專利名稱：人白細胞介素-6的制備方法及其產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人白細胞介素-6的制備方法及其產(chǎn)品。
許多病癥所用的一些藥物(如化療藥物等)可使人的免疫系統(tǒng)失調(diào)或降低免疫功能，使人的抵抗力下降，從而易引起細菌感染，引起其他病癥，如果恢復(fù)或提高人的免疫功能，則就能提高人的抗病能力，人的免疫細胞和造血細胞的生長和分化受許多細胞因子的調(diào)控，白細胞介素就是上述這些細胞分泌的細胞因子，它們誘導(dǎo)淋巴細胞和造血干細胞的生長和分化，目前已發(fā)現(xiàn)有十幾種白細胞介素，白細胞介素6具有抗癌作用，例如能抑制人類乳腺癌克隆的生長，白細胞介素-6具有造血功能，例如用IL-6處理的造血干細胞可恢復(fù)或強化造血系統(tǒng)的功能，從而在治療敗血癥和血小板減少方面有著極其重要的作用，IL-6對于提高人體的免疫功能，抗病防病和進行術(shù)后、疾病愈后康復(fù)期的診斷和治療具有重要意義和廣闊的應(yīng)用前景。
本發(fā)明目的是提供一種人白細胞介素-6的制備方法及其產(chǎn)品，該方法獲得的多肽活性高。
為達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案制備方法包括以下幾個步驟
(1)血液中白細胞分離;
(2)白細胞總mRNA的分離按Pharmacia的微量mRNA純化的試劑盒方法分離;
(3)人工合成含有限制性內(nèi)切酶切點的引物，在合成的上游引物中導(dǎo)入了BamHI位點，在合成的下游引物導(dǎo)入了EcoRI位點，并將天然IL-6的終止密碼子TAG轉(zhuǎn)換成大腸桿菌偏愛的終止密碼子TAA，引物的序列為PL 5' CG GGATCC GC ATG GAA CGA ATT GAC AAA CAA 3'PR 5' CG GAATTC A TTA CAT TTG CCG AAG AG 3'(4)cDNA合成在含有人白細胞介素-6mRNA合成引物的存在下，利用逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA合成系統(tǒng)，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增IL-6基因片段，其核苷酸序列為ATG GAA CGA ATT GAC AAA CAA ATT CGG TAC ATC CTC GAC GGC10ATC TCA GCC CTG AGA AAG GAG ACA TGT AAC AAG AGT AAC ATG20TGT GAA AGC AGC AAA GAG GCA CTG GCA GAA AAC AAC CTG AAC30CTT CCA AAG ATG GCT GAA AAA GAT GGA TGC TTC CAA TCT GGA50TTC AAT GAG GAG ACT TGC CTG GTG AAA ATC ATC ACT GGT CTT60 70
60 70TTG GAG TTT GAG GTA TAC CTA GAG TAC CTC CAG AAC AGA TTT80GAG AGT AGT GAG GAA CAA GCC AGA GCT GTG CAG ATG AGT ACA90AAA GTC CTG ATC CAG TTC CTG CAG AAA AAG GCA AAG AAT CTA100 110GAT GCA ATA ACC ACC CCT GAC CCA ACC ACA AAT GCC AGC CTG120CTG ACG AAG CTG CAG GCA CAG AAC CAG TGG CTG CAG GAC ATG130 140ACA ACT CAT CTC ATT CTG CGC AGC TTT AAG GAG TTC CTG CAG150TCC AGC CTG AGG GCT CTT CGG CAA ATG TAG160 164(5)IL-6cDNA克隆和大腸桿菌轉(zhuǎn)化經(jīng)EcoRI+BamHI酶切的pTrc載體和IL-6cDNA連接，該表達載體pTrc的啟動子是-35(trpB)與-10(IacUV5)的雜合啟動子;載有IL-6基因的質(zhì)粒經(jīng)培養(yǎng)獲得陽性克隆的大腸桿菌。
(6)IL-6純化、測定。
氫基酸序列為Met Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly10Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met20Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn30 40Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly50Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu60 70Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe80Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln Met Ser Thr90Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn Leu100 110Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu120Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met130 140
Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln150Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met End160 164以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作詳細說明(1)血液中白細胞分離取人血，以1∶1.5(V/V)的比例加入細胞分離液，在1000轉(zhuǎn)/分下離心15分鐘進行梯度分離，收集白細胞部分。
(2)白細胞總mRNA的分離按Pharmacia微量mRNA純化試劑盒所述方法進行將含有107個細胞的白細胞懸液放在1.5ml塑料離心管中，1000rpm下，離心棄上清液，管中加入0.4ml提取緩沖液勻漿，再用0.8ml洗脫液稀釋，10000xg下離心1分鐘，得含有mRNA的勻漿清液。
另取一支1.5ml塑料離心管，加入1ml oligo(dt)-纖維素，1000xg下離心1分鐘，除去貯存液。將勻漿清液加入到oligo(dT)-纖維素離心管中，混合3分鐘，使mRNA親合吸附，再在16000xg下離心10秒鐘，棄上清液。
在管中加入1ml高鹽緩沖液(10mM Tris-Hcl，1mM EDTA，0.5MNaCL PH7.4)進行洗滌，將Oligo(dT)-纖維素懸浮，離心10秒鐘，棄上清液。重復(fù)上述步驟4次。
在管中再加入1ml低鹽緩沖液(10mM Tris-Hcl，1mM EDTA，0.1MNacL，PH7.4)進行洗滌，重復(fù)洗滌3次。洗滌后的oligo(dT)-纖維素加入0.3ml低鹽緩沖液懸浮，放入微型柱上，在柱中的oligo(dT)-纖維素再用0.5ml低鹽緩沖液洗滌三次離心，除去洗滌液。加入0.2ml洗脫緩沖液(10mMTris-Hcl，1mMEDTA PH7.4)離心，洗脫下來的400μlmRNA溶液中加入10μl Glycogen溶液40μl乙酸鉀溶液，再加入1ml-20℃冷乙醇(95%)，-20℃靜置至少30分鐘，在4℃離心5分鐘得mRNA沉淀，沉淀在-80℃貯存，洗脫液在260nm的最大吸收是0.05，相當于RNA濃度為2μg/ml。
(3)cDNA的合成按Boehringer公司自Poly(A)RNA合成cDNA試制盒所述方法進行。20μlmRNA放于塑料離心管中，在冰溶中加入4μl第一鏈合成緩沖液，1μlRNase抑制劑，2μl dATP.dcTp.dGTP.dTTp混合液，2μloligo(dT)15引物，2μlAMV逆轉(zhuǎn)錄酶和適量重蒸水，總加入20μl，混勻后，在42℃予溫60分鐘，混合液再放入冰溶中。
再向混合液中加入第二鏈合成組分，包括40μl第二鏈合成緩沖液，1μlRNaseH溶液，5μl E.coli DNA聚合酶和適宜重蒸水，總體積100μl，混合后離心10秒鐘，再于12℃予溫60分鐘22℃予溫60分鐘和65℃予溫10分鐘，再加入4μl T4 DNA聚合酶，于37℃予溫10分鐘，最后，加入10μl EDTA溶液(0.2mol/L)和2μl sarkosye溶液(10%W/V)終止反應(yīng)，cDNA用苯酚/氯仿提取，用乙醇沉淀而獲得。
(4)PCR基因擴增在0.5ml無菌離心管中加入37μl重蒸水，5μl擴增緩沖液(0.5mol/L kcl，0.1mol/L Trise Hcl，15m mol/L Mgcl2，0.1%明膠，1%TriTonx-100.PH8.3).5μl dNTP混合液，5μl引物，1μl模板DNA溶液，混勻后離心10分鐘，再放入95℃水浴中予變性10分鐘離心10秒鐘，然后加入1μl(3單位)Taq DNA聚合酶，混勻后加上50μl石蠟油，于72℃保溫2分鐘，再于93℃(1分鐘)-50℃(1分鐘)。-72℃(3分鐘)循環(huán)35次，擴增樣品，在瓊脂糖凝膠電脈上回收IL-6cDNA擴增帶。
(5)IL-6cDNA克隆和大腸桿菌轉(zhuǎn)化經(jīng)PCR法擴增的IL-6cDNA，經(jīng)瓊脂糖電脈回收，苯酚抽提，乙醇沉淀后，DNA再溶于15μl重蒸水中。
經(jīng)EcoRI+Bam HI酶切的pTre載體和IL-6cDNA進行連接，連接后應(yīng)在0.5ml塑料離心管中進行管中加入4.5μl重蒸水，1.5μl連接反應(yīng)緩沖液(50mMol/L Tris-Hcl 10mMol/L Mgcl2，20mMol/L DTT.1mMOL/L ATP和50ug BSA，PH7.8)2μl載體DNA，6μl IL-6DNA片段和1μl T4 DNA連接酶，樣品混勻后，在14-16℃水浴中保溫24-72小時。
取5-7μl連接產(chǎn)物(載有IL-6基因的質(zhì)粒)加入到100-200μl的E.coli HB101感受態(tài)細胞懸液中，混勻放在冰浴中30分鐘再于42℃熱擊2分鐘，加入1ml LB培養(yǎng)液(不含抗菌素)，37℃保溫1小時，涂布于適當體積的LB固體培養(yǎng)基上(含有氨芐青霉素)，37℃培養(yǎng)過液，提取陽性克隆的大腸桿菌。
(6)IL-6產(chǎn)物鑒定經(jīng)篩選后的大腸桿菌經(jīng)三級培養(yǎng)，菌體裂解。去包含體再進行SDS-PAGE測定表明，IL-6蛋白占菌體蛋白的30%，IL-6純化后可獲得純IL-6蛋白，蛋白分子量為18KD，純化的IL-6的SDS-PAGE圖譜見

圖1。
實驗中表達載體pTrc的啟動子是-35(trpB)與-10(lacUV5)的雜合啟動子，該啟動子有很強的起始轉(zhuǎn)錄功能，Laco位點是Lac阻遇物結(jié)合位點，通過誘導(dǎo)物誘導(dǎo)可高效表達。Anti-Term是一段E.coli rrnB序列，可防過轉(zhuǎn)錄提前終止，其構(gòu)象見圖2，該表達載體市場有售?；蛞?Herman等Proc.Natl Acad Sci VSA 80∶21-25 1983)制備。
本發(fā)明優(yōu)點本發(fā)明中采用了含有限制性內(nèi)切酶切點的引物及特有的序列，經(jīng)cDNA合成，其核苷酸序列為486個核苷酸，將獲得的IL-6的cDNA克隆到質(zhì)粒載體上，該表達載體pTrc的啟動子是-35(trpB)與-10(lacUV5)的雜合啟動子，以及其他特點使cDNA得到高效表達，該方法得到的產(chǎn)物(多肽)是162個氨基酸殘基，依照Brakenhoff等工作，(J.Immunol.143∶1175-1182，1989)，在成熟IL-6的N末端缺失23個氨基酸時，其表達活性是全長成熟蛋白的2.8倍。
權(quán)利要求
1.一種人白細胞介素-6的制備方法，其特征在于它包括以下幾個步驟(1)血液中白細胞分離；(2)白細胞總mPNA的分離按Pharmacia的微量mRNA純化的試劑盒方法分離；(3)人工合成含有限制性內(nèi)切酶切點的引物，在合成的上游引物中導(dǎo)入了BamHI位點，在合成的下游引物導(dǎo)入了EcoRI位點，其引物的序列為PL 5′ CG GGATCC GC ATG GAA CGA ATT GAC AAA CAA 3′PR 5′ CG GAATTC A TTA CAT TTG CCG AAG AG 3′(4)CDAN合成在含有人白細胞介素-6mRNA合成引物的存在下，利用逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA合成系統(tǒng)，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增IL-6基因片段，其核苷酸序列為ATG GAA CGA ATT GAC AAA CAA ATT CGG TAC ATC CTC GAC GGC10ATC TCA GCC CTG AGA AAG GAG ACA TGT AAC AAG AGT AAC ATG20TGT GAA AGC AGC AAA GAG GCA CTG GCA GAA AAC AAC CTG AAC30CTT CCA AAG ATG GCT GAA AAA GAT GGA TGC TTC CAA TCT GGA50TTC AAT GAG GAG ACT TGC CTG GTG AAA ATC ATC ACT GGT CTT60 70TTG GAG TTT GAG GTA TAC CTA GAG TAC CTC CAG AAC AGA TTT80GAG AGT AGT GAG GAA CAA GCC AGA GCT GTG CAG ATG AGT ACA90AAA GTC CTG ATC CAG TTC CTG CAG AAA AAG GCA AAG AAT CTA100 110GAT GCA ATA ACC ACC CCT GAC CCA ACC ACA AAT GCC AGC CTG120CTG ACG AAG CTG CAG GCA CAG AAC CAG TGG CTG CAG GAC ATG130 140ACA ACT CAT CTC ATT CTG CGC AGC TTT AAG GAG TTC CTG CAG150TCC AGC CTG AGG GCT CTT CGG CAA ATG TAG160 164(5)IL-6cDNA克隆和大腸桿菌轉(zhuǎn)化經(jīng)EcoRI+BamHI酶切的pTrc載體和IL-6cDNA連接，該表達載體pTrc的啟動子是-35(trpB)與-10(lacVW5)的雜合啟動子；載有IL-6基因的質(zhì)粒經(jīng)培養(yǎng)獲得陽性克隆的大腸桿菌。(6)IL-6純化，測定。
2.按權(quán)利要求1所述的制備方法得到產(chǎn)物，其特征在于其氫基酸序列為Met Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly10Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met20Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn30 40Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly50Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu60 70Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe80Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln Met Ser Thr90Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn Leu100 110Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu120Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met130 140Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln150Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met End160 16全文摘要
一種人白細胞介素-6的制備方法及其產(chǎn)物，方法包括人白細胞分離；白細胞總mRNA分離；人工合成含有限制性內(nèi)切酶切點的引物；cDNA合成，其產(chǎn)物核苷酸序列全長為486個核苷酸，所獲得的IL-6的cDNA克隆到質(zhì)粒載體上，載體pFrc的啟動子是-35(trpB)與-10(LacUv)的雜合啟動子；經(jīng)誘導(dǎo)高效表達后得高活性IL-6蛋白，它是162個氨基酸殘基，其表達活性是全長成熟蛋白的2.8倍。
文檔編號C12N15/24GK1110319SQ9410400
公開日1995年10月18日 申請日期1994年4月13日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月13日
發(fā)明者吳瓊 申請人:張君宜