專利名稱：制備透明質(zhì)酸的微生物、培養(yǎng)基和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能生產(chǎn)高分子量的透明質(zhì)酸的新型微生物，使用該微生物制備所述的透明質(zhì)酸的方法，以及為生產(chǎn)所述的透明質(zhì)酸，用于培養(yǎng)該微生物的合適的培養(yǎng)基。
本領(lǐng)域熟知的是，透明質(zhì)酸是一種無色、透明和高粘性的線性多糖，其分子量在50kda至13，000kda之間，其分子鏈中具有直鏈的、β-(1，4)-葡糖醛酸和β-(1，3)-N-乙?；咸前方惶媾帕械逆湺?。已發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸及其鹽具有很多用途，例如在眼科手術(shù)中用作透明體替換物和用作眼睛的滴劑，以及在化妝品組合物中用作濕潤劑。通常，透明質(zhì)酸是從動物組織中抽提或用一些微生物培養(yǎng)而制得。
例如，美國專利4，141，973(Balaz)描述了一種從動物組織中抽提制備透明質(zhì)酸的方法，該方法是通過將動物組織進行純化或除去其中的生物聚合物雜質(zhì)，例如硫酸軟骨素和氨基葡聚糖(glycosaminoglycan)，而制得透明質(zhì)酸。由于該方法費用高且效率低，因此一般認為該方法不適合用作大規(guī)模生產(chǎn)透明質(zhì)酸。
因此，已經(jīng)提出了許多種采用微生物，特別是屬于鏈球菌屬(genus Streptococcus)的那些微生物來制備透明質(zhì)酸。已經(jīng)用于生產(chǎn)透明質(zhì)酸的舉例微生物包括釀膿鏈球菌(S.pyrogenes)，糞鏈球菌(S.faecalis)，S.dysgalactiae，獸疫鏈球菌(S.zooepidemicus)，馬鏈球菌(S.equi)，類馬鏈球菌(S.equisimilis)等;并且它們在伯杰氏手冊中被分在Lansfield血清組A或C。也有報道說它們是具有β溶血作用的溶血鏈形成的球菌(cocci)。例如，在已公開的日本專利申請56692/1983和500997/1985，已公開的韓國專利申請92-9494和87-125中，披露了采用鏈球菌屬微生物生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法。
此外，已經(jīng)開發(fā)出了許多采用鏈球菌屬微生物來改善透明質(zhì)酸產(chǎn)率的制備透明質(zhì)酸的方法。例如，已公開的韓國專利申請90-5774披露了一種方法，該方法是通過調(diào)節(jié)磷酸鹽的濃度來提高透明質(zhì)酸的產(chǎn)率;已公開的日本專利申請257901/1987披露了一種采用丙酮酸鹽、氨基葡萄糖等的方法;已公開的日本專利申請225491/1989披露了一種采用含有一個或多個羥基自由基的芳香族化合物的方法;和已公開的日本專利申請141594/1988和289198/1987披露了一種采用氨基酸的方法。
但是，這些方法的缺點是所生產(chǎn)的透明質(zhì)酸的分子量相對較低;例如在300kda至3，000kda的范圍內(nèi)，并且收率低。結(jié)果是，由此生產(chǎn)的透明質(zhì)酸在使用時濕潤效果差，例如當其用于化妝品中時，而且使用時其性能差，例如在眼科手術(shù)過程中，或是作為關(guān)節(jié)炎的治療劑時。
因此，本發(fā)明的一個主要目的是提供一種新型的能以高收率生產(chǎn)出高分子量的透明質(zhì)酸的突變微生物。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種利用所述的微生物生產(chǎn)高分子量的透明質(zhì)酸的方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種培養(yǎng)微生物的合適的培養(yǎng)基，使得能夠高效率地生產(chǎn)出高分子量的透明質(zhì)酸。
按照本發(fā)明的一個方面，提供了一種屬于鏈球菌屬的新型的微生物，該微生物沒有透明質(zhì)酸酶活性和溶血活性，并且能夠生產(chǎn)出高分子量的透明質(zhì)酸。
按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種適合于從鏈球菌屬的一個菌株以高收率得到所述的高分子量的透明質(zhì)酸的培養(yǎng)基，其中，所述的培養(yǎng)基包含尿核甙。
附圖簡要說明結(jié)合附圖，本發(fā)明的上述的和其他的目的及特征從下述的對本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的描述中可以很清楚地看出來。附圖中

圖1A和1B分別描述了獸疫鏈球菌ATCC35246和本發(fā)明的獸疫鏈球菌LBF707的發(fā)酵型圖(fermentation profiles);
圖2示出了由本發(fā)明得到的透明質(zhì)酸的分子量與采用獸疫鏈球菌ATCC35246生產(chǎn)的透明質(zhì)酸的分子量以及商品透明質(zhì)酸的分子量的比較圖;
圖3描述了由本發(fā)明方法得到的透明質(zhì)酸的特性粘度(intrinsic viscosity)隨其濃度的變化曲線與采用現(xiàn)有技術(shù)中的方法得到的透明質(zhì)酸的特性粘度隨其濃度的變化曲線的比較圖;以及圖4描述了尿核甙對透明質(zhì)酸的特性粘度的影響。
按照本發(fā)明，屬于鏈球菌屬、沒有透明質(zhì)酸酶活性和溶血活性并且能生產(chǎn)出高分子量的透明質(zhì)酸的新型微生物是這樣得到的使已知的獸疫鏈球菌ATCC35246致突變。該致突變方法包括用N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NTG)對親代微生物(parent microorganism)至少處理三次。也就是說，按照本發(fā)明，在第一次用NTG對已知的微生物進行處理后，制備和選擇出沒有溶血活性的突變菌株，隨后對其用NTG進行第二次處理，以得到?jīng)]有透明質(zhì)酸酶的菌株，所述的透明質(zhì)酸酶能使透明質(zhì)酸催化分解。此后，將由此得到的菌株用NTG進行第三次處理，隨后將其接種到一固體培養(yǎng)基中，以收集快速生產(chǎn)的、高粘性的大的菌落(colonies)，作為具有優(yōu)異的透明質(zhì)酸產(chǎn)率的突變菌株。
按照上述程序選擇的突變菌株沒有透明質(zhì)酸酶和溶血活性，并且能夠生產(chǎn)出平均分子量高于，例如3，500kda的高分子量透明質(zhì)酸。一種所述的突變菌株被命名為“獸疫鏈球菌LBF707”(“Streptococcus zooepidemicus LBF707”)，并按照布達佩斯條約的有關(guān)條款，即用于專利程序目的微生物保藏的國際認可，于1993年1月29日保藏于韓國典型培養(yǎng)物中心(KCTC)，保藏號為KCTC0075BP。
所述的獸疫鏈球菌LBF707(Streptococcus zooepidemicus LBF707)已于1994年4月11日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)進行了保藏，保藏號為CCTCC M 94023。
一般來說，用于孵育屬于鏈球菌屬的微生物的培養(yǎng)基包含碳源，氮源，微量元素如一種無機鹽等。作為碳源，可以使用淀粉，葡萄糖，蔗糖，半乳糖，果糖及其類似物;優(yōu)選是葡萄糖。作為氮源，可以使用硫酸銨，硝酸銨，硝酸鈉，酪蛋白氨基酸，酵母抽提物，胨，胰化胨等。此外，如果需要的話，還可以加入氯化鈉、磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，硫酸亞鐵，氯化鉀，硫酸鎂等。
按照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，透明質(zhì)酸的收率和分子量隨著孵育產(chǎn)透明質(zhì)酸的微生物，例如上述的新型的微生物的培養(yǎng)基中尿核甙的加入而相應地增加。
因此，每1升本發(fā)明的培養(yǎng)基優(yōu)選是含有10至100克葡萄糖，0.5至3.0克硫酸鎂，1.0至5.0克磷酸二氫鉀，1.0至10.0克酵母抽提物，10.0至20.0克酵母胨，和1.0至5.0克尿核甙;更優(yōu)選的是含有50至70克葡萄糖，0.7至1.5克硫酸鎂，1.5至2.5克磷酸二氫鉀，4.0至6.0克酵母抽提物，13.0至17.0克酵母胨和0.5至1.0克尿核甙。
此外，優(yōu)選是在33℃至38℃的溫度范圍內(nèi)，同時調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為7.0至7.5以及維持換氣速率在0.1至1.0VVM的條件下，對微生物進行需氧培養(yǎng)。
在對所述的微生物進行培養(yǎng)后，培養(yǎng)基中存在的透明質(zhì)酸通常是以其鹽的形式，例如鈉鹽的形式存在。
所述的微生物的培養(yǎng)完成之后，可以采用已知的分離和純化多糖的方法回收存在于所述的培養(yǎng)基中的透明質(zhì)酸(Akasaka，Hinodedo，J.Soc.Cosmet.Chem.Japan，22，35-42(1988))。
按照本發(fā)明，從突變微生物生產(chǎn)的透明質(zhì)酸的產(chǎn)量可達到2.5至6.0克/升的水平，而且其平均分子量高于3，500kda。采用卡唑法對透明質(zhì)酸進行定量分析(Z.Dische，J.Biol.Chem.，167，189(1947))。采用高效液相色譜法(HPLC)和粘度測定法確定透明質(zhì)酸的分子量。采用高效液相色譜法(HPLC)時，用洗脫標準物質(zhì)聚環(huán)氧乙烷得到標準曲線，然后在同樣的條件下洗脫透明質(zhì)酸，參照所述的標準曲線得出其分子量(P.Chabreck，Chromatographia，30，201-204(1990);Narlin B.Beaty，Anal.Biochem.，147，387-395(1985);Noriko Motohashi，J.Chrom.，299，508-512(1984))。采用粘度測定法時，使用粘度計測定一系列的稀釋的透明質(zhì)酸的特性粘度，并繪出粘度隨透明質(zhì)酸的濃度變化的曲線。用外推法得出溶液中透明質(zhì)酸的濃度為零時的溶液的極限特性粘度;隨后按照下述的Narlin方程式(Anal.Biochem.，147，387-395(1985))計算出透明質(zhì)酸的分子量極限特性粘度＝0.000356×MW exp(1.0699)下述的實施例僅用來解釋本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。
實施例1突變菌株的篩選步驟1)沒有溶血活性的菌株的制備將獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus)(ATCC35246)孵育于25ml Todd-Hewitt液體培養(yǎng)基中(Difco，USA，Cat.No.0492-05-0)，并在振搖下37℃培養(yǎng)14小時。此后，將得到的2.5ml培養(yǎng)物再次孵育于25ml Todd-Hewitt培養(yǎng)基中，并在振搖下在37℃培養(yǎng)，直至達到指數(shù)生長階段(exponential growth phase)。隨后，將1ml培養(yǎng)物在4℃離心分離(5，000×g，5分鐘)，收集沉淀物并分別用1ml Tris-順丁烯二酸鹽緩沖溶液(每1升溶液中含有Tris 6克，pH6.0，順丁烯二酸5.8克，硫酸銨1克，硫酸亞鐵0.25毫克，硫酸鎂0.1克，硝酸鈣0.005克)洗滌二次。將洗滌后的沉淀物懸浮于1ml的上述緩沖溶液中，隨后加入N-甲基-N'-硝基-亞硝基胍(NTG)，使其濃度達到100至200μg/l，隨即在37℃振搖20至30分鐘或靜置60至120分鐘，使其致突變。
將經(jīng)由NTG處理后得到的懸浮液在4℃離心分離(5，000×g，5分鐘)，收集沉淀物后用上述的緩沖溶液洗滌數(shù)次以除去其中殘留的NTG。將得到的細胞球(cell pellets)再懸浮于上述的緩沖溶液中。將得到的1ml懸浮液孵育于25ml Todd-Hewitt培養(yǎng)基中，隨后在37℃振搖18小時以增加可見突變細胞的數(shù)目。
得到的培養(yǎng)物用生理食鹽水稀釋，并將稀釋的溶液加入到有Todd-Hewitt瓊脂培養(yǎng)基的平皿中，該培養(yǎng)基含有5%血，將其在37℃孵育48小時。由于具有溶血活性的菌落在其周圍形成一潔凈區(qū)(clear zones)，選擇沒有溶血活性的非潔清區(qū)域中的那些菌落作為突變菌落。
步驟2)不能產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶的菌株的制備重復上述步驟1)所述的相同的過程，以使由上述步驟1)得到的沒有溶血活性的突變菌落致突變。將所述的菌落用生理食鹽水進行懸浮和稀釋，然后加入到加有含400μg透明質(zhì)酸和1%白蛋白第V部分(albumin fraction V)(Sigma Co.，Cat.No.A-2153)的Todd-Hewitt瓊脂培養(yǎng)基的平皿中。將該平皿在潮濕的室內(nèi)37℃放置2至5天后，向其中加入10ml 2N乙酸鹽溶液，然后將該平皿靜置10分鐘。透明質(zhì)酸和白蛋白在乙酸鹽溶液中結(jié)合形成沉淀，該沉淀轉(zhuǎn)化成不透明的培養(yǎng)基。如果是產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的菌落，其消化透明質(zhì)酸而使溶液呈澄清狀態(tài)。因此，選擇能使溶液呈不透明狀態(tài)的菌落，該菌落不能產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶。
步驟3)具有優(yōu)異的透明質(zhì)酸產(chǎn)率的突變菌株的制備重復上述的步驟1)所述的相同的程序，以使由上述的步驟2)得到的突變菌落致突變。將所述的菌落用生理食鹽水稀釋，并加入到加有Todd-Hewitt瓊脂培養(yǎng)基的平皿中。將該平皿在潮濕的室內(nèi)37℃放置48小時。在步驟3)中，使用獸疫鏈球菌(ATCC35246)作為對照組。選擇粘度比對照組高、尺寸比對照組大的那些菌落作為突變菌株，其具有優(yōu)異的透明質(zhì)酸產(chǎn)率。
步驟4)生產(chǎn)高分子量的透明質(zhì)酸的突變菌株的制備采用由上述的步驟3)得到的突變菌株，實施下述的篩選步驟，以選擇能生產(chǎn)高分子量的透明質(zhì)酸的理想的菌株。
3克Todd-Hewitt培養(yǎng)基溶于150ml蒸餾水中，并將得到的溶液在121℃消毒滅菌15分鐘。將每一突變菌落分別接種到上述的消毒滅菌過的培養(yǎng)基中，并在37℃孵育15小時作為種子培養(yǎng)物。在-5升的發(fā)酵罐中加入3升培養(yǎng)基，每升所述的培養(yǎng)基含有60克葡萄糖，1.0克硫酸鎂，2.0克磷酸二氫鉀，5.0克酵母抽提物，15.0克酵母胨和0.75克尿核甙，并且該培養(yǎng)基是在121℃蒸汽消毒滅菌過的。然后，向其中加入150ml上述的種子培養(yǎng)物，在保持pH值為7.1、溫度為35℃、換氣速度為0.5vvm的條件下，培養(yǎng)24小時。
將培養(yǎng)物用0.45μm的濾網(wǎng)過濾，濾液用高效液相色譜進行分離，選擇最快地被洗脫出的菌株作為產(chǎn)透明質(zhì)酸的突變菌株，由此得到的突變菌株生產(chǎn)出的透明質(zhì)酸的分子量，比由獸疫鏈球菌ATCC35246生產(chǎn)出的透明質(zhì)酸的分子量要高得多。已經(jīng)測定出，由本發(fā)明的突變菌株生產(chǎn)出的透明質(zhì)酸的平均分子量要高于3，500kda。
步驟5)突變菌株的細菌學性質(zhì)本發(fā)明得到的突變菌株表現(xiàn)出下述的細菌學性質(zhì)革蘭氏染劑陽性在10℃時的生長陰性在45℃時的生長陰性在6.5%鹽水中的生長陰性在pH9.6時的生長陰性在40%膽汁中的生長陰性精氨酸降解性陽性馬尿酸鹽降解性陰性七葉甙降解性陰性抗枯草桿菌肽(bacitracin)性陰性糖降解性葡萄糖，麥芽糖，蔗糖，山梨糖醇，乳糖陽性甘露醇，丙三醇，繭蜜糖陰性從上面所述可以看出，本發(fā)明新型的突變菌株具有與測定細菌學伯杰氏手冊(Berger's Mannual of Determinatine Bacteriology(1974))中所描述的那些獸疫鏈球菌相同的性質(zhì)，只是它們沒有溶血活性和產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的能力，其被命名為獸疫鏈球菌LBF707。
比較實施例1透明質(zhì)酸收率的比較比較了用由實施例1的步驟4)得到的獸疫鏈球菌LBF707和用獸疫鏈球菌ATCC35246來生產(chǎn)透明質(zhì)酸的收率。從圖1可以看出，使用本發(fā)明的新型突變微生物時，單位體積的透明質(zhì)酸的收率比使用獸疫鏈球菌ATCC35246時要高出約20%。
比例實施例2分子量的比較用高效液相色譜對分別由本發(fā)明的上述突變微生物和由獸疫鏈球菌ATCC35246得到的透明質(zhì)酸的分子量與從動物組織抽提得到的商品透明質(zhì)酸的分子量進行了比較，這些商品透明質(zhì)酸例如可以是HEALON(Pharmacia AB，Sweden，lot No.RH41401)和ARTZ(Biochemical Industry Inc.，Japan)。
從圖2可以看出，由本發(fā)明的突變菌株，即獸疫鏈球菌LBF707生產(chǎn)的透明質(zhì)酸的分子量最高。
此外，用粘度計測定了由使用本發(fā)明的獸疫鏈球菌LBF707生產(chǎn)的透明質(zhì)酸和從動物組織中抽提得到的商品透明質(zhì)酸即，HEALON和AMVISC(Johnson & Johnson，USA)的粘度。如圖3所示，由本發(fā)明的突變菌株生產(chǎn)的透明質(zhì)酸的極限特性粘度最高。采用Narlin方程式，根據(jù)它們的極限特性粘度，分別計算出了這些透明質(zhì)酸的分子量。結(jié)果是，由獸疫鏈球菌LBF707生產(chǎn)的透明質(zhì)酸的平均分子量為3，800kda，HEALON的平均分子量為3，700kda，AMVISC的平均分子量為3，100kda。
實施例2在含有尿核甙的培養(yǎng)基中對微生物的培養(yǎng)在5個5升的發(fā)酵罐中，分別都加入3升培養(yǎng)基，每升所述的培養(yǎng)基含有60克葡萄糖，1.0克硫酸鎂，2.0克磷酸二氫鉀，5.0克酵母抽提物，和15.0克酵母胨。向這五個罐中，以其中的每升培養(yǎng)基計，分別加入0，0.5，0.75，1.0和2.0克尿核甙。所述的培養(yǎng)基在121℃消毒滅菌20分鐘，然后向其中加入150ml獸疫鏈球菌ATCC35246的種子培養(yǎng)物，并在保持pH值為7.2，溫度為35℃以及換氣速率為0.5vvm的條件下，培養(yǎng)24小時。然后測定每一培養(yǎng)基中透明質(zhì)酸的濃度，結(jié)果列于下表1中。
表1透明質(zhì)酸的收率隨尿核甙濃度的變化
從上表1可以看出，尿核甙的加入增加了透明質(zhì)酸的產(chǎn)量。
比較實施例3在有或沒有尿核甙的培養(yǎng)基中生產(chǎn)的透明質(zhì)酸的分子量的比較采用相同的培養(yǎng)基組合物和相同的培養(yǎng)條件重復如實施例2所述的相同的培養(yǎng)程序，只是將尿核甙的濃度固定為0.75g/l。當培養(yǎng)結(jié)束時，經(jīng)測定培養(yǎng)基中透明質(zhì)酸的濃度為4.8g/l。
將本比較實施例中得到的透明質(zhì)酸的分子量與實施例2的對照組的透明質(zhì)酸的分子量進行比較。圖4示出了在有或沒有尿核甙的培養(yǎng)基中生產(chǎn)的透明質(zhì)酸，其特性粘度(以及其極限特性粘度)隨其濃度的變化曲線。圖4中，NH2-Ctrl代表在沒有尿核甙的培養(yǎng)基中得到的透明質(zhì)酸(實施例2，對照組)，NH2-Unid表示在有尿核甙的培養(yǎng)基中得到的透明質(zhì)酸(本比較實施例，實驗組)。對照組的極限特性粘度值為約3，000ml/g，而實驗組則約為3，400ml/g。將所述極限特性粘度值代入如前所述的Narlin方程式中，即可計算出對照組和實驗組的透明質(zhì)酸的分子量，對照組的為約3，000kda，實驗組的則為約3，400kda。這一結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中加入尿核甙，可以增加透明質(zhì)酸的分子量。
實施例3新型微生物的批培養(yǎng)物(Batch Culture)
向-5升的發(fā)酵罐中加入3升培養(yǎng)基，每升該培養(yǎng)基含有60克葡萄糖，1.0克硫酸鎂，2.0克磷酸二氫鉀，5.0克酵母抽提物，15.0克酵母胨和0.75克尿核甙。
將該培養(yǎng)基在121℃消毒滅菌20分鐘，隨后將150ml獸疫鏈球菌LBF707的種子培養(yǎng)物溶液加入到其中，并在保持pH為7.1至7.3，溫度為35至38℃，換氣速率為0.1vvm至1.0vvm的條件下培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)基中的透明質(zhì)酸的濃度為6.0g/l，透明質(zhì)酸的平均分子量為約3，500kda。
實施例4新型微生物的加粒批培養(yǎng)物(Fed-batch Culture)開始時，培養(yǎng)基采用與實施例3中相同的培養(yǎng)基組合物和相同的條件進行，只是葡萄糖的濃度為40g/l。12到18小時后，培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化成加料批培養(yǎng)物(fed-batch culture)，向其中加入葡萄糖，以維持培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度低于10g/l。繼續(xù)培養(yǎng)24至36小時，直至其中的透明質(zhì)酸的濃度不再增加時為止。培養(yǎng)結(jié)束時，培養(yǎng)物溶液中透明質(zhì)酸的濃度為5.0g/l，并且透明質(zhì)酸的平均分子量約為3，500kda。
盡管用上述的特殊的實施方案對本發(fā)明進行了描述，應該理解的是，本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員可以對本發(fā)明進行各種各樣的修正和變化。對本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說，這些修正和變化是顯而易見的，并落在本發(fā)明的由權(quán)利要求所限定的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種具有增強的高分子量透明質(zhì)酸產(chǎn)率的獸疫鏈球菌突變菌株，其是由下述方法制得的，該方法包括采用N-甲基-N’-硝基-亞硝基胍對獸疫鏈球菌ATCC 35246進行至少三次致突變作用，由此生產(chǎn)突變菌株；并且從其中選擇無溶血活性和透明質(zhì)酸酶活性的菌株。
2.如權(quán)利要求1所述的具有增強的高分子量透明質(zhì)酸產(chǎn)率的突變菌株，其為獸疫鏈球菌LBF 707，保藏號為CCTCC M 94023。
3.生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，包括對權(quán)利要求1或2的突變菌株進行培養(yǎng)。
4.以高收率生產(chǎn)高分子量透明質(zhì)酸的方法，包括將屬于鏈球菌屬的一種微生物在一種培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，其中向該培養(yǎng)基中加有尿核甙。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的微生物為獸疫鏈球菌LBF707，保藏號為CCTCC M 94023。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其中所述的尿核甙的濃度為0.1至5.0g/l。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種屬于鏈球菌屬的新型的微生物，其能生產(chǎn)出高分子量的透明質(zhì)酸；使用所述的微生物生產(chǎn)所述的透明質(zhì)酸的方法；以及適于培養(yǎng)產(chǎn)透明質(zhì)酸的微生物的培養(yǎng)基。
文檔編號C12P19/26GK1099068SQ94104439
公開日1995年2月22日 申請日期1994年4月15日 優(yōu)先權(quán)日1993年4月16日
發(fā)明者樸明奎, 張在德, 姜煥求 申請人:株式會社樂喜