專利名稱：D-α氨基酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及D-α-氨基酸的制備方法，該方法是使用具有脫氨基甲?；钚缘拿?以下稱為“脫氨基甲?；浮?作用于用下述通式表示的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸， [式中R是苯基，羥基取代的苯基，取代或未取代的最好是1-5個碳原子的烷基或亞硫酰基]得到用下述通式表示的D-α-氨基酸。
[式中的R定義同上]這種旋光性的D-α-氨基酸類化合物是作為醫(yī)藥中間體，特別是半合成青霉素，半合成頭孢菌素的中間體的重要化合物，例如可以舉出其中的工業(yè)上極為有用的D-苯基甘氨酸和D-(4-羥苯基)甘氨酸(以下稱為“D-PHG”)
從相應(yīng)的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸類化合物通過脫氨基甲?；玫紻-α-氨基酸的制備方法是公知的，可用化學(xué)方法(特公昭58-4707)和利用微生物酶反應(yīng)的方法(特公昭57-18793，63-20520，及特公平1-48758)來脫除上述氨基甲?；?。
但是，上述微生物酶，多數(shù)適用于PH為中性附近。將相應(yīng)于D-α-氨基酸的DL-5取代海因，通過酶的作用將其D-異構(gòu)體選擇性地水解制得N-氨基甲?；?D-α-氨基酸;繼之通過脫氨基甲酰基酶的作用可得到D-α-氨基酸。因為在第一階段對海因水解酶合適的PH值是8-9，因而第二階段的脫氨基甲?；傅姆磻?yīng)必須在不同的反應(yīng)體系中進行。
在研究具有能夠使D-N-氨基甲酰基類通過酶的作用脫除氨基甲?；D(zhuǎn)變?yōu)镈-α-氨基酸的微生物方面，本發(fā)明人集中研究了各種原來不知道存在脫氨基甲?；傅木鷮?，結(jié)果發(fā)現(xiàn)屬于Comamonas屬，Blastobacter屬，Alcaligenes屬，Sporosarcina屬，Rhizobium屬，Bradyrhizobium屬或Arthrobacter屬的菌屬具有脫除氨基甲?；钚裕瑥亩瓿闪吮景l(fā)明。
也就是說，本發(fā)明是關(guān)于以通式(Ⅰ)表示的N-氨基甲?；?D-α-氨基酸 在水溶性介質(zhì)中，在微生物產(chǎn)生的酶的作用下，制備以通式(Ⅱ)表示的D-α-氨基酸的制備方法。
[式中R的定義同前]本發(fā)明提供了用屬于Comamonas屬，Blastobacter屬，Alcaligenes屬，Sporosarcina屬，Rhizobium屬，Bradyrhizobium屬或Arthrobacter屬的微生物產(chǎn)生的酶，即將N-氨基甲酰基-D-α-氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)镈-α-氨基酸的脫氨基甲?；笧樘卣鞯腄-α-氨基酸的制備方法。
雖然，在本發(fā)明中使用的脫氨基甲酰基酶對D-異構(gòu)體有特異的作用，但也可使用對D-異構(gòu)體或L-異構(gòu)體均有作用的酶。另外，對D-N-氨基甲?；?α-氨基酸有嚴格的立體選擇性的酶被稱為D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸酰胺氫化酶。
在這些微生物中脫氨基甲?；钚暂^高的菌株是Comamonas sp.E 222C(FERM BP 第13170號)、Comamonas sp.E 206a、Comamonas sp.E 217a、Blastobacter sp.NA 88-b Blastobacter sp. A17 p-4(FERM BP第13169號)、Alcaligenes sp.E 215(FERM BP 第13168號)，Alcaligenes.xylosoxidans Subsp denitrificans CL66-2a，Sporosarcina sp.NCA 28-b(FERM BP第13174號)、Rhizobium sp. KNK 1415(FERM BP第_號)、Bradyrhizobium Japonicum IFO 14783、Bradyrhizobium sp.IFO 15003，Arthrobacter sp.CA 17-2(FERM BP 第_號)。
作為上述細菌的代表例，下面將Comamonas sp.E 222C、Blastobacter sp. A17 p-4、Alcaligenes sp.E 215、Sporosarcina sp.NCA 28-b、Rhizobium sp. KNK 1415和Arthrobacter sp.CA17-2的細菌學(xué)性質(zhì)說明如下。
Comamonas sp.E222C(a)形態(tài)特征桿菌(彎曲的)革蘭氏染色性可變的有無孢子無菌落態(tài)淡黃色，稍半透明，園形，規(guī)則的，正園形，有光澤，低的凸面，光滑，直徑1mm(48 hr)培養(yǎng)溫度37℃ +(48 hr) 41℃ -45℃ -(b)生理學(xué)性質(zhì)放氧酶 +氧化酶 -葡糖發(fā)酵性 -NO3還原性 -生成吲哚 -
從葡糖生成酸 -精氨酸脫氫酶 -尿素酶 -七葉靈(Aesculin)水分解 -明膠水分解 -β-半乳糖酶 -細胞色素氧化酶 +(弱)(c)同化能力葡糖 -阿拉伯糖 -甘露糖 -甘露糖醇 -N-乙?；咸前? -麥芽酚 -葡糖酸 +己酸 +己二酸 -蘋果酸 +檸檬酸 +乙酸苯酯 +Blastobacter sp. A 17 p-4(a)形態(tài)特征桿菌(卵型)
革蘭氏染色性 陰性有無孢子無菌落態(tài)白色，稍半透明，園形，規(guī)則的，正園形，有光澤，低的凸面，平滑，生成類粘朊，直徑1.0-1.5mm(48 hr)培養(yǎng)溫度37℃ +(48 hr) 41℃ -45℃ -(b)生理學(xué)性質(zhì)放氧酶 +氧化酶 +(弱)葡糖發(fā)酵性 -NO3還原性 -生成吲哚 -從葡糖生成酸 -精氨酸脫氫酶 -尿素酶 +七葉靈水分解 +明膠水分解 -β-半乳糖酶 +細胞色素氧化酶 +(弱)(c)同化能力葡糖 +阿拉伯糖 +甘露糖 +
甘露糖醇 +乙酰基葡糖胺 +麥芽酚 +葡糖酸 -己酸 -己二酸 -蘋果酸 -檸檬酸 -乙酸苯酯 -Alcaligenes Sp.E215(a)形態(tài)特征桿菌革蘭氏染色性可變有無孢子無運動性有菌落態(tài)淡黃色，稍半透明，園形，規(guī)則的，正園，低凸面，有光澤，光滑，直徑1mm(48 hr)培養(yǎng)溫度37℃ +(48 hr) 41℃ -45℃ -(b)生理學(xué)性質(zhì)放氧酶 +氧化酶 -
葡糖發(fā)酵性 -Sporsarcina Sp.NCA 28-b(a)形態(tài)特征球菌革蘭氏染色性可變有無孢子無運動性有菌落態(tài)園形，規(guī)則的，正園形，奶油色或白色，稍半透明，直徑0.5mm以下(48 hr)培養(yǎng)溫度37℃ -45℃ -(b)生理學(xué)性質(zhì)放氧酶 +氧化酶 +葡糖發(fā)酵性 -Rhizobium Sp.KNK-1415(FERM BP-)(a)形態(tài)特征桿菌(稍呈棍棒狀的短桿菌)革蘭氏染色性陰性有無孢子無邊毛極附近或周生菌落態(tài)稍黃色帶白色，無光澤，真園形，大而光滑，稍凸面，直徑5mm(5天)生成類粘朊。
培養(yǎng)溫度30℃ +37℃ ±(b)生理學(xué)性質(zhì)放氧酶 +氧化酶 +葡糖發(fā)酵性 -NO3還原性 +生成吲哚 -從葡糖生成酸 -精氨酸脫氫酶 -尿素酶 +七葉靈水分解 +明膠水分解 -β-半乳糖酶 +細胞色素氧化酶 +生成3-羰基乳糖 -生成H2S -(c)同化能力葡糖 +阿拉伯糖 +甘露糖 +甘露糖醇 +N-乙?；咸前? +
麥芽酚 +葡糖酸 -己酸 -己二酸 -蘋果酸 -檸檬酸 -乙酸苯酯 -GC含量 63.4%醌分析 Q-10 95.7%Q-9 3.3%Q-11 0.6%Q-8 0.4%菌體脂肪酸分析(全部菌體脂肪酸)成分名 面積比(%)3-OH C 14∶0 4.6C 16∶1 5.9C 16∶0 14.03-OH C 16∶0 0.1C 18∶1 70.7C 18∶0 3.3未知物 1.4(3-OH 脂肪酸)
成分名 面積比(%)3-OH C 14∶0 88.83-OH C 16∶0 6.63-OH C 18∶0 4.6(2-OH 脂肪酸)未檢出Arthrobacter Sp.CA 17-2(FERM BP-4420)(a)形態(tài)特征桿菌或球菌革蘭氏染色性陽性有無孢子無運動性有菌落態(tài)稍黃色帶有白色，無光澤，園形，大小整齊，凸面，光滑，直徑約0.5mm(2天)培養(yǎng)溫度30℃ +37℃ (+)45℃ -(b)生理學(xué)性質(zhì)放氧酶 +氧化酶 -葡糖發(fā)酵性 -(c)化學(xué)分類學(xué)分析肽聚糖氨基酸 L-賴氨酸霉菌酸脂肪酸組成反異C15∶0(12-甲基十四烷酸)58%異C15∶0(13-甲基十四烷酸)5.5%異C16∶0(14-甲基十五烷酸)8%反異C17∶0(14-甲基十六烷酸)25%用常規(guī)的方法培養(yǎng)微生物能夠產(chǎn)生出上述脫氨基甲?；钚缘拿?，雖然通常采用液體營養(yǎng)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，但也可以在固體表面進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)其中通常含有同化的碳源、氮源各種微生物生長所必須的無機鹽營養(yǎng)素。而且，加入少量D-對羥苯基甘氨酸，D-苯基甘氨酸等D-氨基酸;N-氨基甲酰基-DL-蛋氨酸，N-氨基甲?；?D-苯基丙氨酸等N-氨基甲?；?α-氨基酸類;DL-5-對羥苯基海因，DL-5-苯基海因等5取代海因類;尿嘧啶，二氫尿嘧啶，β-脲基丙酸等嘧啶代謝物;Fe2+，F(xiàn)e3+，Be2+，Co2+，Al3+，Li+，Mn2+，Mg2+，Cs+等金屬離子，尿素等對增強脫氨基甲酰基酶的能力是有宜的。這種脫氨基甲?；冈鰪娕囵B(yǎng)基的濃度可選擇金屬離子0.1-10mM，其它基質(zhì)0.01-1%重量范圍。
培養(yǎng)溫度為20-85%，PH值4-11，通氣攪拌可促進微生物的生長。
對于D-N-氨基甲?；?α-氨基酸的脫氨基甲酰基反應(yīng)，可使用上述得到的微生物的培養(yǎng)液，菌體或菌體處理物作酶的來源。對于菌體當然可采用生菌體，但本發(fā)明可利用凍結(jié)的干燥菌體，以及菌體破碎物及菌體提取物，及用表面活性劑和超聲波處理后的菌體作為酶源，進而可以從這些菌體的破碎物、提取物及處理所得到的精制的或部分精制的酶或粗酶的狀態(tài)來使用，而且可將這種酶或粗酶固化作為固化酶使用。例如可使用WO PCT/JP 91/01696所述的固化方法。
而且從這些微生物通過基因得到的酶和直接從這些微生物得到的酶基本上是等效的。
脫氨基甲?；磻?yīng)在水溶性介質(zhì)中進行，雖然可采用的PH值為6-11，但PH值為7-9.5特別好。而且具有PH值為8-9的酶更好。雖然脫氨基甲?；磻?yīng)的溫度通常為20-85℃，但應(yīng)根據(jù)使用的菌株采用對酶合適的溫度。
對于本發(fā)明來說，作為脫氨基甲?；富|(zhì)的N-氨基甲酰基-D-α-氨基酸化合物的實例，可以舉出D-N-氨基甲酰基丙氨酸，D-N-氨基甲?；鞍彼?，D-N-氨基甲?；i氨酸，D-N-氨基甲?；涟彼?，D-N-氨基甲?；拾彼幔珼-N-氨基甲?；?(4-羥苯基)甘氨酸，D-N-氨基甲?；?(2-亞硫?；?甘氨酸，D-N-氨基甲?；彼岬?。通式中的R是取代的烷基時，作為其取代基可以是苯基，吲哚基，烷硫基，羥基，氨基，羧基等。
上述通過微生物酶脫氨基甲酰基反應(yīng)生成的D-α-氨基酸的分離，可采用濃縮，中和，離子交換法等公知技術(shù)。也就是說，對于D-苯基甘氨酸，D-(4-羥苯基)甘氨酸，D-亮氨酸和D-苯基丙氨酸等較疏水性的α-氨基酸，在除去酸性或堿性的不溶物以后，可以通過濃縮，中和等操作沉淀出所需的D-α-氨基酸;對于D-亞硫?；拾彼?、D-絲氨酸和D-丙氨酸等較親水性的α-氨基酸，可通過同離子交換樹脂吸附所需化合物，用氨水等洗脫，然后中和，濃縮等得到所需化合物。
作為上述脫氨基甲?；|(zhì)的N-氨基甲?；?D-氨基酸化合物，可以通過從各種屬的微生物培養(yǎng)液，菌體，菌體處理物或菌體中提取出的酶與5-取代海因類化合物反應(yīng)而制得。這種制備方法記載于特開昭53-44690，53-69884，53-91189，53-133688，54-84086及55-7001中。
用本發(fā)明的方法，可將上述D-氨基甲?；?α-氨基酸類化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的旋光性的D-α-氨基酸類化合物。
用以下實施例具體地說明本發(fā)明實施例1將土釀試樣(由日本各地采集)和2ml培養(yǎng)基A(1g/l KH2PO4，1g/l K2HPO4，0.3g/l MgSO47H20，0.1g.l酵母浸液，1g/l NH4Cl，1.5g/l下述記載的化合物作碳源，(PH0.7)或培養(yǎng)基B(1g/l KH2PO4，1g/l K2HPO4，0.3gl MgSO4·7H2O，0.5g/L葡糖，0.1g/L酸母浸液，1.5g/l下述記載的化合物作為氮源(ph 7.0)接種，于28℃及好氧條件下振蕩培養(yǎng)，在同樣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至微生物增殖。然后在平板培養(yǎng)基(含2%瓊脂的和上述的培養(yǎng)基)擴展，于28℃培養(yǎng)2-6天，分離出微生物。
作為碳源或氮源的化合物N-氨基甲?；?D-對羥苯基甘氨酸(C-D-HPG)N-氨基甲?；?D-苯基甘氨酸(C-D-PG)N-氨基甲酰基-D-丙氨酸(C-D-Ala)DL-5-甲基海因(DL-Ala-hyd)
DL-5-苯基海因(DL-PG-hyd)DL-5-對羥苯基海因(DL-HPG-hyD)瓜氨酸苯基脲氨基甲酸正丁酯把各個平板培養(yǎng)基上的菌株懸浮于100ml反應(yīng)液(35mM C-D-HPG，200mM磷酸鉀緩沖液，PH7.0)里，于28℃反應(yīng)1-3天后，用薄層色譜法分析氨基甲?；鵇-HPG和D-HPG，使用默克公司制造的60F254板，用丁醇∶乙酸∶水＝3∶3∶1(V/V/V)展開，用紫外線燈(254nm)或?qū)?二甲氨基)肉桂醛和水合茚滿三酮噴霧檢出。其結(jié)果為，1868株能作為同化上述碳源或氮源的微生物被分離，其中37株產(chǎn)生D-HPG，其中16株顯示出能良好地產(chǎn)生D-HPG(產(chǎn)生2mM以上的D-HPG)。
實施例2對于實施例1得到的16株脫氨基甲?；干a(chǎn)株，為了進行第2次篩選，用1ml培養(yǎng)基C(1.5g/l C-D-HPG，1g/l KH2PO4，1g/l K2HPO4，0.3g/l MgSO4·7H2O，3g/l酵母浸液，3g/l肉浸液，10g/l甘油，2g/l多胨(pH7.0)于28℃培養(yǎng)3天，將1ml培養(yǎng)液離心分離，將菌體懸浮和實施例1使用的同樣的反應(yīng)液100ml中，于30℃或50℃下反應(yīng)24小時，再對生成的D-HPG進行定量。
對于D-HPG的定量，使用Cosmosil 5C18柱(φ4.6×250mm，納拉第斯克(ナカラィテスク)公司制造)，用水∶乙腈∶磷酸(95∶5∶0.01(V/V/V))作洗提液進行高速液體色譜(HPUC)分離，在254nm處測定吸光度，結(jié)果列于表1。
16株中的3株，E206a，E222c和E215，作為單一碳源培養(yǎng)C-D-Ala，在30℃下顯出高的活性，E222C在30℃下生成30.8mM的D-HPG，于50℃下僅生3.5mM的D-HPG。另外三株即A17p-1，A17p-3和A17p-4，以單一碳源培養(yǎng)C-D-HPG，在50℃下顯示出高的活性。A17p-4在50℃下生成28.8mM的D-HPG，在30℃下反生成2.5mM的D-HPG。
實施例3得到的脫氨基甲酰酶的基質(zhì)特異性為了研究Comamonas sp.222和Blastobacter sp.A 17p-4脫氨基甲?；傅幕|(zhì)特異性，用實施例2所述的培養(yǎng)基C于28℃下將Comamonas sp.E222C基養(yǎng)一天，或者將Blastobacter sp.A17p-4振動培養(yǎng)7天，將3ml培養(yǎng)液離心分離，將該菌懸浮于300μl反應(yīng)液(200mM磷取鉀緩沖液，1%(W/V)的各種反應(yīng)基質(zhì))，Comamonas sp.E222C于30℃，Blastobacter sp.A 17p-4于50℃下分別反應(yīng)24小時。
如表1所示，雖然兩種菌體對于脂肪族和芳香族D-氨基酸的N-氨基甲?；w均顯示了很高的水解活性，但對于帶極性基的氨基酸的N-氨基甲?；w的活性低。另外Comamonas sp.E222C能水解尿基丙酸，Blastobacter sp.A 17p-4也具有海因酶活性。
表1新的脫氨基甲?；傅幕|(zhì)特性 氨基酸轉(zhuǎn)化率
-0%+＜10%++＜50%+++＜80%++++100%實施例4Comamonas Sp.E222c株脫氨基甲?；干a(chǎn)的增強物在培養(yǎng)Comamonas Sp.E222c株時，研究增加脫氨基甲?；府a(chǎn)量的酶制備促進物。
在作為營養(yǎng)基的培養(yǎng)基D(1g/l KH2PO4，1g/l K2HPO4，0.3g/l MgSO·7H2O，3g/l肉浸液.10g/l甘油，2g/l多胨(PH 7.0))中以濃度為0.15%(W/V)加入圖2所示化合物接種菌株后于28℃間歇振蕩培養(yǎng)2天。
將1ml培養(yǎng)液離心分離，將菌體懸浮于100ml反應(yīng)液(200mM)磷酸鉀緩沖液(PH 7.0)，35mM C-D-HPG)，于30℃反應(yīng)24小時，按照實施例2的方法用HPLC法定量生成的D-HPG。結(jié)果如圖2所示，可以看出由于尿素，β-尿基丙酸，D-苯基甘氨酸，N-氨基甲酰基-DL-蛋氨酸而增加了活性。
實施例5Comamonas sp.E222c生產(chǎn)的脫氨基甲?；傅木朴?8℃下將Comamonas sp.E222c用添加了β-脲基丙酸(0.15% W/V)的實施例4所述培養(yǎng)基D振蕩培養(yǎng)3天，將共計3.61的培養(yǎng)基離心分離，分離出菌體，將該菌體懸浮于10mM磷酸鉀緩沖液100ml中(PH 7.0)，用超聲波破碎，離心分離除去殘渣，繼續(xù)往該粗酶液中加硫酸銨，用離心分離得到從飽和濃度20%到40%碳酸銨的沉淀組分并溶于上述緩沖液中。
將177ml上述酶液用101上述緩沖液透析12小時，用DEAE-Sephacel柱(φ5×15cm)吸附，用0-1M的NaCl線性濃度梯度洗脫，收集活性組份，將該洗脫液的NaCl濃度調(diào)至4M，用PhenylSepharose CL-4B柱(φ1.5×15cm)吸附，用4-OM的NaCl線性濃度梯度洗脫，收集的活性組分用YM-10膜(阿密康社)進行超過濾濃縮。
將上述濃縮液(5ml)加到含0.2M NaCl的上述緩沖液中，用Sephacryl S-200 HR柱(φ1.8×80cm)進行凝膠過濾，活性成分經(jīng)透析脫鹽后，用羥磷灰石柱(φ1.2×10cm)吸附，用0-1M磷酸鉀緩沖液(PH 7.0)線性濃度梯度洗脫、將活性組分(8.5ml)用10mM磷酸鉀緩沖液(PH 7.0)500ml透析12小時，將其用Mono Q HR 5/5柱吸附，用0-1.0M NaCl線性濃度梯度洗脫，將此活性組分(1.2ml)作為精制酶液用于分析。
如表2所示，由于進行了精制，和細胞破碎上清液比較比活性提高了108倍，此時的酶活性回收率約為2%。另將10ml如此精制的酶按照King，J和Laemmli，U.K的方法(Journal of Molecular Biology 62，465-477(1971))用10%聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-聚丙烯酰胺膠體電泳測定，如圖3所示，在分子量38000處附近，得到單一的頻帶。

而且，用SephadexG-150柱(φ1.5×85cm)，對含0.2M NaCl和0.1M二硫蘇糖醇(DDT)的10ml磷酸鉀緩沖液(PH 7.0)進行膠體過濾，如圖4所示在分子量為111000附近被洗提出。
實施例6Comamonas E222c脫氨基甲?；傅男再|(zhì)用實施例5得到的酶，將Comamonas SP.E222c產(chǎn)生脫氨基甲?；阜磻?yīng)調(diào)制合適的PH值和適宜的溫度。
用以下方法測定適宜反應(yīng)的PH值。在PH 4.2-5.9時用醋酸一鹽酸緩沖液，在PH 5.0-8.8時，用磷酸鉀緩沖液，在PH 7.6-9.9時，用Tris-鹽酸緩沖液在PH 8.9-11.1時用甘氨酸-NaOH緩沖液作為反應(yīng)液(500μl)的緩沖液(濃度200mM)，加10mM N-氨基甲?；?D-苯基丙氨酸和酶液，將此反應(yīng)液于30℃反應(yīng)20分鐘，加500μl乙醇使反應(yīng)停止。
為了定量生成的D-苯基丙氨酸，往含有200mM磷酸鉀緩沖液(PH 7.0)，1.5mM 4-氨基安替比林，2.1mM 酚，2.25u 過氧化酶(由西洋芥茉得到，CALZ-YME Lab制造)及0.375單位的D-氨基酸氧化酶(西格馬公司制造)的反應(yīng)液中添加一份上述反應(yīng)液(最終容量為500μl)，于37℃反應(yīng)60分鐘，測定500nm處吸光度的增加。
反應(yīng)的最佳溫度，用以下方法確定用磷酸鉀緩沖液(PH 7.0)及和上述同樣組成的反應(yīng)液于10℃-80℃反應(yīng)20分鐘，用靛酚法[Bollter.W.T.等，Analytical Chimistry，33，592-594(1961)]測定生成的氨。
以上結(jié)果如圖5和圖6所示，Comamonas sp.E222c的脫氨基甲?；高m宜的PH值為8-9，適宜的反應(yīng)溫度為40℃。
實施例7Comamonas SP.E222c株脫氨基甲?；傅陌被嵝蛄杏脤嵤├?得到的酶液確定脫氨基甲酰基酶的氨基未端的氨基酸序列。將酶液用三得利康-10微型三得來儀(阿西康公司制造)脫鹽，用脈沖式液相蛋白序列器進行解析其結(jié)果脫氨基甲?；鞍椎陌被┒诵蛄袨?5 10Ser-Arg-lle-Val-Asn-Tyr-Ala-Ala-Ala-Gln-Leu-Gly-1520Pro-lle-Gln-Arg-Ala-Asp-Ser-(Arg)-Ala-Asp-Val-Met25 30Glu-(Arg)-Leu-Leu-Ala-His(第20號和第26號的Arg的峰不清楚，所以不能確定)實施例8Blastobacter SP.A17p-4株脫氨基甲?；傅脑鰪娢镌谂囵B(yǎng)Blastobacter SP.A17p-4株時，研究了增加脫氨基甲?；府a(chǎn)量酶制備增強物。
向和實施例4用的相同的培養(yǎng)基D中添加0.15%(W/V)，圖7所示的化合物接種菌株，于28℃振蕩培養(yǎng)3天。按照實施例4的方法，用HPLC定量反應(yīng)溫度僅40℃生成的D-HPG，發(fā)現(xiàn)如圖7所示的那樣，在添加尿嘧啶，二氫尿嘧啶或β-脲基丙酸的情況下，能夠提高脫氨基甲?；傅漠a(chǎn)量。
進而，為了研究添加金屬離子的效果，往培養(yǎng)基D里加0.15%(W/V)的尿嘧啶再加入2mM濃度的圖8所示的金屬離子。往培養(yǎng)基中接種菌種，于28℃下振蕩培養(yǎng)4天，在定量生成的D-HPG時，發(fā)現(xiàn)如圖8所示的那樣，由于加入了Fe2+，F(xiàn)e3+，Li+，Cs+，Be2+，Mg2+，Mn2+，Co2+，Al3+等離子，增加了脫氨基甲?；傅漠a(chǎn)量。
實施例9Blastobacter SP.A17p-4脫氨基甲?；傅木仆蛯嵤├?用的同樣的培養(yǎng)基中加0.15%(W/V)的尿嘧啶和2mM FeSO4·7H2O，往該培養(yǎng)基中接種Blastobacter SP.A17p-4，于28℃間歇振蕩下培養(yǎng)7天。將合計4.8L培養(yǎng)液離心分離，菌體懸浮于120ml的10mM磷酸鉀緩沖液中，用直徑0.25mm的玻璃珠[Dyno-Mill KDL(瑞士)]于5℃下破碎20分鐘，離心分離除去殘渣，往粗酶液中加硫酸銨，用離心分離出飽和濃度為20%至40%沉淀出硫酸銨沉淀組分，并溶于上述緩沖液中。

將41ml上述酶液用5L上述緩沖液透析，按照實施例5的方法，用DEAE-Sephacel柱和Phenyl-Sepharose CL-6B柱精制，用超過濾濃縮，將該濃縮液(3mml)加到含0.2M的NaCl上述緩沖液中，用Sephadex G 150柱(φ1.5×80cm)進行凝膠過濾，用透析將活性組分脫鹽后，按照實施例5的方法，用Mono QHR 5/5柱精制。將活性組分(2ml)作為精制酶液用于分析。如表3所示，精制的酶液和細胞破碎的上清液比較，比活性提高37倍，此時的酶活性回收率為2.3%。
將上述精制酶進行SDS-聚丙烯酰胺電泳，如圖9所示，在分子量39000附近得到單一的頻帶，再者，按照實施例5的方法進行Sephadex G-150柱凝膠過濾時，如

圖10所示那樣，在分子量為120000附近溶脫出。
實施例10Blastobacter SP.A17p-4脫氨基甲酰基酶的性質(zhì)使用實施例9得到的酶液研究Blastobacter SP.A17p-4脫氨基甲?；阜磻?yīng)合適的PH值和合適的溫度，無論那種場合均按實施例6的方法進行，其結(jié)果用圖11和圖12表示，Blastobacter SP.A17p-4脫氨基甲?；阜磻?yīng)的合適PH值為9，反應(yīng)的合適溫度為50℃。
實施例11Blastobacter SP.A17p-4脫氨基甲酰基酶的氨基酸序列用實施例9得到的酶液，用和實施例7相同的方法確定脫氨基甲酰基酶蛋白的氨基未端的氨基酸序列，該序列為1 5 10Ala-Arg-Lys-Leu-Asn-Leu-Ala-Val-Ala-Gln-Leu-Gly-15 20Pro-Ile-Ala-Arg-Ala-Glu-Thr-Arg-Asp-Gln-Val-Val-25 30 35Ala-Arg-Leu-Met-Glu-Met-Met-Lys-Glu-Ala-Lys-Ser-40Ser-(Arg)-Gly-Thr(38號的Arg峰不清楚，而不能確定)實施例12對于表4的Rhizobium屬及Bradyrhizobium屬的7株，向在1ml 805液體培養(yǎng)基(酵母浸液1g/l，甘露糖醇5g/l，K2HPO40.7g/l，KH2PO40.1g/l，MgSO4·7H2O 1g/l，C-D-HPG 1g/l(PH 7.0)中加C-D-HPG或C-D-Ala至濃度為1g/l的培養(yǎng)基中;接種，于30℃振蕩培養(yǎng)24小時，離心分離收集菌體，并懸浮于0.5ml 1% C-D-HPG或C-D Ala，0.1M磷酸鉀緩沖液(PH 7.0)，0.1% TritonX-100中，于37℃邊振蕩邊反應(yīng)24小時后，按照實施例1方法用薄層色譜層析，如表4所示，可以看出Bradyrhizobium層菌株具有脫氨基甲?；钚?。
表4菌株名稱 脫氨基甲?；富钚訰hizobium loti IFO 14779 ++Rhizobium meliloti IFO 14782 ++Rhizobium fredii IFO 14780 ++Rhizobium galegae IFO 14965 ++Rhizobium hualcuii IFO 15243 +Bradyrhizobium Japonicum IFO 14783 +Bradyrhizobium sp.IFO 15003 +實施例13按照實施例1的方法，進一步從土壤中進行篩選。把篩選物的N-氨基甲?；?D-亮氨酸(C-D-Leu)，N-氨基甲?；?D-丙氨酸，(C-D-Ala)，N-氨基甲酰基-D-苯基甘氨酸(C-D-PG)或DL-5-甲基海因(DL-Ala-byd)作碳源或氮源。在生長的菌體中，對9株使用C-D-Ala和C-D-HPG按照實施例12的同樣方法研究脫氨基甲?；钚裕浣Y(jié)果如表5所示列出了對C-D-HPG活性高的菌株和對C-D-Ala活性高的菌株。
表5菌株名 生長基質(zhì) 活性Rhizobium SP KNK1415 C-D-PG +++(C-D-HPG)Alcaligenes.
Xylosoxidans Subspdenitrificans CL66-2a C-D-Leu ++(C-D-HPG)CL67-1 C-D-Leu ++(C-D-HPG)CL85-1 C-D-Leu ++(C-D-HPG)CA17-1 C-D-Ala +(C-D-Ala)ArhrobacterCA17-2 C-D-Ala ++(C-D-Ala)CA77-2 C-D-Ala ++(C-D-Ala)AH71-1 DL-Ala-hyd ++(C-D-Ala)AH57-1 DL-Ala-hyd ++(C-D-Ala)實施例14將實施例3得到的Rhizobium SP KNK 1415接種于101 SE培養(yǎng)基中(蔗糖 23g/l)，酵母浸液4g/l，尿素2g/l，KH2PO42g/l，Na2HPO42g/l，MgSO4·7H2O 1g/l，MnCl2·4H2O 0.01g/l(PH 6.5))，于30℃振蕩培養(yǎng)40小時，離心分離收集菌體，用0.9%食鹽水洗菌體后用超聲波破碎菌體，離心分離除去殘渣后，用硫酸精朊處理(0.1mg/mg蛋白)除去核酸，將離心后的上清液于50℃加熱30分鐘，離心除去變性蛋白，添加硫酸銨，使之成為30%飽和濃度，用離心分離收集沉淀，溶于500ml 20mM的Tris.HCl(PH 7.5)，2mM的DTT，用同樣的緩沖液透析后，用DEAE纖維素柱吸附，用10mM磷酸鈉緩沖液(PH 7.2)，0.15M NaCl，1mM DTT.洗提。將該洗提液用YM-10膜(阿密康公司制造)超過濾濃縮，將該酶液用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析，在約35000附近該脫氨基甲?；赣緞?。
實施例15從分析實施例14得到的脫氨基甲?；赣玫腟DS-聚丙烯酰胺凝膠中切出脫氨基甲?；笌?band)的部分，在洗提緩沖液(50mM Tris.HCl(PH 7.5%)，0.1% SDS，0.1mM EDTA，150mM NaCl，5mM DTT)均化在室溫下洗提出。將該洗提液用超過濾濃縮，加在反相HPLC柱(AP-303;YMC公司制造)上，用乙腈濃度梯度洗提。將含脫氨基甲?；傅慕M分加在氣相蛋白序列器上(阿布拉依特生物工程社制)解析后知道脫氨基甲酰基酶的具有(式5)的序列。
發(fā)現(xiàn)了用于制備抗菌素重要中間體的D-α-氨基酸的新的脫氨基甲?；浮：瓦^去使用和條件不同，例如在PH 8-9及50℃下進行反應(yīng)，能夠有效地制備D-氨基酸。圖的簡要說明圖1表示根據(jù)篩選得到的菌株于50℃和30℃脫氨基甲?；磻?yīng)結(jié)果圖2表示在培養(yǎng)Comamonas SP.E222c時，添加化合物對產(chǎn)生脫氨基甲?；傅挠绊憟D3表示在培養(yǎng)Comamonas SP.E222c精制脫氨基甲?；赣肧DS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析的結(jié)果圖4Comamonas SP.E222c精制脫氨基甲?；赣肧epbadexG-150柱進行凝膠過濾的結(jié)果，圖5表示用Comamonas SP.E222c精制脫氨基甲?；笇Ψ磻?yīng)時的PH值的影響。
圖6表示用Comamonas SP.E222c精制脫氨基甲?；?，對反應(yīng)時的溫度的影響。
圖7表示Blastobacter SP.A17 P-4培養(yǎng)時，添加化合物對脫氨基甲酰基酶的影響圖8表示Blastobacter SP.A17 P-4培養(yǎng)時，添加金屬離子對脫氨基甲?；傅挠绊憟D9表示Blastobacter SP.A17 P-4精制脫氨基甲?；赣肧DS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析的結(jié)果圖10表示Blastobacter SP.A17 P-4精制脫氨基甲?；?，用Sepbadex G-150柱進行凝膠過濾的結(jié)果圖11表示使用Blastobacter SP.A17 P-4精制脫氨基甲?；笇Ψ磻?yīng)中PH值的影響。
圖12表示使用Blastobacter SP.A17 P-4精制脫氨基甲酰基酶對反應(yīng)溫度的影響。
圖2，圖7中縱坐標的說明1無添加2尿素3芐基尿素4N-氨基甲酰肌氨酸5二氫尿嘧啶6尿嘧啶7β-脲基丙酸8D-丙氨酸9D-苯基甘氨酸10D-對羥苯基甘氨酸11N-氨基甲?；z氨酸12N-氨基甲酰基天冬氨酸13N-氨基甲?；涟彼?4N-氨基甲?；鞍彼?5N-氨基甲酰基歷氨酸16N-氨基甲?；?D-苯基丙氨酸17N-氨基甲酰基-D-苯基甘氨酸18N-氨基甲?；?D-對羥苯基甘氨酸19L-5-羥甲基海因
20L-5-羧甲基海因21DL-5-異丁基海因22DL-5-甲硫乙基海因23DL-5-甲基海因24DL-5-芐基海因25DL-5-苯基海因26DL-5-羥苯基海因
權(quán)利要求
1.D-α-氨基酸的制備方法，該方法為在水溶性介質(zhì)中用微生物產(chǎn)生的酶作用于式(Ⅰ)表示的N-氨基甲?；?D-α-氨基酸 [式中的R為苯基，羥基取代的苯基，取代或未取代的烷基或亞硫?；鵠得到式(2)表示的D-α-氨基酸 [式中R的定義同前]其特征是使用屬于Comamonas屬，Blastobacter屬，Alicaligenes屬，Sporosarcina屬，Rhizobium屬，Bradyrhizobium屬或Arthrobacter屬的微生物產(chǎn)生的酶來進行的。
2.權(quán)利要求1的制備方法，其中的微生物產(chǎn)生的脫氨基甲?；敢耘囵B(yǎng)液，菌體，菌體破碎物，菌體提取物，菌體處理物，粗酶，精制酶固化菌體或固化酶形式作用。
3.權(quán)利要求1或2的制備方法，其中的微生物是Comamonas Sp.E222C(FERM BP 第13170號)，Blastobacter Sp. A17 p-4(FERM BP 第13168號)，Alcaligenes Sp.E215(FEMR BP 第13168號)，Sporosarcina Sp.NCA 28-b(FERM BP第13174號)，Rhizoblum Sp. KNK 1415(FERM BP第_號)，Bradyrhi zobium japonicum IFO 14783，Bradyrhi zobium Sp.IFO 15003或Arthrobacter Sp.CA17-2(FERM BP 第_號)。
4.權(quán)利要求1或2的制備方法，其中使用的是在培養(yǎng)基中加入產(chǎn)生脫氨基甲?；傅脑鰪娢镔|(zhì)培養(yǎng)微生物而產(chǎn)生脫氨基甲?；浮?br> 5.權(quán)利要求4的制備方法，產(chǎn)生脫氨基甲?；傅脑鰪娢镔|(zhì)為D-氨基酸，N-氨基甲酰基-α-氨基酸，5-取代海因類化合物，嘧啶代謝物或金屬離子。
6.權(quán)利要求4的制備方法，其中的微生物是Comamonas屬的微生物，產(chǎn)生增強物質(zhì)為尿素，β-脲?；?，D-苯基甘氨酸，或N-氨基甲酰基DL-蛋氨酸。
7.權(quán)利要求4的制備方法，其中的微生物是Blastobacter屬的微生物，產(chǎn)生增強物質(zhì)為尿嘧啶，二氫尿嘧啶，β-脲基丙酸，Li+，Cs+，Be+，Mg2+，Mn2+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+，Co2+，或Al3+。
8.權(quán)利要求1的制備方法，其中保持水溶性質(zhì)的PH為6-11。
9.權(quán)利要求1的制備方法，其中保持水溶性質(zhì)的PH為7.5-9.5。
10.權(quán)利要求1的制備方法，其中是在40°-50℃下與脫氨基甲?；缸饔?。
11.適用于PH在8-9的脫氨基甲?；浮?br> 12.適用于溫度在40℃-50℃的脫氨基甲?；?。
13.Comamonas Sp.E222C，Blastobacter Sp.A17 p-4或Rhizobium Sp. KNK 1415產(chǎn)生的權(quán)利要求11或權(quán)利要求12記載的脫氨基甲?；?。
14.Comamonas Sp.E222C產(chǎn)生的權(quán)利要求13記載的脫氨基甲酰基酶，其中該酶的氨基末端的氨基酸序列用式3表示15 10Ser-Arg-lle-Val-Asn-Tyr-Ala-Ala-Ala-Gln-Leu-Gly-1520Pro-lle-Gln-Arg-Ala-Asp-Ser-(Arg)-Ala-Asp-Val-Met25 30Glu-(Arg)-Leu-Leu-Ala-His (3)
15.Blastobacter Sp.A17 p-4產(chǎn)生的權(quán)利要求13記載的脫氨基甲?；?，其中該酶的氨基末端的氨基酸序列為式41 5 10Ala-Arg-Lys-Leu-Asn-Leu-Ala-Val-Ala-Gln-Leu-Gly-15 20Pro-Ile-Ala-Arg-Ala-Glu-Thr-Arg-Asp-Gln-Val-Val-25 30 35Ala-Arg-Leu-Met-Glu-Met-Met-Lys-Glu-Ala-Lys-Ser-40Ser-(Arg)-Gly-Thr(4)
16.Rhizobium Sp. KNK 1415產(chǎn)生的權(quán)利要求13記載的脫氨基甲?；?，其中該酶的氨基末端的氨基酸序列為式515Thr-Arg-Gln-Met-Ile-Leu-Ala-Gly-Gln-(5)
全文摘要
本發(fā)明涉及一種D-α-氨基酸的制備方法，該方法是使用具有脫氨基甲酰基活性的酶作用于一種N-氨基甲?；?D-α-氨基酸，得到上述表示的D-α-氨基酸。
文檔編號C12P13/04GK1102672SQ9311442
公開日1995年5月17日 申請日期1993年10月5日 優(yōu)先權(quán)日1992年10月5日
發(fā)明者山田秀明, 清水昌, 池中康裕, 矢島麗嘉, 山田勇喜雄, 難波弘憲, 高野昌行, 高橋里美 申請人:鐘淵化學(xué)工業(yè)株式會社