專(zhuān)利名稱(chēng)：用pqq-依賴(lài)性脫氫酶比色測(cè)定分析物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在富電子芳族亞硝基化合物類(lèi)電子受體存在下通過(guò)用PQQ-依賴(lài)性脫氫酶的酶促氧化進(jìn)行比色測(cè)定分析物，以及通過(guò)顏色形成比色測(cè)定還原的電子受體用以測(cè)量分析物的量的方法。此外，本發(fā)明涉及通過(guò)酶促氧化比色測(cè)定分析物的試劑，所述試劑含有PQQ-依賴(lài)性脫氫酶、富電子芳族亞硝基化合物以及對(duì)于該富電子芳族亞硝基化合物還原形成的亞氨基化合物來(lái)說(shuō)形成顏色的非氧化檢測(cè)試劑。另外，本發(fā)明涉及新的亞硝基苯胺類(lèi)化合物，其制備以及其用于比色酶促測(cè)定分析物的用途。
在分析方法中，酶促氧化作用使檢測(cè)和測(cè)定各種樣品材料中的物質(zhì)成為可能。在此情況下，氧化酶在接受氧化反應(yīng)的電子的受體存在下作用于合適的酶底物。電子受體的還原表明存在酶底物。在這一點(diǎn)上，已經(jīng)證實(shí)了當(dāng)還原的電子受體能通過(guò)顏色形成而被檢測(cè)時(shí)是特別有利的，因?yàn)槠洳皇潜匦鑳H僅借助于昂貴的測(cè)量裝置，而是也可以根據(jù)需要目視進(jìn)行。
已知的借助具有氧化作用的酶比色測(cè)定底物的方法使用氧化酶或脫氫酶。這兩組酶均屬于氧化還原酶大類(lèi)(“Roempps Chemielexikon，F(xiàn)rancksche Ver lagsbuchhandlung，Stuttgart”，第8版，1985，第4卷，第2952頁(yè);“Lexikon Biochemie，Publisher H.D.Jakubke，“Verlag Chemie，Weinheim”，第2版，1981，第194頁(yè))，根據(jù)其天然電子受體其成員可以被區(qū)別。
氧化酶的天然電子受體是分子氧(“Roempps Chemielexikon，F(xiàn)rancksche Ver lagsbuchhandlung，Stuttgart”，第8版，1985，第4卷，第2946頁(yè);)。在分析物測(cè)定中，分析物被此方法中的氧化酶和O2氧化。形成的H2O2用于幫助過(guò)氧化物酶氧化無(wú)色染料。作為使用氧化酶比色測(cè)定分析物的現(xiàn)有技術(shù)狀況的代表，引用A.Kunst等人的Methods in enzymatic analysis，Publ.H.U.Bergmeyer，“Verlag Chemie，Weinheim”，第3版，1984，第6卷，第178～185頁(yè)。在此參考文獻(xiàn)中，通過(guò)用葡萄糖氧化酶和大氣氧在水溶液中反應(yīng)，檢測(cè)血清、血漿或去蛋白血液中的葡萄糖，其中在該反應(yīng)中由于氧還原而形成的過(guò)氧化氫在過(guò)氧化物酶存在下被還原并借此作用于均存在于反應(yīng)混合物中的酚和4-氨基非那宗以形成顏色。H2O2高的氧化還原電勢(shì)和過(guò)氧化物酶的非選擇性及不穩(wěn)定性經(jīng)常導(dǎo)致這些試驗(yàn)受到限制。例如過(guò)渡金屬離子或血紅素或血蛋白(如那些易于在血樣中發(fā)現(xiàn)的)會(huì)干擾試驗(yàn)，因?yàn)樗鼈兎纸膺^(guò)氧化氫。樣品中的成分例如膽紅素和藥物例如甲基多巴(它們實(shí)際上可在血樣或尿樣中發(fā)現(xiàn))會(huì)導(dǎo)致與過(guò)氧化氫和過(guò)氧化物酶形成顏色，因而得出假的結(jié)果;它們也可以還原并因而漂白已經(jīng)形成的顏色。
氧化酶對(duì)氧的需求還證實(shí)了其另外的缺點(diǎn)，特別是當(dāng)在固體載體上進(jìn)行所謂的干法試驗(yàn)的上述測(cè)定方法時(shí)。氧從空氣中擴(kuò)散至反應(yīng)基質(zhì)中可以成為速度決定性步驟，尤其是當(dāng)需要大量的氧以氧化高濃度酶底物時(shí)，這就導(dǎo)致了反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)或得出假的結(jié)果，尤其是在動(dòng)態(tài)測(cè)定方法中。
脫氫酶一般可以分成兩類(lèi)，一類(lèi)需要輔酶Ⅰ(NAD)或輔酶Ⅱ(NADP)作為氧化酶底物的天然直接電子受體，另一類(lèi)是非NAD依賴(lài)性或非NADP依賴(lài)性的并因而使用其他底物作為酶促氧化反應(yīng)中的天然直接電子受體。具體地講，PQQ依賴(lài)性和黃素依賴(lài)性脫氫酶是非NAD依賴(lài)性或非NADP依賴(lài)性脫氫酶中的一部分。
用NAD依賴(lài)性脫氫酶進(jìn)行比色測(cè)定是已知的，例如參見(jiàn)DE-A-2147466。該申請(qǐng)描述了乳酸脫氫酶催化乳酸和輔酶Ⅰ轉(zhuǎn)化成丙酮酸和還原型輔酶Ⅰ，所形成的還原型輔酶Ⅰ(NADH)例如在心肌黃酶存在下與四唑鎓鹽反應(yīng)，生成NAD和有色的甲 類(lèi)化合物，該甲 的濃度可進(jìn)行光度測(cè)定。還提及了用N-甲硫酸N-甲基吩嗪鎓(N-Methylphenazinium methosulfate)代替心肌黃酶作為將NADH的電子轉(zhuǎn)移至四唑鎓鹽上的還原催化劑。
該方法的缺點(diǎn)在于，除了NADH之外，在非特異性還原催化劑如心肌黃酶或N-甲硫酸N-甲基吩嗪鎓存在下，其他具有還原作用的底物如谷胱甘肽或藥物如甲基多巴或dobesylate(它們可在生物樣品例如血液、血清、血漿或尿中發(fā)現(xiàn))也可將四唑鎓鹽轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的甲 類(lèi)化合物，因而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，盡管它們?cè)诓淮嬖谶€原催化劑時(shí)不會(huì)與四唑鎓鹽迅速反應(yīng)。
采用富電子芳族亞硝基化合物、借助于黃素依賴(lài)性氧化酶或非NAD依賴(lài)性脫氫酶如PQQ依賴(lài)性脫氫酶氧化酶促檢測(cè)分析物的方法是已知的，參見(jiàn)EP-A-0354441。在此檢測(cè)方法中，芳族亞硝基化合物被酶促還原成相應(yīng)的富電子芳族胺，所述胺或者通過(guò)用沉淀的、難溶的雜多酸形成雜多藍(lán)進(jìn)行檢測(cè)，或者在氧化劑存在下與偶合試劑偶合形成染料。然而，雜多藍(lán)形成的藍(lán)灰色色彩層次并不十分適于準(zhǔn)確地肉眼評(píng)估。對(duì)采用顯色偶合試劑通常不著色或僅僅是很弱著色的芳族胺類(lèi)化合物進(jìn)行比色檢測(cè)的缺點(diǎn)在于需要另外加入氧化劑。由于該氧化物會(huì)干擾芳族亞硝基化合物酶促還原成芳族胺，該檢測(cè)反應(yīng)只得分成兩個(gè)獨(dú)立的步驟進(jìn)行在第一步中，將芳族亞硝基化合物酶促還原成芳族胺，在第二個(gè)分離的步驟中，加入氧化劑使芳族胺與顯色偶合試劑氧化偶合。
該檢測(cè)方法的另一缺點(diǎn)在于，對(duì)于將每當(dāng)量芳族亞硝基化合物還原成芳族胺來(lái)說(shuō)必需氧化2當(dāng)量分析物。這就導(dǎo)致該檢測(cè)方法的靈敏性不能令人滿意，特別是當(dāng)分析物濃度低時(shí)。
因此本發(fā)明的目的在于消除上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，并提供一種氧化檢測(cè)分析物的更簡(jiǎn)便、更靈敏的方法和試劑，本發(fā)明方法更不易受干擾并且可以以改進(jìn)的方式進(jìn)行光學(xué)評(píng)估，尤其是該方法能一步進(jìn)行并產(chǎn)生在整個(gè)可光波長(zhǎng)范圍內(nèi)易于評(píng)估的顏色。
象權(quán)利要求書(shū)中特征化的那樣通過(guò)本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述目的。
因此，發(fā)現(xiàn)了在富電子芳族亞硝基化合物類(lèi)直接電子受體存在下、通過(guò)用氧化還原酶酶促氧化分析物而比色測(cè)定該分析物的方法，其中通過(guò)顏色形成測(cè)定還原的電子受體，用以測(cè)量分析物的量，其特征在于在PQQ依賴(lài)性脫氫酶存在下，伴隨著分析物的氧化，富電子的芳族亞硝基化合物被還原成亞氨基化合物，而該亞氨基化合物可通過(guò)顏色形成而被檢測(cè)，不需要進(jìn)一步酶促還原形成芳族胺。
本發(fā)明特別涉及在富電子芳族亞硝基化合物類(lèi)的直接電子受體存在下用氧化還原酶比色測(cè)定分析物的方法，其中通過(guò)顏色形成測(cè)定還原的電子受體、用以測(cè)量分析物的量，其特征在于在PQQ依賴(lài)性脫氫酶存在下，伴隨分析物的氧化，富電子芳族亞硝基化合物被還原形成亞氨基化合物，該亞氨基化合物通過(guò)與顯色非氧化檢測(cè)試劑反應(yīng)而被比色測(cè)定，而不是被進(jìn)一步酶促還原成芳族胺。
此外還發(fā)現(xiàn)了通過(guò)酶促氧化分析物而對(duì)分析物進(jìn)行比色測(cè)定的試劑，該試劑含有PQQ依賴(lài)性脫氫酶和富電子芳族亞硝基化合物類(lèi)的直接電子受體，其特征在于或者它含有富電子亞硝基化合物，在酶促還原時(shí)該化合物形成有色亞氨基化合物;或者它另外含有顯色非氧化檢測(cè)試劑，用于檢測(cè)富電子亞硝基化合物還原形成的亞氨基化合物。
依照本發(fā)明，“分析物”應(yīng)理解為酶促氧化底物，在很多情況下，分析物是打算直接檢測(cè)的底物。或者是在待檢樣品中打算定量測(cè)定的底物。例如葡萄糖可直接用PQQ依賴(lài)性葡萄糖脫氫酶(葡萄糖染色氧化還原酶)氧化，并進(jìn)行比色測(cè)定。然而，也可能首先經(jīng)歷一步或數(shù)步反應(yīng)從另一底物形成分析物，這樣就可以從分析物的比色測(cè)定間接得到初始底物的濃度。
本發(fā)明的分析物是可用作所使用的PQQ依賴(lài)性脫氫酶底物的物質(zhì)。
PQQ依賴(lài)性脫氫酶含有吡咯并喹啉醌作為輔助因子。J.A.Jongejahn等人在“PQQ and Quinoproteins”(Kluver Academic Publ.Dordrecht Netherlands 1989)中綜述了該“quinoproteins”。本發(fā)明可使用的酶的例子是PQQ依賴(lài)性葡萄糖脫氫酶(葡萄糖染色氧化還原酶，E.C.1.1.1.50/1.1.1.91/1.1.1.97)、醇脫氫酶或乳酸脫氫酶。在本發(fā)明方法中，PQQ依賴(lài)性葡萄糖脫氫酶尤其可以有利地用于葡萄糖的比色測(cè)定。
富電子芳族亞硝基化合物用作從酶/輔助因子系統(tǒng)脫氫酶/PQQ中接受電子的直接電子受體，例如EP-A-0354441和EP-A-0441222中已知的作為氧化酶和非NADH依賴(lài)性脫氫酶電子受體的那些，其中亞硝基直接與富電子芳族核成鍵連接?！爸苯印彪娮邮荏w是指在酶促催化下直接從酶/輔助因子系統(tǒng)中接受電子，而不需要還原催化劑。
本發(fā)明可以使用的可還原的富電子芳族亞硝基化合物是這樣一些化合物，即它們從酶(該酶是在對(duì)所用PQQ依賴(lài)性脫氫酶適合的底物氧化過(guò)程中形成的)中接受電子，并在此過(guò)程中形成亞氨基化合物。相應(yīng)的亞氨基化合物含有亞氨基＝NH，它通過(guò)其雙鍵與先前的芳族核成鍵連接，并與其雙鍵電子共軛。富電子芳族亞硝基化合物在芳族核上或之中含有一個(gè)或數(shù)個(gè)供電子殘基或基團(tuán)，該殘基或基團(tuán)通過(guò)借助電子釋放與亞氨基經(jīng)先前的芳族核共軛，促進(jìn)亞氨基化合物形成。
這些是一方面對(duì)芳族核產(chǎn)生+M效應(yīng)的取代基。
例如 R-Ar-NO (還原)/() R′＝Ar′＝NH與芳族核成鍵連接的具有+M效應(yīng)的基團(tuán)R的例子是取代基如羥基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、單烷氨基、單芳氨基、二烷氨基和二芳氨基。
對(duì)于亞硝基苯衍生物來(lái)說(shuō)，例如，特別地當(dāng)這些取代基位于亞硝基的鄰位和/或?qū)ξ粫r(shí)顯示了其效應(yīng)。
具有供電子和亞胺結(jié)構(gòu)促進(jìn)作用的基團(tuán)也可以是雜芳環(huán)體系的組成。
實(shí)例為具有過(guò)量π電子的雜環(huán)芳族亞硝基化合物，其中芳環(huán)體系極富電子以致于在還原后對(duì)于形成中介穩(wěn)定的亞胺來(lái)說(shuō)不需要外部+M取代基。π電子過(guò)量的原因是，與所具有的能分布π電子的環(huán)原子相比，存在有更多的芳族π電子。這類(lèi)雜環(huán)是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員公知的。
這類(lèi)芳族雜環(huán)的例子是安替比林、吡唑并雜環(huán)類(lèi)化合物和吡唑類(lèi)化合物。
本發(fā)明所用富電子芳族亞硝基化合物的電子富集具有另外的效應(yīng)，這些亞硝基化合物借助酮-烯醇互變異構(gòu)現(xiàn)象在一定程度上與相應(yīng)的肟共振結(jié)構(gòu)達(dá)成平衡。
R-Ar-N＝O <-> R′＝Ar′＝N-OH在本發(fā)明范圍內(nèi)，作為本發(fā)明所用底物的術(shù)語(yǔ)“芳族亞硝基化合物”將包括其互變異構(gòu)的兩種共振結(jié)構(gòu)。
對(duì)上述+M取代基來(lái)說(shuō)，烷氧基、烷硫基、單烷氨基和二烷氨基是其中烷基表示具有1～6個(gè)碳原子的烴基的基團(tuán)，該烴基又可被羥基、氨基(根據(jù)需要被1～6個(gè)碳原子的烷基取代一次或數(shù)次)、PO3H2、SO3H或CO2H取代。該酸基PO3H2、SO3H或CO2H可以以其本身或以其銨鹽、堿金屬鹽或堿土金屬鹽的形式存在。
芳氧基和芳硫基含有具有6～10個(gè)碳原子的芳族基團(tuán)，其中苯氧基和苯硫基是特別優(yōu)選的。
銨鹽是含有銨離子NH+4或含有銨陽(yáng)離子(它們被烷基、芳基或芳烷基取代一次或數(shù)次)的那些。烷基或芳烷基中的烷基是指具有1～6個(gè)碳原子的烴基。芳基和芳烷基中的芳基是具有6～10個(gè)碳原子的芳環(huán)系，其中優(yōu)選苯基。優(yōu)選的芳烷基是芐基。
優(yōu)選的堿金屬鹽是鋰鹽、鈉鹽或鉀鹽。優(yōu)選的堿土金屬鹽是鎂鹽或鈣鹽。
上面給出的+M取代基的例子不應(yīng)理解為已全部列出。對(duì)于各種情況，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員將會(huì)知道所給基團(tuán)R是否是+M取代基以及在哪個(gè)位置它會(huì)對(duì)芳環(huán)發(fā)生該效應(yīng)，或者哪個(gè)芳族雜環(huán)在環(huán)系上含有這種相應(yīng)的基團(tuán)，以及就此而言所有這些基團(tuán)應(yīng)該是可能的可用于本發(fā)明的芳族亞硝基化合物中的取代基。
所用芳族亞硝基化合物的基本芳族結(jié)構(gòu)優(yōu)選表示5～7個(gè)碳或雜原子的富電子芳環(huán)，特別優(yōu)選表示5～6個(gè)碳或雜原子的富電子芳環(huán)，所述芳環(huán)可以與一個(gè)或兩個(gè)芳環(huán)或/和脂環(huán)稠合。在這種情況下，對(duì)于芳族稠環(huán)來(lái)說(shuō)，各自具有5～7(優(yōu)選具有5～6)個(gè)碳或雜原子的芳族碳系統(tǒng)和雜芳族系統(tǒng)是值得考慮的。
脂環(huán)被理解為具有5～7個(gè)碳原子或雜原子(優(yōu)選5或6個(gè)碳原子)的飽和或不飽和環(huán)狀脂族化合物。雜原子被理解為氮、氧或硫。
優(yōu)選用于本發(fā)明的亞硝基化合物是亞硝基苯衍生物。
亞硝基苯衍生物也被理解為包括與一個(gè)或數(shù)個(gè)芳族或/和脂族環(huán)稠合的亞硝基苯。在此情況下。各自具有5～7(優(yōu)選具有5或6)個(gè)環(huán)原子的芳族碳系統(tǒng)和雜芳族化合物被考慮作為芳環(huán)。例如稠合的苯或萘環(huán)，或者稠合的吡啶環(huán)。
通式Ⅰ的亞硝基苯衍生物是特別優(yōu)選的，
其中R1是指氫，羥基，根據(jù)需要被羥基、COOH、PO3H2或SO3H取代的烷基，烷氧基，烷硫基，芳氧基，芳硫基，鹵素或氨基，該氨基根據(jù)需要被烷基(根據(jù)需要該烷基被羥基、PO3H2、二烷基氧膦基、SO3H或CO2H取代)取代一次或幾次，并且，R2是指羥基、烷氧基、芳氧基、芳硫基或烷硫基，其中烷基殘基根據(jù)需要被下述基團(tuán)取代羥基、烷氧基、氨基(該氨基根據(jù)需要被烷基取代一次或幾次)、PO3H2、SO3H或CO2H本身或其鹽如銨鹽、堿金屬鹽或堿土金屬鹽，或者R2是指氨基NR3R4其中R3和R4可以相同或不同，并且是指氫、芳基或烷基，它們又可被下述基團(tuán)取代羥基，烷氧基，羥基烷氧基或多烷氧基(該多烷氧基根據(jù)需要被羥基取代)，PO3H2、SO3H、COOH本身或其鹽;或者它們被根據(jù)需要被烷基取代一次或幾次的氨基取代，或者其中R3和R4可以表示亞烷基，所述亞烷基可根據(jù)需要被氧、硫或氮間斷，其中氮被烷基、羥烷基、羥基烷氧基烷基、烷氧基羥烷基、烷氧羰基烷基、二噁烷基烷基或多烷氧基烷基取代，并且每個(gè)這些基團(tuán)的烷基部分又可根據(jù)需要被羥基取代，或者如果R1在NR3R4的鄰位，R3或R4也可以與R1一起表示亞烷基。
在此情況下，鹵素是指氟、氯、溴或碘。氟和氯是特別優(yōu)選的。
烷基、烷氧基或烷硫基中的烷基部分是指具有1～6個(gè)碳原子的烴基，具有1～3上碳原子的烴基是特別優(yōu)選的。上述對(duì)烷基的定義也適用于羥烷基、二烷氨基烷基、羥基烷氧烷基、烷氧烷基、多烷氧烷基、烷氧基羥基烷基和二噁烷基烷基中的烷基部分。二噁烷基烷基是其中二噁烷環(huán)系與烷基成鍵連接的基團(tuán)。它優(yōu)選為1，4-二噁烷環(huán)系，即 多烷氧烷基是-烷基-(烷氧基)n-烷氧基，其中n＝1～10。優(yōu)選n＝1～4，特別優(yōu)選n＝1～3。亞烷基是具有兩個(gè)自由結(jié)合位點(diǎn)的直鏈或支鏈(優(yōu)選直鏈)、飽和或不飽和(優(yōu)選飽和)和2～5(優(yōu)選2～4)個(gè)碳原子的烴鏈。
芳基和芳烷基中的芳基部分是具有6～10個(gè)碳原子的芳環(huán)系，其中優(yōu)選苯基。
銨鹽是含有銨離子NH+4或者含有被烷基、芳基或芳烷基取代一次或幾次的銨陽(yáng)離子的那些。
堿金屬鹽優(yōu)選鋰鹽、鈉鹽或鉀鹽。堿土金屬鹽優(yōu)選鎂鹽或鈣鹽。
優(yōu)選的基團(tuán)R1是氫和烷基，特別是氫。
優(yōu)選的基團(tuán)R2是烷氧基和氨基NR3R4在被氧、硫或氮間斷的R1和R3的亞烷基含意內(nèi)，通過(guò)結(jié)合通式Ⅰ的氮原子形成的嗎啉或硫代嗎啉或哌嗪基是優(yōu)選的。特別優(yōu)選的是哌嗪基。
在R1和R3形成的亞烷基含意內(nèi)，通過(guò)結(jié)合通式Ⅰ的芳環(huán)形成的二氫吲哚或1，2，3，4-四氫喹啉基是優(yōu)選的。
強(qiáng)酸特別是無(wú)機(jī)酸如鹽酸、硫酸、硝酸和磷酸的鹽是優(yōu)選的本發(fā)明通式Ⅰ亞硝基苯胺衍生物的鹽。鹽酸鹽是特別優(yōu)選的。
優(yōu)選的通式Ⅰ亞硝基化合物是N，N-二-(2-羥乙基)-對(duì)亞硝基苯胺，N，N-二甲基-對(duì)亞硝基苯胺，N，N-二乙基-對(duì)亞硝基苯胺，N-甲基-N′-(4-亞硝基苯基)-哌嗪，N-(2-羥乙基)-5-亞硝基二氫吲哚，2，4-二甲氧基-亞硝基苯，N，N-二-(2-甲氧乙基)-4-亞硝基苯胺，N-(4-亞硝基苯基)-嗎啉，N-(2，2-二乙氧基乙基)-N′-(4-亞硝基苯基)-哌嗪，對(duì)亞硝基苯酚，3-甲氧基-4-亞硝基苯酚。
在富電子雜芳族亞硝基化合物中，其芳環(huán)系統(tǒng)極富電子，以致于對(duì)于形成亞硝基/肟互變異構(gòu)體或亞胺來(lái)說(shuō)不需要外部+M取代基，特別適用于本發(fā)明方法的那些富電子雜芳族亞硝基化合物是吡唑啉酮類(lèi)化合物、吡唑類(lèi)化合物以及特別是被亞硝基取代的吡唑類(lèi)化合物(例如在Ullamann′s Encyclopaedia of Industyial Chemistry第5版，第A20卷，第72～74頁(yè)中所述的)。在此情況下，通式Ⅱ的3-亞硝基吡唑類(lèi)化合物以及根據(jù)需要其相應(yīng)的互變異構(gòu)體及其鹽是特別優(yōu)選的。
在EP-A-0433854中，作為制備合成相應(yīng)的3-氨基吡唑類(lèi)化合物的前體，多數(shù)這些化合物是已知的。式Ⅱ中X-Y是指NR5-CO或N＝CR6，其中R5是指氫、烷基，所述烷基根據(jù)需要被羥基、羧基、SO3H、PO3H2、二烷基氧膦基取代，R6是指氫、烷基、鏈烯基、烷氧基、烷硫基、芳基、芳硫基、芳烷基，其中上述每個(gè)基團(tuán)均可根據(jù)需要被羥基、二烷基氧膦基、羧基、SO3H、PO3H2、這些酸基之一的鹽或/和烷氧羰基取代;或者R6是指根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)烷基取代的氨基，所述烷基根據(jù)需要帶有一個(gè)或幾個(gè)羥基、羧基或/和烷氧羰基，其中如果氨基被2個(gè)烷基取代，那么所述的2個(gè)烷基也可連接成環(huán)，該環(huán)除了含有氨基的N原子之外，還能根據(jù)需要被氧、硫或另外一個(gè)氮原子間斷，或者R6是指根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)?；?、烷氧基或/和芳烷氧羰基、H2N-CO、烷基、芳烷基、或/和芳基氨基甲酰基取代的氨基;
或者R6是指羧基、烷氧羰基、甲酰氨基(carboxamido)或鹵素，并且
R7是指烷基、烷硫基、或芳烷基(它們根據(jù)需要被羥基、羧基、SO3H或PO3H2取代)，或根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)烷基取代的氨基(其中烷基又可被羥基、羧基、SO3H、二烷基氧膦基或PO3H2取代)，其中至少R6和/或R7表示氨基，并且R8是指烷基或芳烷基，它們可以根據(jù)需要被羥基、羧基、SO3H或PO3H2取代，或者其中R7和R8一起指3或4元飽和或不飽和的鏈，所述鏈原子由氮原子或者由碳原子和根據(jù)需要一個(gè)或幾個(gè)氮原子或硫原子組成，其中碳原子根據(jù)需要被烷基、烷氧基、烷硫基、羥基、芳烷基、芳基、羧基、甲酰氨基、烷氧羰基、氰基、鹵素、氨基(根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)烷基取代，其中烷基根據(jù)需要帶有一個(gè)或幾個(gè)羥基、羧基或/和烷氧羰基)取代，并且其中不是通過(guò)雙鍵成連接的氮原子被烷基或芳烷基取代，所述烷基或芳烷基根據(jù)需要被羥基、SO3H、PO3H2、羧基或二烷基氧膦基取代或者根據(jù)需要兩個(gè)相鄰的鏈取代基形成亞烷基，而該亞烷基根據(jù)需要又被芳基取代或稠合。
在此情況下以及在烷硫基、二烷基氧膦基、烷基氨基甲?；头纪榛械摹巴榛笔侵妇哂?～6(優(yōu)選1～4)個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烷基。例如甲基、乙基、丙基、異丁基或叔丁基。
如果氨基被2個(gè)烷基取代，這些基團(tuán)也可以作為一個(gè)整體連成環(huán)，它們表示一個(gè)被N原子間斷的環(huán)。在這種情況下，那些優(yōu)選的氨基表示總共有5或6個(gè)環(huán)原子的環(huán)并且根據(jù)需要其本身被氧、硫或氮原子間斷。嗎啉基是特別優(yōu)選的。
“烷氧基”以及在烷氧基和芳烷氧羰基中的“烷氧基”表示具有1～6個(gè)(優(yōu)選1～4)個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烷氧基。例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丁氧基或叔丁氧基。
“芳基”以及芳基氨基甲酰基中的“芳基”是指碳芳族或雜芳族基團(tuán)，優(yōu)選具有6～10個(gè)環(huán)原子的那些，特別是苯基和萘基，它們還可以被烷基、烷氧基或/和鹵素取代。特別優(yōu)選的是苯基。
“芳烷基”以及芳烷基氨基甲?；械摹胺纪榛笔侵钙渲猩鲜龆x的烷基被具有上述特征的芳基取代的基團(tuán)。優(yōu)選的是芐基。
“芳烷氧基”，例如芳烷氧羰基中的“芳烷氧基”，是指其中如上述定義的烷氧基被具有上述特征的芳基取代的基團(tuán)。優(yōu)選的是芐氧基。
“鹵素”表示氟、氯、溴和碘。優(yōu)選氟和氯。
?；侵负型榛?、芳烷基或芳基的羧酸基。優(yōu)選乙?；⒈揭阴；虮郊柞；?。
亞烷基被理解為具有兩個(gè)自由結(jié)合位點(diǎn)的、具有3～5(優(yōu)選3或4)個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、飽和或不飽和的烴鏈。例如-CH2-CH＝CH-、 -(CH2)4或-CH＝CH-CH＝CH-。優(yōu)選的是丁二烯二基(-CH＝CH-CH＝CH-)和四亞甲基(-(CH2)4-)。
鏈烯基是含至少一個(gè)雙鍵的有2～5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烴基。例如優(yōu)選乙烯基。二烷基氧膦基被理解為以下基團(tuán)
其中烷基的含意如上所述。優(yōu)選的是二甲基氧膦基。
堿金屬或堿土金屬鹽或銨鹽可用作SO3H、PO3H2和羧基的鹽。堿金屬鹽被理解為鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、銣鹽和銫鹽，其中鋰鹽、鈉鹽和鉀鹽及上述所有鈉鹽和鉀鹽是優(yōu)選的，堿土金屬鹽是鈹鹽、鎂鹽、鈣鹽、鍶鹽或鋇鹽。優(yōu)選鎂鹽和鈣鹽，特別優(yōu)選鈣鹽。未取代的銨離子NH+4可用作銨鹽。但是也可以使用其中銨離子被1～4個(gè)烷基、芳基或芳烷基取代的那些銨鹽。上面給出的定義適用于這些基團(tuán)，其中特別優(yōu)選的烷基是甲基、乙基和正丙基，特別優(yōu)選的芳基是苯基，而特別優(yōu)選的芳烷基是芐基。
甲酰氨基被理解為CONH2以及其中氨基被一個(gè)或兩個(gè)烷基取代的CONH2，其中所述烷基根據(jù)需要帶有一個(gè)或幾個(gè)羥基、羧基或/和烷氧羰基。
其中R7和R8如上所述形成飽和或不飽和鏈的那些化合物優(yōu)選用作本發(fā)明通式Ⅱ的亞硝基化合物。就此而言，如果該鏈?zhǔn)遣伙柡偷?，并且不飽和鏈上的雙鍵電子和游離的氮原子對(duì)與雙鍵共軛或者與通式Ⅱ的橋N原子共軛形成稠合芳環(huán)，則它是特別優(yōu)選的。
如果需要，通式Ⅱ化合物也可以是互變異構(gòu)形式。該互變異構(gòu)形式也包括在通式Ⅱ化合物中。
通式Ⅲ至Ⅻ的亞硝基化合物是本發(fā)明優(yōu)選的，

并且根據(jù)需要其相應(yīng)的互變異構(gòu)形式及其鹽也是本發(fā)明優(yōu)選的。
在此情況下，X-Y與上述含意相同。
R9、R10、R11和R12相同或不同，并且是指氫、羥基、烷基、烷氧基、烷硫基、芳烷基、芳基、羧基、烷氧羰基、甲酰氨基、氰基、根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)烷基(該烷基根據(jù)需要帶有一個(gè)或幾個(gè)羥基、羧基或/和烷氧羰基)取代的氨基，或者它們是指鹵素，其中根據(jù)需要兩個(gè)相鄰的基團(tuán)形成亞烷基，該亞烷基根據(jù)需要又被芳基取代或稠合，并且R13表示根據(jù)需要均可被羥基、羧基、SO3H、PO3H2或二烷基氧膦基取代的烷基或芳烷基。這些基團(tuán)的定義相應(yīng)于上述對(duì)通式Ⅱ化合物的定義。
通式Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ化合物以及如果需要其相應(yīng)的互變異構(gòu)形式及其鹽特別優(yōu)選用于本發(fā)明。其中X-Y為N＝CR6(其中R6具有對(duì)通式Ⅱ的定義的含意)的那些化合物是特別優(yōu)選的。
已證明，化合物3-亞硝基-2-甲基-吡唑并[1.5a]吡啶、3-亞硝基-吡唑并[1.5a]吡啶和3-亞硝基-吡唑并[3.2-c]均三唑及其鹽，特別是其鹽酸鹽最適用于本發(fā)明。
如上所述，將芳族亞硝基化合物與本發(fā)明方法的待檢樣品和PQQ依賴(lài)性脫氫酶接觸。在EP-A-0354441和EP-A-0441222中描述了氧化酶和非NAD依賴(lài)性脫氫酶將芳族亞硝基化合物還原成富電子芳族氨基化合物，該氨基化合物本身又可以采用顯色偶合試劑和氧化劑、通過(guò)氧化偶合而被檢測(cè)。
出人意料的是，在醌型亞氨基化合物的非氧化生色檢測(cè)試劑和PQQ依賴(lài)性脫氫酶存在下，伴隨著分析物的氧化芳族亞硝基化合物經(jīng)PQQ依賴(lài)性脫氫酶催化的酶促還原作用沒(méi)有完全還原成富電子胺，但是取而代之的是，在部分酶促還原之后形成的亞氨基中間體可以被俘獲，并且可以被非氧化生色檢測(cè)試劑檢測(cè)。
更出人意料的是，當(dāng)選擇某些已經(jīng)帶有顯色基團(tuán)的芳族亞硝基化合物時(shí)，這些芳族亞硝基化合物在PQQ依賴(lài)性脫氫酶存在下被還原成有色的亞氨基化合物，而實(shí)質(zhì)上沒(méi)有進(jìn)一步酶促反應(yīng)形成芳族胺，因此就可以測(cè)定有色的亞氨基化合物本身，用以測(cè)量分析物的量，而不需要與生色檢測(cè)試劑反應(yīng)。下面列出了可用于本發(fā)明的合適的顯色亞硝基化合物的例子。
盡管合適的富電子芳族亞硝基化合物的范圍很寬，但它們都可以被PQQ依賴(lài)性脫氫酶接受為直接電子受體。僅僅是與富電子芳族基團(tuán)成鍵連接的亞硝基表現(xiàn)為必須的。
以亞硝基苯胺為例，據(jù)推測(cè)，該反應(yīng)可以由下列反應(yīng)式表示反應(yīng)流程Ⅰ
伴隨著分析物的氧化，芳族亞硝基化合物(1)被還原成芳族羥胺(2)，后者自發(fā)脫水形成醌型亞氨基中間體(3)。正如在EP-A-0354441和EP-A-0441222中已知的，在中間體(3)被PQQ依賴(lài)性脫氫酶進(jìn)一步酶促還原成芳胺之前，它可以例如被偶合試劑(HR)俘獲并且以有色的偶合產(chǎn)物(4)的形式進(jìn)行比色測(cè)定，或者它已經(jīng)含有起始化合物(5)中的偶合產(chǎn)物的顯色基團(tuán)，并因此能在酶促還原之后以有色亞氨基化合物(4)的形式直接進(jìn)行比色測(cè)定。
出人意料的是，當(dāng)專(zhuān)門(mén)使用PQQ依賴(lài)性脫氫酶時(shí)，亞氨基中間體(3)可以被專(zhuān)一地俘獲，或者可用檢測(cè)試劑按照本發(fā)明直接檢測(cè)，而不需要象EP-A-0354441中已知的那樣進(jìn)一步酶促還原形成胺。因?yàn)楫?dāng)使用黃素依賴(lài)性氧化酶(按照EP-A-0354441，它也可還原芳族亞硝基化合物)時(shí)，它只可能檢測(cè)小部分亞氨基中間體，而大部分亞氨基中間體伴隨著分析物的氧化非?？焖俚剡M(jìn)一步酶促還原形成芳胺。
按照本發(fā)明，亞氨基化合物可借助于其固有的顏色進(jìn)行檢測(cè)。
按照本發(fā)明，也可以用顯色非氧化試劑檢測(cè)醌型亞氨基化合物。顯色是指通過(guò)生色試劑與亞氨基化合物反應(yīng)得到有色物質(zhì)，亞氨基化合物的最大吸光度不同于所用的亞硝基化合物和反應(yīng)前生色試劑的最大吸光度。非氧化顯色檢測(cè)試劑被理解為該檢測(cè)試劑與待檢測(cè)的化合物反應(yīng)并產(chǎn)生顏色，而沒(méi)有對(duì)待檢測(cè)化合物具有氧化作用的檢測(cè)試劑(例如，通過(guò)在檢測(cè)試劑中加入氧化劑)。
通過(guò)將生色偶合試劑與亞氨基化合物反應(yīng)可以檢測(cè)本發(fā)明方法中生成的亞氨基化合物。在此方法中得到有色物質(zhì)，它含有亞氨基化合物作為其結(jié)構(gòu)部分。然而，也可以通過(guò)亞氨基化合物氧化無(wú)色染料分子生成有色分子而完成該檢測(cè)。
也可以通過(guò)將偶合試劑與一分子待檢測(cè)的亞氨基化合物偶合生成未著色的無(wú)色染料分子，該無(wú)色染料再被另一分子亞氨基化合物氧化形成染料，這樣可將兩種檢測(cè)方法結(jié)合起來(lái)。
許多這類(lèi)亞氨基化合物的生色檢測(cè)試劑都是已知的。例如，理論上，所有與氧化的對(duì)苯二胺衍生物反應(yīng)生成顏色的物質(zhì)都值得考慮。
生色偶合檢測(cè)試劑的例子是芳族化合物，優(yōu)選苯酚類(lèi)和萘酚類(lèi)化合物，它們被好的離去基團(tuán)取代，并且因此這些離去基團(tuán)可以容易地和極快地被待檢測(cè)的亞氨基化合物取代，同時(shí)形成顏色。優(yōu)選的例子是1-萘酚-4-磺酸、2，4，6-三溴-3-羥基苯甲酸、2，4-二氯-1-苯酚、酒石黃或一號(hào)橙。
在本發(fā)明方法中也可以使用檢測(cè)試劑對(duì)亞氨基化合物進(jìn)行檢測(cè)，該檢測(cè)試劑不與亞氨基化合物偶合，而是在亞氨基化合物還原成胺的過(guò)程中產(chǎn)生有色化合物。這通常伴隨著無(wú)色染料的二聚作用發(fā)生。對(duì)于H2O2或過(guò)氧化物酶的檢測(cè)方法來(lái)說(shuō)，合適的無(wú)色染料是該領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的。這類(lèi)無(wú)色染料的例子特別是1-萘基氨基磺酸類(lèi)化合物、三芳基咪唑類(lèi)化合物(DE-OS2735690)、二芳基咪唑類(lèi)化合物(US-P-4919890)、氨基咔唑類(lèi)化合物(DE-OS2205733，2338932)、噁唑類(lèi)化合物、噻唑類(lèi)化合物(EP-A-0167973)。
由于其氧化還原電勢(shì)，所有能夠?qū)啺被衔镞€原的無(wú)色染料都是適用的。
最后，通過(guò)使用與亞氨基化合物形成無(wú)色化合物的試劑作為亞氨基化合物偶合成分，也可以將使用偶合試劑偶合的檢測(cè)方法與無(wú)色染料的氧化作用結(jié)合，所述試劑只能被第二分子亞氨基化合物氧化成染料，而該亞氨基化合物被還原成相應(yīng)的芳胺。在彩色照相術(shù)中眾所周知的所謂“偶合劑”通常是苯酚類(lèi)化合物、萘酚類(lèi)化合物、苯胺類(lèi)化合物、萘胺類(lèi)化合物及其衍生物和活性亞甲基化合物。T.H.James在“The Theory of the Photographic Process”(第3版;Mc Millan，New York，1966，第17章，第385～390頁(yè))中綜述了這類(lèi)偶合劑。
本發(fā)明方法以如下方式進(jìn)行，即將待檢樣品同時(shí)與PQQ依賴(lài)性脫氫酶、上述一種或幾種富電子芳族亞硝基化合物和亞氨基化合物的檢測(cè)試劑接觸。如果該樣品含有被PQQ依賴(lài)性脫氫酶氧化的分析物，則該芳族亞硝基化合物通過(guò)酶促還原作用進(jìn)行反應(yīng)，生成相應(yīng)的亞氨基化合物。亞氨基化合物與生色檢測(cè)試劑反應(yīng)，這樣，所產(chǎn)生的顏色可以用樣品中分析物的濃度進(jìn)行校正。采用參照色或光度法，通過(guò)目視法可直接測(cè)量顏色。
當(dāng)通過(guò)還原芳族亞硝基化合物產(chǎn)生的亞氨基化合物本身有色，并且不一定必須通過(guò)與生色檢測(cè)試劑偶合或通過(guò)無(wú)色染料的氧化作用首先檢測(cè)時(shí)，提出了一種特別簡(jiǎn)單的氧化檢測(cè)分析物的方法。如上所述，對(duì)于彩色照相術(shù)和分析檢測(cè)方法來(lái)說(shuō)，有色亞氨基化合物實(shí)際上是該領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的。
對(duì)于通過(guò)直接測(cè)量有色醌型亞氨基化合物氧化檢測(cè)分析物來(lái)說(shuō)，已證明式XⅢ的亞硝基苯胺類(lèi)化合物以及如果需要其相應(yīng)的互變異構(gòu)體及其鹽特別適于用作本發(fā)明方法的直接顯色電子受體，它被還原成有色的式ⅩⅣ醌二亞胺。
通式ⅩⅢ中R1是指氫、羥基、鹵素、烷氧基、烷硫基、芳氧基或芳硫基、烷基(它們根據(jù)需要被羥基、羧基、PO3H2或SO3H取代)，根據(jù)需要被烷基(該烷基可以根據(jù)需要又被羥基、PO3H2、二烷基氧膦基、SO3H或羧基取代)取代一次或幾次的氨基，X-Y是指NR5-CO或N＝CR6其中R5和R6與通式Ⅱ中的含意相同，并且A表示由三個(gè)原子組成的飽和或不飽和鏈，所述三個(gè)原子為一個(gè)氮或硫原子和兩個(gè)碳原子，或者是兩個(gè)氮原子和一個(gè)碳原子，其中根據(jù)需要碳原子被烷基、烷氧基、烷硫基、羥基、芳烷基，芳基、羧基、甲酰氨基、烷氧羰基、氰基、鹵素、根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)烷基(該烷基根據(jù)需要帶有一個(gè)或幾個(gè)羥基、羧基或/和烷氧羰基)取代的氨基取代，并且其中未通過(guò)雙鍵成鍵連接的氮原子被氫、烷基(該烷基根據(jù)需要被SO3H、羧基、PO3H2或二烷基氧膦基取代)或芳烷基取代，或者根據(jù)需要兩個(gè)相鄰的鏈取代基形成亞烷基，該亞烷基根據(jù)需要又可被芳基取代或稠合，
在此情況下，各取代基的含意與通式Ⅱ化合物中的相同。
在此情況下，優(yōu)選的R1基團(tuán)是氫和烷基，優(yōu)選的X-Y是N＝CR6特別優(yōu)選的是，A與相鄰的雜環(huán)形成咪唑、三唑、苯并咪唑、噻唑或二氫咪唑環(huán)，其碳原子可以帶有A的一般定義中所述的取代基。在此情況下，咪唑環(huán)是特別優(yōu)選的。
特別優(yōu)選的化合物是1)(2，4-二甲基-吡唑并[1.5a]咪唑-3-基)-(4-亞硝基苯基)-胺2)(4-甲基-吡唑并[1.5a]咪唑-3-基)-4-亞硝基苯基)-胺3)(4-(二甲基氧膦基甲基)-2-甲基-吡唑[1.5a]咪唑-3-基)-(4-亞硝基苯胺)5)(5，6-二氫-4-二甲基氧膦基甲基-2-甲基-吡唑并[1.5a]咪唑-3-基)-(4-亞硝基苯基)-胺6)(4-(二甲基氧膦基甲基)-2-甲基-吡唑并[1.5a]咪唑-3-基)-(4-亞硝基苯基)-胺7)2，6-二甲基-4-二甲基氧膦基甲基-吡唑并[3.2c]均三唑-3-基)-(4-亞硝基苯基)-胺如果本發(fā)明方法按下述方式進(jìn)行，即通過(guò)還原芳族亞硝基化合物直接產(chǎn)生式XⅦ的有色醌二亞胺化合物，那么將待檢樣品同時(shí)與PQQ依賴(lài)性脫氫酶和一種或幾種通式XⅣ的富電子芳族亞硝基化合物接觸。如果該樣品含有被PQQ依賴(lài)性脫氫酶氧化的分析物，則富電子芳族亞硝基化合物反應(yīng)生成相應(yīng)的有色醌二亞胺。在縮合至顯色富電子吡唑環(huán)的A環(huán)上，其另外的電子富集具有出人意料的作用，即所形成的醌二亞胺化合物不再被進(jìn)一步酶促還原成相應(yīng)的胺，取而代之的是有色醌二亞胺化合物可以以測(cè)量吸光度的形式直接測(cè)量，并且可以用樣品中分析物的濃度校正。為了使顯色芳族亞硝基化合物迅速酶促還原，當(dāng)這些亞硝基化合物具有充分的溶解度時(shí)是特別有利的。當(dāng)使用式XⅢ的顯色亞硝基芳族化合物時(shí)，對(duì)于本發(fā)明方法特別有利的是，其溶液中的濃度至少為10-3mol/1，優(yōu)選10-2mol/l。
通過(guò)提供具有親水性基團(tuán)的顯色亞硝基化合物尤其可以獲得好的溶解度。
最合適于本發(fā)明方法的合適的顯色亞硝基化合物是例如上述化合物3、4和7。
該方法可以以所謂的濕法試驗(yàn)(例如在比色杯中)進(jìn)行，或者以所謂的干法試驗(yàn)在合適的試劑載體上進(jìn)行，其中必需的試驗(yàn)試劑存在于試驗(yàn)載體上，特別是在吸附性材料或可膨脹材料上。這類(lèi)試驗(yàn)材料例如是DE-A-3247608、EP-A-0262445或EP-A-0256806中已知的。
本發(fā)明另外還涉及通過(guò)酶促氧化比色測(cè)定分析物的試劑，其特征如權(quán)利要求書(shū)中。除了含有酶促氧化待檢測(cè)的分析物所必需的PQQ依賴(lài)性脫氫酶和含有至少一種芳族亞硝基化合物之外，該試劑另外還含有亞氨基化合物的生色非氧化檢測(cè)試劑，所述芳基亞硝基化合物作為直接電子受體接受分析物酶促氧化作用過(guò)程中從PQQ/脫氫酶系統(tǒng)釋放的電子。
上述本發(fā)明方法所述的各種物質(zhì)用作PQQ脫氫酶、芳族亞硝基化合物和醌二亞氨基化合物的顯色檢測(cè)試劑。在本發(fā)明方法中，如果使用已經(jīng)含有與苯胺氮結(jié)合的顯色基團(tuán)的式XⅢ富電子芳族亞硝基化合物，那么該試劑不含亞氨基化合物生色檢測(cè)試劑是有利的，因?yàn)樵谶€原過(guò)程中形成的式XⅣ的醌二亞胺已經(jīng)是有色的。
為了保持該方法合適的pH值(該pH值尤其取決于所用的酶和亞氨基化合物的檢測(cè)試劑)，本發(fā)明的試劑含有緩沖系統(tǒng)。該試劑優(yōu)選含有將試驗(yàn)溶液pH設(shè)置于為pH4～9之間的緩沖系統(tǒng)。pH5～6.5的微酸性pH是特別有利的。
本發(fā)明的試劑可以以溶液形式存在，或者吸附在吸附性載體或可膨脹載體上。當(dāng)其為溶液形式時(shí)，該試劑優(yōu)選含有本發(fā)明方法必需的所有試劑。優(yōu)選考慮用水以及與水溶性有機(jī)溶劑的混合物作溶劑，水溶性有機(jī)溶劑是例如甲醇、乙醇、丙酮或二甲基甲酰胺。從穩(wěn)定性考慮，在實(shí)際檢測(cè)前將試驗(yàn)所需試劑分成兩種或幾種互不混合的溶液應(yīng)該是有利的。但是，在開(kāi)始試驗(yàn)前，芳族亞硝基化合物和亞氨基化合物的檢測(cè)試劑存在于溶液中是有利的。所用芳族亞硝基化合物的濃度取決于待測(cè)分析物的濃度。
本發(fā)明方法中待測(cè)分析物的濃度一般為10-6～10-2mol/l，特別是10-5～10-3mol/l。因此，所用亞硝基化合物的濃度一般為10-4～10-1mol/l。為了實(shí)現(xiàn)足夠快的酶促還原，亞硝基化合物、特別是式XⅣ的顯色亞硝基化合物的濃度大于10-3mol/l是特別有利的。所用PQQ依賴(lài)性脫氫酶的濃度取決于其活性和分析物的濃度。在比色杯試驗(yàn)中酶濃度一般為1mU/ml～1U/ml。
亞硝基化合物的檢測(cè)試劑以至少對(duì)所用亞硝基化合物的化學(xué)計(jì)量率使用，優(yōu)選為過(guò)量1.5～2倍。
本發(fā)明的試劑也可以是試條的形式。各類(lèi)具體的試條是已知的，例如參見(jiàn)EP-A-0016387、DE-A-3247608、EP-A-0262445或EP-A-0256806。在試條中，進(jìn)行該測(cè)定方法所需的試劑存在于固體載體層上，可特別考慮用吸附性和/或膨脹性材料作載體層，它們可被待測(cè)樣品液體濕潤(rùn)。載體材料的例子是明膠、纖維素或合成纖維網(wǎng)。試劑以固體形式存在于這些材料之中或之上。當(dāng)在該試條上加樣品液體或?qū)⒃撌綏l浸入樣品液體中時(shí)，試條中形成了液體環(huán)境，在此發(fā)生了檢測(cè)反應(yīng)，由該反應(yīng)引起的顏色形成可通過(guò)肉眼或光度法評(píng)估，例如通過(guò)反射光度法測(cè)定。
試條上各試劑優(yōu)選的濃度是分析物一般為10-4～10-1亞硝基化合物為10-3～1M非氧化檢測(cè)試劑為10-3～1M酶為0.1～100U/每個(gè)試驗(yàn)區(qū)本發(fā)明提供的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)于電子受體的還原來(lái)說(shuō)，非專(zhuān)一性還原催化劑例如心肌黃酶或N-甲硫酸甲基吩嗪鎓不是必需的，而取而代之的是，通過(guò)專(zhuān)一的分析物/酶系統(tǒng)直接完成電子受體的還原。因此可避免干擾的副反應(yīng)。通過(guò)采用亞硝基化合物作為電子受體，不再會(huì)出現(xiàn)例如當(dāng)用氧作為電子受體時(shí)由于此時(shí)擴(kuò)散速度太慢而引起的電子受體的局限。每當(dāng)量待檢測(cè)的亞氨基中間體只有一當(dāng)量分析物被氧化。這就得到了高度靈敏的分析物檢測(cè)。再者，對(duì)于與生色試劑反應(yīng)不需要氧化試劑。因此可以沒(méi)有干擾地，在同一溶液中一步進(jìn)行完整的檢測(cè)反應(yīng)?？梢允褂酶鞣N顯色檢測(cè)試劑，包括彩色照相術(shù)中已知的那些，這幾乎使得能夠自由選擇進(jìn)行檢測(cè)的波長(zhǎng)和決定測(cè)量靈敏度的吸光系數(shù)。
當(dāng)直接形成了有色亞氨基化合物時(shí)，就不再需要與顯色試劑的反應(yīng)，這時(shí)本發(fā)明方法特別容易進(jìn)行。
另外，本發(fā)明還涉及式XⅢ的新的顯色亞硝基苯胺化合物以及根據(jù)需要其相應(yīng)的互相異構(gòu)體及其鹽， 其中R1是指氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷硫基，芳氧基或芳硫基，根據(jù)需要被羥基、羧基、PO3H2、烷基、二烷基氧膦基或SO3H取代的烷基，或氨基，該氨基根據(jù)需要被烷基(根據(jù)需要該烷基又被羥基、PO3H2、SO3H或CO2H取代)取代一次或幾次，并且X-Y是指NR5-CO或N＝CR6其中R5是指氫、烷基，所述烷基根據(jù)需要被羥基、羧基、SO3H、PO3H2、二烷基氧膦基取代，并且R6是指氫，烷基，所述烷基根據(jù)需要被羥基、二烷基氧膦基、羧基、SO3H、PO3H2、這些酸基之一的鹽或/和烷氧羰基取代;或者
R6是根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)烷基取代的氨基，所述烷基根據(jù)需要帶有一個(gè)或幾個(gè)羥基、羧基或/和烷氧羰基，其中如果氨基被2個(gè)烷基取代，那么所述的2個(gè)烷基也可連接成環(huán)，該環(huán)除了含有氨基的N原子之外，還能根據(jù)需要被氧、硫或另外一個(gè)氮原子間斷，或者R6是指根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)?；?、烷氧基或/和芳烷氧羰基、H2N-CO、烷基、芳烷基、或/和芳基氨基甲?；〈陌被?或者R6是指羧基、烷氧羰基、甲酰氨基或鹵素，并且A表示由三個(gè)原子組成的飽和或不飽和鏈，所述三個(gè)原子為一個(gè)氮或硫原子和兩個(gè)碳原子，或者是兩個(gè)氮原子和一個(gè)碳原子，其中根據(jù)需要碳原子被烷基、烷氧基、烷硫基、羥基、芳烷基，芳基、羧基、甲酰氨基、烷氧羰基、氰基、鹵素、根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)烷基(該烷基根據(jù)需要帶有一個(gè)或幾個(gè)羥基、羧基或/和烷氧羰基)取代的氨基取代，并且其中未通過(guò)雙鍵成鍵連接的氮原子被氫、烷基(該烷基根據(jù)需要被SO3H、羧基、PO3H2或二烷基氧膦基取代)或芳烷基取代，或者根據(jù)需要兩個(gè)相鄰的鏈取代基形成亞烷基，該亞烷基根據(jù)需要又可被芳基取代或稠合，在此情況下，各取代基的含意與通式Ⅱ化合物中的相同。
優(yōu)選的R1是氫和未取代或取代的烷基。X-Y優(yōu)選形成N＝CR6，其中R6優(yōu)選表示氫或者未取代或取代的烷基。
特別優(yōu)選的是，A與相鄰的雜環(huán)一起形成咪唑、三唑、苯并咪唑噻唑或二氫咪唑環(huán)，其中環(huán)取代基的含意與通式Ⅲ中的那些相對(duì)應(yīng)。
特別優(yōu)選的是A形成咪唑環(huán)，特別優(yōu)選的化合物是1)(2，4-二甲基-吡唑并[1.5a]咪唑-3-基)-(4-亞硝基苯基)-胺2)(4-甲基-吡唑并[1.5a]咪唑-3-基)-4-亞硝基苯基)-胺3)(4-(二甲基氧膦基甲基)-2-甲基-吡唑[1.5a]咪唑-3-基)-(4-亞硝基苯胺)5)(5，6-二氫-4-二甲基氧膦基甲基-2-甲基-吡唑并[1.5a]咪唑-3-基)-(4-亞硝基苯基)-胺6)(4-(二甲基氧膦基甲基)-2-甲基-吡唑并[1.5a]咪唑-3-基)-(4-亞硝基苯基)-胺7)2，6-二甲基-4-二甲基氧膦基甲基-吡唑并[3.2c]均三唑-3-基)-(4-亞硝基苯基)-胺按照眾所周知的方法，例如由J.T.Hays等人在J.Org.Chem.32，158(1967)中所述的方法制備本發(fā)明的式XⅢ化合物。為此將醚類(lèi)化合物(優(yōu)選對(duì)亞硝基苯酚衍生物的甲醚)與合適的3-氨基-雜環(huán)類(lèi)化合物在質(zhì)子催化下進(jìn)行反應(yīng)。通過(guò)取代甲氧基得到式XⅢ仲胺類(lèi)化合物。
所用的雜芳胺類(lèi)化合物或者是文獻(xiàn)中描述過(guò)的，或者可以按照已知方法制備。特別是EA-A-0433854中描述了含有吡唑并雜環(huán)類(lèi)化合物作為基本結(jié)構(gòu)單元的氨基化合物。
從穩(wěn)定性的角度考慮，需作為中間體產(chǎn)物的氨基化合物通常以強(qiáng)酸(例如無(wú)機(jī)酸)鹽的形式存在。氨基化合物的游離堿優(yōu)選用于與對(duì)亞硝基茴香醚類(lèi)化合物反應(yīng)，該游離堿是按照常規(guī)方法獲得的，例如將其鹽溶于水中，加堿調(diào)pH至8～10，并用有機(jī)溶劑(如乙酸乙酯或二氯甲烷)萃取該游離堿。或者可以使用下列方法，特別是當(dāng)氨基化合物難以萃取時(shí)將氨基化合物溶于甲醇中，然后加入堿(如NaHCO3溶液、三乙胺等)直到濕pH試紙的pH值達(dá)到約5～6。然后加入第二種反應(yīng)原料，即對(duì)亞硝基茴香醚。
實(shí)施例1用PQQ依賴(lài)性葡萄糖染色氧化還原酶和1-萘酚磺酸作為偶合試劑測(cè)定葡萄糖。
在比色杯中混合下列組分檸檬酸鹽緩沖液/焦磷酸鹽緩沖液(50mM)pH7.5 0.38mlN，N-二(2-羥乙基)-4-亞硝基苯胺(5mM，在緩沖液中) 0.40ml1-萘酚-4-磺酸(10mM，在H2O中)作為偶合試劑 0.20ml樣品溶液(0～40mM葡萄糖) 0.01ml通過(guò)加入0.01ml酶溶液(葡萄糖染色氧化還原酶，EC1.1.99.17，900U/ml，800U/ml)開(kāi)始試驗(yàn)，在606nm處測(cè)量吸光度的變化。最多5分鐘后達(dá)到恒定吸光度值(

圖1)。
實(shí)施例2用PQQ依賴(lài)性葡萄糖染色氧化還原酶和2，4，6-三溴-3-羥基苯甲酸作為檢測(cè)劑檢測(cè)葡萄糖。
測(cè)定混合物(最終濃度)100mM 檸檬酸鹽緩沖液pH5.810mM 2，4，6-三溴-3-羥基苯甲酸
1mM N，N-二(2-羥乙基)-4-亞硝基苯胺10U/ml 葡萄糖染色氧化還原酶0.1M 硝酸鈉100～500mM 葡萄糖隨著葡萄糖濃度增加，觀測(cè)到了綠色染色的形成增加(最大吸收波長(zhǎng)＝700nm，圖2)。
實(shí)施例3列于表1的其它亞胺類(lèi)化合物的偶合試劑可以以同樣的方式使用。表1示出了N，N-二(2-羥乙基)-對(duì)醌二亞胺與所列的偶合劑偶合后獲得的最大吸收波長(zhǎng)。


實(shí)施例4按實(shí)施例1相類(lèi)似的方法，使用表2所列的各種富電子芳族亞硝基化合物。與1-萘酚-2-磺酸或1-萘酚-4-磺酸偶合后的最大吸收波長(zhǎng)和顏色在表2中給出。

實(shí)施例5比較PQQ依賴(lài)性葡萄糖染色氧化還原酶和葡萄糖氧化酶通過(guò)還原偶合檢測(cè)亞氨基化合物測(cè)定葡萄糖的方法。
將下列組分置于比色杯中100mM 磷酸鹽緩沖液 pH7.51mM N，N-二(2-羥乙基)-4-亞硝基苯胺10mM 1-萘酚-4-磺酸100U/ml 葡萄糖染色氧化還原酶加入葡萄糖(0～60mM)獲得相應(yīng)量的顏色(圖3)如果用同樣量的葡萄糖氧化酶替代葡萄糖染色氧化還原酶，所產(chǎn)生的顏色量低8倍，這是因?yàn)榇蟛糠炙纬傻孽啺分虚g體被葡萄糖氧化酶進(jìn)一步還原形成苯二胺，同時(shí)消耗葡萄糖(圖4)。
實(shí)施例6借助于還原形成有色的亞氨基化合物，用PQQ依賴(lài)性葡萄糖染色氧化還原酶(Giuc-DOR)測(cè)定葡萄糖。
反應(yīng)式
(3)和(3a)的光譜示于圖5。
測(cè)示混合物(最終濃度)200mM 檸檬酸鹽緩沖液pH61mM 對(duì)亞硝基苯胺(表3中的第3個(gè)化合物)1mM CaCl220U/ml變旋酶10U/ml 葡萄糖染色氧化還原酶在加入各種數(shù)量的葡萄糖(0～50μm最終濃度)后測(cè)量吸光度5分鐘的變化(圖6)。
相類(lèi)似地使用表3中的化合物。表3示出所用的亞硝基化合物的最大吸收波長(zhǎng)和所形成的有色醌二亞胺的最大吸收波長(zhǎng)。

實(shí)施例7借助于由芳族亞硝基化合物還原形成有色的亞氨基化合物測(cè)示PQQ依賴(lài)性葡萄糖染色氧化還原酶的酶活性。
在實(shí)施例6中所述的反應(yīng)也可用于測(cè)量PQQ依賴(lài)性脫氫酶的酶活性。
測(cè)示混合物(最終濃度)200mM 檸檬酸鹽緩沖液pH5.81mM 實(shí)施例6中的對(duì)亞硝基苯胺(3)1mM CaCl230mM 葡萄糖用0～1mU葡萄糖染色氧化還原酶開(kāi)始該動(dòng)力學(xué)測(cè)示，并且隨時(shí)間測(cè)量顏色的變化(圖7)。
實(shí)施例8(4-(二甲基氧膦基甲基)-2-甲基-吡唑并[1.5a]咪唑-3-基)-(4-亞硝基苯基)-胺(3)將13.7g 3-氨基-2-甲基-4-(二甲基氧膦基甲基)-吡唑并[1.5a]咪唑二鹽酸鹽溶于350ml甲醇。將該溶液冷卻至約5℃并加入濃碳酸氫鈉水溶液直至用濕pH試紙指示的pH值約為6。在30分鐘內(nèi)滴加7.8g對(duì)亞硝基茴香醚的35ml甲醇的溶液。在室溫?cái)嚢柙摶旌衔?小時(shí)并且通過(guò)加入更多的NaHCO3溶液將pH值保持在6。
將反應(yīng)混合物過(guò)濾，與約150ml硅膠混合并蒸發(fā)至干。將硅膠裝在硅膠柱中并且用甲苯/甲醇2∶1洗脫分離該產(chǎn)物，得到10.3g深棕色物質(zhì)。用二氯甲烷/甲醇12∶1在硅膠上對(duì)其再次進(jìn)行色譜純化，得到4.9g標(biāo)題化合物，F(xiàn)p.204℃(同時(shí)分解)。
Rf(硅膠)甲苯/甲醇 2∶1＝0.3CH2Cl2/甲醇 12∶1＝0.21 制備起始產(chǎn)物a)4-二甲基氧膦基甲基-2-甲基-吡唑并[1.5a]咪唑?qū)?7g 2-甲基-吡唑并[1.5a]咪唑(J.Het.Chem.10，441(1973))溶于370ml無(wú)水二甲基甲酰胺中并加入54.2g二甲基氧膦基甲基氯和119g碳酸鉀。在115℃(浴溫)攪拌該混合物10小時(shí)。通過(guò)抽吸過(guò)濾沉淀并通過(guò)蒸發(fā)濃縮該濾液。在硅膠上對(duì)殘余物進(jìn)行色譜純化(流動(dòng)溶劑乙酸乙酯/甲醇2∶1)。得到棕色結(jié)晶和棕色油狀物的混合物形式的標(biāo)題化合物36.6g。
TLC(硅膠，乙酸乙酯/甲醇2∶1)Rf＝0.2b)3-氨基-4-二甲基氧膦基甲基-2-甲基-吡唑并[1.5a]咪唑×2HCl將18g上文所獲得的化合物溶于25ml濃鹽酸和50ml水中。在0℃滴加在25ml水中的6.2g亞硝酸鈉溶液。在0℃，30分鐘后，通過(guò)加入碳酸氫鈉使溶液呈弱堿性，然后分批加入21.4g連二亞硫酸鈉。將混合物進(jìn)一步攪拌30分鐘并加入17g二碳酸二叔丁酯的100ml二噁烷溶液。將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，通過(guò)蒸餾除去二噁烷并用正丁醇/乙酸乙酯3∶1萃取該殘余物幾次。將干燥和蒸發(fā)有機(jī)相后剩下的殘余物溶于用HCl飽和的320ml甲醇中。進(jìn)一步攪拌2小時(shí)，在冰浴中將其冷卻并過(guò)濾該沉淀的結(jié)晶。得到總重為18.1g的標(biāo)題化合物。
TLC(硅膠，甲苯/甲醇 3∶1)Rf＝0.1實(shí)施例9(4-亞硝基苯基)-2-甲基-(4-磺丙基-吡唑并[1.5a]咪唑-3-基)-胺(4)與實(shí)施例7相似，將3-氨基-4-磺丙基-吡唑并[1.5a]咪唑與對(duì)亞硝基茴香醚反應(yīng)。過(guò)濾該反應(yīng)混合物并蒸發(fā)濃縮濾液。用甲苯/甲醇2∶1在硅膠上對(duì)殘余物進(jìn)行色譜純化。然后為了進(jìn)一步純化將產(chǎn)物上樣至裝有吸附樹(shù)脂HP20SS(Mitsubishi Co.)的柱上，并用甲醇/水1∶9至2∶8階式梯度洗脫。將含有產(chǎn)物的級(jí)分合并、濃縮、溶解于少量乙醇中，并通過(guò)加入醚使產(chǎn)物沉淀。得到棕色粉末狀的標(biāo)題化合物。
TLC(硅膠，乙醇Rf＝0.6，異丙醇/乙酸丁酯/水5∶3∶2 Rf＝0.48)
制備起始產(chǎn)物a)2-甲基-4-磺丙基-吡唑并[1.5a]咪唑在pH2～5，將2-甲基-吡唑并[1.5a]咪唑與苯基重氮鹽反應(yīng)。該苯基重氮鹽是由苯胺按常規(guī)方式經(jīng)重氮化制備的。將獲得的2-甲基-3-苯偶氮基-吡唑并[1.5a]-咪唑(5.6g)溶于60ml二甲基甲酰胺中并加入3.4g丙磺酸內(nèi)酯(propanesulfone)和7g碳酸鉀。在110℃攪拌該混合物6小時(shí)。再加入5g丙磺酸內(nèi)酯和7g碳酸鉀并在110℃進(jìn)一步攪拌8小時(shí)。冷卻后進(jìn)行過(guò)濾，并用甲醇沖洗殘余物兩次。將溶液濃縮并且通過(guò)在硅膠上經(jīng)色譜法分離所得殘余物(流動(dòng)溶劑乙酸乙酯/甲醇/水 75∶15∶10)。
產(chǎn)量5.3g棕黃色結(jié)晶TLC(硅膠，乙酸乙酯/甲醇/水 75∶15∶10)Rf＝0.3b)3-氨基-2-甲基-4-磺丙基-吡唑并[1.5a]咪唑?qū)?.3g上文制得的偶氮化合物溶于40ml冰醋酸中，并在1小時(shí)內(nèi)分批加入4g鋅粉。將混合物再攪拌30分鐘，抽吸過(guò)濾并蒸發(fā)。用30ml乙酸乙酯研制殘余物，抽吸過(guò)濾并將濾液傾析。得到10.2g棕灰色粉末，該粉末對(duì)于進(jìn)一步反應(yīng)來(lái)說(shuō)是足夠純的。
TLC(硅膠，乙酸乙酯/丙酮/冰醋酸/水5∶2∶2∶1)Rf＝0.14。
實(shí)施例10按照與實(shí)施例8或9相似的方法制備表4的化合物。以下述方式進(jìn)行氨基起始化合物的合成a)制備表4中第5個(gè)化合物的起始化合物3-氨基-5，6-二氫-4-二甲基氧膦基甲基-2-甲基-吡唑并[1.5a]咪唑?qū)?.9g 2-甲基-吡唑并[1.5a]-咪唑啉、2.7g乙酸鈉和7.4g四氟硼酸對(duì)甲氧基苯重氮鹽溶于40ml冰醋酸，并將該溶液加熱至40～50℃維持1小時(shí)。蒸發(fā)反應(yīng)混合物，將殘余物溶于NaHCO3溶液和乙酸乙酯。用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，干燥并蒸發(fā)濃縮。通過(guò)在硅膠上進(jìn)行色譜純化該殘余物(流動(dòng)溶劑乙酸乙酯/石油英1∶1～2∶1;乙酸乙酯;乙酸乙酯/甲醇95∶5)，得到4.12g相應(yīng)的3-偶氮化合物(TLC硅膠，乙酸乙酯/甲醇95∶5;Rf＝0.5)，該化合物用二甲基氧膦基甲基氯在咪唑啉環(huán)的氮上進(jìn)行烷基化。按照與實(shí)施例8b相似的方法通過(guò)還原該偶氮基團(tuán)使其轉(zhuǎn)化成3-氨基化合物。
為了分離和純化，將氨基化合物粗品溶于少量水中，混入固體碳酸氫鈉并加入3倍摩爾量的二碳酸二叔丁酯在二噁烷中的溶液。將混合物攪拌過(guò)夜、蒸發(fā)，首先用乙醚萃取以便除去副產(chǎn)物，然后用二氯甲烷萃取5次以便分離產(chǎn)物。得到晶體叔丁氧羰基化合物(TLC乙酸乙酯/丙酮/冰醋酸/水50∶25∶12∶5∶12∶5，Rf＝0.5)。將該化合物溶于50ml鹽酸甲醇溶液中以便斷裂叔丁氧羰基。在室溫1小時(shí)后，將其濃縮至一半體積并用乙醚沉淀產(chǎn)物。得到鹽酸鹽形式的標(biāo)題化合物。
TLC正丁醇/冰醋酸/水2∶1∶1Rf＝0.3b)制備表4中第6個(gè)化合物的起始化合物3-氨基-4-二甲基氧膦基甲基-2-甲基-吡唑并[1.5a]苯并咪唑與實(shí)施例10相似，通過(guò)將2-甲基吡唑并[1.5a]苯并咪唑(J.prakt.Chem，326，829(1984))與苯基重氮鹽反應(yīng)，用二甲基氧膦基甲基氯進(jìn)行N-烷基化并在冰醋酸中用鋅還原偶氮基團(tuán)，得到標(biāo)題化合物。該標(biāo)題化合物為二水合三鹽酸鹽，F(xiàn)p192(分解)TLC(硅膠，異丙醇/乙酸乙酯/水 50∶30∶20)Rf＝0.38c)制備表4中第7個(gè)化合物的起始化合物3-氨基-2，6-二甲基-4-二甲基氧膦基-吡唑并-[3.2c]均三唑?qū)?g 2，6-二甲基-吡唑并[3.2c]均三唑溶于65ml二甲基甲酰胺，并向該溶液中加入3.9g二甲基氧膦基甲基氯和8g碳酸鉀。在100℃攪拌該混合物2小時(shí)，在加熱的同時(shí)抽吸過(guò)濾，濾液蒸發(fā)濃縮。在硅膠上對(duì)殘余物進(jìn)行色譜純化(流動(dòng)溶劑乙酸乙酯/甲醇4∶1)。在濃鹽酸中加熱回流該產(chǎn)物7小時(shí)以便皂化和脫羧。蒸發(fā)反應(yīng)混合物，得到淺棕色油狀物。
TLC(硅膠乙酸乙酯/甲醇2∶1)Rf＝0.37按照實(shí)施例8中對(duì)相應(yīng)的3-氨基吡唑并[1.5a]咪唑所述的方法(8b)將上述產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成3-氨基化合物。該標(biāo)題化合物為鹽酸鹽，F(xiàn)p.225℃(分解)TLC(硅膠，乙酸乙酯/甲醇3∶1)Rf＝0.2

權(quán)利要求
1.在富電子芳族亞硝基化合物的直接電子受體存在下通過(guò)用氧化還原酶促氧化分析物進(jìn)行比色測(cè)定該分析物以及通過(guò)顏色形成測(cè)定還原的電子受體用以測(cè)量分析物的量的方法，其中在PQQ依賴(lài)性脫氫酶存在下，伴隨著分析物的氧化，富電子的芳族亞硝基化合物被還原成亞氨基化合物，而該亞氨基化合物可通過(guò)顏色形成進(jìn)行測(cè)定，不需進(jìn)一步酶促還原形成芳族胺。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)與非氧化顯色檢測(cè)試劑反應(yīng)進(jìn)行比色測(cè)定亞氨基化合物。
3.按照權(quán)利要求1或2的方法，其中式Ⅰ化合物用作芳族亞硝基化合物， 其中R1是指氫，羥基，根據(jù)需要被羥基、COOH、PO3H2或SO3H取代的烷基，烷氧基，烷硫基，芳氧基，芳硫基，鹵素或氨基，該氨基根據(jù)需要被烷基(根據(jù)需要該烷基被羥基、PO3H2、二烷基氧膦基、SO3H或CO2H取代)取代一次或幾次，并且，R2是指羥基、烷氧基、芳氧基、芳硫基或烷硫基，其中烷基殘基根據(jù)需要被下述基團(tuán)取代羥基、烷氧基、氨基(該氨基根據(jù)需要被烷基取代一次或幾次)、PO3H2、SO3H或CO2H本身或其鹽如銨鹽、堿金屬鹽或堿土金屬鹽，或者R2是指氨基NR3R4其中R3和R4可以相同或不同，并且是指氫、芳基或烷基，它們又可被下述基團(tuán)取代羥基，烷氧基，羥基烷氧基或多烷氧基(該多烷氧基根據(jù)需要被羥基取代)，PO3H2、SO3H、COOH本身或其鹽;或者它們被根據(jù)需要被烷基取代一次或幾次的氨基取代，或者其中R3和R4可以表示亞烷基，所述亞烷基可根據(jù)需要被氧、硫或氮間斷，其中氮被烷基、羥烷基、羥基烷氧基烷基、烷氧基羥烷基、烷氧羰基烷基、二噁烷基烷基或多烷氧基烷基取代，并且每個(gè)這些基團(tuán)的烷基部分又可根據(jù)需要被羥基取代，或者如果R1在NR3R4的鄰位，R3或R4也可以與R1一起表示亞烷基。
4.按照權(quán)利要求1或2的方法，其中式Ⅱ化合物或者根據(jù)需要其相應(yīng)的互變異構(gòu)體或其鹽用作芳族亞硝基化合物， 其中X-Y是指NR5-CO或N＝CR6，其中R5是指氫、烷基，所述烷基根據(jù)需要被羥基、羧基、SO3H、PO3H2、二烷基氧膦基取代，R6是指氫、烷基、鏈烯基、烷氧基、烷硫基、芳基、芳硫基、芳烷基，其中上述每個(gè)基團(tuán)均可根據(jù)需要被羥基、二烷基氧膦基、羧基、SO3H、PO3H2、這些酸基之一的鹽或/和烷氧羰基取代;或者R6是指根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)烷基取代的氨基，所述烷基根據(jù)需要帶有一個(gè)或幾個(gè)羥基、羧基或/和烷氧羰基，其中如果氨基被2個(gè)烷基取代，那么所述的2個(gè)烷基也可連接成環(huán)，該環(huán)除了含有氨基的N原子之外，還能根據(jù)需要被氧、硫或另外一個(gè)氮原子間斷，或者R6是指根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)?；?、烷氧基或/和芳烷氧羰基、H2N-CO、烷基、芳烷基、或/和芳基氨基甲?；〈陌被?或者R6是指羧基、烷氧羰基、甲酰氨基或鹵素，并且R7是指烷基、烷硫基或芳烷基(它們根據(jù)需要被羥基、羧基、SO3H或PO3H2取代)，或指根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)烷基取代的氨基(其中烷基又可被羥基、羧基、SO3H、二烷基氧膦基或PO3H2取代)，其中至少R6和/或R7表示氨基，并且R8是指烷基或芳烷基，它們可以根據(jù)需要被羥基、羧基、SO3H或PO3H2取代，或者其中R7和R8一起指3或4元飽和或不飽和的鏈，所述鏈原子由氮原子或者由碳原子和根據(jù)需要一個(gè)或幾個(gè)氮原子或硫原子組成，其中碳原子根據(jù)需要被烷基、烷氧基、烷硫基、羥基、芳烷基、芳基、羧基、甲酰氨基、烷氧羰基、氰基、鹵素、氨基(根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)烷基取代，其中烷基根據(jù)需要帶有一個(gè)或幾個(gè)羥基、羧基或/和烷氧羰基)取代，并且其中不是通過(guò)雙鍵成連接的氮原子被烷基或芳烷基取代，所述烷基或芳烷基根據(jù)需要被羥基、SO3H、PO3H2、羧基或二烷基氧膦基取代或者根據(jù)需要兩個(gè)相鄰的鏈取代基形成亞烷基，而該亞烷基根據(jù)需要又被芳基取代或稠合。
5.按照權(quán)利要求4的方法，其中的R7和R8形成飽和或不飽和鏈的化合物用作芳族亞硝基化合物。
6.按照權(quán)利要求3的方法，其中式Ⅲ～Ⅻ化合物用作芳族亞硝基化合物， 其中R9、R10、R11和R12相同或不同，并且是指氫、羥基、烷基、烷氧基、烷硫基、芳烷基、芳基、羧基、烷氧羰基、甲酰氨基、氰基、根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)烷基(該烷基根據(jù)需要帶有一個(gè)或幾個(gè)羥基、羧基或/和烷氧羰基)取代的氨基，或者它們是指鹵素，其中根據(jù)需要兩個(gè)相鄰的基團(tuán)形成亞烷基，該亞烷基根據(jù)需要又被芳基取代或稠合，并且R13表示根據(jù)需要均可被羥基、羧基、SO3H、PO3H2或二烷基氧膦基取代的烷基或芳烷基。
7.按照權(quán)利要求2的方法，其中非氧化顯色檢測(cè)試劑是亞氨基化合物的偶合試劑。
8.按照權(quán)利要求7的方法，其中將苯酚、萘酚、苯胺或萘胺衍生物用作偶合試劑。
9.按照權(quán)利要求7的方法，其中將2，4，6-三溴-3-羥基苯甲酸、2，4-二溴-1-萘酚或1-萘酚-4-磺酸用作偶合試劑。
10.按照權(quán)利要求2的方法，其中通過(guò)將無(wú)色染料氧化成染料檢測(cè)亞氨基化合物。
11.按照權(quán)利要求10的方法，其中二芳基咪唑類(lèi)化合物、三芳基咪唑類(lèi)化合物或萘胺類(lèi)化合物用作無(wú)色染料。
12.按照權(quán)利要求1的方法，其中使用通式ⅩⅢ的芳族亞硝基化合物或者根據(jù)需要其相應(yīng)的互變異構(gòu)體或其鹽，該化合物酶促反應(yīng)生成有色的醌二亞胺用以測(cè)量分析物的量， 其中R1是指氫、羥基、鹵素、烷氧基、烷硫基、芳氧基或芳硫基、烷基(它們根據(jù)需要被羥基、羧基、PO3H2或SO3H取代)、根據(jù)需要被烷基(該烷基可以根據(jù)需要又被羥基、PO3H2、二烷基氧膦基、SO3H或羧基取代)取代一次或幾次的氨基，X-Y是指NR5-CO或N＝CR6，其中R5是指氫、烷基，所述烷基根據(jù)需要被羥基、羧基、SO3H、PO3H2、二烷基氧膦基取代，R6是指氫、烷基、鏈烯基、烷氧基、烷硫基、芳基、芳硫基、芳烷基，其中上述每個(gè)基團(tuán)均可根據(jù)需要被羥基、羧基、SO3H、PO3H2、這些酸基之一的鹽或/和烷氧羰基取代;或者R6是指根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)烷基取代的氨基，所述烷基根據(jù)需要帶有一個(gè)或幾個(gè)羥基、羧基或/和烷氧羰基，其中如果氨基被2個(gè)烷基取代，那么所述的2個(gè)烷基也可連接成環(huán)，該環(huán)除了含有氨基的N原子之外，還能根據(jù)需要被氧、硫或另外一個(gè)氮原子間斷，或者R6是指根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)?；⑼檠趸?和芳烷氧羰基、H2N-CO、烷基、芳烷基、或/和芳基氨基甲?；〈陌被?或者R6是指羧基、烷氧羰基、甲酰氨基或鹵素，并且A表示由三個(gè)原子組成的飽和或不飽和鏈，所述三個(gè)原子為一個(gè)氮或硫原子和兩個(gè)碳原子，或者是兩個(gè)氮原子和一個(gè)碳原子，其中根據(jù)需要碳原子被烷基、烷氧基、烷硫基、羥基、芳烷基，芳基、羧基、甲酰氨基、烷氧羰基、氰基、鹵素、根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)烷基(該烷基根據(jù)需要帶有一個(gè)或幾個(gè)羥基、羧基或/和烷氧羰基)取代的氨基取代，并且其中未通過(guò)雙鍵成鍵連接的氮原子被氫、烷基(該烷基根據(jù)需要被SO3H、羧基、PO3H2或二烷基氧膦基取代)或芳烷基取代，或者根據(jù)需要兩個(gè)相鄰的鏈取代基形成亞烷基，該亞烷基根據(jù)需要又可被芳基取代或稠合。
13.按照權(quán)利要求12的方法，其中A與相鄰的雜環(huán)形成咪唑、三唑、苯并咪唑、噻唑或二氫咪唑環(huán)。
14.按照權(quán)利要求12或13的方法，其中以大于10-3mol/l的濃度使用芳族亞硝基化合物。
15.按照權(quán)利要求1～14任何一項(xiàng)的方法，其中將葡萄糖染色氧化還原酶用作測(cè)定葡萄糖的PQQ依賴(lài)性脫氫酶。
16.用于通過(guò)酶促氧化分析物進(jìn)行比色測(cè)定該分析物的試劑，該試劑含有PQQ依賴(lài)性脫氫酶和富電子芳族亞硝基化合物，其中它還含有使亞氨基化合物產(chǎn)生顏色的、非氧化檢測(cè)試劑。
17.按照權(quán)利要求16的試劑，其中它含有通式Ⅰ亞硝基化合物， 其中R1是指氫，羥基，根據(jù)需要被羥基、COOH、PO3H2或SO3H取代的烷基，烷氧基，烷硫基，芳氧基，芳硫基，鹵素或氨基，該氨基根據(jù)需要被烷基(根據(jù)需要該烷基被羥基、PO3H2、二烷基氧膦基、SO3H或CO2H取代)取代一次或幾次，并且，R2是指羥基、烷氧基、芳氧基、芳硫基或烷硫基，其中烷基殘基根據(jù)需要被下述基團(tuán)取代羥基、烷氧基、氨基(該氨基根據(jù)需要被烷基取代一次或幾次)、PO3H2、SO3H或CO2H本身或其鹽如銨鹽、堿金屬鹽或堿土金屬鹽，或者R2是指氨基NR3R4其中R3和R4可以相同或不同，并且指氫、芳基或烷基，它們又可被下述基團(tuán)取代羥基，烷氧基，羥基烷氧基或多烷氧基(該多烷氧基根據(jù)需要被羥基取代)，PO3H2、SO3H、COOH本身或其鹽;或者它們被根據(jù)需要被烷基取代一次或幾次的氨基取代，或者其中R3和R4可以表示亞烷基，所述亞烷基可根據(jù)需要被氧、硫或氮間斷，其中氮被烷基、羥烷基、羥基烷氧基烷基、烷氧基羥烷基、烷氧羰基烷基、二噁烷基烷基或多烷氧基烷基取代，并且每個(gè)這些基團(tuán)的烷基部分又可根據(jù)需要被羥基取代，或者如果R1在NR3R4的鄰位，R3或R4也可以與R1一起表示亞烷基。
18.按照權(quán)利要求17的試劑，其中它含有通式Ⅱ亞硝基化合物或者根據(jù)需要其相應(yīng)的互變異構(gòu)體或其鹽， X-Y是指NR5-CO或N＝CR6，其中R5是指氫、烷基，所述烷基根據(jù)需要被羥基、羧基、SO3H、PO3H2、二烷基氧膦基取代，R6是指氫、烷基、鏈烯基、烷氧基、烷硫基、芳基、芳硫基、芳烷基，其中上述每個(gè)基團(tuán)均可根據(jù)需要被羥基、二烷基氧膦基、羧基、SO3H、PO3H2、這些酸基之一的鹽或/和烷氧羰基取代;或者R6是指根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)烷基取代的氨基，所述烷基根據(jù)需要帶有一個(gè)或幾個(gè)羥基、羧基或/和烷氧羰基，其中如果氨基被2個(gè)烷基取代，那么所述的2個(gè)烷基也可連接成環(huán)，該環(huán)除了含有氨基的N原子之外，還能根據(jù)需要被氧、硫或另外一個(gè)氮原子間斷，或者R6是指根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)?；?、烷氧基或/和芳烷氧羰基、H2N-CO、烷基、芳烷基、或/和芳基氨基甲?；〈陌被?或者R6是指羧基、烷氧羰基、甲酰氨基或鹵素，并且R7是指烷基、烷硫基或芳烷基(它們根據(jù)需要被羥基、羧基、SO3H或PO3H2取代)，或指根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)烷基取代的氨基(其中烷基又可被羥基、羧基、SO3H、二烷基氧膦基或PO3H2取代)，其中至少R6和/或R7表示氨基，R8是指烷基或芳烷基，它們可以根據(jù)需要被羥基、羧基、SO3H或PO3H2取代，或者其中R7和R8一起指3或4元飽和或不飽和的鏈，所述鏈原子由氮原子或者由碳原子和根據(jù)需要一個(gè)或幾個(gè)氮原子或硫原子組成，其中碳原子根據(jù)需要被烷基、烷氧基、烷硫基、羥基、芳烷基、芳基、羧基、甲酰氨基、烷氧羰基、氰基、鹵素、氨基(根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)烷基取代，其中烷基根據(jù)需要帶有一個(gè)或幾個(gè)羥基、羧基或/和烷氧羰基)取代，并且其中不是通過(guò)雙鍵成連接的氮原子被烷基或芳烷基取代，所述烷基或芳烷基根據(jù)需要被羥基、SO3H、PO3H2、羧基或二烷基氧膦基取代或者根據(jù)需要兩個(gè)相鄰的鏈取代基形成亞烷基，而該亞烷基根據(jù)需要又被芳基取代或稠合。
19.按照權(quán)利要求16～18任何一項(xiàng)的試劑，其中它含有用于亞氨基化合物的顯色偶合試劑或者含有作為用于亞氨基化合物的非氧化檢測(cè)試劑的無(wú)色染料。
20.用于通過(guò)酶促氧化分析物進(jìn)行比色測(cè)定該分析物的試劑，該試劑含有PQQ依賴(lài)性脫氫酶和富電子芳族亞硝基化合物，其中富電子芳族亞硝基化合物是通式ⅩⅢ亞硝基苯胺化合物，或者是根據(jù)需要其互變異構(gòu)體或其鹽， 其中R1是指氫、羥基、鹵素、烷氧基、烷硫基、芳氧基或芳硫基、烷基(它們根據(jù)需要被羥基、羧基、PO3H2或SO3H取代)、根據(jù)需要被烷基(該烷基可以根據(jù)需要又被羥基、PO3H2、二烷基氧膦基、SO3H或羧基取代)取代一次或幾次的氨基，X-Y是指NR5-CO或N＝CR6，其中R5是指氫、烷基，所述烷基根據(jù)需要被羥基、羧基、SO3H、PO3H2、二烷基氧膦基取代，R6是指氫、烷基、鏈烯基、烷氧基、烷硫基、芳基、芳硫基、芳烷基，其中上述每個(gè)基團(tuán)均可根據(jù)需要被羥基、二烷基氧膦基、羧基、SO3H、PO3H2、這些酸基之一的鹽或/和烷氧羰基取代;或者R6是指根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)烷基取代的氨基，所述烷基根據(jù)需要帶有一個(gè)或幾個(gè)羥基、羧基或/和烷氧羰基，其中如果氨基被2個(gè)烷基取代，那么所述的2個(gè)烷基也可連接成環(huán)，該環(huán)除了含有氨基的N原子之外，還能根據(jù)需要被氧、硫或另外一個(gè)氮原子間斷，或者R6是指根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)?；⑼檠趸?和芳烷氧羰基、H2N-CO、烷基、芳烷基、或/和芳基氨基甲?；〈陌被?或者R6是指羧基、烷氧羰基、甲酰氨基或鹵素，并且A表示由三個(gè)原子組成的飽和或不飽和鏈，所述三個(gè)原子為一個(gè)氮或硫原子和兩個(gè)碳原子，或者是兩個(gè)氮原子和一個(gè)碳原子，其中根據(jù)需要碳原子被烷基、烷氧基、烷硫基、羥基、芳烷基，芳基、羧基、甲酰氨基、烷氧羰基、氰基、鹵素、根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)烷基(該烷基根據(jù)需要帶有一個(gè)或幾個(gè)羥基、羧基或/和烷氧羰基)取代的氨基取代，并且其中未通過(guò)雙鍵成鍵連接的氮原子被氫、烷基(該烷基根據(jù)需要被SO3H、羧基、PO3H2或二烷基氧膦基取代)或芳烷基取代，或者根據(jù)需要兩個(gè)相鄰的鏈取代基形成亞烷基，該亞烷基根據(jù)需要又可被芳基取代或稠合。
21.按照權(quán)利要求20的試劑，其中A與相鄰的雜環(huán)形成咪唑、三唑、苯并咪唑、噻唑或二氫咪唑環(huán)。
22.含有權(quán)利要求16～21任何一項(xiàng)所述的試劑的試驗(yàn)載體。
23.式ⅩⅢ亞硝基苯胺化合物以及根據(jù)需要其相應(yīng)的互變異構(gòu)體及其鹽， 其中R1是指氫、羥基、鹵素、烷氧基或芳硫基、烷基(它們根據(jù)需要被羥基、羧基、PO3H2或SO3H取代)，根據(jù)需要被烷基(該烷基可以根據(jù)需要又被羥基、PO3H2、SO3H或羧基取代)取代一次或幾次的氨基，X-Y是指NR5-CO或N＝CR6，其中R5是指氫、烷基，所述烷基根據(jù)需要被羥基、羧基、SO3H、PO3H2、二烷基氧膦基取代，R6是指氫、烷基、鏈烯基、烷氧基、烷硫基、芳基、芳硫基、芳烷基，其中上述每個(gè)基團(tuán)均可根據(jù)需要被羥基、羧基、SO3H、PO3H2、這些酸基之一的鹽或/和烷氧羰基取代;或者R6是指根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)烷基(所述烷基根據(jù)需要帶有一個(gè)或幾個(gè)羥基、羧基或/和烷氧羰基)取代的氨基，其中這些基團(tuán)也可連接成環(huán)，該環(huán)除了含有氨基的N原子之外，還能根據(jù)需要被氧、硫或另外一個(gè)氮原子間斷，或者R6是指根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)酰基、烷氧基或/和芳烷氧羰基、H2N-CO、烷基、芳烷基、或/和芳基氨基甲?；〈陌被?或者R6是指羧基、烷氧羰基、甲酰氨基或鹵素，并且A表示由三個(gè)原子組成的飽和或不飽和鏈，所述三個(gè)原子為一個(gè)氮或硫原子和兩個(gè)碳原子，或者是兩個(gè)氮原子和一個(gè)碳原子，其中根據(jù)需要碳原子被烷基、烷氧基、烷硫基、羥基、芳烷基，芳基、羧基、甲酰氨基、烷氧羰基、氰基、鹵素、根據(jù)需要被一個(gè)或兩個(gè)烷基(該烷基根據(jù)需要帶有一個(gè)或幾個(gè)羥基、羧基或/和烷氧羰基)取代的氨基取代，并且其中未通過(guò)雙鍵成鍵連接的氮原子被氫、烷基(該烷基根據(jù)需要被SO3H、羧基、PO3H2或二烷基氧膦基取代)或芳烷基取代，或者根據(jù)需要兩個(gè)相鄰的鏈取代基形成亞烷基，該亞烷基根據(jù)需要又可被芳基取代或稠合。
24.按照權(quán)利要求23的亞硝基苯胺類(lèi)化合物，其中A與相鄰的雜環(huán)形成咪唑、三唑、苯并咪唑、噻唑或二氫咪唑環(huán)。
25.權(quán)利要求23或24任何一項(xiàng)所述的亞硝基苯胺類(lèi)化合物用于比色酶促測(cè)定分析物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及在富電子芳族亞硝基化合物電子受體存在下，用PQQ依賴(lài)性脫氫酶進(jìn)行酶促氧化、通過(guò)將亞硝基化合物酶促還原成亞氨基化合物，并通過(guò)顏色形成檢測(cè)亞氨基化合物進(jìn)行比色測(cè)定分析物的方法。另外，本發(fā)明涉及相應(yīng)的試劑，它含有PQQ依賴(lài)性脫氫酶、富電子芳族亞硝基化合物以及如果需要亞氨基化合物的檢測(cè)試劑。此外發(fā)明涉及新的亞硝基氨基化合物(它在還原反應(yīng)中形成有色的醌二亞胺類(lèi))及其比色酶促測(cè)定分析物的用途。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK1098745SQ94103578
公開(kāi)日1995年2月15日 申請(qǐng)日期1994年4月8日 優(yōu)先權(quán)日1993年4月8日
發(fā)明者J·赫尼斯, V·昂克里格 申請(qǐng)人:曼海姆泊靈格股份公司