專利名稱：具有免疫刺激活性的葡聚糖的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到具有免疫刺激活性的葡聚糖，以及其制備方法和含有此類葡糖的藥品。
葡聚糖是一種多糖，存在于真菌，尤其是酵母的細(xì)胞壁中。
不同來(lái)源(如不同種類的微生物)的葡聚糖其性質(zhì)各異，甚至提取過(guò)程以及對(duì)上述微生物的處理方法也不同。其中包括培養(yǎng)保存條件及最終產(chǎn)生的不同產(chǎn)物。這些區(qū)別既可能是由于多糖鏈的三維結(jié)構(gòu)，鏈中吡喃葡萄糖苷單元的不同，也可以是由于葡聚糖的生物活性以及在通?；蚨嗷蛏匐y以提純粗品中存在的非葡聚糖的緣故。
現(xiàn)已來(lái)源于嗜熱釀酒酵母或香茹的葡聚糖都具有主要為β-1，3吡喃葡萄糖苷鍵的分枝結(jié)構(gòu)。
上述葡聚糖作為特別研究的原因在于它們具有抗腫瘤及抗細(xì)菌活性(Int.J.Cancer24，773-779(1997);Int.J.Immunopharmacol.Vol.7No.5，747-751(1985))。另外，它們還展示出體內(nèi)體外的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，以及產(chǎn)生一種放射保護(hù)作用(Rev.Microbiol.Vol.15，87-96，1987;Methods and Finding8 Explt.Pharmacol.Vol.8，No.3，151-156(1986))。
也可以從白色念珠菌中得到葡聚糖，并且其免疫調(diào)節(jié)作用也已有研究(J.Gen.Microbiol.Vol.134，1265-74(1958))。
專利EP-A-0416343(16，08，1990)表明了從白色念珠菌ATCC20955中提取制備的胞壁葡聚糖體至少含有90%的葡聚糖及部分幾丁質(zhì)。
未說(shuō)明制備這種產(chǎn)物的方法及產(chǎn)物的生物性質(zhì)，實(shí)際上只敘述了有助于最終產(chǎn)物制備，提純達(dá)到藥用標(biāo)準(zhǔn)的一種中間產(chǎn)物制備方法，包括消毒處理細(xì)胞，然后在高溫下反復(fù)用氫氧化鈉和乙酸進(jìn)行提取。
美國(guó)專利4992540(12，02，1991)表明了從嗜熱釀酒酵母中提取到的葡聚糖可作為營(yíng)養(yǎng)添加劑。
我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)具有高效免疫刺激活性的葡聚糖由于其不含雜質(zhì)而具有顯著的安全性，而這些雜質(zhì)是經(jīng)常存在于目前使用的類似產(chǎn)品中的。
本發(fā)明葡聚糖產(chǎn)品具有如下特點(diǎn)-β(1-3)鍵與β(1-6)鍵的比例是1∶1;
-幾丁質(zhì)含量按重量占3-5%;
-殘留蛋白質(zhì)含量低于0.3%;
-不含甘露聚糖;
-能增強(qiáng)NK細(xì)胞的體外殺傷細(xì)胞活性。
本發(fā)明葡聚糖產(chǎn)品是從不同種的酵母中獲得的。
盡管在專利EP0416343中提出的白色念珠菌ATCC20955的應(yīng)用已具有優(yōu)先權(quán)，但本發(fā)明葡聚糖產(chǎn)品可從許多不同種念珠菌、酵母或其他的酵母及真菌種類中得到。
本發(fā)明葡聚糖產(chǎn)品從細(xì)胞中的提取方法包括下列步驟a)微生物在低葡萄糖含量的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng);
b)在高于100℃的高壓條件下消毒處理培養(yǎng)物;
c)重復(fù)用氫氧化鈉及稀有機(jī)酸提取;
d)高溫下用去污劑處理提取物。
從a)到c)的過(guò)程與EP0416343中所敘述的極為相似，但(d)卻是新的，可作為本發(fā)明葡聚糖產(chǎn)品的特征之一。
另外，本發(fā)明葡聚糖產(chǎn)品的特征還有比已知的葡聚糖高的免疫刺激活性以及毒性低和具有致免疫活性。
用去污劑高溫處理過(guò)程主要是用1-5%的十二烷基磺酸鈉(SDS)，最適濃度為2%，在適當(dāng)?shù)木彌_液中煮沸1-3小時(shí)，b)步驟最好是在120℃左右的高溫下處理3小時(shí)。
交替使用氫氧化鈉和有機(jī)酸如乙酸提取24小時(shí)，溫度控制在80-100℃。
每一步提取后都用水洗至中性，交替提取時(shí)最好用氫氧化鈉和乙酸重復(fù)兩次，以期適當(dāng)除去可溶性堿性的胞壁葡聚糖及所有細(xì)胞殘留物。
根據(jù)發(fā)明具體化準(zhǔn)則，葡聚糖由白色念珠菌ATCC20955制備，這種菌株已經(jīng)細(xì)胞DNA的限制性多態(tài)性分析，由申請(qǐng)者于1988年8月4日按布達(dá)佩斯條約存放于ATCC。據(jù)悉，最安全與現(xiàn)代的鑒定其生物型的方法是細(xì)胞DNA限制性多態(tài)性分析(DNA restriction fragment lenght polymorphism Magee of al.Mol.Cell.Biol.8，4721，1988)。
菌株的限制性分析資料提供了微生物的基因指紋以區(qū)別于所有其他念珠菌屬的菌種。
菌株的培養(yǎng)、生化及生物學(xué)特征報(bào)告如下培養(yǎng)特征在含玉米粉瓊脂上形成厚垣孢子;
生化特征用葡萄糖和麥芽糖發(fā)酵，產(chǎn)酸產(chǎn)氣;用蔗糖發(fā)酵，只產(chǎn)酸;不用乳糖發(fā)酵。
生物學(xué)特征是家兔與小鼠的致病菌。
將白色念珠菌ATCC20955菌株接種于沙保氏瓊脂培養(yǎng)基上，于28℃，24小時(shí)生長(zhǎng)后，保存于4℃的冰箱中。用于制備時(shí)，酵母在低葡萄糖含量的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)有利于胞壁的產(chǎn)生。例如Winge培養(yǎng)基，含有葡萄糖與酵母提取液，酵母在28℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，控制培養(yǎng)進(jìn)行以確定酵母生長(zhǎng)期，以便獲得葡萄糖與幾丁質(zhì)之比為20∶1的最適效果。
生長(zhǎng)在培養(yǎng)基中的細(xì)胞通過(guò)離心收集后，用無(wú)菌蒸餾水洗三次后以1-2%的濃度混懸于pH5的檸檬酸緩沖液中，再置于121℃的高壓下消毒3小時(shí)，使細(xì)胞得以破碎，使含有甘露聚糖。蛋白質(zhì)、甘露蛋白和大部分細(xì)胞組分釋放并溶解。
離心收集上述沉淀物，懸浮于1%的無(wú)菌氫氧化鈉中(1%-2%)，加熱到100℃并持續(xù)24小時(shí)，而后用無(wú)菌蒸餾水洗沉淀物三次直至中性;接著再以1-2%的濃度混懸于無(wú)菌0.5M的乙酸溶液加熱到80℃并持續(xù)24小時(shí)，再用無(wú)菌蒸餾水洗三次直至中性。
為確保最佳除去所有可能在治療應(yīng)用中帶來(lái)危險(xiǎn)的蛋白質(zhì)成分，應(yīng)對(duì)獲得的葡聚糖進(jìn)一步純化，具體即以濃度1-2%混懸于含有2%SDS的Tris-EDTA巰基乙醇溶液中，煮沸1.5小時(shí)。
產(chǎn)物通過(guò)離心用無(wú)菌蒸餾水洗至除去所有去污劑，得到的葡聚糖在121℃的高壓下消毒30分鐘，最后使其冷干，獲得的產(chǎn)品不溶于水、甲醇、丙酮、甲醚、稀酸及稀堿，部分溶于熱的1M氫氧化鈉(0.06%)，溶于二甲亞砜中;產(chǎn)物含有95-97%的葡聚糖，3-5%的幾丁質(zhì)和低于0.3%的蛋白質(zhì)，(通常為0.1-0.3%)，不含有甘露聚糖。紅外光譜和C13質(zhì)譜(75MHz，72℃)分析表明本聚合物是，是β(1-3)多糖鍵形成長(zhǎng)直鏈，支鏈與主鏈之間以β(1-6)多糖鍵相連，β(1-3)與β(1-6)鍵之比為1∶1，這個(gè)特點(diǎn)也影響到本藥物的生物學(xué)活性。因據(jù)報(bào)導(dǎo)此產(chǎn)品的免疫學(xué)特征可因此比例的改變而呈顯著變化(Jong SC et.al.EOS-J Immunol.Immuro pharmacol.11(3)，115，1991)，從紅外光譜和C13質(zhì)譜中也可明顯得知存在以共價(jià)鍵結(jié)構(gòu)相連的幾丁質(zhì)(Kogan，G.et.al，Biopolymers27，1055，1988)。薄層層板或紙層析顯示有葡萄糖沒(méi)有甘露糖，己糖含量占95-97%。
如此得到的葡聚糖沒(méi)有抗原活性，但具有生物活性，可將其歸類為生物應(yīng)答調(diào)節(jié)物。
特別的是，對(duì)小鼠的研究表明，葡聚糖的給藥可誘導(dǎo)增強(qiáng)由急性、慢性感染的多核白細(xì)胞及激活巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的抗感染活性，也因NK細(xì)胞及激活巨噬細(xì)胞的作用而增強(qiáng)抗腫瘤活性;可有效地增加白細(xì)胞介素，尤其是腫瘤壞死因子-α及白細(xì)胞介素-2的產(chǎn)生;還可加強(qiáng)抗體的應(yīng)答作用。
本品在動(dòng)物不經(jīng)胃腸途徑給藥時(shí)有很高的免疫調(diào)節(jié)活性，且沒(méi)有顯著的副作用;在口服給藥時(shí)，其活性也是十分顯著的，此外，本品對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞的活性也是良好的。
本發(fā)明葡聚糖產(chǎn)品的高純度主要與蛋白質(zhì)含量有關(guān)，較有把握的意見(jiàn)認(rèn)為這種產(chǎn)品分子特別有意義的性質(zhì)在于急性與慢性毒性試驗(yàn)未顯示出任何局部及全身毒性(在小鼠試驗(yàn)中，腹腔注射，半數(shù)致死量大于每千克1000毫克，(LD50＞100)，大鼠口服其LD50＞2000mg/kg，每日重復(fù)靜脈給藥一年，劑量為400mg/kg或250mg/kg，沒(méi)有表性效應(yīng))，另外，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)致突變性、致畸胎性、或任何影響繁殖的因素。
下面的例子將進(jìn)一步闡明本發(fā)明實(shí)例在沙保氏瓊脂斜面上(葡萄糖20%，蛋白胨10%，瓊脂1.5%，溶于蒸餾水，pH6，5%)，白色念珠菌ATCC20955在28℃條件下生長(zhǎng)1-2天，長(zhǎng)到呈古銅色，保存于環(huán)境溫度或4℃，生產(chǎn)時(shí)，將一白金鉺的白色念珠菌瓊脂塊接種到100毫升Winge培養(yǎng)基中，(葡萄糖0.3%，酵母提取液0.1%，溶于蒸餾水中，pH6.5)，置于28℃，并做輕微搖動(dòng)(50rpm)的條件下長(zhǎng)18-24小時(shí)，至生長(zhǎng)靜止期，(大約2，8×108細(xì)胞/毫升，相當(dāng)于干重14毫克/毫升)。
以100毫升的菌培養(yǎng)液種于1000毫升的Winge培養(yǎng)基中，按上述條件保溫培養(yǎng)。
此1000毫升培養(yǎng)液再接種到裝有10升的Winge培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，酵母在28℃下生長(zhǎng)，50rpm輕微攪拌，通氣量為1升/分鐘，維持pH為6.5，直至生長(zhǎng)靜止期(大約在24小時(shí)后達(dá)到2.8-4.8×108細(xì)胞/毫升)，只有在生長(zhǎng)期間可控制檢驗(yàn)酵母細(xì)胞的數(shù)量。
培養(yǎng)基中的細(xì)胞可通過(guò)低速離心(300rpm)30分鐘收集，用無(wú)菌蒸餾水洗三次，再懸于pH5.0的檸檬酸緩沖液中(223克檸檬酸鈉/升蒸餾水)，使?jié)舛冗_(dá)到2-4%，于121℃的高壓下滅菌處理3小時(shí)。
離心收集菌體，并懸于1%的無(wú)菌氫氧化鈉溶液中使?jié)舛葹?-4%，100℃油浴加熱24小時(shí)，離心并以消毒蒸餾水洗滌三次至中性，最后離心(5000rpm)30分鐘，將沉淀重懸于0.5M無(wú)菌乙酸中使?jié)舛冗_(dá)到2-4%，再在80℃的油浴中處理24小時(shí)。
離心沉淀物以無(wú)菌蒸餾水洗三次至中性。
交替用氫氧化鈉和乙酸重復(fù)處理兩次。
離心收集沉淀并懸浮于含有2%十二烷基硫酸鈉(SDS)的Tris-EDTA-巰基乙醇緩沖液中(Thri0.1M，EDTA5mM，巰基乙醇100mM，pH6.5)，濃度為2-4%，煮沸1.5小時(shí)。
然后沉淀物再通過(guò)離心方法用無(wú)菌食鹽蒸餾水洗滌三次，葡聚糖中可能殘留的SDS可通過(guò)溶解于DMSO，再用水抽提法除去。
約1克葡聚糖懸浮于25毫升DMSO中，77℃下攪拌直至完全溶解，輕微攪拌此溶液15分鐘，并加入65毫升的蒸餾水，水的加入會(huì)使葡聚糖沉淀，將混合液輕微攪拌5分鐘，再加入65毫升蒸餾水，以3500rpm離心混合物5分鐘，去除上清液。
進(jìn)一步向沉淀加少量水，并輕微地?cái)嚢瑁貜?fù)整個(gè)步驟直至DMSO水為1∶19，因而整個(gè)步驟是重復(fù)使用了兩倍體積的DMSO/水混合液。
經(jīng)最后洗滌后，離心收集的產(chǎn)物置一盤(pán)中于60℃烘箱中24小時(shí)。
整個(gè)過(guò)程的產(chǎn)率大約是每升發(fā)酵培養(yǎng)液可獲得1.8-2.2克。
將本產(chǎn)品溶于DMSO-d6采用Bruker AC300儀在75MHz及70℃條件下記錄C13質(zhì)譜結(jié)果，經(jīng)綜合分析，103與86ppm相當(dāng)于β(1-3)鍵，60.7與70ppm相當(dāng)于β(1-6)鍵，計(jì)算得知兩種鍵的比例為1∶1。與已知的葡聚糖，如在US4992540和EP0416343(Biopolymers 271055，1988)中提到的此比例相比有很大不同，US499540為65∶35(β1-3∶β1-6)，而EP0416343為35∶65。
按Dubis的方法(Anal.Chem.28，350，1956)測(cè)定的己糖值為96.4%(US4992540中敘述的為96-97%)。
本品在100℃的三氟乙酸中完全酸水解12小時(shí)后，在上行的紙層析(溶劑系統(tǒng)為吡啶∶乙酸乙酯∶水＝2∶5∶7)中顯示出一個(gè)Rf值與葡萄糖相當(dāng)?shù)膯吸c(diǎn)。
按Loury方法計(jì)算的蛋白質(zhì)含量約為0.16%(US4992540中敘述的葡聚糖中蛋白質(zhì)含量為0.78)。
生物活性檢測(cè)根據(jù)文獻(xiàn)(Marcomi.P.et al.Iufeetion and Immunity，50(1)297-303，1985)報(bào)導(dǎo)的方法生產(chǎn)出的葡聚糖，以0.1-1毫克之間的劑量進(jìn)行腹腔注射，在體外實(shí)驗(yàn)前5天，用采用腹腔滲出液和脾細(xì)胞的細(xì)胞懸液進(jìn)行對(duì)YAC-1敏感的抗腫瘤NK細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1與表2，從表中可知本發(fā)明葡聚糖產(chǎn)品的免疫值劑活性明顯高于已知的產(chǎn)品。
綜上所述，藥理學(xué)一般特性及其良好藥理特點(diǎn)-主要指其耐受性和無(wú)過(guò)敏及過(guò)敏性現(xiàn)象-本發(fā)明葡聚糖產(chǎn)品適用于治療腫瘤疾病，細(xì)菌或病毒感染癥，以及任何希望調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的病例為此，本品將制成多種藥用形式以適合于口服、非腸胃用、直腸內(nèi)用或局部使用，例如片劑、膠囊、香粉、糖漿、溶液、小藥水瓶裝、乳狀液、膠狀、噴霧等任何方便形式，日用量由醫(yī)生根據(jù)病情分析及病人本身?xiàng)l件(體重、性別、年齡)決定，劑量為0.1-50mg/kg，分一次或多次服用。
權(quán)利要求
1.具有下述特征的葡聚糖-β(1-3)與β(1-6)鍵之比為1∶1；-幾丁質(zhì)的重量含量為3-5%；-殘留蛋白質(zhì)的含量低于0.3%；-不含甘露聚糖；-增強(qiáng)NK細(xì)胞的體外細(xì)胞毒活性。
2.權(quán)利要求1的葡聚糖可從酵母細(xì)胞中得到。
3.權(quán)利要求2的葡聚糖可從嗜熱釀酒酵母或白色念珠菌中獲得。
4.權(quán)利要求3的葡聚糖可從白色念珠菌ATCC20955中獲得。
5.制備權(quán)利要求1-4的葡聚糖的方法，其包括a)在含低葡萄糖的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物;b)在高于100℃高壓消毒處理細(xì)胞;c)反復(fù)用氫氧化鈉和稀有機(jī)酸提取;d)用去污劑高溫處理提取物。
6.權(quán)利要求5的方法，其中涉及到的去污劑為1-5%的十二烷基硫酸鈉。
7.將權(quán)利要求1-5的葡聚糖用于制備具有免疫刺激活性的藥物。
8.含權(quán)利要求1-5的葡聚糖作主要成份及適宜載體的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及到具有免疫刺激性的葡聚糖，以及其制備方法和含有此類葡聚糖的藥用組合物。
文檔編號(hào)C12P19/04GK1082056SQ9310936
公開(kāi)日1994年2月16日 申請(qǐng)日期1993年8月6日 優(yōu)先權(quán)日1992年8月10日
發(fā)明者A·卡塞尼, F·比思陶尼, P·F·馬考尼, R·格茂戈里 申請(qǐng)人:國(guó)家研究委員會(huì), 高級(jí)衛(wèi)生研究院, 貢薩法姆有限公司