專利名稱：感覺神經(jīng)抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵或使用酶的方法以合成所要求的化合物或組合物或從外消旋混合物中分離旋光構(gòu)體，是一種肽或蛋白質(zhì)及其制備，具體地說是一種單克隆抗體及其制備。
周圍神經(jīng)損傷后，若兩斷端的感覺束與運動束互相接錯，再生的神經(jīng)軸索就無法到達功能相同的神經(jīng)終末器，使相應(yīng)部位的皮膚和肌肉收縮功能都喪失。因此，神經(jīng)兩斷端的功能束能否準確對位是神經(jīng)修復(fù)后功能恢復(fù)的重要條件之一。在周圍神經(jīng)的外科修復(fù)中怎樣才能準確、快速、簡便地鑒別功能神經(jīng)束，是骨科與顯微外科、神經(jīng)外科、整形外科以及殘疾與康復(fù)醫(yī)療中極為關(guān)注的課題。
從1954年澳大利亞的Sunder Land最早使用形態(tài)學(xué)法區(qū)別神經(jīng)束性質(zhì)以來，先后出現(xiàn)了電刺激法(Gruber1976)、碳酸酐酶法(Piley 1984)和乙酰膽堿酯酶(Cruber 1976，鐘世鎮(zhèn)1987)等方法。但這些方法屬非特異性顯示法，影響其結(jié)果的可靠性，而且反應(yīng)時間長，因此在臨床推廣應(yīng)用中受到很大的限制，多少年來，國內(nèi)外的學(xué)者一直都在孜孜不倦地鉆研，力求攻克這一難題。
本發(fā)明的目的在于提供一種能特異性地與感覺神經(jīng)結(jié)合，從而能區(qū)分感覺、運動神經(jīng)纖維的感覺神經(jīng)抗體及其制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種感覺神經(jīng)抗體，能特異性地與感覺神經(jīng)相結(jié)合。
一種制備感覺神經(jīng)抗體的方法，包括如下步驟
(a)取作為抗原的哺乳類感覺神經(jīng)特異蛋白;
(b)用抗原免疫小鼠，然后提取小鼠細胞;
(c)將經(jīng)免疫的小鼠的細胞與骨髓瘤細胞融合，并接種、培養(yǎng)克隆;
(d)用細胞免疫化學(xué)法檢測抗體，篩選出只對感覺神經(jīng)元起免疫反應(yīng)的陽性克隆，再經(jīng)有限稀釋法克隆化三次以上，獲得分泌感覺神經(jīng)抗體的雜交瘤細胞株，CCTCCNOC93004分泌出感覺神經(jīng)抗體。
取哺乳類感覺神經(jīng)特異蛋白的步驟是取哺乳類神經(jīng)組織，勻漿、離心、提取上清液，再以等電點聚焦SDS凝膠電泳區(qū)分出感覺神經(jīng)特有的蛋白區(qū)帶，將蛋白回收、純化。等電聚焦SDS凝膠電泳的PH控制在3-11。
用抗原免疫小鼠的步驟是向小鼠腹腔內(nèi)注入與完全福氏佐劑等量混合的感覺神經(jīng)蛋白100微克，2-4周后，再向小鼠腹腔注入與不完全福氏佐劑等量混合的感覺神經(jīng)蛋白100微克，再過1-3周后，向小鼠腹腔內(nèi)再注入感覺神經(jīng)蛋白100微克，過2-4天后提取小鼠的脾細胞。
將經(jīng)免疫的小鼠的細胞與骨髓瘤細胞融合，并接種、培養(yǎng)克隆的步驟是將經(jīng)免疫的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞，在PEG作用下融合，用含小牛血清的HAT液稀釋后接種于鋪有飼養(yǎng)細胞的細胞培養(yǎng)板中，置于5%的CO2孵箱中37℃培養(yǎng)，2-4周后換HAT液繼續(xù)培養(yǎng)。
本發(fā)明所提供的感覺神經(jīng)抗體能特異地與感覺神經(jīng)結(jié)合，故能在將抗體特異性標(biāo)記后(如考馬斯亮蘭標(biāo)記)方便地區(qū)分出感覺與運動神經(jīng)。本發(fā)明所提供的感覺神經(jīng)抗體的制備方法，簡單、可靠，材料易得。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明實施例1取人神經(jīng)組織，勻漿、離心、提取上清液，SDS凝膠電(PH3-11)區(qū)分出感覺神經(jīng)特有的蛋白區(qū)帶回收與純化感覺神經(jīng)特異蛋白，作為抗原。
選用八周齡的BABL/C雌性小鼠(上海醫(yī)科大學(xué)提供)。每只小鼠腹腔內(nèi)注入與完全福氏佐劑(Sigma)等量混合的感覺神經(jīng)蛋白100微克，三周后，每只小鼠腹腔注入與不完全福氏佐劑等量混合的感覺神經(jīng)蛋白100微克，再間隔二周后，向小鼠腹腔內(nèi)注入感覺神經(jīng)蛋白100微克，過后第三天取小鼠的脾細胞1×108與SP2/0骨髓瘤細胞(中科院上海細胞生物所提供)1×107在50%的PEG(上海洗滌劑二廠、分子量1000)作用下融合。用含15%小牛血清的HAT液稀釋成100ml含109個細胞后，接種于鋪有飼養(yǎng)細胞(小鼠腹腔巨噬細胞)的96孔細胞培養(yǎng)板(Costar)中，每孔0.2ml置于5%的CO2的孵箱中(37℃)培養(yǎng)。三周后換HAT液，當(dāng)克隆生長達孔底1/3時，以免疫細胞化學(xué)法(ABC法)檢測抗體(檢測試劑由衛(wèi)生部上海生物制品研究所提供)，篩選出只對感覺神經(jīng)元起免疫反應(yīng)的陽性克隆。再經(jīng)有限稀釋法克隆三次以上，獲得分泌人感覺神經(jīng)抗體的雜交瘤細胞株CCTCCNOC93004(Human Sensory Nerve Antibody Cell)該細胞株即分泌出人感覺神經(jīng)抗體(HumanSensory Nerve Antibody，簡寫HSNA)。該抗體可用考馬斯蘭進行特異性抗體標(biāo)記(或用其它方法標(biāo)記)。該抗體可特異性地與人感覺神經(jīng)結(jié)合。能分泌人感覺神經(jīng)抗體的雜交瘤細胞株，染色體檢查平均為96條，可接種于同種小鼠體內(nèi)產(chǎn)生腹水和瘤結(jié)節(jié)，該細胞株體外培養(yǎng)一年以后，仍可穩(wěn)定地分泌抗體，且該細胞株液氮中保存，復(fù)蘇后生物活性不變。
實施例2取成年新西蘭大白兔神經(jīng)組織，其余同實施例1，所得細胞株能分泌新西蘭大白兔感覺神經(jīng)抗體，該抗體可特異性地與新西蘭大白兔神經(jīng)結(jié)合。
權(quán)利要求
1.一種感覺神經(jīng)抗體，其特征在于能特異性地與感覺神經(jīng)相結(jié)合。
2.一種制備感覺神經(jīng)抗體的方法，其特征在于包括如下步驟(a)取作為抗原的哺乳類感覺神經(jīng)特異蛋白;(b)用抗原免疫小鼠，然后提取小鼠細胞;(c)將經(jīng)免疫的小鼠的細胞與骨髓瘤細胞融合，并接種、培養(yǎng)克隆;(d)用細胞免疫化學(xué)法檢測抗體，篩選陽性克隆，篩選出只對感覺神經(jīng)元起免疫反應(yīng)的陽性克隆，再經(jīng)有限稀釋法克隆化三次以上，獲得分泌感覺神經(jīng)抗體的雜交瘤細胞株CCTCCNOC93004。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備感覺神經(jīng)抗體的方法，其特征在于取哺乳類感覺神經(jīng)特異蛋白的步驟是取哺乳類神經(jīng)組織，勻漿、離心、提取上清液，再以等電點聚焦SDS凝膠電泳區(qū)分出感覺神經(jīng)特有的蛋白區(qū)帶，將蛋白回收、純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備感覺神經(jīng)抗體的方法，其特征在于等電點聚焦SDS凝膠電泳的PH控制在3-11。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4所述的制備感覺神經(jīng)抗體的方法，其特征在于用抗原免疫小鼠的步驟是向小鼠腹腔內(nèi)注入與完全福氏佐劑等量混合的感覺神經(jīng)蛋白100微克，2-4周后，再向小鼠腹腔注入與不完全福氏佐劑等量混合的感覺神經(jīng)蛋白100微克，再過1-3周后，向小鼠腹腔內(nèi)再注入感覺神經(jīng)蛋白100微克，過2-4天后提取小鼠的脾細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4所述的制備感覺神經(jīng)抗體的方法，其特征在于將經(jīng)免疫的小鼠的細胞與骨髓瘤細胞融合，并接種、培養(yǎng)克隆的步驟是將經(jīng)免疫的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞，在PEG作用下融合，用含小牛血清的HAT液稀釋后接種于鋪有飼養(yǎng)細胞的細胞培養(yǎng)板中，置于5%的CO2的孵箱中37℃培養(yǎng)，2-4周后換HAT液繼續(xù)培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種感覺神經(jīng)抗體及其制備方法，感覺神經(jīng)抗體能特異地與感覺神經(jīng)相結(jié)合，其制備步驟包括取感覺神經(jīng)特異蛋白作抗原、用抗原免疫小鼠、取經(jīng)免疫的小鼠細胞與骨髓瘤細胞融合、接種、培養(yǎng)克隆、篩選克隆、獲得分泌感覺神經(jīng)抗體雜交瘤細胞株等。本發(fā)明所提供的抗體通過特異性地與感覺神經(jīng)結(jié)合，而方便地區(qū)分感覺神經(jīng)與運動神經(jīng)，且其制備方法簡單、可靠、材料易得。
文檔編號C12P21/08GK1084891SQ93111758
公開日1994年4月6日 申請日期1993年9月22日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月22日
發(fā)明者顧曉松, 張沛云, 陳昌富, 嚴志強, 曹錚 申請人:南通醫(yī)學(xué)院