專利名稱：一種應(yīng)用于聚合酶鏈反應(yīng)的核甙酸引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核甙酸引物的設(shè)計(jì)，特別是一種應(yīng)用于聚合酶鏈反應(yīng)的核甙酸引物的設(shè)計(jì)及其應(yīng)用。
目前，核甙酸引物用于人體心肌疾病線粒體DNA突變的研究，已有報(bào)導(dǎo)，如(1)、Ozawa T，Tanaka M，Sugi-yama S，et al，Multiple mtdnA deletions exist in cardiomyocytes of patients with hyperophic or dilated cardiomyopathy.Biochem Biophys Res Commun 1990;170(2)830.(2)、Anderson S，Bankier AT，Barrel BG，et al，Sequence and organization of the human mitochondrial genomne.Nature 1981;290457.L853引物(核甙酸序列為5′ACG AAA ATC TGT TCG CTT CA3′)與H60引物(核甙酸序列為5′AAA CAT TTT CAG TGT ATT GC3′)配合使用，利用聚合酶鏈反應(yīng)，可對(duì)線粒體DNA第8531至第600位的8.6KbDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，但拉增效果不理想，因?yàn)橛胁煌瑓^(qū)段的缺失，實(shí)際擴(kuò)增只有1.2Kb，有時(shí)結(jié)果難以判定。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)經(jīng)常缺失部位起始點(diǎn)在線粒體DNA第8531位至第9333位區(qū)域，需要設(shè)計(jì)新的引物進(jìn)行該區(qū)域的擴(kuò)增，否則就無法研究該區(qū)域內(nèi)存在的基因突變。
本發(fā)明的目的是，設(shè)計(jì)一種能與L853引物配合使用，利用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增人線粒體DNA第8531位至第9333位的DNA片段，研究該區(qū)域內(nèi)存在的基因突變。
本發(fā)明的技術(shù)方案是，根據(jù)人線粒體基因組DNA序列及引物設(shè)計(jì)的基本規(guī)則，利用電腦分析候選引物的特異性，預(yù)測(cè)其各自的擴(kuò)增效果，設(shè)計(jì)出H9333寡聚核甙酸引物，其核甙酸序列為5′ GGA GCG TTA TGG AGT GGA AGT G3′，并用人工將其合成，經(jīng)過測(cè)定濃度，用于聚合酶鏈反應(yīng)。
本發(fā)明H933引物為反意引物，其與L853引物合用，對(duì)應(yīng)于線粒體DNA重鏈的9333-9311位，可以擴(kuò)增出0.8Kb的DNA片段，然后應(yīng)用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，可以發(fā)現(xiàn)該區(qū)域內(nèi)存在的突變。因?yàn)樵搮^(qū)域?yàn)橥蛔兂０l(fā)區(qū)，大的缺失區(qū)起點(diǎn)幾乎均位于該區(qū)域內(nèi)，篩檢出突變的機(jī)會(huì)較大。在應(yīng)用其它引物(如L853-H60)檢測(cè)缺失時(shí)，可以同時(shí)加入本發(fā)明H933引物，能夠定量缺失線粒體DNA占總線粒體DNA的比例，以利于對(duì)不同類型的心肌疾病作出正確判斷。
應(yīng)用實(shí)施例。根據(jù)所測(cè)的H933引物濃度，用TE0.1(10mmol/L Tris，0.1mmol/L EDTA，pH8.0)把引物稀釋為50pmol/μl，加0.5-0.1μl至以下反應(yīng)體系中，同時(shí)加入等量L853dH20 37μl10xPCR緩沖液 5μldATP dCTP dGTP dTTP 各2μmol/L人外周血或心肌DNA模板 100mg
高純度石蠟油 30μl在基因擴(kuò)增儀上95℃變性5分鐘后，加入Taq DNA聚合酶2單位后，94℃變性，35S，50℃退火35S，72℃延伸100S，共運(yùn)行45個(gè)循環(huán)，其中后20循環(huán)的72℃延伸100S后，每次循環(huán)自動(dòng)增加2秒。運(yùn)行完畢后取20μl進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，同時(shí)還可取10μl加等體積95%甲酰胺溴酚藍(lán)進(jìn)行SSCP，銀染色觀察結(jié)果。
以L853和H933擴(kuò)增同樣模板，產(chǎn)生一個(gè)預(yù)測(cè)大小的片段(0.8Kb)，而該片段是對(duì)尚未發(fā)生缺失的正常mtDNA擴(kuò)增的結(jié)果;SSCP分析該片段，發(fā)現(xiàn)一例DCM病人心肌mtDNA在該片段所對(duì)應(yīng)的區(qū)域內(nèi)存在點(diǎn)突變。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用于聚合酶鏈反應(yīng)的核甙酸引物，其特征是根據(jù)人線粒體基因組DHA序列，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)擴(kuò)增效果的H933寡聚核甙酸引物，經(jīng)人工合成，其核甙酸序列為5′ GGA GCA TTA TGG AGT GGA AGT G3′。
2.權(quán)利要求1的H933寡聚核甙酸引物與L853引物配合使用，利用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增人線粒體DNA第8531位至第9333位的DNA片段。
全文摘要
一種應(yīng)用于聚合酶鏈反應(yīng)的核甙酸引物H933寡聚核甙酸，根據(jù)人線粒體基因組DNA序列及擴(kuò)增效果設(shè)計(jì)，經(jīng)人工合成，其核甙酸序列為5′GGAGCG TTA TGG AGT GGA AGT G3′，用于研究擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)存在的基因突變。
文檔編號(hào)C12Q1/25GK1103109SQ9311511
公開日1995年5月31日 申請(qǐng)日期1993年11月20日 優(yōu)先權(quán)日1993年11月20日
發(fā)明者李運(yùn)有 申請(qǐng)人:江蘇省人民醫(yī)院