專利名稱：D-泛解酸和d-泛酸的生產的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的D-泛解酸和/或D-泛酸(或其鹽)的生產方法和純化方法，一種能夠生產它的微生物，和一種具有包括在泛解酸或其鹽或其部分區(qū)域的生物合成的一種基因區(qū)的質粒DNA。泛酸是一種有用的維生素物質。D-泛解酸是用作合成泛酸和CoA的重要中間體物質。
通常D-泛酸(或其鹽)即一種重要的維生素物質的生產方法包括(1)通過DL-泛酸內酯(pantolactone)的光分解獲得D-泛酸內酯和β-丙氨酸(或其鹽)在甲醇中化學縮合的方法，(2)D-泛酸酯水解成D-泛酸的方法，D-構型的DL-泛酸酯選擇性水解成D-泛酸的方法，這兩種方法均使用微生物或一種酶(未審公開的日本專利Nos.228487/1989和228488/1989)，(3)使泛解酸鉀、β-丙氨酸和ATP與在Tris緩沖液中的休眠細胞或微生物酶接觸得到泛酸的方法(描述于Journal of Biological Chemistry，第198卷，第23頁(1952)，發(fā)表于第176屆American Chemical Society National Meeting的Abstracts of Papers，Division of Microbial and Biochemical Technology，No.48(1978)和其它公開出版物)。
通常D-泛解酸和/或D-泛酸內酯的生產方法包括(4)將一種分解劑例如奎寧或番木鱉堿用于光分解的方法，(5)用一種特定的微生物使DL-泛酸內酯中的L-泛酸內酯分解，得到單一的D-泛酸內酯的一種方法(審定公開的日本專利No.19745/1972)，(6)用一種特定的微生物使DL-泛酸內酯中單一的L-泛酸內酯氧化得到酮泛酸內酯(ketopantolactone)，然后使它不對稱地還原成D-泛酸內酯的方法(審定公開的日本專利No.293386/1986)，(7)將化學合成酮泛酸內酯用一種特定的微生物不對稱地還原成D-泛酸內酯的方法(審定公開的日本專利No.14797/1986)，(8)用一種特定的微生物使DL-泛酸內酯中的L-構型不對稱的水解成L-泛解酸的方法(未審查公開的日本專利Nos.152895/1982和294092/1987)以及(9)用一種特定的微生物使DL-泛酸內酯中的D-構型選擇性不對稱水解成D-泛解酸的方法(審定公開的日本專利No.65198/1991)。
人們關心怎樣收集泛酸的鹽，一種公知方法是在結晶前加入氯化鈣，以得到高產率和高純度的泛酸鈣和氯化鈣的絡合鹽結晶(如Jonathan O.Brooks1960年10月18日申請的US2957025，審定公開的日本專利No.49571/1972等所述)。然而，沒有一種方法能從這樣獲得的絡合鹽中去除氯化鈣以高產率獲得泛酸鈣，該絡合鹽是通常所述的成品。
在工業(yè)化生產D-泛酸(包括其鹽;以下應用相同)中，方法(1)不僅需要復雜的工藝以合成原料DL-泛酸內酯，而且需要一種麻煩且困難的方法進行其光分解。方法(2)缺點是需要由DL-泛酸內酯生產D-泛酸酯或DL-泛酸酯的方法。方法(3)的缺點在于需要使用昂貴的ATP和Tris緩沖液;泛酸的產率僅為痕量，且當使用昂貴的D-泛解酸(或其鹽)作為原料時是不實用的。
還有，D-泛解酸和/或D-泛酸內酯的大部分生產方法的失敗在于它們使用DL-泛酸內酯作為原料，它需用麻煩的合成工藝。然而，方法(4)的缺點為，例如使用一種昂貴的分解劑和D-泛酸內酯回收困難，以及方法(5)具有所生產的DL-泛酸內酯丟失一半的缺陷。在方法(6)、(7)、(8)和(9)中，由于所用微生物的性質，或由于泛酸內酯(或泛解酸)的性質，在培養(yǎng)肉湯中生產100%光學純的單一的D-構型是非常困難的。方法(4)、(8)、和(9)也涉及更多麻煩的工藝因為要回收、消旋和重新利用殘余的L-構型。
通過對于D-泛酸的有利于工業(yè)化和更有效的生產方法的廣泛研究，本發(fā)明人發(fā)現在添加β-丙氨酸的培養(yǎng)液中培養(yǎng)一種微生物會導致D-泛酸的形成。本發(fā)明人也發(fā)現D-泛解酸能通過培養(yǎng)耐水楊酸的菌株進行積累，通過在添加β-丙氨酸的培養(yǎng)液中培養(yǎng)耐水楊酸的菌株可生產高濃度的D-泛酸，并且使用能耐α-酮異戊酸、α-氧代丁酸、α-氨基丁酸、β-羥基天冬氨酸和/或O-甲基蘇氨酸的菌株會增加D-泛解酸和D-泛酸的產量。同時，本發(fā)明人通過研究應用基因重組技術進行菌株繁殖，發(fā)現用包括泛酸或其鹽生物合成運載基因的一種質粒轉化的菌株在培養(yǎng)液中以甚至更高的濃度積累D-泛酸或D-泛解酸(和/或D-泛酸內酯)?；谶@些發(fā)現本發(fā)明人作進一步研究，并發(fā)展成本發(fā)明。
因此，本發(fā)明涉及(Ⅰ)一種生產D-泛解酸或其鹽的方法，該方法包括培養(yǎng)屬于腸桿菌科的一種微生物，該微生物耐水楊酸且能夠生產D-泛解酸，積累D-泛解酸或其鹽，并隨后收獲它;
(Ⅱ)用微生物生產(Ⅰ)的方法，所用的微生物至少耐α-酮異戊酸、α-氧代丁酸、α-氨基丁酸、β-羥基天冬氨酸和O-甲基蘇氨酸之一種;
(Ⅲ)一種生產D-泛酸或其鹽的方法，其特征在于使屬于腸桿菌科的耐水楊酸和能生產D-泛酸的一種微生物與β-丙氨酸相接觸;
(Ⅳ)用微生物生產(Ⅲ)的方法，所用的微生物至少耐α-酮異戊酸、α-氧代丁酸、α-氨基丁酸、β-羥基天冬氨酸和O-甲基蘇氨酸之一種;和(Ⅴ)用微生物生產(Ⅰ)-(Ⅳ)的方法，所用微生物是用包括泛酸或其鹽或其一部分區(qū)域生物合成運載基因區(qū)的一種質粒DNA轉化的一種微生物。
本發(fā)明也提供一種轉化的微生物和一種用于這些生產方法中所得到該微生物的質粒，以及純化和分離所要化合物的方法。
本發(fā)明具有許多優(yōu)點，它不需要使用DL-泛解酸、泛酸內酯等作原料，它能獲得100%光學純的D-構型化合物，而且不需要回收L-構型化合物和使所獲得消旋化合物重新利用而進行消旋的工序。


圖1表示實例3中獲得的質粒pFv31的限制性圖。
在圖1中，E代表EcoRⅠ;EV代表EcoRV;P代表PvuⅡ;B代表BglⅡ。
下文將詳細描述本發(fā)明。
在本發(fā)明中，D-泛解酸、D-泛酸和β-丙氨酸可以是它們的鹽。當本說明書提及D-泛解酸、D-泛酸和β-丙氨酸時，不僅包括的游離形式，而且也包括其鹽。D-泛解酸、D-泛酸和β-丙氨酸的鹽包括堿金屬和堿土金屬鹽。在任何情況下，優(yōu)選的是鈣鹽、鈉鹽和鉀鹽。本發(fā)明合成D-泛酸和D-泛解酸的方法，其特征在于培養(yǎng)能夠生產泛酸和D-泛解酸的微生物，使其從各種碳源如葡萄糖中微生物地生產D-泛解酸，該D-泛解酸在培養(yǎng)液中進行積累，或通過將β-丙氨酸與該微生物接觸，如將β-丙氨酸加入到培養(yǎng)液中，用β-丙氨酸進行縮合，從而生產D-泛酸。在β-丙氨酸存在的條件下，能夠生產D-泛酸或D-泛解酸的微生物能用于本發(fā)明。特別是，優(yōu)選屬于腸桿菌科的微生物，如屬于檸檬酸細菌屬、志賀菌屬(Shigella)、克雷白桿菌屬(Klebgiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、沙門菌屬(Salmonella)和埃希桿菌屬(Escherichia)的微生物。更優(yōu)選地將屬于埃希桿菌屬和它的那些衍生形式的微生物用于本發(fā)明，其中包括已知的大腸桿菌菌株列于List of Cultures，第8版，由Institute for Fermentation，Osaka出版，例如大腸桿菌K-12(IFO3301)和大腸桿菌IFO3547。
在力圖發(fā)展用埃希桿菌屬和其它屬微生物電碳源如糖重新合成D-泛解酸的更有效、更經濟的生產方法時，本發(fā)明人進行了研究并發(fā)現人為地使菌株耐水楊酸時它就能生產大量的D-泛解酸。本發(fā)明人也發(fā)現在含有碳源的培養(yǎng)液中使該微生物與β-丙氨酸相接觸能積累大量的D-泛酸。
另外，本發(fā)明人發(fā)現，使這些菌株耐水楊酸以及耐α-酮異戊酸、α-氧代丁酸、α-氨基丁酸、β-羥基天冬氨酸和O-甲基蘇氨酸可生產更高濃度的D-泛酸。
用于本發(fā)明方法的突變體包括屬于腸桿菌科的微生物，其它微生物中屬于埃希桿菌屬的能生產D-泛解酸或D-泛酸。確切地說，這些突變體的實例為大腸桿菌FV5714(IFO 15368)，它耐水楊酸，大腸桿菌FV525(IFO 15369)，它耐水楊酸和α-酮異戊酸，大腸桿菌FV814(IFO 15370)，它耐水楊酸、α-酮異戊酸和α-氧代丁酸，大腸桿菌FV 521，它耐水楊酸、α-酮異戊酸、α-氧代丁酸和α-氨基丁酸，大腸桿菌FV 221，它耐水楊酸、α-酮異戊酸、α-氧代丁酸、和β-羥基天冬氨酸，大腸桿菌FV 6051和大腸桿菌FV 5069，它們耐水楊酸、α-酮異戊酸、α-氧代丁酸、β-羥基天冬氨酸和O-甲基蘇氨酸。
用于本發(fā)明的突變體是通過對大腸桿菌IFO 3547(作為一種母菌株)進行通常的致突變處理，例如紫外輻射，或用化學試劑例如N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍處理，然后在含有水楊酸(其濃度不能使母菌株生長)的瓊脂板培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，隨后分離該板培養(yǎng)液中的克隆生長物而獲得的。同樣，FV525是通過在含有α-酮異戊酸(其濃度不能使母菌株生長)的瓊脂板培養(yǎng)液中培養(yǎng)FV5714(作為母菌株)，然后分離該板培養(yǎng)液中的克隆生長物而獲得的。FV814是通過在含有α-氧代丁酸(其濃度不能使母菌株生長)的瓊脂板培養(yǎng)液中培養(yǎng)FV 525(作為母菌株)，然后分離該板培養(yǎng)液中的克隆生長物來獲得的。FV 521是通過在含有α-氨基丁酸(其濃度不能使母菌株生長)的瓊脂板培養(yǎng)液中培養(yǎng)FV 814(作為母菌株)，然后分離該板培養(yǎng)液中的克隆生長物而獲得的。FV221是通過在含有β-羥基天冬氨酸(其濃度不能使母菌株生長)的瓊脂板培養(yǎng)液中培養(yǎng)FV814(作為母菌株)，然后分離該板培養(yǎng)液中的克隆生長物而獲得的。FV6051是通過在含有O-甲基蘇氨酸(其濃度不能使母菌株生長)的瓊脂板培養(yǎng)液中培養(yǎng)FV221(作為母菌株)，然后分離該板培養(yǎng)液中的克隆生長物而獲得的。FV5069是通過在含有α-氧代丁酸(其濃度不能使母菌株生長)的瓊脂板培養(yǎng)液中培養(yǎng)FV6051(作為母菌株)，然后分離該板培養(yǎng)液中的克隆生長物而獲得的。
在最終獲得的滿足本發(fā)明目的的一種菌株中，對藥物例如水楊酸、α-酮異戊酸、α-氧代丁酸、α-氨基丁酸、β-羥基天冬氨酸和O-甲基蘇氨酸的耐受力可以任何順序傳給菌株。α-酮異戊酸、α-氨基丁酸和O-甲基蘇氨酸也可用已知的支鏈氨基酸類似物來代替，例如4-氮雜亮氨酸、4-硫雜異亮氨酸和正纈氨酸。
上述菌株耐水楊酸、α-酮異戊酸、α-氧代丁酸、α-氨基丁酸、β-羥基天冬氨酸和O-甲基蘇氨酸的程度在下列試驗實驗實例中加以說明。
試驗實例表1(下文“%”是指“重量/體積%”，除另有說明外)所示的組合物培養(yǎng)液在121℃進行10分鐘的熱消毒之后，加入預先消毒過濾的水楊酸、α-酮異戊酸、α-氧代丁酸、α-氨基丁酸、β-羥基天冬氨酸或O-甲基蘇氨酸以達到表2所示濃度。然后將該培養(yǎng)液分配到9厘米直徑的陪替氏培養(yǎng)皿。在每一個該瓊脂培養(yǎng)液中加入0.1毫升的菌株培養(yǎng)肉湯，該菌株選自大腸桿菌IFO3547、FV5714、FV525、FV814、FV521、FV221、FV6051和FV5069(如表2示)，在最少量培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時，接著再培養(yǎng)30小時。生長程度列于表2。
表1瓊脂組合物培養(yǎng)液(pH7.0)成分 濃度Na2HPO40.6%KH2PO40.3%NaCl 0.05%NH4Cl 0.1%葡萄糖 0.5%MgSO41mMCaCl20.1mM維生素B15μg/ml瓊脂 1.5%表2①在水楊酸板上生長程度相似濃度 菌株名稱(mg/ml) IFO3547 FV5714 FV525 FV8140.125 - ++ ++ ++0.25 - ± + +0.5 - - ± ±1 - - - -2 - - - -②在α-酮異戊酸板上生長程度IFO3547 FV5714 FV525 FV8140.625 ++ ++ ++ ++1.25 + ++ ++ ++2.5 ± + + +5 - ± + +10 - - - -③在α-氧代丁酸板上生長程度IFO3547 FV5714 FV525 FV814 FV221 FV6051 FV50690.125 ++ ++ ++ ++ + + ++0.25 ++ ++ ++ ++ + + +0.5 ± + + ++ ± ± +1 - ± ± + ± ± ±
2 - - - ± - - ±④在α-氨基丁酸板上生長程度IFO3547 FV571 FV525 FV814 FV5210.125 ++ ++ ++ ++ ++0.25 + + ++ ++ ++0.5 - + + + +1 - - ± + +2 - - - - +⑤在β-羥基天冬氨酸板上生長程度IFO3547 FV814 FV221 FV6051 FV50690.125 + + ++ ++ ++0.25 + + ++ ++ ++0.5 - - + ± +1 - - ± ± ±2 - - - - -⑥在O-甲基蘇氨酸板上生長程度IFO3547 FV814 FV221 FV6051 FV50690.0125 ++ ++ ++ ++ ++0.025 ++ ++ ++ ++ ++
0.05 + + + ++ ++0.1 ± ± - ++ ++0.2 - - - ++ ++在表2中符號具有如下含義++生長很好 +生長良好 ±生長較差 -不生長同時，基于上述D-泛酸的生產方法，本發(fā)明人發(fā)現，含有包括泛酸或其鹽或其部分生物合成的基因區(qū)運載的載體科微生物(由特定科微生物的染色體衍生)可高濃度積累D-泛酸和/或D-泛解酸。
本文所涉及的泛酸生物合成中所包括的基因是panB、panC或panD基因，它們分別與酶酮泛酸羥基甲基轉移酶、泛酸合成酶和天冬氨酸-α-脫羧酶相對應。
這樣的DNA供體微生物包括上述的微生物，優(yōu)選能生產泛酸的埃希桿菌屬微生物。確切地說，如List of Cultures，第8版，1988中，由Institute for Fermentation，Osaks出版中所列的已知菌株，例如大腸桿菌K-12(IFO 3301)和大腸桿菌IFO3547。更有效的是使用上述突變體如大腸桿菌FV5714、FV525、FV814、FV521、FV221、FV6051和FV5069。
含有包括泛酸或其鹽生物合成基因的DNA片斷的制備方法包括用已知方法從一種供體微生物中先萃取染色體DNA的方法(如H.Saito和K.Miura在Biochim.Biophys.Acta，72，619(1963)中所述)，或用抑制酶EcoRI分裂后的其類似方法。然后，將上述獲得的含有包括泛酸或其鹽的生物合成的基因的染色體DNA片斷插入載體DNA。
用于本發(fā)明的載體DNA可適當選自能在受體微生物中增殖的那些。能在受體微生物中增殖的質粒包括(但不限于)pSC101[Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA，70，3240(1973)]和pBR322[Gene，4，121(1978)];甚至能用最新分離或合成的載體DNA，只要能實現本發(fā)明的目的。
將含有包括泛酸或其鹽的生物合成的基因的DNA片斷插入這些質粒中能用公知方法或基于此的一種方法來實現，該公知方法如T.Maniatis等人在Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，University of Tokyo Press，1982中所述。
能用一種已知的轉化方法或基于此的一種方法將載有包括泛酸或其鹽生物合成基因的質粒載體引入受體微生物中，該已知方法如Journal of Molecular Biology，53，159(1979)中所述。受體桿菌的實例包括已知的菌株例如大腸桿菌C600菌株[Bacteriology Review，36，525(1972)]。
含有包括泛酸或其鹽生物合成基因運載質粒的轉化體可選自通過轉化泛酸營養(yǎng)缺陷體作DNA受體和選擇一種菌株，轉化結果使其變成能在泛酸游離培養(yǎng)液中生長的轉化體。當所用培養(yǎng)液使選擇的菌株作為質粒DNA標記時這種選擇是容易的。如此獲得的含有包括泛酸或其鹽生物合成基因運載的載體DNA能用于從含有它的菌株中提取重組DNA，并且將它引入另一個受體微生物，或從提取的重組DNA中制備含有包括泛酸或其鹽生物合成基因的DNA片斷，并將它引入另一個載體質粒上。如此獲得的轉化體的實例包括如下大腸桿菌3547/pFV31菌株(IFO 15371)大腸桿菌5714/pFV31菌株(IFO 15372)大腸桿菌525/pFV31菌株(IFO 15373)大腸桿菌814/pFV31菌株(IFO 15374)(FERMBP 4401)大腸桿菌521/pFV31菌株，大腸桿菌221/pFV31菌株(IFO 15524)，大腸桿菌6051/pFV31菌株(IFO 15525)，和大腸桿菌5069/pFV31菌株(IFO 15526)(FERM BP 4395)上述大腸桿菌3547/pFV31菌株是通過將從大腸桿菌FV525衍生出的含有包括泛酸或其鹽的生物合成運載基因質粒pFV31引入IFO 3547而獲得的，大腸桿菌5714/pFV31是將pFV31引入FV5714菌株而得到的，大腸桿菌525/pFV31是將pFV31引入FV525菌株而得到的，大腸桿菌814/pFV31是將pFV31引入FV814菌株而得到的，大腸桿菌521/pFV31是將pFV31引入FV521菌株而得到的，大腸桿菌221/pFV31是將pFV31引入FV221菌株而得到的，大腸桿菌6051/pFV31是將pFV31引入FV6051菌株而得到的，和大腸桿菌5069/pFV31是將pFV31引入FV5069菌株而得到的。
在本說明書中，IFO的數值表示在Institute for Fermintation，Osaka(2-17-85，Jyuso Honmachi，Yodogawa-ku，Osaka_shi)處的登記號，FERM BP的數值表示在Budapest Treaty Fermentation Research Institute，Agency of Industrial Science and Technology(1-1-3，Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki)處的登記號。
如此獲得的菌株能用普通培養(yǎng)方法〖如靜置培養(yǎng)、振動培養(yǎng)(旋轉振動培養(yǎng)等)和通氣旋轉器培養(yǎng)〗進行連續(xù)或間斷的培養(yǎng)。所用培養(yǎng)液為可使所用微生物生長的普通組合物。該微生物能消化的碳源可適當選自單一使用或在組合物中的烴、油和脂肪、脂肪酸、有機酸、和醇。氮源的實例包括有機氮源如胨、大豆粉、棉籽粉、玉米漿、酵母抽提物、肉羹、麥精和尿素，以及無機氮源如硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、和磷酸銨按需要單獨或混合使用。用磷酸二氫鉀或磷酸二鉀作磷源也是有利的。該培養(yǎng)液通?？商砑由L所需的金屬鹽(例如硫酸鎂)、基本生長因子如氨基酸和維生素、生長促進因子、以及碳源、氮源、和磷源。為控制培養(yǎng)液pH值和泡沫，可適當加入堿性物質如氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸銨和碳酸鈣，加入消泡劑是有效的。這些物質可以在培養(yǎng)過程中適當地加入。噴入氧氣對保持需氧條件的環(huán)境也是有效的。通常將培養(yǎng)溫度保持在15至45℃、優(yōu)選25至40℃范圍內是有利的。培養(yǎng)連續(xù)進行直到泛酸和/或泛解酸的含量已基本達到最高值;一般能在6至120小時內實現本發(fā)明的目的。
在D-泛酸的生產中，能通過在菌株開始培養(yǎng)之前、或菌株培養(yǎng)過程中的適當時間加入原料，或通過在適當時間將原料加到加工過的細胞中以使原料β-丙氨酸與細胞相接觸。本文所述的已加工過的細胞包括洗滌過的細胞培養(yǎng)液、及包含和固定在丙酮粉、聚丙烯酰胺凝膠或K-角叉萊膠中的細胞。將該原料以溶液形式、或在合適溶劑中(如水)的懸浮液、或以粉末形式，在一定時間或連續(xù)地、或在給定時間內間斷地加入。
加入的β-丙氨酸濃度最好與加到培養(yǎng)液中該微生物的產率相適應、以經濟為原則，所加β-丙氨酸的優(yōu)選濃度為0.1至5%(重量/體積比)，最好是0.5至3%(重量/體積比)。
當從上述培養(yǎng)液或反應產物中分離D-泛酸或其鹽時，它能以常規(guī)的方法進行收獲。例如，D-泛酸或其鹽可通過從培養(yǎng)肉湯中去除細胞，隨后進行一個或多個公知工序如離子交換樹脂處理、用活性碳吸收處理等、結晶、去鹽、以及電透析以來進行分離。
通過上述反應獲得的游離形式D-泛酸能用普通方法轉化成鹽;通過該反應獲得的D-泛酸鹽能用普通方法轉化成游離形式。
例如，泛酸鈣的分離方法如下從含有泛酸或其鹽的培養(yǎng)肉湯中去除細胞。使該液體流經陽離子交換樹脂柱(例如，DIAION PK-216(H型)或pk-228(H型)，二者均由Mitsubishi Chemical Industries生產)以去除陽離子，然后經過陰離子交換樹脂柱(例如，DIAION PA-412(OH型)或WA-30(OH型)，二者均由Mitsubishi Chemical Industries生產)以去除比無機陰離子和泛酸酸性更大的有機酸。在加入活性碳(如，Shirasagi A，由Takeda Chemieal Industries生產)，隨之進行過濾之后，通過加入氫氧化鈣將流出物(pH3±1)調節(jié)到近于中性pH值(pH7±2)。濃縮所得溶液，且加入適量低級醇(如，甲醇、乙醇、異丙醇)，加入晶種以使D-泛酸鈣結晶，然后將所得D-泛酸鈣晶體分離并干燥。若這種D-泛酸鈣結晶產率不夠的話，可在結晶前適當加入氯化鈣以得到高產率和高純度結晶D-泛酸鈣和氯化鈣的絡合鹽，按US2957025(由Jonathan O.Brooks，于1960年10月18日申請)和審定公開的日本專利No.49571/1972所述方法進行。雖然為此目的加入的氯化鈣可以是無水、二水、六水鹽結晶，但最好是無水或二水鹽。氯化鈣的加入量一般是泛酸鈣摩爾比的0.5至5倍，優(yōu)選為1至3倍。US2957025(由Jonathan O.Brooks，于1960年10月18日提出申請)指出，該泛酸鈣和氯化鈣的絡合鹽是不吸濕的，且是有效的動物飼料添加物;英國專利No.933669指出它在片劑中比泛酸鈣更穩(wěn)定。
有關從這樣獲得的D-泛酸鈣和氯化鈣絡合鹽中去除氯化鈣以高產率獲得D-泛酸鈣的方法尚未見報道。本發(fā)明人為實現本發(fā)明目的進行各種方法的廣泛研究之后，設計出了一種非常有效的電滲析方法。確切地說，本發(fā)明人發(fā)現用一種陰離子可滲透膜〖該膜可使氯離子通過但泛酸不行(例如，一價離子可選擇性滲透的膜Neocepter ACS，由Tokuyama soda生產)〗并用硝酸鈣水溶液作電極液進行電滲析，可有效地從D-泛酸鈣和氯化鈣絡合鹽的水溶液中去除氧化鈣。雖然，在水溶液中該絡合鹽的濃度是可選擇的，但通常在1至60%(重量/體積比)，優(yōu)選4至40%(重量/體積比)的正常濃度范圍內是可溶的。通過這種電滲析處理所獲得的D-泛酸鈣水溶液可用普通方法如噴霧干燥得到D-泛酸鈣粉末。
因此，D-泛酸鈣能有效地從培養(yǎng)肉湯中分離。
D-泛解酸能通過從培養(yǎng)肉湯中去除細胞、用硫酸或鹽酸調節(jié)該液體的pH為1-2、衍生出泛酸內酯(泛解酸的環(huán)化衍生物)、用溶劑(例如，異丙酸乙酯、乙酸乙酯)進行萃取、然后進行濃縮和結晶，以進行分離，從而得到晶體。通過加入氫氧化鈉等很容易使這樣獲得的泛酸內酯還原成泛解酸。
實 例在下文中通過以下實例對本發(fā)明進行更詳細地描述，這些實例僅是本發(fā)明的實施方案，它們不能以任何方式限制本發(fā)明范圍。
D-泛酸可用高性能液體色譜法進行定量(柱Shimadzu SCR101H(7.9mm直徑×30cm);微生物相0.008N硫酸;流量0.8毫升/分鐘;檢測器差動式折射計)和/或微生物的生物試驗(指示菌株植物乳桿菌 IFO 3070;培養(yǎng)液市售可得的泛酸試驗培養(yǎng)液(由DIFCO生產))。泛解酸的定量測定和光學純度測定是通過離心從培養(yǎng)肉湯中去除細胞后用高性能乙酸乙酯抽提物的液體色譜法進行的(柱SUMICHIRAL OA-1200;微生物相n-己烷/1，2-二氯代乙烷/乙醇＝90/8/2;流量1.0毫升/分鐘;檢測器UV)，將6N鹽酸加到該上清液中，接著在水浴中在80℃加熱15分鐘(該操作使平衡的泛解酸轉化成泛酸內酯)。
實例1在含20ml如表3所示組合物的第一消毒種培養(yǎng)液的200ml錐形瓶中接種得自斜面培養(yǎng)液的白金圈大腸桿菌IF03547菌株、FV5714(IFO15368)菌株、FV525(IFO15369)菌株、FV814(IFO15370)菌株、或FV521菌株，隨后以220rpm的轉速在30℃進行20小時的旋轉振動培養(yǎng)。將該第一種培養(yǎng)液1ml部分移至含有20ml表4所示組合物消毒培養(yǎng)液的200ml肋狀錐形瓶中，然后在38℃下培養(yǎng)20小時，在每個瓶中加入2.5ml、54%含水葡萄糖溶液之后，再培養(yǎng)24小時。在培養(yǎng)完成后所產生的泛解酸量和光學純度以及積累的泛酸的量在表5中給出。
表3組合物培養(yǎng)液(pH7.0)成分 濃度玉米浸液 0.5%(NH4)2SO40.5%MgSO4·7H2O 0.01%KH2PO40.01%K2HPO40.03%CaCO31.0%葡萄糖 5.0%
表4培養(yǎng)液①(pH7.0) 培養(yǎng)液②(pH7.0)成分 濃度 成分 濃度玉米浸液 0.2% 玉米浸液 0.2%(NH4)2SO41.5% (NH4)2SO41.5%MgSO4·7H2O 0.02% MgSO4·7H2O 0.02%KH2PO40.05% KH2PO40.05%K2HPO40.1% K2HPO40.1%CaCO32.0% CaCO32.0%葡萄糖 9.0% 葡萄糖 9.0%β-丙氨酸 2.0%表5培養(yǎng)液① 培養(yǎng)液②菌株 生成的泛解酸量 光學純度 生成的泛解酸量(mg/ml) (%ee) (mg/ml)大腸桿菌IFO3547 未測出 - 0.1FV5714 1.5 100 7.0FV525 2.8 100 11.0
FV814 3.0 100 13.0FV521 3.5 100 13.9實例2在含有20ml如表3所示組合物的第一消毒種培養(yǎng)液的200ml錐形瓶中接種得自斜面培養(yǎng)液的白金圈大腸桿菌FV221菌株、FV6051菌株，隨后以220rpm的轉速在30℃進行20小時的旋轉振動培養(yǎng)。將該第一種培養(yǎng)液1ml部分移至含有40ml如表6所示組合物的消毒培養(yǎng)液的200ml肋狀錐形瓶中，然后在38℃下培養(yǎng)20小時，在每個瓶中加入5ml、54%含水葡萄糖溶液之后，立刻再培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)完成后所產生的泛解酸量和光學純度以及積累的泛酸量，在表5中給出。
表6培養(yǎng)液①(pH7.0) 培養(yǎng)液②(pH7.0)成分 濃度 成分 濃度玉米浸液 2.0% 玉米浸液 2.0%(NH4)2SO41.5% (NH4)2SO41.5%MgSO4·7H2O 0.02% MgSO4·7H2O 0.02%KH2PO40.05% KH2PO40.05%K2HPO40.1% K2HPO40.1%CaCO33.0% CaCO33.0%葡萄糖 9.0% 葡萄糖 9.0%β-丙氨酸 2.0%
表7培養(yǎng)液① 培養(yǎng)液②菌株 生成的泛解酸量 光學純度 生成的泛解酸量(mg/ml) (%ee) (mg/ml)大腸桿菌FV221 3.2 100 15.8FV6051 3.9 100 16.3FV5069 4.5 100 17.9實例3ⅰ)DNA染色體的制備將能產生D-泛酸的大腸桿菌FV525菌株接種到1升的L培養(yǎng)液中(1.0%Bactotrypton、0.5%酵母提取物、0.5%氯化鈉)，隨后在37℃下過夜培養(yǎng)。最后，用Saito等人的方法用苯酚[Biochim.Biophys.Aeta，72，619(1963)]從該細胞中獲得DNA染色體3.3mg。
ⅱ)將DNA染色體插入載體質粒pMW118除非另外說明以下實驗均按T.Maniatis等人在Molecular Cloning中(由University of Tokyo Press，1982出版)所述方法進行操作。
用限制性酶EcoRI(由Nippon Gene生產)分別使在上述第ⅰ)項中獲得的DNA染色體10μg和pMW118(由Nippon Gene生產)分裂，隨后在存在T4噬菌體-衍生的DNA連接酶(由Nippon Gene生產)的條件下進行混合和連接。
ⅲ)泛酸生物合成系統基因的克隆用合適的細胞方法進行轉化。確切地說，合適的細胞是用得自大腸桿菌C600菌株的亞硝基胍誘變衍生的D-泛酸營養(yǎng)缺陷體A4C菌株(IFO 15251，FERM BP-3677)制備的。在該上清液中加入在上述第ⅱ)項中制備的質粒DNA，從而使它用于轉化。然后將含該轉化體的懸浮液涂于含M-9瓊脂培養(yǎng)液(0.6%磷酸氫二鈉、0.3%磷酸二氫鉀、0.1%氯化銨、0.05%氯化鈉、1mM硫酸鎂、0.1mM氯化鈣、0.5%葡萄糖、10μg/ml維生素B1、50μg/ml蘇氨酸、50μg/ml亮氨酸、1.5%瓊脂、pH7.2)的培養(yǎng)板上，添加50μg/ml氨芐青霉素的鈉鹽，隨后在37℃下培養(yǎng)2天。從該板培養(yǎng)液中的克隆生長物中獲得耐氨芐青霉素和能生產D-泛酸的轉化體。將用從大腸桿菌FV525菌株的DNA染色體插入衍生出的運載質粒轉化的A4C菌株命名為A4C/pFV31菌株(IFO 15367)。
ⅳ)從轉化體中提取質粒最后，從1升的該轉化體大腸桿菌A4C/pFV31菌株的培養(yǎng)肉湯中獲得600μg的質粒，且命名為pFV31。
ⅴ)質粒pFV31的分析用各種抑制性酶使pFV31分裂，并進行瓊脂糖凝膠電泳。從該電泳圖中，以λ形噬菌體DNA(由Nippon Gene生產)Hind Ⅲ消化產物的分子量為基礎制備圖1所示的限制性酶分裂圖。發(fā)現pFV31是在pMW118的EcoRI位點載帶約2.5kb的DNA片斷的重組質粒。
ⅵ)重新轉化為了證實在pFV31中存在包括泛酸或其鹽的生物合成的基因，用上述質粒DNA使α-酮泛解酸營養(yǎng)缺陷體A1B菌株、β-丙氨酸營養(yǎng)缺陷體A17C菌株和泛酸營養(yǎng)缺陷體A4C菌株，(均通過大腸桿菌C600菌株的亞硝基胍誘變衍生的)重新轉化。所得到的轉化體能在上述M-9瓊脂培養(yǎng)液中生長，從而證實在pFV31中存在酮泛酸羥基甲基轉化酶、天冬氨酸-α-脫羧酸以及泛酸合成酶基因。
此外，為證實該轉化體能生產泛酸，用pFV31使大腸桿菌IFO 3547菌株、FV5714、FV525、FV814、FV521、FV221、FV6051和FV5069進行轉化。如此獲得的轉化體分別命名為大腸桿菌3547/pFV31菌株、5714/pFV31菌株、525/pFV31菌株、814/pFV31菌株、521/pFV31菌株、221/pFV31菌株、6051/pFV31菌株和5069/pFV31菌株。
實例4使如表3所示組合物液體培養(yǎng)液在高壓滅菌器中在121℃加熱消毒15分鐘，并且以每瓶20ml分配到200ml的錐形瓶中。每瓶中接種實例3第ⅳ)項中得自斜面培養(yǎng)液的大腸桿菌3547/pFV31菌株、5714/pFV31菌株、525/pFV31菌株、814/pFV31菌株、或521/pFV31菌株的白金圈，然后以220rpm轉速，在30℃進行旋轉振動培養(yǎng)20小時。將該種培養(yǎng)液(1ml部分)移至20ml如表4所示的組合物培養(yǎng)液中，隨后，在38℃在200ml肋狀錐形瓶中培養(yǎng)20小時，每瓶中加入2.5ml、54%葡萄糖含水溶液，立刻再培養(yǎng)24小時以上。在培養(yǎng)完成之后所產生的泛解酸量和光學純度以及積累的泛酸量，在表8中給出。
表8培養(yǎng)液① 培養(yǎng)液②菌株 生成的泛解酸量 光學純度 生成的泛解酸量(mg/ml) (%ee) (mg/ml)大腸桿菌3547/pFV31 2.2 100 13.05714/pFV31 3.4 100 14.4525/pFV31 7.4 100 25.0814/pFV31 8.5 100 31.5521/pFV31 9.6 100 34.9實例5將表3所示組合物的一種液體培養(yǎng)液在高壓滅菌器中在121℃加熱消毒15分鐘，并且以每瓶20ml分配到200ml的錐形瓶中。每瓶中接種實例3第ⅵ)項中得自斜面培養(yǎng)液的大腸桿菌221/pFV31菌株、6051/pFV31菌株、或5069/pFV31菌株的白金圈，然后以220rpm轉速，在30℃進行旋轉振動培養(yǎng)20小時。將該種培養(yǎng)液(2ml部分)移至40ml如表6所示的組合物培養(yǎng)液中，隨后，在38℃在200ml肋狀錐形瓶中培養(yǎng)24小時，每瓶中加入5ml、54%葡萄糖含水溶液后，立刻再培養(yǎng)24小時。在培養(yǎng)完成之后所產生的泛解酸量和光學純度以及積累的泛酸量，在表9中給出。
表9培養(yǎng)液① 培養(yǎng)液②菌株 生成的泛解酸量 光學純度 生成的泛解酸量(mg/ml) (%ee) (mg/ml)大腸桿菌FV221/pFV31 9.8 100 32.6FV6051/pFV31 10.5 100 41.3FV5069/pFV31 11.2 100 45.4實例6在含20ml表3所示組合物的第一消毒種培養(yǎng)液的200ml錐形瓶中加入得自斜面培養(yǎng)液的白金圈大腸桿菌814/pFV31菌株，隨后以220rpm的轉速，在30℃進行24小時的旋轉振動培養(yǎng)。將該第一種培養(yǎng)液(20ml部分)移至含有200ml相同組合物的第二消毒種培養(yǎng)液的1000ml錐形瓶中，隨后以220rpm的轉速，在30℃進行24小時的旋轉振動培養(yǎng)。將該第二種培養(yǎng)液(125ml部分)移至5升發(fā)酵罐中，其中含有2.3升消毒培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液含有250g葡萄糖、12.5g玉米漿、37.5g硫酸銨、1.25g磷酸二氫鉀、2.5g磷酸二鉀、0.5g硫酸鎂、75g碳酸鈣、和33gβ-丙氨酸(pH7.0)，然后在38℃下培養(yǎng)，同時通氣(0.8體積/體積/分鐘)并攪拌(800rpm)。16至62小時后開始，連續(xù)加入葡萄糖，以保持其濃度在2%至3%之間。培養(yǎng)68小時后，最終液體體積是2.5升，D-泛酸生成量是38.5g/l。
實例7將2.0升實例6中獲得的發(fā)酵肉湯(含有77.0gD-泛酸)在80℃加熱10分鐘，然后過濾以去除細胞和不溶物質。該濾液與洗滌液合并，得到2.4升液體，使其通過填充600mIDIAION PK-216(H型)的柱，然后通過填充340mIDIAION PA-412(OH型)的柱，與水洗脫液相合并得到總共4.1升處理過的液體(pH3.2)，加入氫氧化鈣將該處理過的液體pH調節(jié)到6.8再加入5克活性碳，然后進行過濾。將濾液和洗滌液合并，得到4.2升含有75.1克D-泛酸的液體，從該數值計算得到D-泛酸鈣的含量為82.0克。該液體可用作結晶的起始液。
使2.1升如此獲得的4.2升起始材料結晶液體(含有41.0克D-泛酸鈣)在減壓條件下濃縮，從而得到約43%(重量/重量)濃度的最終D-泛酸鈣。在該濃縮液中加入410ml甲醇并加入0.5克晶種，隨后在30℃緩慢攪拌5小時。然后，使該液體在5℃下靜置14小時接著通過過濾分離晶體并干燥，所得晶體重6.3克，純度為98.5%。
實例8使2.1升實例7中所得的4.2升起始材料結晶液體(含有41.0克D-泛酸鈣)在減壓條件下濃縮，從而得到約43%(重量/重量)濃度的最終D-泛酸鈣。在該濃縮液中加入100ml甲醇。混合后，加入310ml含有37.94克氯化鈣二水合物的甲醇溶液，并加入0.5克晶種，隨后在50℃下緩慢攪拌5小時。通過過濾收集晶體并干燥。所得晶體重41.95克，且含有74.3%(重量/重量)D-泛酸、13.6%(重量/重量)Ca和12.1%(重量/重量)C1的組合物。這一發(fā)現證明這種晶體是1∶1摩爾比的一種D-泛酸和氯化鈣的絡合鹽。
將40克這樣的絡合鹽溶于約2升的水中，并用電滲析器進行電泳〖TS-2-10型(Tokuyama Soda);陽離子可滲透膜Neocepter CM-1;陰離子可滲透膜Neocepter ACS;電極液0.2N硝酸鈣水溶液;流量0.3升/分鐘;電壓10V)。結果，該氯化鈣去除出系統外面，且獲得含D-泛酸和鈣摩爾比為2∶1的D-泛酸鈣水溶液(pH7.0)。將該D-泛酸鈣水溶液在減壓下濃縮，使其濃度約為50%(重量/重量)，然后使用噴射干燥器進行噴射干燥，從而得到34.0克D-泛酸鈣粉末。該粉末的D-泛酸鈣純度為99.8%(重量/重量)([α]D＝+28.1(c＝5，H2O)〗。
實例9在含有20ml如表3所示組合物的第一消毒種培養(yǎng)液的200ml錐形瓶中加入得自斜面培養(yǎng)液的白金圈大腸桿菌5069/pFV31菌株，隨后以220rpm的轉速，在30℃進行24小時的旋轉振動培養(yǎng)。將該第一種培養(yǎng)液20ml移至含有200ml相同組合物的第二消毒種培養(yǎng)液的1000ml錐形瓶中，隨后在30℃下進行24小時的旋轉振動培養(yǎng)。將該第二種培養(yǎng)液75ml移至3升的發(fā)酵罐中，其中含有1.35升一消毒培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液含有75g葡萄糖、30g玉米漿、22.5g硫酸銨、0.75g磷酸二氫鉀、1.5g磷酸二鉀、0.3g硫酸鎂、45g碳酸鈣、0.75mg維生素B1和15gβ-丙氨酸(pH7.0)，然后在38℃下培養(yǎng)，同時通氣(0.8體積/體積/分鐘)并攪拌(700rpm)。在培養(yǎng)開始之后15、27、和38.5小時間歇加入葡萄糖，以保持5%濃度。在培養(yǎng)開始之后27和46.5小時還加β-丙氨酸以保持1%濃度，和在培養(yǎng)開始之后30和50小時0.75mg維生素B1。在培養(yǎng)72小時后，該最終液體體積是1.58升，D-泛酸量是65.4g/l。
權利要求
1.一種生產D-泛解酸或其鹽的方法，該方法包括培養(yǎng)屬于腸桿菌科的耐水楊酸和能生產D-泛解酸的微生物，積累D-泛解酸或其鹽，然后將其收獲。
2.如權利要求1所述的生產方法，其中所述微生物還至少耐α-酮異戊酸、α-氧代丁酸、α-氨基丁酸、β-羥基天冬氨酸和O-甲基蘇氨酸之一種。
3.一種生產D-泛酸或其鹽的方法，其特征在于將屬于腸桿菌科的耐水楊酸和能生產D-泛酸的微生物與β-丙氨酸相接觸。
4.如權利要求3所述的生產方法，其中所述微生物還至少耐α-酮異戊酸、α-氧代丁酸、α-氨基丁酸、β-羥基天冬氨酸和O-甲基蘇氨酸之一種。
5.如權利要求1、2、3、或4所述的生產方法，其中所述微生物是用包括泛酸或其鹽或其一部分區(qū)域生物合成運載基因區(qū)的一種質粒DNA轉化的一種微生物。
6.如權利要求1、2、3、4、和5所述的生產方法，其中所述微生物是屬于埃希桿菌屬的一種微生物。
7.一種能生產D-泛酸的微生物，它是用包括泛酸或其鹽或其一部分區(qū)域生物合成運載基因區(qū)的一種質粒DNA轉化的一種微生物。
8.一種質粒DNA，它具有用包括泛酸或其鹽或其一部分區(qū)域生物合成的一種基因區(qū)。
9.一種純化D-泛酸鈣的方法，該方法用可允許氯離子通過而不允許泛酸離子通過的陰離子可滲透膜且用硝酸鈣水溶液作為電極溶液使將D-泛酸鈣和氯化鈣的絡合鹽水溶液電滲析。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產D-泛酸或其鹽的方法和生產D-泛解酸或其鹽的方法。D-泛酸，D-泛解酸或其鹽能有效地直接用微生物方法獲得，而不需要使用DL-泛解酸、DL-泛酸內酯等作起始材料。
文檔編號C12R1/19GK1095105SQ9311417
公開日1994年11月16日 申請日期1993年9月25日 優(yōu)先權日1992年9月25日
發(fā)明者引地裕一, 守谷岳郎, 三木啟司, 山口高正, 野上昱雄 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社