專利名稱：1，6-二磷酸果糖的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種生化藥品的生產(chǎn)方法，特別涉及1，6-二磷酸果糖的生產(chǎn)方法。
1，6-二磷酸果糖，又稱FDP(Fructose-1，6-diphosphate)，是一種重要的有機(jī)磷藥物。目前，國(guó)際上普遍采用葡萄糖的磷酸化進(jìn)行FDP的商業(yè)化生產(chǎn)，利用有機(jī)溶劑甲苯處理酵母細(xì)胞，增強(qiáng)其透性，通過Harden-Young發(fā)酵法合成FDP;德國(guó)《生物化學(xué)》雜志1986年8月期上公開了一種“用戊二醛交聯(lián)酵母細(xì)胞連續(xù)化生產(chǎn)FDP”，它是在上述生產(chǎn)方法基礎(chǔ)上作了適當(dāng)改進(jìn)，利用戊二醛把酶固定在酵母上，以防止酶的滲漏，另外，國(guó)際上也有用中空纖維超濾分離可滲透的底物，以利連續(xù)化生產(chǎn)FDP。
但是，在用上述這些方法生產(chǎn)FDP的過程中，酶流失過大，副產(chǎn)品也多，且工藝流程復(fù)雜、過長(zhǎng)，操作繁瑣。最致命的是FDP的轉(zhuǎn)化率太低，最高只有55%。
本發(fā)明的目的就是采用適當(dāng)?shù)拿讣せ顒┖鸵种苿┱{(diào)控酶反應(yīng)，提高葡萄糖和無(wú)機(jī)磷的轉(zhuǎn)化率以及發(fā)酵單位，簡(jiǎn)化工藝流程，穩(wěn)定質(zhì)量，提高FDP的轉(zhuǎn)化率并降低工業(yè)化生產(chǎn)FDP的成本。
本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)將在下面的說(shuō)明中作進(jìn)一步的闡述。
本發(fā)明的基本原理就是改變細(xì)胞壁透性，使FDP通過細(xì)胞膜進(jìn)入到溶液中，選擇適當(dāng)?shù)慕饘匐x子和AMP/ATP的比例，提高果糖激酶的活性，使FDP不斷積累。
根據(jù)這一原理及技術(shù)方案，制定出如下的生產(chǎn)方法并得以實(shí)現(xiàn)。
實(shí)施例1在150升敞口式發(fā)酵罐或搖瓶里加入100升混合液，該混合液由0.5M 葡萄糖0.2M NaH2PO40.2M Na2HPO44g/l 酵母膏組成，加熱并保溫在35°-37℃，此時(shí)以高活性干酵母12.5kg作底物加入到該混合液中，開動(dòng)攪拌機(jī)攪拌并保溫在36°-38℃;待攪拌均勻后加入1升6%的胞質(zhì)分離劑甲苯，破壞細(xì)胞壁，使FDP從細(xì)胞內(nèi)流到溶液中，溶液成細(xì)胞懸浮液，再加入8g/l氯化鎂，繼續(xù)攪拌，激活酶的活性，使FDP累積速度加快，3小時(shí)30分鐘后停止反應(yīng)，加熱至80℃，滅酶;然后將反應(yīng)液倒入離心機(jī)內(nèi)離心后，得到FDP清液87升，其中含208mMFDP和36mM無(wú)機(jī)磷，F(xiàn)DP對(duì)無(wú)機(jī)磷的得率為90.5%，大大高于其他方法。
實(shí)施例2在150升反應(yīng)罐中加入100升混合液，由0.40M 葡萄糖0.15M 磷酸氫二鈉0.25M 磷二氫鈉4g/l 酵母膏組成，加熱并保溫在35°-37℃，加入高活性干酵母13Kg作底物，攪拌均勻后再加入6-10g/l氯化鎂，攪拌均勻后加入4.5%的Triton X-300，在36°-38℃溫度下攪拌，3小時(shí)后中止反應(yīng)，再加溫至80℃滅酶，離心后得86升FDP清液，每升含有214.5mMFDP和30mM無(wú)機(jī)磷，F(xiàn)DP對(duì)無(wú)機(jī)磷的轉(zhuǎn)化率為92%。
權(quán)利要求
1.1，6--二磷酸果糖的生產(chǎn)方法，其特征在于(1)在敞口式發(fā)酵罐或搖瓶里加入混合液，由0.5M 葡萄糖0.2M Na2HPO40.2M NaH2PO44g/l 發(fā)酵膏組成，加溫在35°-38℃；(2)在上述混合液中加入干酵母，一邊緩慢攪拌，保溫在35-39℃；(3)加入5-6%的胞質(zhì)分離劑甲苯或Triton-X100，使之成細(xì)胞懸浮液；(4)以6-10g/l的Mg離子作酶激活劑加入到細(xì)胞懸浮液中；(5)保持反應(yīng)時(shí)間2小時(shí)45分至3小時(shí)45分；(6)停止反應(yīng)并加熱至80℃，滅酶；(7)將反應(yīng)液送入離心機(jī)里離心，得到FDP清液。
全文摘要
本發(fā)明是一種生化藥品的生產(chǎn)方法，特別涉及1，6—二磷酸果糖(又稱FDP)的生產(chǎn)方法。本方法以高活性干酵母作底物，采用適當(dāng)?shù)拿讣せ顒┖鸵种苿┱{(diào)控酶反應(yīng)，改變細(xì)胞壁透性，使FDP通過細(xì)胞膜進(jìn)入到溶液中，使FDP不斷積累，獲得FDP對(duì)無(wú)機(jī)磷高達(dá)90％以上的轉(zhuǎn)化率。解決了國(guó)內(nèi)外目前生產(chǎn)FDP的方法中酶流失過大、副產(chǎn)品過多、工藝流程復(fù)雜過長(zhǎng)、操作繁瑣以及轉(zhuǎn)化率過低的缺陷。
文檔編號(hào)C12P19/02GK1089654SQ93110528
公開日1994年7月20日 申請(qǐng)日期1993年1月11日 優(yōu)先權(quán)日1993年1月11日
發(fā)明者殷志敏, 應(yīng)漢杰, 歐陽(yáng)平凱 申請(qǐng)人:歐陽(yáng)平凱