專利名稱：氨端帶前表面抗原決定簇的乙型肝炎表面抗原蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一類用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的乙型肝炎疫苗，國際專利分類是C12N15/09。
乙型肝炎是一種嚴重危害人類健康的傳染性疾病。它的致病原是乙型肝炎病毒(HBV)。據(jù)調(diào)查我國乙型肝炎病毒攜帶者達1億人之多。乙型肝炎特別是慢性遷延性乙型肝炎可導致肝硬化而且和原發(fā)性肝癌的誘發(fā)直接有關(guān)。設(shè)計研制有效的乙肝疫苗來大規(guī)模免疫易感人群和治療HBV攜帶者對保障人民身體健康有重大的戰(zhàn)略意義。
乙型肝炎患者血液中不僅有直徑為42nm的HBV病毒顆粒而且還有數(shù)量多得多的直徑為22nm的球狀或纖維狀的表面抗原(HBsAg)顆粒，后二者并不含有HBVDNA，因而沒有感染性，但卻能誘發(fā)人體產(chǎn)生中和入侵的HBV的抗體。從乙肝病毒攜帶者血液分離制備的表面抗原是第一代乙肝疫苗。但血液來源有限，它還可能有其他病毒如HIV，HCV等污染。而遺傳工程乙肝疫苗是在動物細胞或酵母中表達的，能形成顆粒的HBsAg的蛋白。這類疫苗的生產(chǎn)不受材料來源限制，大量制備時成本低廉，而且排除了其他血源性致病原污染的可能性。臨床試用表明基因工程乙肝疫苗和血源乙肝疫苗對易感人群的保護作用相同。
HBV的HBsAg基因的長閱讀框架有多個翻譯起始密碼子，從不同AUG起始翻譯的多肽可以形成三種大小不同的HBsAg分子。它們的羧端有共同的順序，但在氨端不同。表面抗原主蛋白(S蛋白)長226個氨基酸;表面抗原中蛋白(MS蛋白)氨端含有preS2區(qū)，長281個氨基酸;表面抗原大蛋白(LS蛋白)氨端含有preS1和preS2區(qū)，長389或400個氨基酸。后二者主要存在于HBV病毒顆粒中。這二個蛋白特別是LS蛋白在HBV顆粒組裝和對肝細胞的識別中起重要作用。preS1和preS2區(qū)還有多個抗原決定簇，其中以preS1區(qū)的抗原決定簇尤為重要。由于preS區(qū)暴露在HBsAg蛋白分子的表面，是機體免疫系統(tǒng)的靶區(qū)，因而有很好的免疫原性。Neurath等人發(fā)現(xiàn)相應于肝細胞受體結(jié)合區(qū)(preSaa21-47)的合成肽段及其抗體都能阻斷HBV和肝細胞的結(jié)合(Neurath，A.R.etal.，“IdentificationandchemicalsynthesisofahostcellreceptorbindingsiteonhepatitisBvirus”，Cell，(1986)，46，429)。許多HBV研究者根據(jù)動物模型和人體臨床試驗的結(jié)果提出用含有preS區(qū)的HBsAg蛋白作為疫苗有以下的優(yōu)點。1、由于preS區(qū)和S區(qū)可以以不同的機制調(diào)動機體對HBV的免疫反應，使用帶preS區(qū)的新型乙肝疫苗能大大提高疫苗的免疫原性，減少疫苗用量和免疫次數(shù)后仍舊能達到同樣或更好的免疫效果，使基因工程疫苗得到更加廣泛的應用。2、現(xiàn)有商品化的血源和基因工程疫苗只含有S蛋白。新型乙肝疫苗有助于克服人群中一部分人對現(xiàn)有乙肝疫苗的低反應性或無反應性。3、可以發(fā)展為一類治療性乙肝疫苗，用來幫助克服機體對HBV慢性感染的免疫耐受性，從而開辟治療慢性乙型肝炎的新途徑。
但在動物細胞，轉(zhuǎn)基因小鼠中進行的研究表明由于preS區(qū)特別是preS1區(qū)的存在，LS蛋白不能從動物細胞中分泌，而且它還強烈地抑制MS和S蛋白的分泌。LS蛋白在動物細胞中以不溶于胞漿的膜結(jié)合蛋白形式存在，不能單獨形成HBsAg顆粒。preS區(qū)特別是preS2區(qū)還有蛋白降解酶識別的位點。這也為提取和純化LS蛋白帶來了困難(Persing，P.H.，etal.，“InhibitionofsecretionofhepatitisBsurfaceantigenbyarelatedpresurfacepolypeptide”，Science，(1986)，234，1388;Molnar-kimber，K.L.，etal.“DistinctivepropertiesofthehepatitisBvirusenvelopeproteins”，J.Virol.，(1988)，62，407)。雖然S蛋白和少量的LS蛋白同時表達時可以形成混合的HBsAg顆粒。但LS在這種顆粒中僅占5%左右，不能充分發(fā)揮preS區(qū)的免疫原性。從國外的研究報導來看，利用重組DNA技術(shù)對preS區(qū)進行改造，特別是選擇性地部分缺失LS蛋白的preS區(qū)后既能保留preS區(qū)的重要的抗原決定簇。又改善了LS蛋白形成顆粒和分泌的性能和穩(wěn)定性，提高HBsAg蛋白的表達水平，是獲得新一代乙肝疫苗的可行方法。德國的Hexal生物技術(shù)公司報導了用帶preS區(qū)的疫苗免疫人群(包括一些對現(xiàn)有的只含S蛋白的疫苗無反應者)后百分之百地產(chǎn)生抗S和抗preS的抗體(Thoma，H.A.，etal.，“DoespreS2havethesameeffectinimprovingtheHBVimmuneresponseaspreS1？”，inViralHepatitisandLiverDisease，F(xiàn).B.Hollinger，S，M，LemonandH.S.Margolis(ed.)TheWilliamsandWilkinsCo.，Baltmore)。但他們的疫苗是三種蛋白(即S蛋白，S區(qū)有缺失的MS和LS蛋白)的混合物，因而制備過程較復雜。Prange等人則發(fā)現(xiàn)preS1區(qū)或其中一部分連接在S區(qū)羧端所得的融合蛋白能形成顆粒并分泌出哺乳動物細胞(Streeck，R.E.，etal.，“AnalysisofHBsAgassemblyandsecretionusingsite-directedmutagenesis”，in“ViralHepatitisandLiverDisease”，F(xiàn).B.Hollinger，S.M.LemonandH.S.Margolis(ed.)，TheWilliamsandWilkinsCo.，Baltimore)。美國的Merck公司在酵母中表達了帶preS區(qū)的HBsAg基因，并在歐美和中國申請了專利(中國專利CN87100465A)。他們所設(shè)計的HBsAg蛋白至少包括一部分preS1區(qū)和preS2區(qū)以及部分或全部的S區(qū)。比利時的SmithKline公司也報導了在酵母中表達帶preS1和preS2抗原決定簇的HBsAg蛋白，L蛋白(Cabezon，T.，etal.，“AnewhepatitisBvaccinecontainingpreS1andpreS2epitopesfromsaccharomycescerevisiae”，Vaccine，(1990)，199)。但這樣的蛋白在酵母中難以單獨形成顆粒。而且根據(jù)我們的研究表明較長的氨端preS區(qū)會嚴重地影響HBsAg蛋白在動物細胞中的產(chǎn)量和分泌。因此不大可能在動物細胞系統(tǒng)中表達和生產(chǎn)這些蛋白。
本發(fā)明的目的是通過構(gòu)建preS編碼區(qū)有缺失的HBsAg基因，將這些基因在哺乳動物細胞或酵母細胞中表達產(chǎn)生帶preS區(qū)的HBsAg蛋白。它們的特點是1、只含部分缺失的preS1區(qū)或preS2區(qū)，因而分子量比野生型的LS蛋白小得多。使由單一蛋白分子同時呈現(xiàn)暴露的preS和S區(qū)的抗原決定簇成為可能。2、在蛋白分子氨端保留了preS1區(qū)或preS2區(qū)的能產(chǎn)生中和HBV的抗體的抗原決定簇，有利于充分發(fā)揮它們的免疫原性。3、能單獨形成顆粒，也能和S蛋白或其他HBsAg蛋白形成HBsAg顆粒。4、大部分形成的顆粒能分泌出哺乳動物細胞。5、在細胞和培養(yǎng)液中有良好的穩(wěn)定性。6、在哺乳動物細胞中表達水平和S蛋白相近。在酵母細胞中雖不能分泌，但蛋白大多在胞漿中以可溶性蛋白顆粒穩(wěn)定存在，易于用常規(guī)的酵母蛋白提取方法純化。
本發(fā)明的示意圖說明如下

圖1、用PCR和體外重組法構(gòu)建的部分HBsAg基因的結(jié)構(gòu)示意圖。
除了pS100和pS200外所有質(zhì)粒都包含preS1的編碼區(qū)。
(S300即LS蛋白，S200即MS蛋白，S100即S蛋白。
圖2、SV40表達質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3、35S標記的preS區(qū)有部分缺失的HBsAg蛋白被抗HBsAg或抗preS1抗體免疫沉淀后的放射自顯影圖。
圖3a、細胞質(zhì)抽提物中35S標記的HBV表面抗原經(jīng)抗HBsAg抗體免疫沉淀和蛋白電泳后的放射自顯影圖。
圖3b、細胞質(zhì)抽提物中35S標記的HBV表面抗原經(jīng)抗preS1抗體免疫沉淀和蛋白電泳后的放射自顯影圖。
(S100-S蛋白，每一行中箭頭所指分別為糖化型和非糖化型的表面抗原蛋白，左側(cè)為標準分子量)。
圖4、S311蛋白的分泌性，在不同細胞株中S311蛋白和S(S100)蛋白的表達和分泌水平的比較。
圖5、在酵母中表達的preS區(qū)有缺失突變的HBsAg蛋白經(jīng)免疫沉淀后的蛋白電泳圖。
如圖1所示，我們采用多聚酶鏈式反應(PCR)和其他體外重組技術(shù)從野生型HBsAg基因中缺失部分preS的編碼區(qū)，構(gòu)建了一系列HBsAg基因。這些重組HBsAg基因能被克隆進各種真核生物載體進行表達。我們選擇使用了SV40表達質(zhì)粒-哺乳動物細胞和ADH1表達質(zhì)粒-酵母細胞系統(tǒng)來篩選能表達具有上述多個優(yōu)點的重組HBsAg基因。
我們構(gòu)建了一個SV40表達質(zhì)粒。如圖2所示，該質(zhì)粒是質(zhì)粒pSP65的衍生物。它有氨芐青霉素抗性基因和DNA復制起點，因而可以在大腸桿菌中篩選克隆并擴增。HBsAg基因插在SV40早期啟動子和HBV多聚腺苷化信號之間。在哺乳動物細胞中SV40早期啟動子可以驅(qū)動HBsAg基因的表達。我們用SV40表達質(zhì)粒瞬間轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞有猴腎細胞COSM6，CV-1，Vero以及人肝癌細胞株HepG2和Huh7。由于COSM6細胞能組成型表達SV40病毒的T抗原，因而轉(zhuǎn)入的SV40表達質(zhì)粒能進行擴增，從而增加了HBsAg的表達量。SV40表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入的細胞用35S甲硫氨酸脈沖標記并追蹤后收獲培養(yǎng)液和細胞，裂解后提取的細胞質(zhì)蛋白或者直接用于放射免疫測定或者分別經(jīng)抗HBsAg或抗preS1的抗體免疫沉淀后用SDS-蛋白電泳分離，并放射自顯影，以此來研究表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性，形成顆粒的性能，分泌性和在細胞中的表達水平，篩選有可能發(fā)展成為新一代乙肝亞單位疫苗的重組HBsAg基因。我們還把帶preS區(qū)缺失突變的一系列HBsAg基因克隆到酵母表達質(zhì)粒pVT102U中在酵母S78 XV700-6B中進行表達。酵母細胞經(jīng)玻璃株震蕩破碎后，所得細胞提取物用抗HBsAg抗體免疫沉淀后經(jīng)SDS-蛋白電泳分離和銀染顯色，或者將破碎酵母后的提取物稀釋后用“放射免疫檢測乙肝表面抗原試劑盒”定量測定。
本發(fā)明的內(nèi)容在以下的實施例中具體敘述實施例1、S311基因的構(gòu)建及其在哺乳動物細胞中的表達。
材料與方法a.DNA聚合酶IKlenow片段，限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶是NewEnglandBiolab的產(chǎn)品，TaqDNA聚合酶為Promega產(chǎn)品。PCR的引物DNA由美國Wisconsin大學生物技術(shù)中心和中國科學院上海生化所合成。
b.猴腎細胞株COSM6和CV-1以及人肝癌細胞株HepG2和Huh7由美國Wisconsin大學J.Mertz提供。Vero細胞由生化所汪垣提供，上述細胞都在含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
c.細胞的轉(zhuǎn)染。COSM6細胞用DEAE-dextran法轉(zhuǎn)染(Yu，X.M.，“TheC-terminalhalfofthepreS1regionisessentialforthesecretionofhumanhepatitisBviruslargeproteindevoidoftheN-terminalretentionsequence”，Virology，(1991)，181，386)。其他細胞用磷酸鈣共沉淀的DNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后細胞在37℃的CO2培養(yǎng)箱中保溫5小時后換培養(yǎng)液，再培養(yǎng)48小時后收獲細胞和培養(yǎng)液供放射免疫和酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定。或者用于同位素標記。
d.HBsAg放射免疫測定和preS1抗原性的ELISA測定細胞經(jīng)多次凍融后上清液中HBsAg蛋白用AUSRIA藥盒(Abbott公司產(chǎn)品)或放射免疫檢測乙肝表面抗原試劑盒(北京生物制品研究所產(chǎn)品)測定。ELISA測定采用OrganonTeknick公司的preS1(a.a.12-32)藥盒測定。
e.同位素標記和免疫測定35S甲硫氨酸是Amersham公司的產(chǎn)品。抗HBsAg的抗體是DAKO Corp公司產(chǎn)品?？筽reS1(a.a.12-47)抗體由Neurath提供。細胞脈沖標記和追蹤以及免疫沉淀和SDS-蛋白電泳方法見獻(Yu，X.M.，“TheC-terminalhalfofthepreS1regionisessentialforthesecretionofhumanhepatitisBviruslargeproteindevoidoftheN-terminalretentionsequence”;Virology，(1991)，181，386)。
我們分步描述實施的具體步驟(1)表達質(zhì)粒pS311構(gòu)建SV40表達質(zhì)粒是從質(zhì)粒pSP65衍生而來，它的構(gòu)建見文獻(俞賢明等，“一個能分泌出哺乳動物細胞的HBV表面抗原大蛋白”，中國科學B輯(1991)6，633)。S311基因是preS1區(qū)的肝細胞受體結(jié)合區(qū)(a.a.21-47)編碼區(qū)和S編碼區(qū)融合而成。它的構(gòu)建采用二步PCR法。PCR模板為pS301基因(俞賢明等，“一個能分泌出哺乳動物細胞的HBV表面抗原大蛋白”，中國科學B輯(1991)6，633)。第一對引物擴增preS1a.a.21-47的編碼區(qū)，并在擴增的DNA片段的3’端引入一個限制性內(nèi)切酶NcoI的切點。第二對引物擴增S區(qū)(a.a.1-32)的編碼區(qū)并在擴增的DNA片段的5’端引入一個限制性內(nèi)切酶NcoI切點。二個DNA片段分別用BamHI、NcoI或NcoI、XbaI酶切后和經(jīng)BamHI和XbaI酶切的質(zhì)粒pS301進行三片段連接，得到pS311表達質(zhì)粒。質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)用限制性內(nèi)切酶圖譜法檢證，對PCR擴增的區(qū)域還進行了DNA序列測定，未發(fā)現(xiàn)核苷酸順序有任何改變。這樣的S311基因編碼一個LS蛋白的缺失突變體，它的preS區(qū)長29個氨基酸加上羧端S區(qū)226個氨基酸，總長255個氨基酸，比S蛋白分子量略大。
(2)S311蛋白的結(jié)構(gòu)特點我們用pS311質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染猴腎COSM6細胞并脈沖標記和追蹤后。發(fā)現(xiàn)細胞中35S甲硫氨酸標記的S311蛋白能分別被抗HBsAg和抗preS1抗體沉淀(見圖3)。由于抗HBsAg的抗體主要識別S區(qū)的構(gòu)型型抗原決定簇。S311蛋白被這一抗體的免疫沉淀提示了它的S區(qū)保持了S蛋白的基本結(jié)構(gòu)，即S區(qū)的肽鏈折疊和二硫鍵形成方式和S蛋白相同。同時用抗preS1抗體的免疫沉淀說明preS1區(qū)暴露在蛋白分子的表面，易于被抗preS1抗體所識別。圖3還顯示糖化和非糖化S311蛋白的分子量和從核苷酸序列推測的相符，并無其他HBsAg蛋白如S蛋白的同時表達。
(3)S311蛋白的分泌性和穩(wěn)定性35S標記的S311蛋白在細胞中和培養(yǎng)液中含量的比較(見圖4)顯示絕大多數(shù)標記的S311蛋白在脈沖標記并追蹤24小時后存在于培養(yǎng)液中，這說明S311蛋白分泌良好。用放射免疫法分別測定不同時間S311在細胞中和培養(yǎng)液中的含量表明，在脈沖標記3小時或追蹤24小時后標記的S311總量不變。說明S311蛋白在細胞和培養(yǎng)液中穩(wěn)定存在。
根據(jù)放射免疫定量的結(jié)果，S311蛋白在猴腎COSM6細胞中的分泌水平和S蛋白相同。在Vero，HepG2和Huh7細胞中S311蛋白的分泌良好，但總的表達水平比S蛋白略低。
(4)S311蛋白的抗原性35S甲硫氨酸標記的S311能被抗化學合成肽段(S區(qū)a.a.122-145)的抗體沉淀。這說明S311蛋白中preS區(qū)存在并沒有對S區(qū)的主要抗原決定簇的區(qū)域有明顯的遮掩作用，提示了在同一蛋白分子上同時呈現(xiàn)暴露的preS區(qū)和S區(qū)的抗原簇是可能的。而以往的學者鑒于LS蛋白的較長的preS區(qū)(163或174個氨基酸)對S區(qū)的嚴重遮掩作用認為新型乙肝疫苗應是帶preS區(qū)的HBsAg蛋白和S蛋白的混合物(Alberti，A.，et al.，“Nature and display of hepatitis B virus envelope proteins and the humoral immune response”，in In Immunopathology Springer-Verlag，(1990)，5)。
在LS蛋白中肝細胞受體結(jié)合區(qū)(a.a.21-47)和羧端的S區(qū)間隔116或127個氨基酸殘基，但在S311蛋白這二區(qū)域直接相連。用ELISA法對preS1抗原性的測定表明S311蛋白和S301蛋白(LS蛋白的缺失突變體，它缺失了preS的a.a.2-19，但上述這二個區(qū)域之間距離未變)的抗原性相同。這說明即使preS區(qū)大部分缺失，和S區(qū)直接相連的preS區(qū)抗原決定簇仍然易于被相應的抗體所識別。
(5)S311蛋白能形成HBsAg顆粒我們所用的放射免疫法的測定原理是雙夾心法，這種方法僅能測定以顆粒形式存在的HBsAg蛋白。用放射免疫法測定的在哺乳動物細胞和酵母細胞中S311蛋白的表達水平和S蛋白接近，這一結(jié)果和免疫沉淀后蛋白電泳的結(jié)果相符合。由此可見在這二個系統(tǒng)表達的S311蛋白能單獨形成HBsAg顆粒。
實施例2，S311蛋白在酵母系統(tǒng)中的表達酵母HBsAg蛋白的免疫沉淀和SDS-蛋白電泳等方法與實施例1中的相同。
酵母株S78XV700-6B和含ADH1啟動子的酵母表達質(zhì)粒pVT102U由T.Vernet提供。帶preS區(qū)的HBsAg基因經(jīng)BamHI和HindIII酶切后插入表達質(zhì)粒pVT102U后，構(gòu)建成一系列HBsAg表達質(zhì)粒。酵母細胞的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子篩選見文獻(Vernet，T.，etal.，“Afamilyofyeastexpressionvectorscontainingthephagef1intergenicreglon”，Gene，(1987)，52，225)。酵母培養(yǎng)在YPD培養(yǎng)液中，30℃振蕩培養(yǎng)48小時，至O.D.650達10.0左右收集細胞。細胞懸浮在三倍體積的PBS(含5mMEDTA，1mMPMSF，1%NP-40)中，再加入一倍體積的玻璃珠(直徑0.45mm)，劇烈震蕩8次，每次30秒，離心30分鐘取上清液后進行免疫沉淀。
在酵母細胞中表達的S311蛋白和S蛋白一樣，雖然不能分泌，但以可溶性蛋白存在于胞漿之中，經(jīng)玻璃珠破碎后，用含去垢劑的緩沖液即可抽提出來。在酵母中S311蛋白表達水平和S蛋白相當。
權(quán)利要求
1.一類能有效地阻斷乙型肝炎病毒感染或用于慢性肝炎治療的新型疫苗，其特征是作為主要組成成分的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)蛋白的氨端帶有部分缺失的preS區(qū)(即部分缺失的preS1區(qū)或preS2區(qū))，羧端是完整的S區(qū)；這類HBsAg蛋白在哺乳動物細胞中以能分泌的顆粒形式表達；在酵母細胞中能形成顆粒，并能在細胞經(jīng)破碎后用常規(guī)方法純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的HBsAg蛋白質(zhì)，其特征是可以由部分缺失的preS1區(qū)、完整preS2區(qū)和完整的S區(qū)組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的HBsAg蛋白質(zhì)，其特征是可以由部分缺失的preS1區(qū)和完整的S區(qū)組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、3中所述的HBsAg蛋白質(zhì)，其特征是可以由preS(a.a.21-47)和完整的S區(qū)組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4中所述的HBsAg蛋白是從帶部分缺失的preS編碼區(qū)和完整的S編碼區(qū)的HBsAg基因表達的或者是完整的HBsAg基因編碼的表面抗原大蛋白(LS蛋白)經(jīng)生物化學或化學法降解處理，缺失部分preS區(qū)而得到的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4中所述的HBsAg基因是用體外重組法部分缺失HBsAg基因中preS區(qū)來構(gòu)建的，或者先用化學法或生物化學法合成相應于preS區(qū)的DNA片段，然后和相應于S編碼區(qū)的DNA片段連結(jié)而成的。
7.根據(jù)權(quán)利要求5中所述構(gòu)建的HBsAg基因的表達系統(tǒng)包括動物細胞-質(zhì)粒表達系統(tǒng)，動物細胞-重組病毒表達系統(tǒng)，酵母表達系統(tǒng)和原核生物表達系統(tǒng)(例如大腸桿菌和枯草桿菌等)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5中所述構(gòu)建的HBsAg基因除用來表達HBsAg蛋白外，還可直接以DNA形式用于基因免疫或基因治療。
全文摘要
本發(fā)明是用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的預防和治療乙型肝炎的新型疫苗，氨端帶preS抗原決定簇的HBsAg蛋白。它的特征是氨端是有部分缺失的preS區(qū)，羧端是完整的S區(qū)。這類HBsAg蛋白的優(yōu)點是在哺乳動物細胞中以能分泌的顆粒形式表達；在酵母細胞中能形成顆粒，并能在細胞經(jīng)破碎后用常規(guī)方法純化，因此有利于生產(chǎn)。
文檔編號C12P21/00GK1094311SQ9311242
公開日1994年11月2日 申請日期1993年4月27日 優(yōu)先權(quán)日1993年4月27日
發(fā)明者俞賢明, 徐可立, 李載平, 汪垣 申請人:中國科學院上海生物化學研究所