專利名稱：一種霍亂弧菌新菌株及其活菌苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種霍亂弧菌新菌株，以及由此菌株制備的口服活菌苗。
霍亂是世界衛(wèi)生組織規(guī)定的國際檢疫烈性傳染病之一，為我國法定的甲類傳染病。霍亂弧菌由兩種生物型(古典型和埃爾托生物型)和兩種血清型(小川和稻葉)組成。從1883年人們分離到霍亂弧菌時，人們就開始了霍亂免疫預(yù)防研究，至今百余年。尚無理想的霍亂疫苗問世。瑞典人1982年推出高效的霍亂腸毒素加霍亂全菌死菌苗，經(jīng)過志愿者與現(xiàn)場8年之久的觀察，結(jié)果免疫效果僅50%，而且持續(xù)時間3個月，且要經(jīng)多次口服，生產(chǎn)價值很高，至今未被世界衛(wèi)生組織所認可。
另外，人們從自然存在的菌株選育或用物理化學(xué)誘變的方法或抗生素的方法誘變的減毒活菌苗或因免疫效力不好，或因盲目突變，潛伏回復(fù)突變的可能性，未被接受。
近年來，由于基因工程的使用，人們用新技術(shù)研制霍亂菌苗，以美國菌苗發(fā)展中心研制的用基因工程手段將霍亂致毒因子逐一減去的方法，自1982年至今，都因有殘余毒力，至今尚不為世界衛(wèi)生組織認可。
我們在總結(jié)以上研制菌苗的基礎(chǔ)上，從我所保藏的霍亂弧菌埃爾托生物型流行株和非流行株中，用DNA重組手段，以霍亂腸毒素的基因探針，挑選出14株自然霍亂腸毒素結(jié)構(gòu)基因缺失株。又用免疫學(xué)方法選出一株無毒，具有良好免疫效果的菌株IEM101，該菌株缺失了至今已有報導(dǎo)的毒力因子的結(jié)構(gòu)基因，又保持其表面抗原結(jié)構(gòu)，如脂多糖，外膜蛋白和主要定居因子一菌毛等結(jié)構(gòu)。經(jīng)過動物測毒，證明無毒，免疫效果檢測證明，有很好的免疫反應(yīng)，進而在人體一次口服達109cfu無付反應(yīng)，且可在人腸道定居，并刺激人體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫抗體，是理想的菌苗制備株。
本發(fā)明提供一種可制備理想菌苗的新的霍亂弧菌菌株。本發(fā)明人在研究霍亂腸毒素原性中用CT基因探針檢驗402株EVC流行株，發(fā)現(xiàn)14株自然CT基因缺失株。從這些菌株中應(yīng)用基因探針和免疫學(xué)方法選出了1株自然缺失主要毒力因子CT，zot和ace結(jié)構(gòu)基因，但有TcpA及B菌毛的菌株，它對實驗動物及人體都有較好保護力。經(jīng)鑒定，該菌株為霍亂弧菌種內(nèi)的一個新株，我們將該菌株命名為霍亂弧菌(Vibrio cholerae)IEM101，我們已于1994年元月29日將該菌株保藏于中國微生物菌株保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.0207。
本發(fā)明還提供了一種安全無殘毒的口服活菌苗，將IEM101菌株在一定的培養(yǎng)液中培養(yǎng)后得到的菌液，給人體志愿者一次口服免疫，在人體能定居2-9天以上，并能刺激血清與腸道產(chǎn)生特異性保護性抗體。因而得到了一種理想的口服用霍亂弧菌活菌苗。
下文中詳細描述本發(fā)明的特征一、IEM菌體的生物學(xué)性狀1、血清型霍亂弧菌EVC小川血清型。噬菌體生物型1a2、生化反應(yīng)發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、半乳糖、左旋糖、糊精和可溶性淀粉產(chǎn)酸不產(chǎn)氣;遲發(fā)酵乳糖。不發(fā)酵阿拉伯糖、衛(wèi)茅醇、水楊素、木膠糖、側(cè)金盞花和肌醇。靛基質(zhì)和亞硝酸靛基質(zhì)反應(yīng)陰性，VP試驗陽性，溶血試驗陽性。
3、TcpA及B型菌毛電鏡檢測見

圖1。
4、抗生藥物敏感實驗IEM101菌株對四環(huán)素、氯霉素、慶大霉素、氨卞青霉素、卡那霉素、先鋒霉素、新霉素、羧卞青霉素、紅霉素、磺胺、利福平、奈定酮酸、丁胺卡那等14種藥物敏感，對多粘菌素B及痢特靈表現(xiàn)抗藥。
5、生長特性見圖2。
二、遺傳性狀檢測1、染色體DNA核酸內(nèi)切酶圖譜見圖3。其染色體DNA限制性內(nèi)切酶圖譜與ELTor型流行株相同。
2、DNA-DNA分子雜交結(jié)果見圖4。
基因探針ct tcpA RSI hly zot st ace slt- ++ +- - - -三、毒力測定
1、Vero細胞測毒按于永茂等人(《中華流行病學(xué)雜志》，1992年13(特刊7號)232)的方法進行。將IEM101產(chǎn)毒培養(yǎng)過夜，取培養(yǎng)物上清液試驗，未見病理改變。
2、GM1-ELISA檢測CT的產(chǎn)生按于永茂等人(同上)的方法進行，IEM101株P(guān)/N為1.67(P/N>2為陽性)。
3、乳鼠LD50測定按于永茂等人(同上)的方法進行，IEM101的LD50為1.58×107cfu，比毒株低4個數(shù)量級。
4、家兔小腸結(jié)扎實驗按Bleck RZ等人(Infect Immun.1987551116)描述的方法進行，將IEM101產(chǎn)毒培養(yǎng)48小時后，取1ml靜止培養(yǎng)物腸內(nèi)注射，結(jié)果IEM101菌株的積液量為0ml/cm。(大于1.0ml/cm為陽性)。
四、免疫保護力測定家兔被動和主動保護力試驗按于永茂等人(同上)的方法進行，家兔主動保護試驗分三種方法進行(1)IEM101自然缺失CT菌株，經(jīng)口服1011菌量，于免疫后28天用EVC79005(小川)，805(稻葉)和CVC小川型395攻擊。結(jié)果見表1。
表1 家兔主動免疫保護力試驗結(jié)果 注表中數(shù)值為腸段積液量(ml/cm)
(2)IME101 106-8經(jīng)口免疫家兔，口服后14天用EVC濱43(小川)、吳江-2(稻葉)及CVC395(小川)川9(稻葉)菌株攻擊，結(jié)果見表2。
表2 家兔主動保護力測定結(jié)果 注表中數(shù)值為腸段積液量(ml/cm)由表中看出IEM101經(jīng)口免疫106-8均可對攻毒菌株兩種生物型及兩種血清型有保護作用。
(3)IEM101 106-7菌懸液直接注入家兔小腸上段，免疫14天后用攻毒菌(ELTor生物型的小川和稻葉血清型及古典生物型小川和稻葉血清型)105-7細菌進行攻擊實驗，觀察8-16小時內(nèi)腸腫脹，充血，壞死及積液量(ml/cm)，結(jié)果見表3。
表3 IEM101家兔主動保護試驗結(jié)果
注表中數(shù)值為腸段積液量(ml/cm)家兔被動保護力測定結(jié)果見表4。
免疫血清IEM101免疫家兔后第10天分離免疫血清攻毒菌株吳江-2，濱43 106菌量表4 家兔被動保護實驗 注表中數(shù)值為積液量ml/cm上表結(jié)果顯示IEM101免疫血清12稀釋可保護毒株攻擊，140稀釋尚有保護力。
五、人體安全性與免疫原性檢測1、免疫志愿者無霍亂發(fā)病史的健康人共31人，其中女性13，男性18人，年齡25-60。將31人按免疫劑量不同分為7組，第Ⅰ-第Ⅴ組，每組4人，第Ⅵ組為5人，第Ⅶ組6人。第Ⅰ組每人口服100℃加熱殺死的IEM101 109cfu，第Ⅱ-Ⅶ組依次每人口服活I(lǐng)EM101 102、104、106、108、109及1010cuf.這些菌數(shù)均懸于2%NaHCO3 50ml。服菌前20-30分鐘，先服2%NaHCO3 50ml以中和胃酸。
2、觀察結(jié)果(1)安全性試驗結(jié)果在31名志愿者中，IEM101死菌109，活菌102-1010cfu口服者均無副反應(yīng)。在10名志愿者中有一名于40小時開始無痛性腹瀉，稀便兩天內(nèi)共4次，大便量不超過100ml/次，未服藥自愈。
表5 志愿者口服菌后癥狀 (2)排菌時間的檢測收集志愿者每次大便及嘔吐物，直接接種選擇性培養(yǎng)基-慶大霉素瓊脂(購自我所腹瀉病室)。同時用堿性蛋白胨水做增菌培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24-72小時觀察慶大霉素培養(yǎng)菌落形態(tài)與顏色，用玻片凝集反應(yīng)檢定，抗霍亂多價與小川血清購自衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所。按天計算排菌時間。結(jié)果，口服不同劑量IEM101的志愿者，排菌時間長短明顯不同，隨口服劑量的增加排菌時間延長，結(jié)果見表6。
表6 志愿者排菌時間 (3)于免疫前零天及免疫后7、14、28、90、180、270及360天分別采血分離血清及外周血液淋巴細胞(PBL)，血清中特異性抗體的檢測ELISA法檢測(王世霞等《中華流行病學(xué)雜志》1990;11(特刊7號)222，殺弧菌抗體與菌體凝集反應(yīng)參考Svennerbolm AM，等人(Infect Immun 1976;13735)進行，指示菌為01群霍亂弧菌ELTor型流行株79005，特異性抗體分泌PBL-ELISA的檢測按文獻[64]進行。同時檢測PBL分泌抗CT、LPS及全菌抗體，結(jié)果用酶聯(lián)免疫測定儀測每孔的OD值，計算出P/N值，辣根過氧化物酶標記的鼠抗人IgA，IgG及IgM均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所。
通過ELISA，殺弧菌抗體試驗和凝集試驗，檢測免疫前后不同時間血清中各種抗體水平，抗CT抗體免疫前后均為陰性，抗LPS抗體、凝集反應(yīng)及殺弧菌抗體于免疫前各種抗體水平很低或接近零，免疫后第七天明顯上升，殺弧菌抗體和凝集反應(yīng)抗體水平第14天達高峰，抗LPS抗體IgA、IgG及IgM于28天達高峰，以后逐漸下降，維持到270天，見表7、8、9表7 免疫前后不同時間血清殺弧菌抗體滴度 表中數(shù)值為各組抗體滴度的幾何平均數(shù)表8 免疫前后不同時期血清凝集素抗體滴度 表中數(shù)值為各組抗體滴度的幾何平均數(shù)表9 免疫前后不同時間血清抗LPS抗體滴度 注表中數(shù)值為各組抗體滴度的幾何平均數(shù)實施例1霍亂弧菌IEM101菌株的培養(yǎng)將霍亂弧菌IEM101菌株(CGMCC，0207)接種于添加了0.5%Nacl的普通肉湯(PH7.4)中，于37℃培養(yǎng)2小時。
實施例2霍亂弧菌IEM101菌株口服活菌苗的制備如實施例1所述方法培養(yǎng)得到的菌懸液可直接使用，活菌免疫的劑量為102-1010cfu含菌量，優(yōu)選為109cfu菌量。
實施例3霍亂弧菌IEM101菌株口服活菌苗的制備將實施例1所述方法制備的菌懸液，按常規(guī)方法冷凍干燥，再懸浮于0.85%Nacl溶液中，即制成含菌量為109cfu的口服菌苗。
權(quán)利要求
1.一種霍亂弧菌(Vibrio cholerae)新菌株IEM101(CGMCC∶0207)。
2.如權(quán)利要求1所述菌株的培養(yǎng)方法，其特征在于將IEM101接種于添加了0.5%Nacl的普通肉湯(PH7.4)中，于37℃，培養(yǎng)2小時。
3.由權(quán)利要求1所述菌株制備的口服活菌苗，其特征在于將權(quán)利要求2所述方法制備的菌懸液直接口服，或按常規(guī)方法將該菌液凍干后，懸浮于0.85% Nacl溶液中即可。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可制備理想菌苗的新的霍亂弧菌菌株，該菌株缺失了毒力因子的結(jié)構(gòu)基團，又保持其表面抗原結(jié)構(gòu)，對人體和動物無毒，有良好的免疫能力。本發(fā)明還提供了由該菌株制備的口服活菌苗。
文檔編號C12N1/20GK1109503SQ9410338
公開日1995年10月4日 申請日期1994年4月1日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月1日
發(fā)明者劉延清, 祁國明, 王世霞, 于永茂, 段廣才, 章麗娟, 高守一 申請人:中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)微生物研究所