抗體。
為生產(chǎn)單克隆和多克隆抗體，所用實驗動物可以是羊、兔、大鼠或小鼠。如必要時，可將本發(fā)明的PTP酶或其衍生物作為結(jié)合物給藥，其中將PTP酶或衍生物例如通過其氨基酸殘基之一的側(cè)鏈偶聯(lián)到適當(dāng)?shù)妮d體多肽上。載體分子一般是生理學(xué)上可接受的載體?？煞蛛x并根據(jù)需要純化所得到的抗體。
本發(fā)明包括檢測試驗樣品中本發(fā)明PTP酶或衍生物的方法，該方法包括使試驗樣品與本發(fā)明的抗體接觸，并檢測與PTP酶或其衍生物結(jié)合之抗體的量。該方法可用于診斷與本發(fā)明的PTP酶有關(guān)的疾病。
可使用ELISA(酶聯(lián)免疫檢測法)方法，如非競爭性ELISA進(jìn)行檢測。一般說來，ELISA方法包括下述步驟(ⅰ)將根據(jù)本發(fā)明的未標(biāo)記的抗體固定于固相載體上，(ⅱ)加入含有待檢PTP酶或其衍生物的試驗樣品，以使PTP酶或其衍生物被未標(biāo)記的抗體俘獲，(ⅲ)加入已標(biāo)記的根據(jù)本發(fā)明的抗體，和(ⅳ)檢測已結(jié)合的被標(biāo)記抗體的量。
適當(dāng)?shù)目贵w標(biāo)記物的例子包括生物素(其可用與過氧化物酶結(jié)合的抗生物素蛋白檢測)和堿性磷酸酶。
可用Western吸印法檢測本發(fā)明的PTP酶或衍生物。此方法可包括下列步驟(ⅰ)對含有PTP酶或其衍生物的試驗樣品進(jìn)行凝膠電泳分離，(ⅱ)以吸印法將在凝膠中分離的RNA分子轉(zhuǎn)移到固相載體(如硝化纖維素載體)上，和(ⅲ)使已被標(biāo)記的根據(jù)本發(fā)明的抗體與PTP酶或其衍生物結(jié)合。
本發(fā)明包括檢測試驗樣品中編碼本發(fā)明之PTP酶或其衍生物的mRNA的方法，該方法包括使存在于試驗樣品中的mRNA與基本上由圖1中所示順序組成的DNA探針雜交，并檢測所得DNA∶mRNA雜交體的量。
亦可用Northern吸印法檢測mRNA，該方法包括下列步驟(ⅰ)對含有編碼本發(fā)明PTP酶或其衍生物之mRNA的試驗樣品進(jìn)行凝膠電泳分離，(ⅱ)將在凝膠中分離的RNA分子吸印轉(zhuǎn)移到固相載體(如硝化纖維素載體)上，(ⅲ)使DNA探針與mRNA雜交，和(ⅳ)檢測已雜交之DNA探針的量。
在了解了本發(fā)明的總的特征后，可通過參考下列實施例更容易地理解本發(fā)明。下述實施例只是舉例說明而不是限制本發(fā)明。
圖1PTP35的順序。其中顯示了cDNA克隆PTP35，11(圖1a)和PTPT35，12(圖1b)的順序，連同主要開放讀碼的翻譯。DNA順序方框內(nèi)是假定的ATG(克隆11)和CTG(克隆12)起始密碼子，以及TGA終止密碼子。蛋白質(zhì)順序RGD特征，方框內(nèi)是假定的跨膜肽和酪氨酸磷酸酶相符主順序。
圖2，A框?qū)Σ煌∈蠼M織中PTP35的Northern印跡分析。使用質(zhì)粒PTZ-PTP35中的SalI-EcoRI片段作探針，對20μg小鼠組織的總RNA進(jìn)行Northern印跡分析。泳道1，肝;泳道2，脾;泳道3，心;泳道4，腦。標(biāo)出了28S和18S核糖體RNA的位置。示出RNA轉(zhuǎn)移印跡前凝膠的照片，證明各泳道有相等的上樣量。B框在大鼠腦中表達(dá)PTP35。使用質(zhì)粒PTZ-PTP35中的SalI-EcoRI片段作探針，對10μg從培養(yǎng)2天(泳道1)和8天(泳道2)的大鼠小腦顆粒神經(jīng)元(cerebellum granules neurons)得到總RNA進(jìn)行Northern印跡分析。標(biāo)出了28S和18S核糖體RNA的位置。經(jīng)使同一濾膜再次與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)探針雜交，證實各泳道有相等的上樣品。
圖3，A框Swiss NIH 3T3細(xì)胞的生長曲線。在添加10%FCS的DMEM培養(yǎng)基中以103細(xì)胞/Cm2的密度接種3T3細(xì)胞并培養(yǎng)之。每天用胰酶消化細(xì)胞單層并計數(shù)。B框細(xì)胞生長期間PTP35 mRNA水平的時間過程。使用質(zhì)粒PTZ-PTP35中的SalI-EcoRI片段作探針，以Northern印跡雜交法分析20μg從每天收獲的細(xì)胞中制得的總RNA。標(biāo)出了28S和18S核糖體RNA的位置。經(jīng)再次與肌動蛋白探針雜交進(jìn)一步證實所有泳道均有同樣的上樣量。
圖4，A框bFGF對3T3細(xì)胞中PTP35mRNA之誘導(dǎo)作用的動力學(xué)。不用或用30ng/mlbFGF(+)處理細(xì)胞，在用bFGF處理后不同時間從細(xì)胞中制備總RNA并進(jìn)行Northern印跡雜交分析。在加入bFGF后24小時最大程度地誘導(dǎo)了PTP35mRNA。經(jīng)再次與肌動蛋白探針雜交，進(jìn)一步證實所有泳道均有相同的上樣量。示出了28S和18S核糖體RNA的位置。B框PTP35 mRNA誘導(dǎo)的特異性。處理后24小時對總RNA進(jìn)行Northern印跡分析。泳道1，對照;泳道2，加30ng/mlbFGF;泳道3，加30ng/ml bFGF和10μg/ml放線菌酮;泳道4，加10μg/ml放線菌酮;泳道5，加10ng/ml PDGF;泳道6，加10ng/ml PDGF和10μg/ml放線菌酮。經(jīng)再次與肌動蛋白探針雜交，進(jìn)一步證明所有泳道有相等的上樣量。
圖5，PTP35細(xì)胞外區(qū)域的表達(dá)。顯示用pRI T33(泳道1)和pRIT33-PTP35XC轉(zhuǎn)化的(泳道2)或未轉(zhuǎn)化的(泳道3)HB101細(xì)胞之總細(xì)胞提取物的10%SDS-PAGE分析結(jié)果。標(biāo)出了相當(dāng)于蛋白A(約33KDa)和蛋白A-PTP35XC(約75KDa)之帶的位置。
圖6，PTP35細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的表達(dá)。顯示PTP35細(xì)胞內(nèi)區(qū)域之表達(dá)和純化的10%SDS-PAGE。將超聲處理后的可溶性細(xì)胞提取物與谷胱甘肽瓊脂糖樹脂一起保溫，徹底清洗后與凝血酶一起保溫。在從樹脂上釋放后，收集培養(yǎng)基中的基本上純的可溶性PTP35細(xì)胞內(nèi)區(qū)域。泳道1，分子量標(biāo)志物;泳道2，可溶性細(xì)胞提取物，泳道3，洗滌培養(yǎng)基;泳道4，加入凝血酶后的等分樹脂樣品;泳道5，純的可溶性PTP35細(xì)胞內(nèi)區(qū)域。箭頭指示GST-PTP35融合體(泳道2)或成熟的PTP35細(xì)胞內(nèi)區(qū)域(泳道5)。
實施例1分離和分析小鼠PTP35cDNA克隆聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增并鑒定PTP35克隆按常規(guī)方法(Maniatis，T.，F(xiàn)risch，E.F.and Sambrook，J.，Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989)從活躍生長的Swiss3T3成纖維細(xì)胞(ATCCCCL92)中制備總RNA。使用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Boehringer Mannheim)以10μg總RNA合成第一股cDNA，并使用2個編碼保守磷酸酶順序的簡并的引物，以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴(kuò)增之。包含SalI限制性位點的有意義引物1(5′AAG CTT CTG CAG GTC GAC TTT/CTGG GAA/G ATG GT/A/C/T/G TGG CA 3′)之后是編碼保守的氨基酸FWEMVWE的簡并序列。包含互補(bǔ)于保守之氨基酸VHCSAGA的互補(bǔ)引物4(5′CGA ATT CGG TAC CGG ATC CTG CCC CGG CAC TGC AGT GCA C 3′)之后是EcoRI限制性位點。使用Taq聚合酶(Perkin-Elmer)，以兩個引物擴(kuò)增來自生長之3T3細(xì)胞的第一股cDNA鏈。退火溫度為55℃，且聚合反應(yīng)于72℃下進(jìn)行。使用Perkin-Elmer熱循環(huán)器進(jìn)行40次擴(kuò)增反應(yīng)。
用SalI/EcoRI切割有預(yù)定的約360bp大小的擴(kuò)增片段，并再克隆利用同樣酶切割的質(zhì)粒PTZ19R(購自Pharmacia;參見Protein Engineering 1∶67，1986和Proc.Natl.Acad.Sci.854832，1988)中。使用序列酶(Sequenase)(United States Biochemicals)直接對雙股DNA分析不同重組質(zhì)粒的序列。按標(biāo)準(zhǔn)序列制備質(zhì)粒PTZ-PTP35的DNA并用SalI和EloRI酶切割之。用已描述的凝膠電泳和電洗脫法(Maniatis，T.，F(xiàn)risch，E.F.and Sambrook，J.Molecular Cloning.A laboratory manual.Cold Spring Harbour Laboratory，Cold Spring Harbour，NY，1989)純化相當(dāng)于磷酸酶DNA插入段的360bp片段。
文庫篩選為了得到PTP35的完整DNA順序，在5×SSC、5×Denhardts、0.1%SDS、250mg/ml鮭精子DNA中于65℃雜交過夜，以高嚴(yán)緊度篩選NIHSwiss 3T3成纖維細(xì)胞cDNAλZapⅡ文庫(Stratagene，LaJolla，USA)。用已按隨機(jī)引導(dǎo)方法進(jìn)行32P標(biāo)記的得自質(zhì)粒pTZ-PTP35的360bp SalI/EcoRI片段作為探針(2×106cpm/ml)。于65℃在1×SSC、0.1%SDS中洗滌。從2×105個克隆中選出7個陽性克隆并進(jìn)一步分析其特性。按制造商(Stratagene，La Jolla，USA)所述方法，從選擇的克隆上切掉重組pBluescript SK-質(zhì)粒的DNA并進(jìn)行EcoRI消化，以證實其中的插入段的存在和大小。使用二脫氧核苷酸鏈終止法(Sequenase，United States Biochemical;Proc.Natl.Acad.Sci.74∶5463-5476，1977)和通用的正向和反向引物直接測定不同克隆之雙股DNA的順序。根據(jù)限制性酶切圖及順序交迭分析結(jié)果，確定重組質(zhì)粒中EcoRI片段的相對次序及定向。使用內(nèi)部順序分析引物以兩個方向測定所有區(qū)域的順序。發(fā)現(xiàn)所有已定出順序的克隆均含有同樣順序的部分。還進(jìn)一步證實了用PCR所獲得之片段的順序。圖1a和1b中示出了兩個最長的克隆PTP35，11和PTP35，12的順序。
分析克隆PTP35，11的順序使用Geneworks程序(Intelligenetics，CA)進(jìn)行核苷酸順序分析。轉(zhuǎn)譯cDNA克隆PTP35，11中所含有的順序后，發(fā)現(xiàn)存在有推測在核苷酸505處轉(zhuǎn)譯起始的編碼790個氨基酸的主要開放讀碼(在核苷酸124處，381核苷酸上游存在有碼內(nèi)終止密碼子)。基于在氨基酸388和408之間存在有疏水段，而將此蛋白質(zhì)分類為跨膜蛋白質(zhì)。推測的蛋白質(zhì)細(xì)胞內(nèi)部分由表現(xiàn)與先前描述的跨膜磷酸酶的細(xì)胞內(nèi)催化區(qū)有顯著同源性的獨特區(qū)域組成。已提示作為磷酸酶催化位點之一部分的保守序列VHCSDG存在于PTP35中。因為沒有催化區(qū)的重復(fù)出現(xiàn)，所以蛋白質(zhì)PTP35屬于Ⅱ類酪氨酸磷酸酶。
分析克隆PTP35，12的順序使用Geneworks程序(Intelligenetics，CA)分析克隆PTP35，12的順序。發(fā)現(xiàn)該順序相當(dāng)于PTP35之克隆11從核苷酸279至末端的順序，但可能由于可替代的拼接而使兩順序在其5′末端有所不同。
轉(zhuǎn)譯包含于cDNA克隆PTP35，12中的順序后，發(fā)現(xiàn)存在一個編碼961個氨基酸的主要開放讀碼，推測轉(zhuǎn)譯起始于核苷酸157處的CTG密碼子(在核苷酸99處，58核苷酸上游存在一個碼內(nèi)終止密碼子)?；谠诎被?59和579之間存在有疏水段，而將此蛋白質(zhì)分類為跨膜蛋白質(zhì)。推測的細(xì)胞外區(qū)域編碼558個氨基酸并包含作為真核細(xì)胞分泌信號順序的短的17氨基酸疏水順序，且后者可由計算機(jī)識別出來。其后將在氨基酸18處開始克隆PTP35，12中編碼的成熟PTP35分子。相當(dāng)于克隆PTP35，11中編碼之分子的推測的細(xì)胞內(nèi)部分由表現(xiàn)出與先前描述的跨膜磷酸酶之細(xì)胞內(nèi)催化區(qū)有顯著同源性的獨特區(qū)域組成。氨基酸886至899間的順序IIVHCSDGAGRTG與PTP酶活性的同感順序相匹配。
實施例Ⅱ分析PTP35 mRNA的表達(dá)組織中的PTP35 mRNA分布每泳道使用20μgRNA，按照標(biāo)準(zhǔn)程序(Maniatis，T.et al.，文獻(xiàn)同上)對得自小鼠脾、心、腦和肝細(xì)胞的總RNA(購自Clonetech，CA)進(jìn)行Northern印跡分析。使用文庫篩選中所用的SalI/EcoRI片段作探針(2×106cpm/ml)在50%甲酰胺、5×SSC、1×Denhardt′s，0.1%SDS和250mg/ml鮭精子DNA中于42℃雜交過夜。42℃下，在1×SSC、0.1%SDS中洗滌。高嚴(yán)緊度洗滌并沒有顯著地影響雜交結(jié)果。
Northern分析(圖2，A框)揭示了小鼠組織內(nèi)，特別是腦組織內(nèi)PTP35表達(dá)的高特異性特征。在該組織中，除了以高水平表達(dá)約3200bp的mRNA外，還以較低水平表達(dá)約1400bp的較小的第二種mRNA。
分析PTP35mRNA調(diào)節(jié)作用基于PTP35在小鼠腦內(nèi)的特異性表達(dá)，研究大鼠小腦顆粒神經(jīng)元中PTP35mRNA的表達(dá)。按已述方法(A.Frandsenand A.SchousboeInt.J.of Dev.Neurosci，8(2)209-216，1990)從大鼠腦組織中分離初級細(xì)胞。在35mm平皿中以3×106個細(xì)胞/平皿接種細(xì)胞并培養(yǎng)8天。在第2天(分化差)和第8天(分化狀態(tài)好)收獲細(xì)胞，分離總RNA并按上述方法(Maniatis，T.et al.，文獻(xiàn)同上)進(jìn)行Northern印跡雜交。使用通常的雜交和洗滌條件(參見上文)。用SalI/EcoRI PTP35片段作為探針(2×106cpm/ml)。如圖2B所示，大鼠小腦顆粒神經(jīng)元可以高水平表達(dá)如小鼠腦組織中表達(dá)的同樣大小(約3200bp)的PTP35mRNA。在分化狀態(tài)良好、長出伸展的軸突并且在細(xì)胞與細(xì)胞有相互連接的細(xì)胞中表達(dá)水平較高，此提示PTP35與大鼠小腦顆粒神經(jīng)元分化和存活有關(guān)。分析了生長的NIH3T3細(xì)胞中對PTP35mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。在添加10%胎牛血清(FCS)(Gibco)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)中以低密度(103個細(xì)胞/cm2)接種NIH3T3細(xì)胞并培養(yǎng)7天。每隔一天換一次培養(yǎng)基。每天從兩個平皿中胰酶處理后收獲細(xì)胞樣品并計數(shù)。圖3，A框顯示了3T3細(xì)胞的生長曲線。同時每天收獲細(xì)胞并制備總RNA，然后按已述方法(Maniatis，T.et al.，文獻(xiàn)同上)使用每泳道20μgRNA進(jìn)行Northern印跡分析。使用SalI/EcoRI PTP35片段作探針(2×106cpm/ml)，在標(biāo)準(zhǔn)條件(見上文所述)下進(jìn)行雜交。圖3，B框內(nèi)顯示了Northern印跡雜交的結(jié)果。其中可看到在小鼠和大鼠腦中觀察到的同樣大小(約3200bp)有優(yōu)勢信號的mRNA。
分析從不同培養(yǎng)天數(shù)之細(xì)胞制得的mRNA的穩(wěn)定態(tài)水平，表明PTP35mRNA表達(dá)與細(xì)胞生長有著直接的關(guān)聯(lián)。在生長活躍的細(xì)胞中觀察到最大mRNA水平，而在合會的、靜止期3T3細(xì)胞上則可見表達(dá)水平降低以至很少或不表達(dá)，這表明PTP35參予對細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)。
檢查堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)刺激對NIH3T3細(xì)胞中PTP35mRNA水平的影響。將細(xì)胞以半會合濃度(3×104個細(xì)胞/cm2)接種在DMEM+10%FCS中，并在DMEM培養(yǎng)基+0.4%FCS中保溫24小時。然后加入30ng/mlbFGF并定時收獲經(jīng)如此處理的細(xì)胞和未處理的對照組細(xì)胞。制備總RNA并按已述方法(Maniatis，T.et al.，文獻(xiàn)同上)使用PTP35 SalI/EcoRI片段作探針進(jìn)行Northern印跡分析。雜交條件同樣是一般常用的。如圖4所示，bFGF刺激后PTP35mRNA穩(wěn)定態(tài)水平提高，并在24小時后達(dá)到峰值。當(dāng)于10μg/ml放線菌酮存在下進(jìn)行bFGF刺激時，這一作用沒有受到抑制。在用血小板衍生的生長因子(PDGF)和血清刺激后，也觀察到同樣的作用。
實施Ⅲ在原核細(xì)胞中表達(dá)PTP35載體pRIT33(可得自Pharmacia;參見Methods in Enzy mology 185∶144-161，1990)是質(zhì)粒pRIT2的衍生物，并且是為了在誘導(dǎo)λPr啟動子后在大腸桿菌中溫度可誘導(dǎo)性表達(dá)細(xì)胞內(nèi)雜交蛋白質(zhì)而設(shè)計的。另外，可用1mMIPTG誘導(dǎo)已插入到λPr啟動子上游lacUV5啟動子而獲得表達(dá)。該構(gòu)建體含有處于λPr啟動子控制下的葡萄球菌蛋白A的IgG結(jié)合區(qū)。多克隆位點有利于在蛋白A的3′側(cè)插入外來基因。在蛋白A編碼順序的末端存在有編碼因子X之識別位點的順序。蛋白A轉(zhuǎn)錄終止順序被插入到緊接多克隆位點的下游處。為了得到蛋白A-PTP35融合體蛋白質(zhì)，將編碼PTP35蛋白質(zhì)的順序插入到質(zhì)粒pRIT33中。從質(zhì)粒PTP35，4(其為篩選實施例1中所述文庫后分離的一個克隆)中重新得到PTP35順序。PTP35，4相當(dāng)于含有以下述方式定向之PTP35編碼順序的質(zhì)粒pB luescript SK-其5′末端的前面是多聚接頭的BamHI位點，且其3′末端之后是多聚接頭的SalI位點。從質(zhì)粒PTP35，4中分離一個包含PTP35編碼順序的均3000bp的StuI-SalI片段(圖1b，克隆12的核苷酸590至3561)，并再克隆到已用SmaI和SalI切割的質(zhì)粒pRIT33中。將SmaI和StuI平頭連接在一起，從而使PTP35順序直接接在pRIT33中的因子X識別順序之后，而得以在碼內(nèi)有適當(dāng)?shù)亩ㄎ?。所得質(zhì)粒pRIT33-PTP35攜帶一個編碼120KDa融合體蛋白質(zhì)的開放讀碼，所說的融合體蛋白質(zhì)包含N末端的蛋白A，其后是由原核細(xì)胞裂解所需之特定順序分隔開的PTP35蛋白質(zhì)。
此外，亦可在大腸桿菌中作為蛋白A融合蛋白質(zhì)分別表達(dá)包含397個氨基酸的PTP35的細(xì)胞外區(qū)域部分。為了分離編碼該區(qū)域的順序，用NcoI切割質(zhì)粒PTP35，4并用Klenow DNA聚合酶充填突出的末端以得到平頭末端。然后用StuI切割該質(zhì)粒并將帶有平頭末端的1200bp片段(相當(dāng)于克隆PTP35，12的核苷酸590至1804)再克隆到用SmaI切割并去磷酸化的質(zhì)粒pRIT33中。所得質(zhì)粒pRIT33-PTP35XC攜帶一個編碼約75KD蛋白質(zhì)的開放讀碼，所說的蛋白質(zhì)包括蛋白A和其后的由原核裂解特異性順序分開的PTP35細(xì)胞外區(qū)域氨基酸。
在用包含λPR啟動子之熱敏感性阻遏物(Nilsson，B.and Abrahmsen，L.，Methods in Enzymology 185∶144-161，1990)的稱為pRITc1857的相容性質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化的HB101大腸桿菌細(xì)胞(J.Mol.Biol.41∶454，1969)中分析蛋白A-PTP35XC融合體蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。
將溫度從30℃改變到42℃(熱休克)以使阻遏物失活并從而誘導(dǎo)啟動子開始轉(zhuǎn)錄。另外亦可在用1mM IPTG誘導(dǎo)lacUV5啟動子后獲得表達(dá)。因為該啟動子從不會完全靜止，所以在30℃下長時間培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的克隆也可高水平地表達(dá)蛋白質(zhì)。圖5顯示了在30℃下生長3天后所達(dá)到的融合蛋白質(zhì)表達(dá)水平。當(dāng)在這些條件下生長時，蛋白A-PTP35XC融合體蛋白質(zhì)的量約占總細(xì)胞蛋白質(zhì)的20%。如所期望的，雜交蛋白質(zhì)在SDS-PAGE上的表觀分子量為75KD。
實施例Ⅳ在原核細(xì)胞中表達(dá)PTP35磷酸酶區(qū)域為了在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白質(zhì)，已設(shè)計了pGEX系列的質(zhì)粒(可購自Pharmacia;參見Smith，D.and Kevin，J.(1988)Gene 67∶31-40)，其中所說的重組蛋白質(zhì)是作為與Sj26即由寄生蠕蟲日本血吸蟲編碼的26KD谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的C末端形成的融合體表達(dá)的。可在非變性條件下，在固相化谷胱甘肽柱上的親和層析法從粗制細(xì)菌溶胞產(chǎn)物中純化這些融合體蛋白質(zhì)。此外，已對載體進(jìn)行了基因工程操作，從而可在用位點特異性蛋白酶如凝血酶消化后從融合體蛋白質(zhì)上裂解掉GST載體，以得到實際上純的有用的成熟重組多肽。
為了得到GST-PTP35PTP酶區(qū)域，分別用含有BamHI和Eco RI位點的5′和3′引物，以PCR擴(kuò)增編碼假定之細(xì)胞內(nèi)區(qū)域(克隆PTP35，12中編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸583-961)的順序。然后將此順序插入已用同樣的酶切割的質(zhì)粒pGKX-2T中。所得到的稱為pFC221的質(zhì)粒編碼一個約70KD的融合蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)由氨基末端的GST和其后PTP35的穩(wěn)定的PTP酶區(qū)域組成?？砂匆咽龇椒?Smith，D.and Kevin，J.(1988)Gene67∶31-40)在用IPTG誘導(dǎo)后在DH52菌株中高水平表達(dá)此融合蛋白質(zhì)。為了純化PTP35的PTP酶區(qū)域可將超聲處理細(xì)胞后得到的可溶性溶胞產(chǎn)物與瓊脂糖-谷胱甘肽樹脂(Pharmacia，Sweden)一起保溫。保溫后，徹底洗滌樹脂以除去非特異性結(jié)合，再與催化活性量的凝血酶一起保溫以從結(jié)合于樹脂上的GST部分中釋放掉PTP酶區(qū)域。然后收集有可溶性PTP酶區(qū)域的保溫培養(yǎng)基，加入40%甘油后將酶等分并于-80℃下冷凍保存。圖6中顯示了一個表達(dá)并在瓊脂糖-谷胱甘肽樹脂柱上純化GST-PTP35PTP酶區(qū)域的實例。
權(quán)利要求
1.其細(xì)胞外區(qū)域包括Arg-Gly-Asp順序的哺乳動物受體型蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTP酶)或其功能衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的PTP酶，其為天然來源的，并且基本上沒有與之天然有關(guān)聯(lián)的其他蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的PTP酶，其基本上具有圖1a或1b中所示的氨基酸順序或其功能衍生物。
4.包含與載體多肽融合的根據(jù)權(quán)利要求1，2或3的PTP酶或其功能衍生物的融合蛋白質(zhì)。
5.基本上由編碼根據(jù)權(quán)利要求1之PTP酶或其功能衍生物的核苷酸順序組成的DNA分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的DNA分子，其為cDNA分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的DNA分子，其為基因組DNA分子。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項的DNA分子，其中編碼載體多肽的核苷酸順序連接到所說的編碼PTP酶或其功能衍生物的順序上。
9.根據(jù)權(quán)利要求4的融合蛋白質(zhì)或根據(jù)權(quán)利要求8的DNA分子，其中載體多肽包括一個或多個葡萄球菌蛋白A的IgG結(jié)合區(qū)。
10.含有根據(jù)權(quán)利要求5至9中任一項的DNA分子的表達(dá)載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的宿主，其為真核宿主。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的宿主，其為原核宿主。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的宿主，其為大腸桿菌。
15.制備根據(jù)權(quán)利要求1的PTP酶或其功能衍生物的方法，該方法包括(ⅰ)提供處于能使PTP酶或其功能衍生物得以表達(dá)之條件下的根據(jù)權(quán)利要求11至14中之任一項的宿主;和(ⅱ)純化如此得到的PTP酶或其功能衍生物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所說的宿主是按下述步驟制備的(a)分離基本上由編碼所說的PTP酶或其功能衍生物的核苷酸順序組成的DNA分子;(b)將所說的DNA分子插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中;和(c)用所說的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗鳌?br> 17.鑒定能刺激或抑制根據(jù)權(quán)利要求1，2或3的PTP酶或其功能衍生物之酶促活性的化合物的方法，該方法包括(a)使化合物與純的膜制劑或完整的活的或固定的細(xì)胞形式的PTP酶或其功能衍生物接觸;(b)將步驟(a)的混合物保溫足夠長時間;和(c)將步驟(a)之混合物的酶促活性與不加化合物保溫的PTP酶或其功能衍生物的酶促活性相比較，從而確定該化合物是否刺激或抑制上述活性。
18.能夠與根據(jù)權(quán)利要求1，2或3的PTP酶或其功能衍生物結(jié)合的多克隆或單克隆抗體。
19.檢測試驗樣品中的根據(jù)權(quán)利要求1的PTP酶或其功能衍生物的方法，該方法包括使試驗樣品與根據(jù)權(quán)利要求18的抗體接觸，并檢測結(jié)合到PTP酶或其功能衍生物上的抗體的量。
20.檢測試驗樣品中的編碼根據(jù)權(quán)利要求1的PTP酶或其功能衍生物之mRNA的方法，該方法包括使存在于試驗樣品中的mRNA與基本上由圖1所示順序組成的DNA探針雜交，并檢測所得DNA∶mRNA雜交體的量。
全文摘要
其細(xì)胞外區(qū)域包含Arg-Gly-Asp順序的哺乳動物受體型蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTP酶)或其功能衍生物。這類PTP酶的例子是II類PTP酶的新成員。
文檔編號C12N9/16GK1082110SQ9310907
公開日1994年2月16日 申請日期1993年7月27日 優(yōu)先權(quán)日1992年7月31日
發(fā)明者L·莫那科, A·艾薩奇 申請人:法米塔利亞·卡洛·埃巴有限責(zé)任公司