專利名稱：L-蘋果酸高產(chǎn)突變株曲霉n1-14′及生產(chǎn)l-蘋果酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可直接發(fā)酵糖質(zhì)原料生產(chǎn)L-蘋果酸的微生物菌株及利用該菌株生產(chǎn)L-蘋果酸的方法。
L-蘋果酸學(xué)名為L-羥基丁二酸(L-hydroxysuccinic acid)，是繼檸檬酸之后的一個很有發(fā)展前景的產(chǎn)品，可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、印染、化工、電鍍及建筑材料等各個方面。
迄今為止，制造L-蘋果酸的途徑大致有5條1，從植物莖葉及果實中提取;2、拆分化學(xué)合成的DL-蘋果酸;3、利用微生物產(chǎn)生的富馬酸酶轉(zhuǎn)化富馬酸為L-蘋果酸(簡稱酶法);4、利用微生物發(fā)酵糖質(zhì)原料生產(chǎn)L-蘋果酸;5、利用微生物發(fā)酵非糖質(zhì)原料生產(chǎn)L-蘋果酸。目前，國內(nèi)外市場的L-蘋果酸產(chǎn)品主要采用酶法生產(chǎn)，然而由于化學(xué)合成的高純度富馬酸價格較高，加上產(chǎn)品中的富馬酸含量較高等因素，很多國家一直在探討和發(fā)展直接發(fā)酵糖質(zhì)原料生產(chǎn)L-蘋果酸的方法。1990年以色列人Battat等，采用黃曲霉(Aspergillus flavus)在16L發(fā)酵罐上發(fā)酵葡萄糖約192小時，產(chǎn)酸113g/L，產(chǎn)酸速率0.59g/L.h，但該菌種產(chǎn)生黃曲霉毒素，因此不能應(yīng)用于生產(chǎn)(Biotechnology and Bioengineering 37∶1108～1116)。1991年日本公開特許公報(平3-180187)公布了采用稗疣黑粉菌(Ustilago crus-galli)等搖瓶發(fā)酵葡萄糖168小時，產(chǎn)酸52g/L，產(chǎn)酸速率0.31g/L.h的結(jié)果。1988年中國無錫輕工業(yè)學(xué)院金其榮等(食品科學(xué)2∶12-19)報告了采用不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉搖瓶發(fā)酵大米水解糖140小時，產(chǎn)酸60-70g/L，產(chǎn)酸速率0.43-0.50g/L.h，500L規(guī)模中試平均產(chǎn)酸44g/L的結(jié)果。上述L-蘋果酸產(chǎn)生菌的產(chǎn)酸水平及其發(fā)酵工藝技術(shù)均未達到工業(yè)化生產(chǎn)的水平。
本發(fā)明的目的是提供一種能直接發(fā)酵糖質(zhì)原料生產(chǎn)L-蘋果酸，產(chǎn)酸速率及對糖轉(zhuǎn)化率高，可進行工業(yè)化生產(chǎn)L-蘋果酸的微生物菌株以及利用該微生物菌株生產(chǎn)L-蘋果酸的可行的工業(yè)化生產(chǎn)方法。
本發(fā)明所提供的微生物菌株是經(jīng)選育的L-蘋果酸高產(chǎn)突變株曲霉(Aspergillus SP.)N1-14′，該曲霉N1-14′的樣品保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，編號為M94013。該菌株以下簡稱為N1-14′CCTCC M94013。
N1-14′CCTCC M94013在察氏(Czapek)培養(yǎng)基上，28-32℃下培養(yǎng)5-7天，其菌落直徑約1-2cm。在生長初期，菌落淺黃白色，老后呈淡褐黃色，較致密，沒有特殊氣味，反面淡黃色，具較明顯的皺褶。菌絲短羊毛狀，白色，有隔;分生孢子梗從壁厚而膨大的足細胞垂直長出，無隔，上部較粗大，頂端膨大成近球形的泡囊，從泡囊的全部表面放射狀地生出小梗，小梗單層或雙層，分生孢子生于小梗頂端，最初為橢圓形或洋梨形，成熟后為球形或近球形，帶黃褐色和粗糙的小刺，并具有不很明顯的雙層壁。N1-14′CCTCC M94013的生長適宜條件為1、培養(yǎng)物質(zhì)20×10-2馬鈴薯汁500-1000ml/L，葡萄糖10-30g/L，KH2PO42-5g/L，MgSO4·7H2O 1-3g/L，瓊脂15-20g/L;2、培養(yǎng)溫度25-35℃;3、培養(yǎng)pH值5.5-7.5。本突變株經(jīng)測定不產(chǎn)生黃曲霉毒素，其全發(fā)酵液急性中毒試驗屬實際無毒級，慢性蓄積試驗屬弱蓄積。
利用N1-14′CCTCC M94013直接發(fā)酵糖質(zhì)原料可生產(chǎn)L-蘋果酸，本發(fā)明在搖瓶試驗的基礎(chǔ)上，通過1.2L，20L，240L，1.7m3及20m3發(fā)酵罐的逐步擴大試驗，已經(jīng)形成了利用N1-14′CCTCC M94013直接發(fā)酵糖質(zhì)原料生產(chǎn)L-蘋果酸的合適發(fā)酵工藝條件，并建立了從發(fā)酵液中提取L-蘋果酸的可行方法。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其主要特點是利用N1-14′CCTCC M94013對糖質(zhì)原料進行直接發(fā)酵。所說的糖質(zhì)原料可為葡萄糖，淀粉水解糖，蔗糖及淀粉等，如采用淀粉為原料，則需加α-淀粉酶進行液化處理。
利用N1-14′CCTCC M94013直接發(fā)酵糖質(zhì)原料生產(chǎn)L-蘋果酸的工藝過程包括1、發(fā)酵工藝過程1.1、在25-35℃溫度范圍并加入其主要成份為葡萄糖和KH2PO4的產(chǎn)孢促進劑的條件下，使N1-14′CCTCC M94013在三角瓶麩皮培養(yǎng)基內(nèi)大量產(chǎn)生孢子，即菌種制備;
1.2、將成熟的孢子接入種子罐中含有碳酸鈣的培養(yǎng)基進行種子培養(yǎng);
1.3、將成熟的種子移入繁殖罐中含有碳酸鈣的培養(yǎng)基中進行深層液體孢子生產(chǎn);
1.4、將合適菌齡的種子及成熟的孢子移入發(fā)酵罐中含有碳酸鈣的培養(yǎng)基中，對糖質(zhì)原料進行直接發(fā)酵得到發(fā)酵醪;
2、L-蘋果酸提取工藝過程2.1、直接真空抽濾發(fā)酵醪收得含有菌體的L-蘋果酸鈣;
2.2、用無砷硫酸解含有菌體的L-蘋果酸鈣，并對酸解液進行除雜和脫色;
2.3、對上述除雜脫色后的酸解液真空抽濾去除菌體和硫酸鈣，獲得L-蘋果酸粗溶液;
2.4、在L-蘋果酸粗溶液中加入絮凝劑澄清后精濾，然后使精濾液通過陰陽離子交換樹脂進行凈化;
2.5、將凈化后的L-蘋果酸溶液進行濃縮、結(jié)晶，最后將離心收得的濕晶體進行干燥。
本發(fā)明在菌種制備階段采用產(chǎn)孢促進劑，可以極大地提高孢子產(chǎn)量，一般可使麩皮培養(yǎng)基產(chǎn)生孢子由1.0×106/克培養(yǎng)基(干重)提高到4.0×108/克培養(yǎng)基(干重)，產(chǎn)孢促進劑的主要成份為葡萄糖與KH2PO4，兩者的比例為葡萄糖KH2PO4＝1∶0.005-0.05(重量份)。所使用的麩皮培養(yǎng)基成份(按每公斤培養(yǎng)基所含克重g/kg計算)為新鮮麩皮400-600，余量為水。加入培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢促進劑的用量為麩皮培養(yǎng)基的(1-10)×10-2，而以(3-6)×10-2為佳。N1-14′CCTCC M94013適宜的產(chǎn)孢溫度范圍為25-35℃，較好的產(chǎn)孢溫度范圍為28-32℃。
本發(fā)明采用的深層液體孢子生產(chǎn)步驟(步驟1.3)目的是進一步解決真菌發(fā)酵的孢子產(chǎn)量問題，可以使液體中孢子產(chǎn)量達到5.0×105個/毫升。適宜的種子培養(yǎng)及深層液體孢子生產(chǎn)步驟所用的培養(yǎng)基成份(按每升培養(yǎng)基所含克重g/L計算)為還原糖30-70，(NH4)2SO41.0-5.0，KH2PO40.1-1.0，MgSO4·7H2O 0.2-1.2，MnSO4·H2O 0.2-1.2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.3-1.5，CaCO320-60。自然pH，其中(NH4)SO4分開滅菌。
在步驟1.4中，適宜的發(fā)酵產(chǎn)酸的培養(yǎng)基成份(按每升培養(yǎng)基所含克重g/L計算)為還原糖115-135，(NH4)2SO41.0-5.0，KH2PO40.1-1.0，MgSO4·7H2O 0.2-1.2，MnSO4·H2O 0.2-1.2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.3-1.5，CaCO370-120。自然pH，其中(NH4)2SO4分開滅菌。
本發(fā)明用以澄清L-蘋果酸粗溶液的絮凝劑(步驟2.4)主要采用聚丙烯酰胺，其用量為1-30mg/L(L-蘋果酸粗溶液)，最佳用量為5-10mg/L(L-蘋果酸粗溶液)。
用以凈化L-蘋果酸溶液的陰離子交換樹脂(步驟2.4)可采用F-1檸檬酸陰離子交換樹脂，也可采用A561陰離子交換樹脂。陽離子交換脂可采用732陽離子交換樹脂或C26陽離子交換樹脂。
利用N1-14′CCTCC M94103直接發(fā)酵糖質(zhì)原料生產(chǎn)L-蘋果酸的具體工藝過程為
1、發(fā)酵工藝過程1.1、菌種制備將新配制的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)試管斜面接種后，置28-32℃下培養(yǎng)5-7天，待孢子成熟后，加入無菌水，把制得的孢子懸浮液接入三角瓶麩皮培養(yǎng)基內(nèi)，麩皮培養(yǎng)基內(nèi)加有產(chǎn)孢促進劑，置28-32℃下培養(yǎng)5-7天后，放在4-6℃冰箱內(nèi)，保存?zhèn)溆?
1.2、種子培養(yǎng)將成熟的麩曲接入種子罐中，保持溫度30-37℃，攪拌速度200-300r/m，通氣量0.4-0.7vvm，罐壓0.01-0.1MPa，培養(yǎng)20-30小時;
1.3、深層液體孢子生產(chǎn)將成熟的種子移入繁殖罐內(nèi)，保持溫度33-38℃，攪拌速度150-250r/m，通氣量0.3-0.6vvm，罐壓0.01-0.1MPa，培養(yǎng)18-23小時；1.4、發(fā)酵罐發(fā)酵把合適菌齡的種子及成熟的孢子移入發(fā)酵罐中對糖質(zhì)原料直接發(fā)酵，保持溫度32-37℃，攪拌速度50-150r/m，通氣量0.05-0.3vvm，罐壓0.01-0.1MPa，培養(yǎng)100-120小時，待殘?zhí)窍陆抵?g/L，停止發(fā)酵，獲得發(fā)酵醪。
2、L-蘋果酸提取工藝過程2.1、直接真空抽濾成熟的發(fā)酵醪，并用少量無鹽水將濾餅(含有菌體的L-蘋果酸鈣)中的殘?zhí)窍磧?
2.2、用1-3倍濾餅重量的稀酸水將濾餅調(diào)成漿狀，加入(20-60)×10-2的無砷硫酸，維持攪拌速度50-100r/m，溫度30-50℃的溫和條件，對L-蘋果酸鈣進行酸解，采用雙管法檢查酸解終點，并對酸解液進行除雜和脫色;
2.3、真空抽濾除去菌體和硫酸鈣，并用少量無鹽水將濾餅中的L-蘋果酸洗脫下來;
2.4、在L-蘋果酸粗溶液加入絮凝劑澄清后，進行精濾，然后將精濾液送至高位槽，先引入732陽離子交換樹脂柱或C26陽離子交換樹脂柱，然后引入F-1檸檬酸專用陰離子交換樹脂柱或A561陰離子交換樹脂柱，陽柱流出液主要檢查有無Fe2+和Ca2+的漏出，陰柱流出液主要檢查有無SO42-和Cl-的漏出。
2.5、把凈化后的L-蘋果酸溶液引入濃縮塔中，在50-70℃下濃縮至1000-1300g/L，再將濃縮液引入結(jié)晶罐中，冷卻至5-20℃，加入適量晶種，在1-10r/m緩慢攪拌下結(jié)晶，然后用離心機把晶體從母液中分離出來，并用少量無鹽水洗滌干凈，再將洗滌后的晶體置沸騰干燥床中，在進風(fēng)溫度30-80℃下干燥，最后將干燥后的L-蘋果酸包裝即完成全部工藝過程。
本發(fā)明利用優(yōu)良的L-蘋果酸高產(chǎn)突變株N1-14′CCTCC M94103，在20m3罐上發(fā)酵糖質(zhì)原料100-120小時，產(chǎn)酸75-85g/L，產(chǎn)酸速率0.65-0.71g/L.h，對糖轉(zhuǎn)化率65-68%，大大優(yōu)于國內(nèi)外現(xiàn)有的L-蘋果酸產(chǎn)生菌的產(chǎn)酸水平。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)L-蘋果酸的工藝技術(shù)，工藝過程簡化，L-蘋果酸回收率達50-60%，產(chǎn)品中L-蘋果酸的含量≥99×10-2，其突出的特點是富馬酸含量極低，小于0.2×10-2實施例一以蔗糖為原料直接發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸。
將4℃冰箱內(nèi)保存的N1-14′斜面菌種，轉(zhuǎn)接到新配制的馬鈴薯葡萄糖瓊脂試管斜面上，置28-32℃下培養(yǎng)6天后，獲得新鮮試管斜面菌種。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基成份(按每升培養(yǎng)基所含的量計算)20×10-2馬鈴薯汁800ml，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 2g，pH6.5，瓊脂18g。然后，將新鮮成熟的試管斜面菌種，加入無菌水，制得孢子懸浮液，接入三角瓶麩皮培養(yǎng)基內(nèi)。麩皮培養(yǎng)基的成份(按每公斤培養(yǎng)基所含克重g/kg計算)新鮮麩皮500，水500。所加入其中的產(chǎn)孢促進劑的成份為葡萄糖KH2PO4＝1∶0.01，其用量為麩皮培養(yǎng)基的3×10-2。接種后的培養(yǎng)基，置28-32℃下培養(yǎng)6天后，其孢子產(chǎn)量為4.5×108個/克培養(yǎng)基(干重)。
種子罐容積為600L，裝液450L，采用種子培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基的成份(按每升培養(yǎng)基所含克重g/L計算)蔗糖50，(NH4)2SO42.0，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.5，MnSO4·H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5，CaCO340;自然pH，其中(NH4)2SO4分開滅菌。種子培養(yǎng)基采用121℃滅菌25分鐘，冷卻后接入麩曲種，保持溫度33-35℃，攪拌速度230-240r/m，通氣量0.5vvm，罐壓0.03-0.05MPa，培養(yǎng)23小時，殘?zhí)?0g/L，移入繁殖罐中培養(yǎng)。
繁殖罐容積為3m3，裝液2.4m3，采用深層孢子生產(chǎn)培養(yǎng)基(成份與種子培養(yǎng)基相同)，121℃滅菌20分鐘，冷卻后移入成熟種子培養(yǎng)液，保持溫度35-36℃，攪拌速度200-220r/m，通氣量0.4vvm，罐壓0.03-0.05MPa，培養(yǎng)20小時，孢子產(chǎn)量為6.7×105個/毫升，殘?zhí)?g/L，移入發(fā)酵罐。
發(fā)酵罐容積為20m3，裝液16m3，采用發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基。發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基成份(按每升培養(yǎng)基所含克重g/L計算)蔗糖115，(NH4)2SO42.0，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.5，MnSO4·H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5，CaCO390;自然pH，其中(NH4)2SO4分開滅菌。發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基121℃滅菌10分鐘，冷卻后移入合適菌齡的種子及成熟的孢子培養(yǎng)液，保持溫度34-35℃，攪拌速度80-100r/m，通氣量0.1vvm，罐壓0.03-0.05MPa，培養(yǎng)107小時，產(chǎn)酸為76.1g/L，殘?zhí)菫?g/L，停止發(fā)酵，進行L-蘋果酸提取。
放罐后直接真空抽濾發(fā)酵醪，獲得含有菌體的L-蘋果酸鈣濾餅;將濾餅用稀酸水(無砷硫酸)調(diào)成漿狀后，在溫度40℃，攪拌速度70-80r/m的溫和條件下進行酸解、除雜和脫色;過濾除去石膏渣及菌體等后，加入聚丙烯酰胺絮凝劑進行澄清，絮凝劑的用量為10mg/L;L-蘋果酸粗溶液進行精濾和通過F-1檸檬酸陰離子交換樹脂柱及732陽離子交換樹脂柱后，在60℃下，采用兩級濃縮，濃縮至1200g/L時，引入結(jié)晶罐中，在5-6r/m攪拌下，冷卻至10℃，加入適量晶種進行結(jié)晶;結(jié)晶后，用離心機將晶體分離出來，母液和洗水進行再濃縮或凈化處理，晶體則在進風(fēng)溫度50-60℃下沸騰干燥后立即包裝。
實施例二以淀粉為原料直接發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸。
將4℃冰箱內(nèi)保存的N1-14′斜面菌種，轉(zhuǎn)接到新配制的馬鈴薯葡萄糖瓊脂試管斜面上，置25-27℃下培養(yǎng)7天，獲得新鮮試管斜面菌種。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基成份(按每升培養(yǎng)基所含的量計算)20×10-2馬鈴薯汁500ml，葡萄糖10g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 1g，pH5.0，瓊脂15g。然后，將新鮮成熟的試管斜面菌種，加入無菌水，制得孢子懸浮液，接入三角瓶麩皮培養(yǎng)基內(nèi)。麩皮培養(yǎng)基的成份(按每公斤培養(yǎng)基所含克重g/kg計算)新鮮麩皮600，水400。所加入其中的產(chǎn)孢促進劑的成份葡萄糖KH2PO4＝1∶0.005，其用量為麩皮培養(yǎng)基的5×10-2。接種后的培養(yǎng)基，置25-27℃下培養(yǎng)7天后，其孢子產(chǎn)量為4.3×103個/克培養(yǎng)基(干重)。
淀粉在直接使用前，要先調(diào)成300-350g/L濃度的淀粉漿，升溫至50-55℃時，加入5-10個單位/克淀粉的α-淀粉酶和1g/L的CaCl2，然后再升溫至85-90℃下進行液化處理。
種子罐容積為600L，裝液450L，采用種子培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基的成份(按每升培養(yǎng)基所含克重g/L計算)淀粉70，(NH4)2SO41.0，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.3，CaCO320;自然pH，其中(NH4)2SO4分開滅菌。種子培養(yǎng)基采用121℃滅菌25分鐘，冷卻后接入麩曲種，保持溫度30-32℃，攪拌速度200-220r/m，通氣量0.4vvm，罐壓0.08-0.1MPa，培養(yǎng)30小時，殘?zhí)?0g/L，移入繁殖罐中培養(yǎng)。
繁殖罐容積為3m3，裝液2.4m3，采用深層孢子生產(chǎn)培養(yǎng)基(成份與種子培養(yǎng)基相同)，121℃滅菌20分鐘，冷卻后移入成熟種子培養(yǎng)液，保持溫度33-34℃，攪拌速度150-180r/m，通氣量0.3vvm，罐壓0.08-0.1MPa，培養(yǎng)23小時，孢子產(chǎn)量為5.5×105個毫升，殘?zhí)?0g/L，移入發(fā)酵罐。
發(fā)酵罐容積為20m3，裝液16m3，采用發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基。發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基成份(按每升培養(yǎng)基所含克重g/L計算)淀粉135，(NH4)2SO41.0，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.3，CaCO370;自然pH，其中(NH4)2SO4分開滅菌。發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基121℃滅菌10分鐘，冷卻后移入合適菌齡的種子及成熟的孢子培養(yǎng)液，保持溫度32-34℃，攪拌速度50-70r/m，通氣量0.05vvm，罐壓0.08-0.1MPa，培養(yǎng)115小時，產(chǎn)酸75.0g/L，殘?zhí)?g/L，停止發(fā)酵，進行L-蘋果酸提取。
放罐后直接真空抽濾發(fā)酵醪，獲得含有菌體的L-蘋果酸鈣濾餅;將濾餅用稀酸水(無砷硫酸)調(diào)成漿狀后，在溫度30℃，攪拌速度50-60r/m的溫和條件下進行酸解、除雜和脫色;過濾除去石膏渣及菌體等后，加入聚丙烯酰胺絮凝劑進行澄清，絮凝劑的用量為30mg/L;L-蘋果酸粗溶液進行精濾和通過F-1檸檬酸陰離子交換樹脂柱及C26陽離子交換樹脂柱后，在50℃下，采用兩級濃縮，濃縮至1000g/L時，引入結(jié)晶罐中，在1-3r/m攪拌下，冷卻至5℃，加入適量晶種進行結(jié)晶;結(jié)晶后，用離心機將晶體分離出來，母液和洗水進行再濃縮或凈化處理，晶體則在進風(fēng)溫度30-50℃下沸騰干燥后立即包裝。
實施例三以葡萄糖為原料直接發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸。
將4℃冰箱內(nèi)保存的N1-14′斜面菌種，轉(zhuǎn)接到新配制的馬鈴薯葡萄糖瓊脂試管斜面上，置32-35℃下培養(yǎng)5天，獲得新鮮試管斜面菌種。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基成份(按每升培養(yǎng)基所含的量計算)20×10-2馬鈴薯汁1000ml，葡萄糖30g，KH2PO45g，MgSO4·7H2O 3g，pH7.5，瓊脂20g。然后，制得孢子懸浮液，接入三角瓶麩皮培養(yǎng)基內(nèi)。麩皮培養(yǎng)基的成份(按每公斤培養(yǎng)基所含克重g/L計算)新鮮麩皮400，水600。所加入其中的產(chǎn)孢促進劑的成份為葡萄糖KH2PO4＝1∶0.05，其用量為麩皮培養(yǎng)基的10×10-2。接種后的培養(yǎng)基，置32-35℃下培養(yǎng)5天后，其孢子產(chǎn)量為4.0×106個/克培養(yǎng)基(干重)。
種子罐容積為600L，裝液450L，采用種子培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基的成份(按每升培養(yǎng)基所含克重g/L計算)葡萄糖30，(NH4)2SO45.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 1.2，MnSO4·H2O 1.2，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.5，CaCO360;自然pH，其中(NH4)2SO4分開滅菌。種子培養(yǎng)基采用121℃滅菌25分鐘，冷卻后接入麩曲種，保持溫度35-37℃，攪拌速度280-300r/m，通氣量0.7vvm，罐壓0.01-0.02MPa，培養(yǎng)20小時，殘?zhí)?g/L，移入繁殖罐中培養(yǎng)。
繁殖罐容積為3m3，裝液2.4m3，采用深層孢子生產(chǎn)培養(yǎng)基(成份與種子培養(yǎng)基相同)，121℃滅菌20分鐘，冷卻后移入成熟種子培養(yǎng)液，保持溫度36-38℃，攪拌速度240-250r/m，通氣量0.6vvm，罐壓0.01-0.02MPa，培養(yǎng)18小時，孢子產(chǎn)量為5.0×105個/毫升，殘?zhí)?g/L，移入發(fā)酵罐。
發(fā)酵罐容積為20m3，裝液16m3，采用發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基。發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基成份(按每升培養(yǎng)基所含克重g/L計算)葡萄糖125，(NH4)2SO45.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 1.2，MnSO4·H21.2，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.5，CaCO3120;自然pH，其中(NH4)2SO4分開滅菌。發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基121℃滅菌10分鐘，冷卻后移入合適菌齡的種子及成熟的孢子培養(yǎng)液，保持溫度35-37℃，攪拌速度140-150r/m，通氣量0.3vvm，罐壓0.01-0.02MPa，培養(yǎng)120小時，產(chǎn)酸85.0g/L，殘?zhí)?g/L，停止發(fā)酵，進行L-蘋果酸提取。
放罐后直接真空抽濾發(fā)酵醪，獲得含有菌體的L-蘋果酸鈣濾餅;將濾餅用稀酸水(無砷硫酸)調(diào)成漿狀后，在溫度50℃，攪拌速度90-100r/m的溫和條件下進行酸解、除雜和脫色;過濾除去石膏渣及菌體等后，加入聚丙烯酰胺絮凝劑進行澄清，絮凝劑的用量為1mg/L；L-蘋果酸粗溶液進行精濾和通過A561陰離子交換樹脂柱及C26陽離子交換樹脂柱后，在70℃下，采用兩級濃縮，濃縮至1300g/L時，引入結(jié)晶罐中，在8-10r/m攪拌下，冷卻至20℃，加入適量晶種進行結(jié)晶;結(jié)晶后，用離心機將晶體分離出來，母液和洗水進行再次濃縮或凈化處理，晶體則在進風(fēng)溫度70-80℃下沸騰干燥后立即包裝。
權(quán)利要求
1.L-蘋果酸高產(chǎn)突變株曲霉(Aspergillus sp.N1-14′)，其特征在于該突變株是其樣品保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，編號為M94013這樣的微生物菌株。
2.一種生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于利用N1-14′CCTCC M94013直接發(fā)酵糖質(zhì)原料而生產(chǎn)L-蘋果酸。
3.按權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于所說的糖質(zhì)原料為葡萄糖、淀粉水解糖、蔗糖或淀粉。
4.按權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于生產(chǎn)的工藝過程包括4.1、發(fā)酵工藝過程4.1.1、在25-35℃溫度范圍并加入其主要成份為葡萄糖和KH2PO4的產(chǎn)孢促進劑的條件下，使N1-14′CCTCC M94013在三角瓶麩皮培養(yǎng)基內(nèi)大量產(chǎn)生孢子;4.1.2、將成熟的孢子接入種子罐中含有碳酸鈣的培養(yǎng)基進行種子培養(yǎng);4.1.3、將成熟的種子移入繁殖罐中含有碳酸鈣的培養(yǎng)基進行深層液體孢子生產(chǎn);4.1.4、將合適菌齡的種子及成熟的孢子移入發(fā)酵罐中含有碳酸鈣的培養(yǎng)基，對糖質(zhì)原料進行直接發(fā)酵得到含L-蘋果酸鈣的發(fā)酵醪;4.2、L-蘋果酸提取工藝過程4.2.1、直接真空抽濾發(fā)酵醪收得含有菌體的L-蘋果酸鈣;4.2.2、用無砷硫酸酸解含有菌體的L-蘋果酸鈣，并對酸解液進行除雜和脫色;4.2.3、對上述酸解液真空抽濾去除菌體和硫酸鈣，獲得L-蘋果酸粗溶液;4.2.4、在L-蘋果酸粗溶液中加入絮凝劑澄清后精濾，然后使精濾液通過陰陽離子交換樹脂進行凈化;4.2.5、將凈化后的L-蘋果酸溶液進行濃縮、結(jié)晶，最后將離心收得的濕晶體進行干燥。
5.按權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于步驟4.1.1的過程包括將新配制的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)試管斜面接種后，置28-32℃培養(yǎng)5-7天，待孢子成熟后，加入無菌水，把制得的孢子懸浮液接入三角瓶麩皮培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)基內(nèi)加有其主要成份為葡萄糖和KH2PO4的產(chǎn)孢促進劑，置28-32℃下培養(yǎng)5-7天。
6.按權(quán)利要求4或5所述的生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于所說的產(chǎn)孢促進劑成份比例為葡萄糖∶KH2PO4＝1∶0.005-0.05(重量份)。
7.按權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于步驟4.1.1中產(chǎn)孢促進劑的用量為麩皮培養(yǎng)基的(1～10)×10-1
8.按權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于步驟4.1.1中產(chǎn)孢促進劑的用量為麩皮培養(yǎng)基的(3～6)×10-1
9.按權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于步驟4.1.2和4.1.3中所說的含有碳酸鈣的培養(yǎng)基的成份(按每升培養(yǎng)基所含克重g/L計算)為還原糖30-70，(NH4)2SO41.0-5.0，KH2PO40.1-1.0，MgSO4·7H2O 0.2-1.2，MnSO4·H2O 0.2-1.2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.3-1.5，CaCO，20-60。
10.按權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于步驟4.1.4中所說的含有碳酸鈣的培養(yǎng)基的成份(按每升培養(yǎng)基所含克重g/L計算)為還原糖115-135，(NH4)2SO41.0-5.0，KH2PO40.1-1.0，MgSO4·7H2O 0.2-1.2，MnSO4·H2O 0.2-1.2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.3-1.5，CaCO，70-120。
11.按權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于步驟4.1.2中種子培養(yǎng)是在溫度為30-37℃，攪拌速度為200-300r/m，通氣量為0.4-0.7vvm，罐壓為0.01-0.1MPa的條件下培養(yǎng)20-30小時。
12.按權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于步驟4.1.3中深層液體孢子生產(chǎn)是在溫度為33-38℃，攪拌速度為150-250r/m，通氣量為0.3-0.6vvm，罐壓為0.01-0.1MPa的條件下培養(yǎng)18-23小時。
13.按權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于步驟4.1.4中是在溫度為32-37℃，攪拌速度為50-150r/m，通氣量為0.05-0.3vvm，罐壓為0.01-0.1MPa的條件下對糖質(zhì)原料進行發(fā)酵。
14.按權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于步驟2.2中是加入(20-60)×10-2的無砷硫酸，并于溫度為30-50℃，攪拌速度為50-100r/m的條件下酸解含有菌體的L-蘋果酸鈣。
15.按權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于步驟4.2.4中所使用的絮凝劑主要為聚丙烯酰胺，其用量為1-30mg/L。
16.按權(quán)利要求14所述的生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于聚丙烯酰胺的用量為5～10mg/L。
17.按權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于步驟4.2.4中所使用的陰離子交換樹脂為F-1檸檬酸陰離子交換樹脂或A561陰離子交換樹脂。
18.按權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于步驟4.2.4中所使用的陽離子交換樹脂為732陽離子交換樹脂或C26陽離子交換樹脂。
全文摘要
L-蘋果酸高產(chǎn)突變株曲霉(Aspergillus sp.)N1-14′及利用該菌株生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，本發(fā)明涉及工業(yè)微生物及其利用。本發(fā)明提供的曲霉N1-14′CCTCCM94103能夠直接發(fā)酵糖質(zhì)原料產(chǎn)生L-蘋果酸，該產(chǎn)酸菌株在20m
文檔編號C12N1/14GK1112160SQ9410563
公開日1995年11月22日 申請日期1994年5月20日 優(yōu)先權(quán)日1994年5月20日
發(fā)明者吳清平, 周小燕, 陳素云, 鐘瑜 申請人:廣東省微生物研究所