專利名稱：促進豬成年前生長和提高豬飼料轉(zhuǎn)化效率的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在原核生物里表達異源DNA 順序(例如真核生物基因)的方法。在其中一個重要的實施例中，本發(fā)明指向在原核生物里生產(chǎn)具有一個N端為丙氨酸的多肽以及用該方法能夠生產(chǎn)各種N端為丙氯酰的多肽。
由真核生物和原核生物表達基因，雖然在基因轉(zhuǎn)錄至信使RNA(mRNA)以及隨之又把這種mRNA轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)中都具有相同的基本步驟，但是要應用細胞內(nèi)的不同組合以控制這些步驟。
此外，在真核生物里，許多成熟的蛋白質(zhì)首先被轉(zhuǎn)譯成為前一蛋白質(zhì)；即含有與引導順序或信號順序融合的成熟蛋白質(zhì)順序的多肽。真核生物的信使RNA(mRNA)編碼整套前一蛋白質(zhì)，它們在轉(zhuǎn)譯后被加工除去引導順序以后才成為這種成熟蛋白質(zhì)的。真核生物細胞裝備有把這種前一蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓鞍踪|(zhì)的特異加工機制，原核生物的細胞一般不能識別存在于真核生物的蛋白質(zhì)里的這種加工處理信號。因此，如果真核生物信使RNA(mRNA)的完整互補DNA(cDNA)轉(zhuǎn)錄物被用作DNA 順序在原核生物里來表達，那就只能發(fā)現(xiàn)前一蛋白質(zhì)而無成熟蛋白質(zhì)。前一蛋白質(zhì)在體外轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓鞍踪|(zhì)是有可能的，但不能沒有重要的代價。
在編碼成熟蛋白質(zhì)的DNA順序在原核生物里用作成熟蛋白質(zhì)表達的過程中，這一順序?qū)⑹菦]有真核的轉(zhuǎn)譯作用和通常包含在作引導順序DNA里的轉(zhuǎn)譯后加工信號。因此，基于效能以及由于原核生物的宿主細胞也許不能識別真核生物的信號，現(xiàn)已證實，要在原核生物系統(tǒng)里表達所克隆的真核基因或其它異源DNA順序。最理想的是應用原核生物控制訊號。
“異源DNA”一詞在此定義為核DNA至少其有一部分序列不是正常地包含在宿主細胞的染色體組內(nèi)。異源DNA的實例包括，病毒及真核基因，基因此段，等位基因以及合成的DNA順序但不局限這些?！爱愒吹鞍踪|(zhì)”或“異源多肽”一詞在此定義為一種蛋白質(zhì)或多肽，其中至少有一部分氨基酸順序不是正常地將其密碼編在宿主細胞的染色體組里。
原核生物的控制訊號包括一啟動子，它引發(fā)轉(zhuǎn)錄啟始和轉(zhuǎn)譯控制訊號包括核糖體結(jié)合位點，轉(zhuǎn)譯啟動以及轉(zhuǎn)譯停止。除了轉(zhuǎn)譯停止信號外，所有這些訊號都必須位于真核基因或其它待表達DNA的前面。
技術(shù)界已采用一些方法在原核生物里去表達異源DNA(即真核基因)。其中一個方法是，把編碼終產(chǎn)物蛋白的DNA片段與受細菌啟動子操縱編碼細菌的全部或一部分蛋白的DNA相連接。這種內(nèi)生的原核DNA也需要有核糖體結(jié)合位點及轉(zhuǎn)譯啟動訊號。這樣連接的DNA的表達結(jié)果產(chǎn)生一種所謂融合蛋白，它由真核多肽與整個細菌蛋白組成，這種真核生物的蛋白質(zhì)的分離就可以用位點特異酶的或化學的方法在內(nèi)源的——真核生物的蛋白質(zhì)融合點上裂解而完成，或用原核生物對多肽順序的選擇降解而實現(xiàn)。
在細菌中，與生產(chǎn)真核生物蛋白融合的蛋白質(zhì)，有關(guān)的出版物包括全歐專利申請47，600(1982，3，17出版)它涉及融合蛋白與非融合蛋白包括，牛前——生長激素或牛生長激素，在其羧基端(C-)上帶有或在氨基端(-N)沒有。原核生物蛋白質(zhì)部分的。英聯(lián)邦專利申請GB2，073，245A(1981，10，14出版)論及bGH與大腸桿菌E，coliβ-乳酰胺酶(β-Lactamase)的融合蛋白質(zhì)；E.Keshet等人，核酸研究，(Nucleic Acid Research)919-30(1981)論及牛生長激素(bGH)與大腸桿菌β-乳酰胺酶的融合蛋白質(zhì)；全歐專利申請95，361(1983，11，30出版)論及融合蛋白質(zhì)包括依次為，在N基端的內(nèi)源蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)譯起動信號氨基酸，腸激酶切割優(yōu)點以及羧基端(C-)上的外源蛋白質(zhì)(即生長激素)。然而，這些融合蛋白質(zhì)的方法都是繁瑣的，其間在純化之后還需要進行體外加工處理，而且達到商品化所需酶的成本過高。
不過，由于融合的產(chǎn)物似乎能保護終產(chǎn)物異源蛋白質(zhì)免受細胞內(nèi)的降解，因此已成為在原核生物細胞中表達某些真核基因或其它異源DNA的一種有吸引力的系統(tǒng)。細菌細胞似乎能識別出在其處產(chǎn)生的某些真核蛋白質(zhì)是外來的，因而，在這些蛋白質(zhì)合成時或剛合成后就盡快地使之降解。為保護目的而設(shè)計的融合蛋白質(zhì)應用內(nèi)源多肽順序放在異源蛋白質(zhì)的氨基端或羧基端。后者方法的例子見于歐州專利申請111，814(1984，6，27出版)其中論及融合蛋白質(zhì)、包括一種具有一合成的前一端(氨基端)以及在羧基端(C-)上有一大腸桿菌(E，coli)β-半乳糖苷酶(β-galactosida-se)形式的牛生長激素bHG。它的優(yōu)越性仍然由于象前面討論過那樣需要最后從內(nèi)生多肽切割異源蛋白而受貶。
在另一方法里，轉(zhuǎn)譯啟動訊號，ATG，受細菌啟動子操縱之下，被直接連于編碼異源蛋白質(zhì)(即真核的蛋白質(zhì))的DNA順序之前，該所產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)在其氨基端(N-)及羧基端(C-)都沒有內(nèi)源蛋白質(zhì)。雖然由這樣構(gòu)建的基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)不需要最后切割來產(chǎn)生期望獲得的蛋白質(zhì)，它們典型的在N端上總會有蛋氨酸(某些情況下是甲酰蛋氨酸)，因為ATG啟動訊號本身也是蛋氨酸密碼子。因此，除非所期望的成熟蛋白質(zhì)以一蛋氨酸開始否則這種蛋白質(zhì)將一在氨基端(N-)被包含有蛋氨酸殘基在內(nèi)的基團取代。
這樣基團結(jié)構(gòu)的例子包括Guarente等人，細胞(Cell)(1980)20∶543-553其中具有N基端為纈氨酸的家兔β-球蛋白基因(β-globin gene)是應用剛敘述的基因結(jié)構(gòu)在大腸桿菌(E.coli)里表達的。研究者發(fā)現(xiàn)，有鑒于“在家兔β-球蛋白里沒有氨基端的蛋氨酸，且發(fā)現(xiàn)亮氨酸位于3，14，28，31，32……位上。而在標記的蛋白質(zhì)里則發(fā)現(xiàn)亮氨酸在4，15，29，32和33位上，還發(fā)現(xiàn)有一蛋氨酸在1位上。這一結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)是家兔β-球蛋白加上一個在大腸桿菌上未除去的氨基端的蛋氨酸。同上文獻的546-547。
另一例子是與應用上述基因結(jié)構(gòu)在細菌里生產(chǎn)生長激素有關(guān)。Schoner等人Proc.Natl Acad,Scie U.S.A(1984)81∶5403-5407敘述了在細菌里生產(chǎn)牛生長激素(bGH)一種高水平的表達系統(tǒng)。它導至產(chǎn)生出一種N-甲硫氨酰bGH；它是一種氨基酸順序與天然存在的牛生長激素品種相似。在其N端加有蛋氨酸的化合物在細菌里生產(chǎn)在N端加蛋氨酸到各種生長激素品種里去又被再一次在全歐專利申請103，395(1984，3，21出版)里討論，而全歐專利申請75，444(1983，3，30出版)論述了bGH和Seeburg etal，在DNA(1983)237-45論述了bGH及豬的生長激素(“PGH”)。
把一個N端蛋氨酸加到天然蛋白的N端去由于多種原因也許是不太理想的。首先，在一種有機體里，它的內(nèi)源蛋白質(zhì)沒有為N-端蛋氨酸的，這種蛋氨酸就有可能會趨向于造成該蛋白質(zhì)呈抗原。其次，把蛋氨酸加到蛋白質(zhì)的N端部分對它的生物活性及它的物理學特性會有非所期望的影響。其三，蛋白質(zhì)的這種改變形式會阻礙在測定天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能相互關(guān)系上的科學嘗試。再者，一種生物合成的蛋白質(zhì)，使其結(jié)構(gòu)盡可能地與天然的接近這對在請求政府批準醫(yī)藥的或獸醫(yī)的申請時也許是有利的。
象細菌一樣的原核生物，無論蛋白質(zhì)正在產(chǎn)生或產(chǎn)生之后，從蛋白質(zhì)上除去N端蛋氨酸的能力，一直是相當有趣的課題。例如，Waller，J,Mol.Biol.(1963)7∶483-496考查了“可除的“N-端氨基酸成分，以及從無細胞的大腸桿菌E.coli抽提液得到的核糖體蛋白，以及全歐專利申請103，395(1984，3，21出版)公開了從大腸桿菌E，coli產(chǎn)生的真核蛋白質(zhì)去除N端蛋氨酸。特別的是，蛋氨酸從二個在細菌上生產(chǎn)的牛生長激素的一個上除去，該二個牛生長激素都會有絲氨酸殘基緊接的是原先就存在的N端蛋氨酸。然而在這些研究里應用的基因結(jié)構(gòu)包含有合成的編碼5′-蛋氨酸-絲氨酸-亮氨酸-3′的啟動順序，它直接地插至緊接在牛生長激素編碼順序的5′端，在這bGH編碼順序里編碼前面4個或9個天然存在的氨基酸的堿基已被刪去。因此，在大腸桿菌里產(chǎn)生的終產(chǎn)物蛋白質(zhì)是一種非天然存在的蛋白質(zhì)。英聯(lián)邦專利申請2，073，245A(1981，10，4出版)公開在成熟的bGH蛋白質(zhì)里的丙氨酸被蛋氨酸、脯氨酸取代時，“蛋氨酸就能被細菌加工而成為用脯氨酸(Pro)，苯丙氨酸(Phe)，丙氨酸(Ala)脯氨酸(Pro)為一氨基酸順序開始的修飾過的牛生長激素(bGH)。
因此，需要發(fā)展一種既經(jīng)濟而有預見性的在諸為細菌樣的微生物里生產(chǎn)不帶N基端蛋氨酸的異源(即真核生物的)蛋白質(zhì)的方法。明確的說，人們特別希望發(fā)展一種方法，依靠它可以在細菌里生產(chǎn)這類蛋白質(zhì)而不需要在體外進行發(fā)酵后加工處理，而且它不含有外加的非天然存在的N-端蛋氨酸。
生長激素(又稱somatotropins)是由垂體細胞產(chǎn)生或分泌的多肽，大多數(shù)具有專一的活性。它的作用除了促進骨骼生長外，還可對包括激發(fā)泌乳增加從胰腺釋放胰島素和增加糖源分泌等代謝過程的變異型發(fā)生影響，而且它們還起脂類調(diào)動的作用。例如，給牛施用外源生長激素(bGH)證明可增加產(chǎn)奶量，飼養(yǎng)率和/或生長率，可降低肥育時間和增加瘦肉比率。然而，還沒有完全弄清這種激素是怎樣起到這么多效應的。
涉及人類生長激素(hGH)的工作已開始。例如人類垂體腺所分泌激素不是一個單一分子的實體而是多肽的混合物。不同類型的人類生長激素hGH的分級分離導至制成某些既不致糖尿病也不起脂解作用的人類生長激素(hGH)片斷。
同樣地，牛生長激素bGH是有多種類型在牛中產(chǎn)生的。明確地說，產(chǎn)生了四種類型的bGH，它們的差異是在蛋白質(zhì)的兩個位點上。由于在訊號肽(引導)順序的除去上可能出現(xiàn)錯誤，所以N端氨基酸就會不同，因此成熟蛋白質(zhì)就會用NH2-phe-pro開頭，或者用NH2-ala-phe-pro開頭。此外，在氨基酸126位處有一變異性或是亮氨酸或是纈氨酸，這是顯然由于存在于牛種群里的一個等位基因的變異而引起的。Wallis(1969)FEBS Latters 3∶118-120;Fellows和Rogol(1969)J.Biol.Chem.244∶1567-1575；Fernandez等人(1971)FEBS Letters 18∶53-54,Fellows(1973)在Recent Progress in Hormone Research 29∶404的個人評述；Santome(1973) Eur.J.Biochem.37∶164-170；Grat和Li(1974)Biochem.Biophyc.Res.Comm.56∶168-176.垂體bGH的4種分子型式(種)命名并縮寫如下Abbr.縮寫 結(jié)構(gòu)bGH(L) NH2-phe(1)-pro(2)…Leu(126)…COOHbGH(A,L) NH2-ala(-1)-phe(1)-pro(2)…Leu(126)…COOHbGH(V) NH2-phe(1)-pro(2)…Val(126)…COOHbGH(A,V) NH2-ala(-1)-phe(1)-pro(2)…Val(126)…COOHbGH(A,V)和bGH(V)品種這里有時合稱“纈氨酸等位的bGH品種”或“纈氨酸品種”。同樣，bGH(A，L)和bGH(L)品種這里有時合稱“亮氨酸等位bGH品種”或“亮氨酸bGH品種”。在bGH蛋白中縮寫如上的氨基酸旁邊的號碼，只是為了鑒定和參照的目的。
全部DNA編碼順序以及與bGH(L)及pGH(p)的對應氨基酸順序已由See bvrg等人在DNA(1983)2∶37-45上發(fā)表。在此它被編入?yún)⒖嘉墨I。
已發(fā)現(xiàn)單個牛的垂體細胞通常都至少含有bGH(A.L)和bGH(L)的混合物或bGH(A.V)和bGH(V)的混合物。
在培養(yǎng)的腦垂體細胞中所產(chǎn)生bGH蛋白的N端分析說明近50∶50分子混合物中含有N-端苯丙氨酸(Phe)或N-端丙氨酸(ala)從許多牛的垂體制成的在商業(yè)上有用的制劑通常包含有全部4種分子型的垂體牛生長激素。bGH而且，已有報告從腺體中收集得到的bGH制品中大約30%在126位氨基酸的亮氨酸已由纈氨酸代替(Ferandez等)(1971)FEBS Letters 18∶53-54用來分離已知4種bGH型的標準生化方法不容許按商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)當中的每一品種或任一種類型。這些牛生長激素bGH的4種類型的不同生物活性將會被充分研究并用基本上沒有其它三種型中一種或多種以及/或其他牛源蛋白方法制成這類型中一種有商業(yè)效益的類型在這里應用“基本上純的”術(shù)語是指基本上沒有在自然環(huán)境中或來源中與其結(jié)合的蛋白或其他物質(zhì)。為了那些及其它目的，本發(fā)明的目標包括發(fā)明一種方法，借助它至少能夠方便地生產(chǎn)那些牛生長激素單一型中的一些型。
據(jù)此，本發(fā)明的一個目的是在原核生物里生產(chǎn)真核的或其它異源的不具N端蛋氨酸殘基的多肽。
本發(fā)明的另一目的是在原核生物里生產(chǎn)真核的或其它異源的多肽，它是不需要在體外進行加工來除去其N端的蛋氨酸。
本發(fā)明還有另一目的是提供一種方法以便在原核生物里生產(chǎn)真核的或其它異源的多肽它不需在體外進行加工就具有一N端丙氨酸。
本發(fā)明的一目的是在原核生物里生產(chǎn)真核的或其它異源的多肽，它具有的氨基酸順序基本上與沒有N端蛋氨酸的天然存在的蛋白質(zhì)相同。
本發(fā)明更深遠的目的是提供一種在原核生物里生產(chǎn)多肽的方法，該多肽具有在成熟真核多肽里例如在bGH(A.L)bGH(A.V)及pGH(A)中發(fā)現(xiàn)的氨基酸順序。
本發(fā)明還有另外一個更深遠的目的是提供實際上各自地不含牛或豬來的蛋白質(zhì)的bGH(A、L)bGH(A.V)或PGH(A)，本發(fā)明的這些或其它的目的將會從本發(fā)明隨后的一般的和詳細的說明而更加明白。
在一個實施方案中，本發(fā)明的目的是通過用細菌生產(chǎn)一種具有N端為丙氨酸能在所選擇的細菌里促使染色體組DNA表達的異源多肽的方法而達到的。所說的DNA含有鄰接蛋氨酸的一個約到三個密碼子包括轉(zhuǎn)譯啟動訊號，緊接的是所說多肽的密碼子，后面接著的是轉(zhuǎn)譯停止信號密碼子，而且還回收在上述細菌內(nèi)產(chǎn)生具有N端丙氨酸的終產(chǎn)物的異源多肽。
在另一實施例中，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)具有包含在所選擇過的細菌里促使染色體組DNA表達的N端丙氨酸的異源多肽的方法，所說的DNA包含有轉(zhuǎn)譯啟始訊號/蛋氨酸密碼子，其后接有所說的多肽密碼子，接著為轉(zhuǎn)譯停止信號密碼子，而且回收在所說細菌內(nèi)所產(chǎn)生的具有N端丙氨酸的終產(chǎn)物一異源多肽。
仍是在另一實施例中，本發(fā)明提供出一種在細菌里制備氨基酸順序基本上與天然存在的真核多肽相同的異源多肽的方法。
在另一實施例中，本發(fā)明可提供包括象bGH(A.L)，bGH(A.V),PGH(A)這樣的生長激素以及bGH(A、L、)和bGH(A.V)的混合物中各種組分，它們實際上各自沒有牛源或豬源的或其它生長激素品種的多肽。
其它的實施例包括各種基因，DNA運載體和在前述方法上有用的轉(zhuǎn)化過的細菌，以及利用前述的組分以增加牛以及/或豬泌乳，成年前生長，以及/或飼養(yǎng)轉(zhuǎn)化率的某些方法。
在下列圖示里，鑲線框代表細菌啟動子的編碼順序，黑框表示異源DNA編碼順序，線條表示附加的如所標明的DNA編碼順序，而定向箭頭表示從5′到3′的DNA編碼順序方位。有關(guān)的限制性核酸酶內(nèi)切位點亦表示出。這樣標出的DNA區(qū)段只為圖解示意的目的而不是按比例尺繪制的。


圖1.M13mp8/xba I的構(gòu)建圖包含在SmaI切點上插入一個xbaI酶切片段的M13mp8運載體。
圖2.M13mp8/BGH ex-1的構(gòu)建圖包括帶有bGH(L)DNA編碼順序的M13mp8/xba T圖3.以寡聚核苷酸導致一特異位點一誘發(fā)生成的bGH(A.L)DNA編碼順序的創(chuàng)造。
圖4.以寡聚核苷酸導致特異位點誘發(fā)的bGH(A.V)DNA編碼順序的創(chuàng)造。
圖5.PMON3209表達運載體的構(gòu)建。其上在bGH(L)DNA編碼順序中帶有bGH(A.L)DNA編碼順序的PBGHex-1。
圖6.PMON3215表達運載體的構(gòu)建，其上在bGH(L)DNA編碼順序中帶有bGH(A.V)DNA編碼順序的PBGHex-1圖7.M13mp9/PGHex-1的構(gòu)建，其上帶有-PGH(P)DNA編碼順序的M13mP9。
圖8.由寡聚核苷酸導致特異位點一誘發(fā)的-PGH(A)DNA編碼順序的創(chuàng)造。
圖9.含有PBGHex-1的PBGHex-1*的構(gòu)建圖其中位于Ptrp DNA編碼順序5′端上游的ECORI限制性內(nèi)切介位點已被除去。
圖10.PMON3213表達運載體的構(gòu)建圖，它含有用PPGH(A)DNA編碼順序代替bGH(L)DNA順序的PBGHeX-1*本發(fā)明提供一種在原核生物里生產(chǎn)象真核生物(即哺乳動物或鳥類)蛋白質(zhì)那樣的具有N端丙氨酸的異源多肽的方法。因此產(chǎn)生的多肽N端不具蛋氨酸，因而可省去在生產(chǎn)該種N端具蛋氨酸的多肽時所需的體外加工。持續(xù)生產(chǎn)這樣一種在基因編碼順序中缺N端蛋氨酸的多肽是一項嶄新的以及完全設(shè)想到的成果。
本發(fā)明提供一種有價值的方法以生產(chǎn)基本上純的具有N端丙氨酸的蛋白質(zhì)。這樣的蛋白質(zhì)范圍較廣，包括特定牛生長激素品種和豬生長激素品種及其變異型，植物蛋白核酮糖-1，5-磷酸二氫羧化酶小亞基，谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶，熱體克蛋白70，本發(fā)明對期望生產(chǎn)具有N末端丙氨酸而不是蛋氨酸其他多肽的生產(chǎn)亦是有用的。使N端丙氨酸比N端蛋氨酸更能合乎需要的是因為在多肽中，N-丙酰氨型的多肽也許致免疫性較少，或者可能有不同的物理性和修飾了的生物活性。
在本發(fā)明的例子里，其中基本上純的bGH成PGH品種是由細菌細胞生產(chǎn)的除去N末端蛋氨酸的證據(jù)和技術(shù)，顯然還缺乏。事實上，由細菌細胞表達bGH的所有報導其中有關(guān)N端的包括與天然存在的bGHN端氨基酸順序相同的都報告N端蛋氨酸的存在。在See-burg等人，DNA(1983)2∶37-45中44頁里報導bGH即bGH(L)的N端苯丙氨酸品種的基因順序是審慎地被選擇在大腸桿菌表達，部分原因是想避免予想中的第二個疏水氨基酸(蛋氨酸)加到其它bGH品種即bGH(AL)的疏水的N端丙氨酸上去。因此有用的研究至今教導在細菌上生產(chǎn)bGH品種要保留這種N端蛋氨酸。不管這些報導如何，我根據(jù)上面討論的理由認定，有必要生產(chǎn)兩種bGH品種bGH(A、L)和bGH(A、V)中任一種以及PGH的bGH(A)品種。然而，企圖在細菌里生產(chǎn)這些生長激素品種是帶著產(chǎn)生的多肽將含有N端蛋氨酸的希望進行的。
正如在本發(fā)明例子里詳細說明一樣，我把在細菌里生產(chǎn)bGH(A、L)，bGH(A、V)及PGH(A)的方法簡述如下前面所說蛋白質(zhì)的DNA編碼順序，圖3，4及8所示它是由含N端苯丙氨酸的牛和豬生長激素品種編碼順序的DNA往用寡聚核苷酸--導致位點一特導誘發(fā)而構(gòu)建的。此后，這種bGH(A、L)，bGH(A、V)及PGH(A)的編碼順序插入到表達運載體，這樣所包含最后的基因順序依次為啟動子，核糖體結(jié)合位點，1ATG啟動/蛋氨酸密碼子它緊接在bGH(A、L)，bGH(A、V)或PGH(A)的任一種密碼順序DNA上以及一個轉(zhuǎn)譯停止密碼子。大腸桿菌隨后被帶有我們所期望得到的基因順序的特定表達運載體感染，而且使它在可讓這種所期望的異源DNA表達并能生產(chǎn)這種期望的蛋白質(zhì)的條件下進行培養(yǎng)。這樣生產(chǎn)的蛋白質(zhì)隨后進行順序分析及檢定它們適當?shù)纳锘钚浴?br> 因此，人們在此發(fā)現(xiàn)當異源多肽含有的N-丙酰氨密碼子緊跟啟始訊號/蛋氨酸密碼子的DNA順序表達時，從原核生物有機體回收的蛋白質(zhì)，在其N端上實際上是丙氨酸而不是蛋氨酸。人們相信，當丙氨酸密碼子被直接前移到約三個鄰接蛋氨酸的密碼子，其中包含編碼所期望得到多肽產(chǎn)物的信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)譯的啟動信號時就獲得相似的結(jié)果。例如用含有那種轉(zhuǎn)譯啟動信號和期望得到多肽產(chǎn)物的密碼子的DNA就能夠包含任何合適地為蛋氨酸丙氨酸(met ala),蛋氨酸蛋氨酸丙氨酸(met met ala)，蛋氨酸蛋氨酸蛋氨酸丙氨酸(met met met ala)成其它任何動能相等物編碼的順序。
在這里把N丙氨酸多肽定義為其氨基端有-丙氨酸的一種多肽。然而申請人不希望受以下的機制原理所約束，人們相信轉(zhuǎn)譯之后，如果下一個氨基酸是丙氨酸或其它具有能使容易地除去N-蛋氨酸的，相似特性的氨基酸(即極性或疏水性)多肽上N-端的蛋氨酸就可被原核生物用酶除去。人們進一步相信，當上述N-端的蛋氨酸是直接地連有-丙氨酸，則許多原核生物是能從異源的以及/或內(nèi)生的多肽上除去N-端的蛋氨酸。
這些原核生物(即熟知的以及通過公認的象ATCC或其它類似微生物保存機關(guān)獲得對公眾有益的各種細菌)包括大腸桿菌，但相信不限于大腸桿菌E.coli及其不同的品系。事實上期望的是對能產(chǎn)生具有N-端丙氨酸，DNA編碼順序開始約為1個到3個蛋氨酸密碼子，緊接的是丙氨酸密碼子之多肽的任何原核生物，這里公開發(fā)明的實際可能是有用的。在商業(yè)上或其它方面有用的原核生物可以用插入一個基因到所說有機體的基因組中，而根據(jù)他們生產(chǎn)這樣的N-丙氨酸多肽的能力而被篩選到，插入的基因有序地包括一個在上述有機體起作用的啟動子，編碼核糖體結(jié)合位點的DNA，從約1個到3個鄰接的蛋氨酸密碼子其中包括一個轉(zhuǎn)譯啟始信號緊接其后有異源的N-丙氨酸多肽密碼子及一轉(zhuǎn)譯停止訊號，此后，促使所說基因的表達并從而測定所產(chǎn)生的異源多肽的N-端的氨基酸的順序。在體內(nèi)能產(chǎn)生這類異源N丙氨酰多肽的原核生物被發(fā)現(xiàn)時，按這里專利公開和權(quán)利要求的目的看，則此原核生物可被列入“選中”。
在本發(fā)明較佳的實施例中，大腸桿菌K12株的三種不同分離株，全都存放在美國馬里蘭州(Maryland)洛克維蘭(Roc kville)標準菌種保存庫并已標有ATcc 39936,53010,及53009的登記號。并注明上述N端的蛋氨酸后緊接丙氨酸時有除去N端蛋氨酸的能力。
本發(fā)明由于它提供在原核生物里生產(chǎn)具有N端丙氨酸的異源多肽的方法而有價值。
在其中一個較佳的具體實施例中，本發(fā)明的方法是用來生產(chǎn)兩種bGH品種，bGH(A、L)及bGH(A、V)以及一種pGH品種pGH(A)它們分別不帶有牛的或豬的蛋白質(zhì)以及/或其他bGH或pGH品種。準確的說，本方法可為生產(chǎn)bGH(A、L)，bGH(A、V)或pGH(A)，作單一產(chǎn)種作準備。生產(chǎn)單一而氨基酸順序與天然存在的生長激素相同的bGH品種或pGH品種的能力對測定每個bGH和PGH的已知品種的精確生物反應性是相當重要，bGH和pGH的很多潛在作用，大體上如前所引。
在其廣泛實施例中的一個實施例中，本發(fā)明細致地應用DNA重組體技術(shù)直接在原核生物里生產(chǎn)異源多肽。因此，發(fā)明的敘述是以所應用的重組DNA工藝學的技術(shù)基礎(chǔ)知識為先需條件，它包括編碼多肽的DNA順序的分離與克隆DNA順序的重排與交換，克隆了的或經(jīng)修飾過的DNA順序在轉(zhuǎn)化過微生物中的表達。這樣的技術(shù)已處于工藝技術(shù)范疇之內(nèi)。(見，例如，分子克隆化實驗手冊MolecularCloning:Alaboratory Manual;Maniatis,Fritsch & Sam brook eds.1982)異源DNA的分離以及/或構(gòu)建在本發(fā)明的一個實施例里，已被選得或分離到為在原核生物里待生產(chǎn)想要得到的編碼異源多肽的DNA順序，或是說，編碼它的DNA順序已構(gòu)建或已被化學合成。在許多重要的實施例中，這種多肽是一種真核生物蛋白質(zhì)。如果這種多肽不大而且已知它的完整氨基酸順序，一個合成的DNA分子或編碼多肽的順序就能夠被構(gòu)建。如果這種多肽的氨基酸順序不知道，或是它或過大而實際上不能合成相應的DNA順序，則可從表達這種多肽組織或細胞里獲得的相應信使RNA，用它的逆轉(zhuǎn)錄能制備一個互補DNA(cDNA)順序。例如，在本發(fā)明的一個實施里，bGH的順序能夠用Goodman等人，在酶學方法(Methods in Enz ymology 68∶75-90(1979)所述的目前常用的步驟從牛的重體獲得。另一方面，一個互補的DNA(cDNA)順序能夠用以一適當?shù)奶结槒纳a(chǎn)GH動物基因庫中分離得到的染色體組DNA亦可在不同的運載體系統(tǒng)進行修飾，使能在原核生物里表達。這些技術(shù)皆屬工藝技術(shù)范疇。
一旦獲得想要的多肽密碼子的異源DNA順序、有可能在該分子的核酸順序上作一那修飾。例如，如果這一分子已從mRNA模板逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，它往往含有至少一部分是編碼前——蛋白質(zhì)的引導順序的DNA。因此，必須除去想得到的蛋白質(zhì)第一個密碼子前面的所有帶引導順序的DNA。在某些情況下，如果這一順序還未具有-N-端的丙氨酸密碼子就有必要在編碼想要得的蛋白質(zhì)順序引起點加進或替代一個丙氨酸密碼子。隨后在上游引入一轉(zhuǎn)譯起動信號(它亦是一蛋氨酸密碼子)而且直接緊靠著丙氨酸密碼子。雖然這個啟始信號/蛋氨酸密碼子通常會(而且較常地)是核苷酸順序ATG，但GTG順序偶然也能用作啟動信號/蛋氨酸密碼子。此外在本發(fā)明的方法內(nèi)，把出現(xiàn)多于一個蛋氨酸密碼子，即2，3或可能更多的鄰接蛋氨酸密碼子都理解為組建功能等值。
如果還未出現(xiàn)，也至少有一轉(zhuǎn)譯停止信號必須引到為羧基端氨基酸而編的密碼子之后。轉(zhuǎn)譯停止信號的例子包括脫氧核苷酸三聯(lián)體TAA，TGA，及TAG。因此，從本質(zhì)上看，重組體DNA技術(shù)是用來組建重組體DNA順序的，這些順序按序地包括一個轉(zhuǎn)譯啟動信號/蛋氨酸密碼子，具有緊靠啟始信號N-端丙氨酸密碼子期望得到的多肽的密碼子以及至少一個靠著為C-端氨基酸密碼子的轉(zhuǎn)譯停止信號。
已發(fā)現(xiàn)在mRNA內(nèi)由氫鍵結(jié)合將兩個互補的核苷酸系列形成二級結(jié)構(gòu)能夠阻礙信使RNA的有效表達。消除這些互補的順序，特別是編碼N-端的分子的那段順序，有利于將核糖體結(jié)合到mRNA上，從而增加表達級別。因此，有可能用氨基酸相同的密碼子但包含不同的核苷酸三聯(lián)體去取代那些參與形成二級結(jié)構(gòu)的密碼子。參閱全歐專利75，444(1983，3，30出版)；Seeburg等人，(1983)DNA2∶37-45和shoner等人(1984)。Proc，Nat′l Acad.Sci.U.S.A.81.5403-5407。
組建異源DNA順序的其他方法對熟悉本行技術(shù)者們是很清楚的。例如，如果DNA分子合用的話，它編碼的多肽是以NH2-met-X-y的N-端結(jié)構(gòu)表達的，式中的X是除丙氨酸外的任一種氨基酸，一個丙氨酸密碼子之間。另一方面，X密碼子可以刪去而用丙氨酸密碼子代而插在其中。因此，在本發(fā)明的工藝過程里，將會產(chǎn)生N-端分別具有NH2-ala-X-y或NH2-ala-y……的蛋白質(zhì)。
同樣的，也許會對一個已知基因順序的任一氨基酸密碼子進行刪減，加入以及/或取代，所以在本發(fā)明的工藝過程里就會表達出變異的多肽。一個“變異的”多肽在這里定義為與已知多肽天然存在的氨基酸順序相比，有獨個或多個氨基酸被刪去，取代或加進。這樣的變異實例包括在，但不局限在met-bGH(L)及met-bGH(D)型，這些變異品種的bGH的氨基酸順序除了在N-端出現(xiàn)一個額外的蛋氨酸之外分別與bGH(L)和bGH(V)相同，都是用牛的垂體體細胞生產(chǎn)的。被構(gòu)建成的這些變異的多肽的氨基酸順序具有與天然存在的多肽基本相似。只要其生物活性不會減到不允許的程度。為達到增加積留，提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，便于純化多肽以及/或使生物活性達到最適的程度，創(chuàng)建與表達變異多肽是有希望的。
上述編碼期望得到的多肽的DNA分子的修飾能夠使用限制性酶類，外切核酸酶，內(nèi)切核酸酶等等的已知技術(shù)來完成。寡聚核苷酸一導致位點特導誘變的一般技術(shù)亦能在DNA分子的結(jié)構(gòu)或順序上起到上述修飾的作用。而這些一般性技術(shù)是熟知本行技術(shù)的人所知道的。參閱例如，Zoller及Smith (1982)Nuc. Acids Res.10∶6487-6500;Zoller及Smith,(1983)Meth. Enrymol. 100∶468∶500;Norris等人,(1983)Nuc. Acids Res, 11∶5103-5112。
按照重組體DNA技術(shù)，一旦獲得想要得到的異源DNA順序之后，就要將該順序插入到一個合適的能提供復制這一DNA順序的克隆運載體里。任何合適的克隆運載體都可采用，但最好是采用那些含有標記功能的克隆運載體，它包括colEl, Hershfield等人，Proc Nat′1,Acad,Sci.U.S.A(1974)71∶3455;pBR322,Bolivar等人，Gene(1977)2∶95,PBR325,Soberon等人；Gene(1978)4∶121;以及pKc7，Rao等人，Gene(1979)7∶79；以及大腸桿菌E·coli噬菌體運載體，它包括Charon入L47.1,Loenen等人，Gene(1980)10∶249；以及M13mp8和M13mp9，Messing等人，Gene(1982)19∶269。把上述DNA順序插到一克隆運載體里去生成一個重組體的運載體的一般技術(shù)是屬于工藝技術(shù)范圍。參閱，Molecular Cloning∶A Laboratory Munual;Maniatis, Fritsch 和Sam brook, eds, (1982)。
一旦獲得期望得到的異源體DNA順序的多重拷貝，這些順序就可按后面較詳細的說明那樣從重組的運載體里移去這順序，并把它插入到為生產(chǎn)和分離期望得到的異源蛋白的表達系統(tǒng)里。在將這些DNA順序插入到一個表達運載體之前或之后可以用工藝熟練者所知的方法對異源體DNA順序進行修飾。
在本發(fā)明的一些例子里，Mesring等人在Gene(1982)19∶269所說的，修飾成含有一個Xbaz位點的M13mp8如圖2所示，與M13mp9一道被選為克隆運載體，參考文獻同上一。M13mp8及M13mp9一道被選為克隆運載體，參考文獻同上一。M13mp8及M13mp9集合為“M13運載體”其雙鏈(ds)或復制型(RF)及單鏈(ss)DNA型都可作分離用的重組體運載體。RFDNA重組體運載體的分離，如圖5，6及10所示便于隨后把已復制了的希望得到的DNA順序插到表達運載體上。另一方面，分離這些單鏈型重組體運載體，對在合適的5′到3′表達位置上含有的所期望得到DNA順序的重組體運載體的分離，以及如圖3、4和8所示對用寡聚核苷酸導致特異位點誘變一類的技術(shù)所修飾的任何DNA順序的創(chuàng)建都是方便的。此外，M13運載體能按納長度是以克隆一個典型而又完整的真核基因順序高達四千對堿基(4Kb)的DNA片段或基因。
用于M13運載體里的功能標記，正如Messing等人在Gene(1982)19∶269所述，它涉及與β-半乳糖苷酶有關(guān)的酶。確切地說，期望得到的異源DNA順序被插到至M13運載體里的LacI基因片段上。這樣它就破壞了在M13運載體上lncE基因片段與寄主(即大腸桿菌JM101)細胞染色體上部分lncE基因片段間的正?；パa作用，所以，所論的宿主不能再代謝在細菌培養(yǎng)基里存在的乳糖。用無任何外來基因順序插入并承受有l(wèi)acz基因片段的M13運載體去侵染的大腸桿菌E，coli，如果菌是在含有0.8%(W/V)胰蛋白胨，0.5%(W/V)酵母提取液，0.5%(W/V)氯化鈉以及一種β-半乳糖苷酶指示劑配成的1XYT培養(yǎng)基里生長，是能夠代謝存在于細菌培養(yǎng)基里的乳糖并產(chǎn)生出特微性的蘭色的噬菌斑。用在M13lacZ基因片段上已插入有異源DNA順序的重組體運載體感染的大腸桿菌E·coli，如果仍是在上述培養(yǎng)基生長時，其噬菌斑的顏色就是透明的或無色的。據(jù)此，異源體DNA順序插到這些克隆運載體的陽性反應可根據(jù)重組體運載體感染大腸桿菌寄主細胞后形成的無色噬菌斑進行鑒定。把編碼bGH(L)及pGH(P)的DNA順序插入到M13載體分別如圖2和9所示。
在一個較準的實施例中，象在seeburg等人，DNA(1983)2(1)∶37-45所作一樣分別在細菌質(zhì)粒pBGHex-1及PPGHex-1′上的bGH(L)及pGH(P)DNA編碼順序是通過位點專一的限制性內(nèi)切核酸酶切割方法從這些質(zhì)粒分離得到的。應該注意的是，用細菌質(zhì)粒pBGHex-1或pPGHex-1，分別對細菌轉(zhuǎn)化，隨后又分別在容許表達bGH(L)和PGH(P)密碼順序條件下進行培養(yǎng)可分別產(chǎn)生帶有N-端蛋氨酸(即met-bGH(L)或met-PGH(P)的促生長激素。然后分別地把各個順序插入到如圖2和7所學的經(jīng)修飾了的M13mp8運載體(M13mp8/XbaI)和M13mp9載體的復制型DNA(RFDNA)上。把期望得到的bGH(L)及pGH(P)DNA順序插入到M13mp8/XbaI及M13mp9RFDNA是通過位點--專一的限制性內(nèi)切核酸酶切割進行確定，仍分別如圖2和7所示。隨后，如Mcssing等人所述那樣，見酶學方法(Methods in Enzymology 1983)101∶20用這些重組運載體中的一些運載體去感染大腸桿菌Jmlol Messing等人，在Gene (1982)19∶269上所說那樣分離重組體運載體的單鏈DNA(SSDNA)Messing等人所引這些文獻的有關(guān)部分在此 作參考文獻。
一旦分離到這種重組體運載體的單鏈DNA(SSDNA)可通過寡聚核苷酸導致專一位點誘發(fā)進行修飾而創(chuàng)建bGH(A、V)，bGH(A、L)、bGH(V)及PGH(A)的DNA編碼順序。確切地說，DGH(L)是用加一個丙氨酸密碼子進行修飾，例如，在bGH(L)編碼順序的5′-末端上加GCC(如圖3所示?？梢杂枰姷氖蔷幋a丙氨酸4個密碼子中的任何一個都可以加入為得促生長激素最好產(chǎn)量而最好的編碼丙氨酸密碼子在這里表達系統(tǒng)中應用的是GCC。加入一個丙氨酸密碼子而創(chuàng)建的bGH(A、L)編碼順序可借用Sanger等人1)Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A.(1977)74∶5463的方法對整個bGH(A、L)的DNA順序或其5′-末端的DNA順序分析而進行確證。
bGH(A、V)編碼順序是通過bGH(A、L)密碼順序的寡聚核苷酸導致特異位點誘發(fā)而生成的如圖4所示、或是用127位氨基酸[在bGH(A、L)是如此]即亮氨酸、密碼子變?yōu)槔i氨酸密碼子，例如轉(zhuǎn)變成GTG。再一次可以肯定的是，任何纈氨酸密碼子都可用于這類轉(zhuǎn)變。這類bGH(A、V)密碼順序的創(chuàng)建仍然是通過對終產(chǎn)物bGH(A、V)編碼順序的DNA序列分析進行確認。
能使感染有包括bGH(V)編碼序列的表達運載體的細菌中產(chǎn)生met-bGH(V)蛋白的編碼順序也同樣可用寡聚核苷酸導致特異位點突變而創(chuàng)建，使bGH(L)編碼序列在126位(在bGHL上)氨基酸改變成纈氨酸密碼子GTG。
這種通過PGHCP)編碼順序的寡聚核苷酸導致特異位點誘發(fā)而創(chuàng)造PGH(A)編碼順序同樣地象圖8所示過程那樣以及象后面將要較詳細說明那樣進行完成的，而且仍是通過DNA順序分析進行確認的。
如果現(xiàn)在已分離和組建的這種期望得到的異源DNA順序象所列舉的bGH(A、L)bGH(A、V)及bGH(A)則，這些順序可以靠熟悉本行技藝者們用已知的方法和參照上述文獻擴增各個重組體運載體以復制和產(chǎn)生很多的拷貝數(shù)?，F(xiàn)在這些異源DNA順序就可以被插入到任何適合表達運載體上使在原核生物里生產(chǎn)這類期望得到的異源多肽。
N-端丙氨酸多肽的生產(chǎn)象前面討論的那樣在選定的宿主細胞里，一個適合表達的運載體應該含有為生產(chǎn)異源蛋白必需的轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)譯信號和與之一起用以識別那些已插入有異源DNA順序的表達運載體上的功能標記。用原核生物的表達載體，能夠通過轉(zhuǎn)導作用，轉(zhuǎn)化作用，或者轉(zhuǎn)染作用(在此通稱“作轉(zhuǎn)染作用”)把重組體DNA順序引入與其基因互補的生物體中，然后所說的原核生物能夠在一定的條件里培養(yǎng)C一般都由啟動子和所用宿主控制)從而導致生產(chǎn)出期望得到的異源蛋白質(zhì)。因此，在本發(fā)明里所用的“染色體組”DNA包含有染色體的和附加體的DNA。
為了表達異源基因及在源核生物的宿主細胞里生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)。許多表達運載體已被描述，而且都為熟悉本行技藝者們掌握。
在本發(fā)明一個較佳的實施例里，應用了表達運載體pBGHex-1＇參閱Seeburg等人”DNA(1983)2(1)∶37-45。以及pBGHex-1*，還包括已修飾過的pBGHex-1運載體。
表達運載體bGHex-1是一種帶有bGH(L)基因的細菌值粒pBR322。這個基因依次包括一色氨酸啟動子(ptrp)。-Shine-Delgarro順序，一種除接在N一端苯丙氨酸編碼順序上的ATG轉(zhuǎn)譯啟動/蛋氨酸密碼子，bGH(L)多肽的第一個氨基酸，bGH(L)編碼順序以及一個轉(zhuǎn)譯停止密碼子。有關(guān)pBGHex-1表達載體的功能標記是抗菌素抗性。確切地說，pBGHex-l帶有兩種抗菌素抗性基因，一種是抗氨芐青霉素抗性(ampr)而第二種是抗四環(huán)素抗性(tetr)，這兩種抗性由于表達運載體授與其它敏感性宿主細胞以對抗菌素的特異抗性而穩(wěn)定地被轉(zhuǎn)化。因此穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體通入在含有四環(huán)素，氨芐青霉素或二者都有的培養(yǎng)基上生長可以被選出來。
在本發(fā)明的一些例子里，表達運載體PMON3209以及包括有分別帶bGH(A、L)及bGH(A、V)編碼順序以代替bGH(L)編碼順序的pBGHex-1質(zhì)粒在內(nèi)的PMON3215都分別如圖5和6所示那樣過程產(chǎn)生的。象大腸桿菌樣的細菌隨后被這些表達運載體的一種所穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化，而且轉(zhuǎn)化體通過在含有適當抗菌素的培養(yǎng)基上生長而被選出，在轉(zhuǎn)化的細菌里含有的這些表達運載體隨后用限制性酶切割方法查對在正確的5＇至3＇位置上篩選bGH(A，L)及bGH(A，V)編碼順序的存在。
在本發(fā)明的一個例子里pBGHex-1*包括位于Ptrp編碼順序5＇端上游經(jīng)除EcoRI酶切位點方法修飾過的pBGHex-1也被應用以創(chuàng)造帶有PGH(A)編碼順序代替bGH(L)編碼順序的表達運載體PMOM3213終產(chǎn)物pBGHex-1運載體只含有單一的EcoR1位點如圖9所示在pBGHex-1*里用PGH(A)編碼順序代替bGH(L)編碼順序以創(chuàng)造表達運載體PMON3213圖10所示。然后用所說混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，同時通過在含有抗菌素的培養(yǎng)基上生長選取轉(zhuǎn)化體。在經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細菌里含有的表達質(zhì)粒隨后用限制切割篩選PGH(A)編碼順序的存在。
在大腸桿菌里生產(chǎn)bGH(A、L)，bGH(A、V)或bGH(A)是用表達運載體PMON3209，pMON3215或pMON3213中任一種按照后面較詳細說明的方法通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌株多ECodiW3110LE392或294而實現(xiàn)的，這些株多的ATCC登記號分別為39936，53010，及53009。轉(zhuǎn)化了的大腸桿菌(E，COLi)W3110隨后在容許表達生長激素基因和生產(chǎn)這種期望得到的異源多肽的條件下進行培養(yǎng)。
所產(chǎn)異源肽的純化將隨蛋白質(zhì)及所選的宿主細胞二者而定。例如，曾觀察到在象大腸桿菌那樣的細菌里生產(chǎn)的異源蛋白質(zhì)常常以“折射體”的形式在細胞里沉積，采用“折射體”一詞是因為這些物體實際上用相差顯微鏡能夠看見的。一種回收異源蛋白質(zhì)及回收在生物學上有活性物質(zhì)有用的方法已在全歐專利申請114，506(1984.8.1出版)里敘述，在此 作參考文獻。這個純化的方法簡言之包括濃縮宿主細胞，將它們裂解以產(chǎn)生細胞提取液或勻漿液，繼而用差速離心分離這些折射體，其中所有步驟對熟知本行技藝者都是知道的。分離得的折射體溶于一種象鹽酸胍一類的強變性劑里，這種溶解了的蛋白質(zhì)隨后在適當?shù)娜軇├?例如尿素)交換，用層析法純化。最后使之在生物學上活化。即容許它呈假定的活性構(gòu)型然后進行氧化之。因而使這樣的構(gòu)型就象在全歐專利申請114，506所述那樣，通過它合適的半胱氨酸殘基間的二硫鍵而保持它的構(gòu)型。這種異源蛋白質(zhì)更詳細的純化過程在兩個同時申請的美國專利里敘述，其一是由storrs s.B題名生長激素可溶解化的方法“Method of somatotropin Solobibilitation”，而另一由Bentle,L.A storrs.S.B及Mitchell J.W.題名生長激素自然化的方法Method of Sometotropin Natura-tion”，在此均 作文獻。”這兩個同時申請的美國專利以及本申請一起全都同意轉(zhuǎn)讓給mon Santo公司。從這種異源多肽上去除污染的細菌性蛋白質(zhì)的進一步純化，可通過象凝膠過濾處理或離子交換層析的常規(guī)層析方法能夠達到。經(jīng)這樣處理純化過的組成物，典型地將含有N-丙氨酸、多肽大約為其全重的90%至99.5%而由細菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或在其它原核生物宿主上產(chǎn)生的多肽。大約為0.5%到10%。
已發(fā)現(xiàn)用本發(fā)明的方法所表達的異源肽，通常至少有大約80%具有-NH2-ala的N端結(jié)構(gòu)……其余的多肽有代表性的是呈蛋氨酰型式，它具有-NH2-met-ala……的N端結(jié)構(gòu)。然而，以不同的培養(yǎng)條件以及/或者誘導基因表達的時間，就有可能提高N端具有丙氨酸的多肽的比值至少到95%或甚至更高一些。
在本發(fā)明的一個特別好的實施例中，根據(jù)前面敘述那樣生產(chǎn)和分離的多種生長激素多肽按照Tsushina及Frieses在J.clin,Endocpinol.Metab.(1973)37∶334-337所說那樣在家兔肝受體上分析完成的方法進行測定以及對小白鼠增重的生物分析都表明有類生長激素的生物活性。在后者的分析里，大腸桿菌產(chǎn)生的生長激素的生物活性是通過切除重體小白鼠分別主入不同劑量待測生長激素與注入一些已知的生長激素(例如豬或牛的垂體生長激素)后所得小白鼠的相對增重進行評定。確切地說，給去除垂體的小白鼠(體重95-135克)注射滴定劑量未知的或標準的(0至60微克之間)生長激素，按日為基礎(chǔ)進行7天或更長的試驗時間。使用多重回歸分析，接受已知或未知激素組的動物的體重增量與劑量的對數(shù)變換值呈回歸，測試斜率以確定非平行現(xiàn)象及截距普遍性。生物活性是以斜率的比值乘標準的活性。
正如前面討論過一樣，本發(fā)明亦期望bGH變異型的產(chǎn)品其上有-N-端丙氨酸，但此沿著多肽鏈可進行刪減、加進倒轉(zhuǎn)和/或取代。這種具有期望得到的泌乳和/或生長增效功能的修飾作用能夠通過在牛里進行的常規(guī)試驗鑒定。
下列例子闡述了較佳的實施例本發(fā)明，但無論如何不想限制本發(fā)明的界限。雖然本發(fā)明已在與發(fā)明有關(guān)的較好的實施例中作了闡述熟知本行技術(shù)者從閱讀這個申請里，提出各種各樣的修正那將是顯然的。
微生物及質(zhì)粒下列微生物可從美國標準菌種庫(ATCC)12301 parklawn Drive,Rockville,Maryland,20852,U.S.A.獲得，它們也已在武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心進行了保藏，保藏號為CCTCCM90031-M90036。
ATCC 39936-CCTCC: M90033-E.Coli W3110ATCC 53010-CCTCC: M90032-E.Coli LE392ATCC 53009-CCTCC: M90031-E.Coli Strain 294ATCC 53024-CCTCC: M90034-E.Coli W3110(pMON3209)ATCC 53022-CCTCC: M90036-E.Coli W3110(pMON3215)ATCC 53023-CCTCC: M90035-E.Coli W3110(pMON3213)這些存放菌種可通過本申請的受讓人(Monsanto公司)取得美國專利(局)同意而為共眾使用。這些存放菌種將會由于這個申請具有申請日期開始獲利的任何這樣的美國(U.S)專利的有效期內(nèi)而可取得使用。然而，必須明了這些存放菌種的可用性并不構(gòu)成允許去實施本主題的發(fā)明以貶低政府同意頒發(fā)的專利權(quán)。況且本發(fā)明不限于存放微生物的范疇，因為這個存放菌種的實施例只是企圖作為本發(fā)明的具體闡述而已。
例一所有的寡聚核苷酸的合成都是依據(jù)制造廠應用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystem,Inc.Foster City,Califor-nia)提出的步驟用一個應用生物系統(tǒng)DNA合成儀在Monsanto公司生物科學部(Department of BiologiCal Science,Monsanto)進行的、限制性內(nèi)切酶和DNA修飾酶是由新英倫生物實驗室(New England Biolabs Beverly,MassaChu-Setts)新英倫核子公司(New England Nuclear,Boston,MassachuSetts)及Bettesda研究實驗室(Bethesda Research Laboratories,(BRL)(Gaithersburg,Maryland)供應，限制性核酶內(nèi)切酶Xbal接頭(XbaI linker)是從合作研究公司(Collabora tive Research,Inc.(Lexington,Massachus etts)獲得、T4DNA連接酶是由BRL供應。T4DNA激酶是從新英倫生物實驗室購買。32P-林記核苷酸是由Amercham(Arlington Heights, Illinois)供應。E.Coli DNA多聚酶I.Klenow片段，是由新英倫核子公司供應，E.Coli Jmioi是從Dr.JoMessing,University of Minnesota(st.paul,Minnesots)處獲得。
限制性酶的酶解過程，T4DNA連接酶的連接及大腸桿菌E·Coli DNA多聚酶I,KlenoW片段酶的反應都可以按制造商提出的步驟進行。對下列限制性酶的較佳緩沖液如下用于XbaI:100毫摩爾Nacl,50毫摩爾Tris(三羥甲基氨基甲烷)PH.7.5,10毫摩爾mgSo4;用于EcoRI,Hind Ⅲ及SmaI∶50毫摩爾NaCl，10毫摩爾Tris pH7.5,10毫摩爾mgSo4DNA連接酶反應是在含在25毫摩爾Tris,pH8.0 10毫克Mgcl2,10毫摩爾dithiothritol (DTT)[二巰基赤癬糖醇]2毫摩爾亞精胺以及0.2毫摩爾ATp的緩沖液內(nèi)進行，大腸桿菌E·Coli DNA多聚酶I,klenow片段酶，是在含有20毫摩爾Tris pH7.2,10毫摩爾Mgcl2,10毫摩爾(DTT)，1毫摩爾ATP，及1毫摩爾下列各物之一dATA,dGTp,dCTP,dTTp的緩沖液中使用。如果標記新合成的DNA鏈，則可加入Alpha-32P-dATp(400居里/毫摩爾)至KlenoW反應液里。
標記寡聚核苷酸是用伽馬(γ)-32P-ATp(比活性大于5000居里/毫摩爾)及T4DNA激酶于100毫摩爾Tris,pH8.0 10毫摩爾MgCl2,5毫摩爾DTT。
供bGH(L)及pGH(P)用的帶有DNA密碼順序的質(zhì)粒(分別是pBGHex-1及pBGHex-1)是從遺傳工程有限責任公司Genentech Inc.獲得，So.San·Francisco,California。這些質(zhì)粒也能按在全歐專利申請75，444(1983、3、30出版)；Seeburg·等人，DNA(1983)2(1)∶37-45；Goed-del等人，Nature(1979)281∶544-548；DeBoer等人，在啟動子Promoters結(jié)構(gòu)與功能(Structure and Function)(1982)；M·J·Chamberlin and R·Rodriguer ed Charptor 293；Miozzari and yanofsky, J·Bacteriol.(1978)133∶1457-1466；以及Rosenberg and Court,Annual RevieW of Genetics B:319-353所述制備。如在全歐專利的申請75，444(DeBer等人)所示，在bGH(L)DNA前面21個轉(zhuǎn)譯密碼是ATG，TTC CCA GCT ATG TCT CTA TCT GGT CTA TTC GCT AAC GCT GTT CTT CGT GCT CAG CAT CTT或是它們的功能等值物編碼氨基酸相同的不同密碼子)(那些密碼子的功能等值物當然可以交換使用的。)這些出版刊物的有關(guān)部份在此皆并作文獻。
M13mp8及M13mp9是從明尼蘇達大學(圣保羅，密蘇里)Mes-Sing Jo博士處獲得。
所有細菌培養(yǎng)基成份及抗菌素是Sigma(St.louis Mo)或是從DifCo實驗室(Detroit,MiChigan)獲得的。
例二下面的例子說明三種DNA密碼順序的組建，這些順序在細菌里表達時，就提供直接在細菌里生產(chǎn)具-N端丙氨酸的多肽。確切地說，DNA密碼順序就是建成這樣以致在轉(zhuǎn)譯啟始/蛋氨酸密碼子(ATG)之后緊接有-丙氨酸密碼子(即GCC)。這三種DNA編碼順序，它們包括bGH(A.L.)，bGH(A.V)及pGH(A)，是從以前分離的生長激素DNA順序通過寡聚核苷酸-導致特異位點-誘變而建成的。此例也說明在細菌中表達使產(chǎn)生metbGH(V)的編碼bGH(V)密碼順序的DNA的構(gòu)建。
a.bGH(A.L)DNA密碼順序的組建生長激素bGH(L)的DNA密碼順序是由pGHex-1質(zhì)粒上切出-XbaI片段并克降至一個修飾了的M13mp8運載體(M13mp8/XbaI)的XbaI位點上。在原來SmaI位點處含有一個XbaI接頭(或稱連接子)·的M13mp8/XbaI運載體其組建過程在圖1示出。如圖2所示，XbaI能在bGH(L)密碼順序的任一端酶切，因此切出完整的bGH(L)密碼順序。在存在有T4DNA連接酶時，XbaI限制酶切過的pBGHex-1質(zhì)粒與用XbaI限制性酶裂開后并用小牛腸堿性磷酸酶去末端磷處理呈線形化復制型的(RF)M13mp8/XbaI DNA相混合。隨后這種混合物在14℃里溫育過液，用小牛腸堿性磷酸處理防止了M13mp8/XbaI運載體重新環(huán)化。將bGH(L)DNA密碼順序插到M13mp8/XbaI運載體里制造成重組運載體M13mp8/BGHex-1，開始時是以在含有10微升100毫摩爾IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)和50微升2%(W/V)X-GAL(5-溴-4氯-3吲哚氧基-β-D-半乳糖吡喃糖苷)加入到3ml上層瓊脂中并用前面所述的重組運載體去轉(zhuǎn)柒分子克隆化Molecular CloningAlaboratory Manual,Maniatis,Fritsch 和 Sambrook, eds (1982)pq·64，所說的運用軟瓊脂復蓋步驟(雙層法)，在IXyT培養(yǎng)基上生長的大腸桿菌E·ColiJM101 菌層上形成無色的噬菌斑進行確定，bGH(L)密碼順序插入可用酶解分離出的復制型(RF)DNA而確證，把重組運載體用XbaI酶切，產(chǎn)生含有插入序列590堿基對片段。參閱分子克隆化Molecular CloningALabora-tory Manual,Maniatis,Fritsch and Sambrook,eds·(1982)第三章。這590對堿基片段是在百分之一(W/V)瓊脂糖里按在Molecular CloningALaboratory Manual,Maniatis,Fritsch Sambrook,eds(1982)所述用瓊脂糖凝膠電泳鑒定出的。所有后面的限制性酶酶切片段都用這種參比的方法鑒定。插入的bGH(L)密碼順序的方位是通過用SamI和HindⅢ酶解RF重組運載體進行確定的。當這種密碼順序是在正確的5＇至3′方位，用這些限制性酶酶解時應該產(chǎn)生-207對堿基的片段。單鏈噬菌體DNA的分離是按Messing et al,在Gene(1982)19:269里的方法進行的。M13mp8/BGHex-1運載體以后在寡聚核苷酸導致特異位點誘變中被用作模板，基本上按Eoller和Smith，在NuC.Acids Res.(1982)10:64876500,Eoller and Smith在 Methods in EnZymol (1983)100:468-500所述進行，Norris等人，NuC.ACids ResearCh(1983)11:5103-5112,其中有關(guān)部分在此并作文獻。
圖3繪出從bGH(L)密碼順序構(gòu)建成一個為bGH(A.L)編碼的DNA順序的誘變步驟。簡言之含有希望突變順序寡聚核苷酸引物(見后表1)被用作合成單鏈DNA M13mp8/BGHex-1運載體的閉環(huán)DNA拷貝引物的模板。因此而產(chǎn)生的閉環(huán)雙鏈DNA分子按Zoller和Smith Methods in Enzymol(1983)100:468-500里所述那樣方法用堿性庶糖梯度離心從不完整環(huán)和單鏈DNA環(huán)中分離開。這種閉環(huán)的雙鏈DNA分子隨后用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E·Coll)JM101方法像 MeSSing等人，Gene (1982) 19:269-276所述那樣，而且挑取出無色的噬菌斑，把它們放在從pall Vltrafine Filtration Corp·(Glen Cove,NeW york)獲得的pall濾器上與用以產(chǎn)生特異位點誘變并用32P標記的寡核苷酸引物作分子雜交進行篩選。上述噬菌體的挑取是按pall濾器制造廠所述方法進行。分子雜交篩選是用生物達因尼龍滬器實現(xiàn)的，該方法按pall超細滬器公司在其“DNA轉(zhuǎn)移到pall生物達因尼龍滬器上的指導方案”中所述。用升高溫度洗滌滬器，直到用M13mp8/bGHex-1制備的對照滬器洗盡放射性為止。一個標準的濾器清洗方案包括用6×SSC(0.9MNaCl和0.09M檸檬酸鈉)在室溫清洗10分鐘，接著在50℃用6×SSC洗5分鐘，最后升高5℃洗滌之。與放射性標記寡聚核苷酸引物分子雜交的噬菌斑，溫度比對照噬菌體高時，被假設(shè)為帶有新構(gòu)建成的bGH(A.L)密碼順序，而且各之為潛在陽性。另一方面，從轉(zhuǎn)化的E.Coli JM101上挑取各個無色噬菌斑，并放在5ml2XyT培養(yǎng)基(1.6%(W/v)胰蛋白胨Tryptone,1.0%(W/V)酵母抽提液，0.5%(W/V)Nacl)置37℃下好氣培養(yǎng)過液。依據(jù)Messing等人，在Gene(1982)19:269方法制備噬菌體DNA隨后在硝酸纖維上與放射性標記引物一起分子雜交，并像上述一樣升溫洗滌之。顯示出雜交溫度比M13mp8/bGHex-1對照噬菌斑高的噬菌體DNA同樣地被各之為潛在陽性。從兩種篩選過程中取得具潛在陽性的噬菌斑按上述一樣培養(yǎng)，并用來制備單鏈(SS)噬菌體DNA，隨后又按Sanger等人，在proC·Nat＇1,ACad-Sai U.S.A.(1977)74∶5463-的方法進行序列分析以確證它們帶有bGH(A.l)密碼順序。因為丙氨酸密碼子可創(chuàng)造成一個附加的HalⅢ限制性位點，所以M13mp8/BGH(aLa)復制型也可以用HaeⅢ限制性內(nèi)切配介分析篩選以證實加入的一個丙氨酸密碼子跟在啟始訊號/蛋氨酸密碼子ATG之后。在這種bGH(L)DNA密碼順序上加進丙氨酸密碼子的頻率大約是2%。
b.bGH(A.V)DNA密碼順序的組建bGH(A.V)DNA密碼順序的組建，篩選及順序確認除了模板如圖4所示是M13mp8/BGHex-1(ala)以及寡聚核苷酸引物是如后表1所示外都是使用前面同樣的步驟完成的。亮氨酸密碼子轉(zhuǎn)化為纈氨酸密碼子的頻率大約是10%。
c.bGH(V)DNA密碼順序的組建bGH(V)DNA密碼順序的組建，篩選，和順序硝定是用與上述相同的方法實現(xiàn)的。明確的說，模板，M13mp8/BGHex-1和寡核苷酸引物也與創(chuàng)建DGH(AV)所應用的相同，亮氨酸密碼子到纈氨酸密碼子的轉(zhuǎn)變頻率再次為約10%。
d.pGH(A1)DNA密碼順序的組建寡聚核苷酸——特異位點——誘變，像Seeburg等人，在DNA(1983)2(1)∶37-45里所說的那樣同樣可以用來把丙氨酸密碼子加到pGH(P)DNA密碼順序里。這一銹變方法如圖8所示進行如后。
在pPGHex-1質(zhì)粒上所帶的590對堿基pGH(p)DNA密碼順序在pGH(p)密碼順序5＇端和3＇端分別用ECoRI和HindⅢ限制性酶切割質(zhì)粒從質(zhì)粒上把它移去，如圖7所示。這個限制性酶切過的PGex-1質(zhì)粒隨后與MBmp9復制型DNA混合，該復制型DNA在混合之前同樣用E.CoPl及HindⅢ酶切開，并另外再用小牛腸堿性磷酸酶予處理以予防該M13mp9的限制性片段重新連接。T4DNA連接酶隨后加入上述混合物里。由于畸型的端部位于用兩種不同的限制性酶酶切生成RF噬菌體DNA和pGH(P)DNA密碼順序衛(wèi)，所以pGH(P)DNA將能選擇地被插到RF噬菌體DNA里，并且將會插至正確的5＇至3＇方位上，如圖7所示。如前面所述M13mp8/BGHex-1一樣，隨后大腸桿菌E.eoliM101用帶有pGH(P)DNA密碼序的重組體M13Mp9/pGHex-1運載體轉(zhuǎn)化。然后把這種轉(zhuǎn)化了的大腸桿菌E.CollJM101放在有指示劑的1XTY培養(yǎng)基里生長，而且也像前面所說那樣選擇無色噬菌斑。這種pGH(p)DNA密碼順序的插入是用下法確認的。挑取無色的噬菌斑，按前面所說方法分離M13mp9/pGHex-1的復制型DNA然后用ECoRl及HindⅢ切開，并在瓊脂糖凝膠上電脈產(chǎn)生含有所插入pGH(p)DNA的一個590對堿基的片段。然后把M13mp9/pGHex-1噬菌體在大腸桿菌E.ColiJM101里增殖并按前所說的方法分離單鏈噬菌體DNA。
隨后將M13mp9/pGHex-1DNA用作步驟核苷酸——特異位點——誘發(fā)的模板，如圖8所示，按前面所說的步驟構(gòu)造成一個應用專性引物的bGH(AL)密碼順序(見后表1)。在這種pGH(p)密碼順序上加進一個在此是GCC的丙氨酸密碼子的頻率幾乎是12%。終產(chǎn)物pGH(A)密碼順序再用DNA順序分析法進行確認。
例三這個例子說明供直接在細菌里生產(chǎn)含有N-端丙氨酸的多肽的三個重組的表達運載體的組建及表達。這樣生產(chǎn)出的三種多肽是bGH(A.L)，bGH(A.V)及PGH(A)型的生長激素。這個例子也說明bGH(V)表達運載體和bGH(L)表達運載體的組建。這樣產(chǎn)生的多肽分別是mef-bGH(V)和mef-bGH(L)。
a.bGH(A.L)、bGH(A.V)和bGH(L)的表達。
分別用重組的運載體M13mp8/BGHex-1(ala),M13mp8/BGHex-1(ala,Val)及M13mp8/BGHex-1(Val)上帶有的bGH(A.l)及bGH(A.V)DNA密碼順序去代替在pBGHex-1表達質(zhì)粒上帶有的bGH(L)DNA密碼順序(參閱圖5和圖6)。這是用XbaI酶解相應的M13RFDNA上片段而完成的。表達質(zhì)粒pBGHex-1亦用Xbal酶解，并接著用小牛腸堿性磷酸酶處理以防止這些限制性酶切片段重新連接。每種已酶解了的RFDNA的片段隨后分別與已酶解了和處理過的pBGHex-1DNA混合，并如前面所說那樣在14℃下連接過夜。這樣形成的重組的表達運載體把帶有bGH(A.L)bGH(A.V)和bGH(V)DNA密碼順序分別標記為pMoN3209、pMoN3215和pMoN3214。隨后大腸桿菌E.ColiW3110用含有pMoN3209或含有pMoN3215或含有pMoN3214或含有pBGHex-1的連接混合物轉(zhuǎn)化，并在Lauria肉湯上生長出Lauua肉湯含有.1%(w/v)胰蛋白胨，0.5%(w/v)酵母抽提液和0.5%Nacl(w/v)以及含有12.5微克/毫升四環(huán)素和200微克/毫升氨芐青霉素。含pMoN3209的大腸桿菌E.Coli W3110其ATCC登記號為53024。含pMoN3215的E.Coli W3110其ATCC登記號為53022。轉(zhuǎn)化作用簡要地進行如下。把近50MlE.Coli W3110在LB培養(yǎng)液里生長到光密度(oD)600=0.60。隨后將其細胞收集成小丸并懸浮在含有25毫摩爾Tris,pH7.6和10毫摩爾NaCl的10毫升緩沖液A里。然后，又把這些細胞收集成小丸并再懸浮在1毫升緩沖液A內(nèi)于其中加入14毫升緩沖溶液B使成懸浮液并在水中保持30分鐘，緩沖液B含有25毫摩爾Tris,pH7.6,10毫摩爾NaCl，50毫摩爾Cacl2。然后又把這些細胞再收集成小丸并再懸浮在3毫升緩沖溶液B內(nèi)。取再懸浮的細胞的一份等分試樣0.2毫升隨后與0.1毫升緩沖液B及0.1-0.5μg理想的重組的表達運載體(PMON3209或pMoN3215或pMoN3214或BGHex-1)混合，并在水上孵育60分鐘。這些孵育的混合液隨后在37℃上加熱1分鐘在此之后加入3毫升LB培養(yǎng)基，然后把終產(chǎn)混合物在37℃溫育60分鐘。隨后收集這些細胞成小丸并再將其懸浮在300毫升LB培養(yǎng)液內(nèi)，并使它在如前面所述的含抗菌素的LB平板上生長。就這樣選出了抗性菌落以及按Molecular Cloning Alabor atory manual, maniatiS,Fritsch and Sambrook,eds(1982)所說的步驟分離出pMoN3209、pMoN3215,pMGHex-1和pMoN3214表達運載體DNA的片段。這些pMoN3209、pMoN3215,pBGHex-1和pMoN3214的DNA片段可用它存在有590對堿基的XbaI片段與200堿基對HindⅢ/Smal DNA片段進行篩選因為它說明在正確的方位上存在有bGH(A.L)bGH(V)和bGH(A.V)DNA編碼順序。pMoN3209和pMoN3215表達質(zhì)粒可以用HaeⅢ酶酶解分析進一步篩選，并從而確證由于加進GCC(丙氨酸)密碼子導致產(chǎn)生一個HaeⅢ新位點的存在。最后，從pMoN3209、pMoN3214和pMoN3215三運載體來的590堿基對的XbaI片段，可按前面所述進行部分順序測定以確定在這些表達運載體上存在有bGH(A.L)bGH(V)與bGH(A.V)DNA編碼順序。
帶有pMoN3209 pMoN3214.BGHex-1＇或pMoN3215的E.Coli W3110的單菌落分別接種在含有12.5Mg/ml四環(huán)素的5毫升培養(yǎng)基LB里，而且在37℃下通氣培養(yǎng)過夜。然后取0.5毫升過夜培養(yǎng)物分別接種裝在250ml錐形瓶里的25毫升的M9培養(yǎng)液。M9培養(yǎng)液組分為(按升計)100毫升10倍濃縮鹽液(按千毫升總體積計含有70克(g)Na2Hpo4,30gKH2po4,5gNaCl 10gNH4Cl,1.2毫升1MMgSo4，0.25毫升0.1%B1,12.5毫升20%(W/V)葡萄糖，0.025毫升1MCaCl2，并再補充0.5%(W/V)酪蛋白氨基酸液和6.25μg/ml四環(huán)素。隨后把這些接種物各自在37℃通氣培養(yǎng)至達到OD600(光密度在600毫微米)=1.0。每份0.2ml等份試液再從每個上述的錐形瓶里取出并逐個裂解后放在十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電脈(PAGE)緩沖液里，并按Laemmli,在Nature(1970)227∶680-685所說方法用SDS-pAGE分析。從這兩種基團結(jié)構(gòu)得出的22,000道爾頓的蛋白質(zhì)在大腸桿菌E.ColiW3110里處于高水平。而且，與在Western浸漬分析中，兩種22,000道爾頓蛋白質(zhì)由抗牛垂體生長激素所產(chǎn)生，單克隆抗體，F(xiàn)11-A1-B6結(jié)合(參圖Kriviand RoWold, Hybridoma(1984),因此，證實這種多肽是與垂體生長激素有關(guān)。帶有親本的pBR322質(zhì)粒的E.ColiW3110細胞不產(chǎn)生與抗生長激素抗體結(jié)合22，000道爾頓蛋白質(zhì)。
帶有表達質(zhì)粒pMoN320 pMoN3214,pBGHex-1及pMoN3215的細菌貯存方法如下，用這些質(zhì)粒(pMoN3209或pMoN3215)或pMoN3214,或pBGHex-1)轉(zhuǎn)化了的E.Coli W3110的單菌落，放入5m′加有12.5μg/ml四環(huán)素的LB在37℃下通氣生長過夜。從每一過夜培養(yǎng)物里取出1m(等分成液分別地加到各個含有25mlLB和12.5μg/ml四環(huán)素的三角瓶里生長至oD600=1.0，然后把每個瓶里的細胞用6000Xg在4℃下離心5分鐘收集。離心集成小丸逐個地再懸浮在12毫升加有7.5%(V/V)DMSO的LB里并且用1毫升等分試液立即在干水上凍結(jié)。這些細胞隨后就貯存在一個液氮瓶內(nèi)。另外，大約10毫克純化了的質(zhì)粒DNA可貯存在-80℃。
b.pGH(A)DNA順序的表達如圖10所示，重組的運載體M13mp9/pGHex-1(a/a)上的pGH(A)密碼順序可代替在修飾過的pBGHex-1表達運載體上所帶的bGH(L)DNA密碼順序。一個修飾過的表達運載體pBGHex-1包括一個pBGHex-1表達載體，其上位于色氨酸啟動子(ptrp)上游的ECoRI限制性位點已經(jīng)被除去(見圖9)。已修飾的pBGHex-1*表達運載體是先用pBGHex-1*的ECoRI部分酶介之后用Sl核酸酶處理除去其粘性端面創(chuàng)建成。這種經(jīng)限制性酶切的pBGHex-1運載體隨后用J4DNA連接酶環(huán)化并用它轉(zhuǎn)化E、ColiJM101，以上皆按前面所說方法進行。第二步就是從單菌落的質(zhì)粒DNA中篩選帶有pGH(A)密碼順序的590對堿基的EooR1/HindⅢ片段以及帶有色氨酸啟動區(qū)(ptrp)順序的1050對堿基的ECoR1/pat1片段(見圖9)。這種ECoR1酶切位點的除去，使得在正確方位上把pGH(A)密碼順序插到pBGHex-1*表達運載體上去的專性位點插入過程變得簡便，如圖10所示，由此形成的這種重組的表達運載體在下文皆稱作PMoN3213。含有pMoN3213的混合物隨后用來轉(zhuǎn)化E.Coli W3110，而且如上所述一樣對生長出的轉(zhuǎn)化體進行篩選。含有pMoN3213的E、Coli W3110有-ATCC的登記號53023。在pBGHex-1*表達運載體里用pBGH(A)密碼順序取代pBGH(L)密碼順序的證實是用分離pMoN3213DNA，并隨后用E(oR)及HindⅢ酶切上述表達運載體產(chǎn)生出590對堿基片段，以及用HaeⅢ切割表明pGH(A)DNA密碼順序里含丙氨酸密碼子導致額外的一種HaeⅢ限制性酶片段的存在等方法進行。在pMoN3212表達運載體里有pGH(A)DNA順序存在的最后確認是把EcoRI/HinclⅢ的590對堿基的片段按前面所說方法作部分序列測定。
pGH(A)DNA密碼順序的表達以及pGH(A)在E.Coli W3110內(nèi)的生產(chǎn)是按前所說生產(chǎn)bGH(A.L)及bGH(A.V)所提出的作法實現(xiàn)的。證明22，000道爾頓蛋白質(zhì)的高水平同樣地是像前面所說那樣用SDS/pAGE來完成的。
帶有pMoN3212表達運載體的E.Coli W3110可按前面所說的那樣保存的，而且供大規(guī)模(10-100升發(fā)酵)生產(chǎn)pGH(A)用的亦像前面所說那樣進行。這種100升批量發(fā)酵的pGH(A)蛋白質(zhì)含量按ROSner等人，J.lmmunol.Methods(1982)52:175-181用放射免疫法測定產(chǎn)量接近1克/升肉汁培養(yǎng)基。
例四完成這個實例是為了測定在細菌里生產(chǎn)的bGH(A、L)、bGH(A、V)met-bGH(V)、met-bGH(L)及pGH(A)等導源蛋白質(zhì)的N端氨基酸順序而作為本發(fā)明方法的實例。
這種在大腸桿菌所產(chǎn)生的促生長激素多肽是從含有bGH(A.L),bGH(A、V)met-bGH(v)met-bGH(L)或pGH(A)的粗而可溶的折射體中用按Krivi& ROwold,Hybridoma(1984)3∶151-161所說的免疫吸附層析法被純化的，用免疫吸附層析法純化的所有三種促生長素品種似乎都比按Laemmli,Nature(1970)227∶680-685的方法用SDS-pAGE分析在7.5-15%(W/V)梯度凝膠里處理所得1μg純化蛋白質(zhì)所得95%純度要高。純化后的bGH品種的蛋白溶度按常規(guī)的高壓液相層析法分析。
由免疫吸附層析純化供N一端序列分析使用的蛋白質(zhì)要對水充份透析，然后親水化。在作N一端序列分析之前，把純化蛋白質(zhì)再懸浮在含有50毫摩爾重碳酸胺加0.1%(W/V)SDS的重碳酸胺緩沖液里，而且對相同的緩沖液透析以除去殘留的tris(羥甲基)氨基甲醇(tris)及甘氨酸。然后用“應用生物系統(tǒng)”的蛋白質(zhì)順序分析儀470A型(Applied、Biosystems,InC.Foster(ity CA)按HunKapiller等人，(1983)，Methods in Enzymol、91∶399-413 and Hunkapiller等人(1983)，Method-SinEngmol、91∶486-493，所說的方法把所有的都進行N-端的序列分析。
后面的表2列出了幾種bGH(A.L),bGH(A.V),met-bGH(V),met-bGH(L)及pGH(A)多肽制品序列分析的結(jié)果。是N-端蛋氨酸的蛋白質(zhì)含量是作為樣品內(nèi)生長激素總量的百分比而列于表內(nèi)的。兩種方法都在蛋氨酸定量中使用。使用直接法，NH2-met-ala-phe的量……在主要為NH2-ala-phe…組群里根據(jù)遲滯訊號的差導進行計算。由于這一方法取決于對“正?！表樞蜓舆t滯的估計。這種延遲各環(huán)不同，所以只能是對NH2-ala-phe順序的粗略估計。直接法包括ECdan的降解反應，它能在用高壓液相層析從化學干擾里(Hplc)分開pTH-met，之后對pTH-met和pTH-ala的訊號強度進行比較。“pTH”指的是苯基一硫化乙內(nèi)酰尿。確切地說，這個Edman降解順序反應是由與N端氨基酸作用的試劑組成，它促使氨基酸斷裂并隨之釋放出那個氨基酸的pTH-衍生物，這后一過程只要游離氨基酸污染是低就會給met-ala-phe的百分比作出好的估計。根據(jù)后表2所列的N-端序列分析的結(jié)果表明，當N-端蛋氨酸之后是苯丙氨酸就見不到蛋氨酸加工的證據(jù)。然而有80%或更多的從MBs(A.L)及MBs(A.V)基因結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的分子在其N-端具有丙氨酸而不是蛋氨酸。從不同發(fā)酵生產(chǎn)里得到的細胞其N-端蛋氨酸的加工過程是各不相同的，但至少有80%生長激素分子經(jīng)常發(fā)生的。此外，在轉(zhuǎn)化微生物里生產(chǎn)生長激素的生產(chǎn)水平接近細菌蛋白質(zhì)總量10-15%。

表2met-bGH(L),bGH(A、L),bGH(A.V)及pGH(A)蛋白質(zhì)N-端順序分析%N-端蛋氨酸樣品 間接法 直接法met-bGH(L) 92.0 100.0bGH(A、L) 20.3218.42210.8 <6.0bGH(A、V) 7.52<3.0216.7 9.0pGH(A) 16.7 17.0met-bGH(V) 沒有做 100.01、具N-端蛋氨酸蛋白質(zhì)的含量是按樣品中生長激素總量的%列出2、兩個數(shù)字代表從2個單獨的發(fā)酵中純化而得蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)。
補充實施例 CPCH946356D實施例6制備一種pH約為6的制劑，該制劑含有30%用實施例3b方法生產(chǎn)的pGH(A)、3%組氨酸鹽酸鹽、33.5%甘油和33.5%水。用200μ1的14天Alzet 滲透分配器將該制劑施用于總數(shù)為8頭的一組雜交繁育的閹豬，用量達到每天3.6mg pGH(A)。將裝滿制劑的分配器皮下植入耳后，14天后再植入第二個分配器。給類似的一組豬每天注射3.6mg配制在pH9.5的25mM碳酸氫鈉中的pGH(A)。記錄每頭豬的平均日增重(ADG)和平均日飼料消耗量(FC)，并計算每頭豬的飼料效率(FE)。飼料效率以FC/ADG表示，所以飼料效率越低越好。28天處理期間處理豬的平均結(jié)果，與未施用激素的陰性對照組豬的結(jié)果一起示于表4。
表4陰性對照每日注射pGH(A)(無pGH) pGH(A) 甘油制劑處理第1－14天ADG(kg／天).64.67.60FC(kg/天)2.671.921.85FE4.223.023.27第15－28天ADG(kg/天).74.66.58FC(kg/天)2.661.761.68FE3.642.713.49第1－28天ADG(kg/天).69.66.60FC(kg/天)2.661.841.75FE3.892.843.17
在第15天和第29天觀察到飼料效率得到改善，胰島素樣生長因子1水平得到提高。這證實了每日注射pGH(A)和給予緩釋pGH(A)制劑都能顯著改善飼料效率。
實施例7將雜交繁育的閹豬分成8組，其中7組用pGH(A)處理。所用的制劑在水中含有下列數(shù)量的pGH(A)和1M磷酸二氫鈉3.0% pGH(A)和3.5%磷酸鹽溶液；4.5% pGH(A)和5.3%磷酸鹽溶液；6.0% pGH(A)和7.0%磷酸鹽溶液；15% pGH(A)和17.5%磷酸鹽溶液；30% pGH(A)和35%磷酸鹽溶液。每種制劑的其余部分是甘油。分配器釋放出足量的制劑達到指定的日劑量。設(shè)一組不作pGH處理的陰性對照豬。另一組類似的豬每日注射2mg溶解于pH9.5的碳酸氫鈉緩沖液中的pGH(A)。對于甘油/磷酸鹽制劑處理組，處理1以推進型(push-type)植入物形式施用，處理2-6用持續(xù)時間為4周的2ml Alzet滲透分配器施用。處理5和6在第5周開始時用2周的Alzet滲透分配器再次植入，同時計算pGH(A)制劑的量以維持指定的日劑量。pGH(A)負荷量和所達到的日劑量如下所示處理編號 處理內(nèi)容1 1.3-1.4mg/天；推進型分配器；30%負荷2 2mg/天；Alzet分配器；3.0%負荷3 3mg/天；Alzet分配器；4.5%負荷4 4mg/天；Alzet分配器；6.0%負荷5 10mg/天；Alzet分配器；15.0%負荷6 20mg/天；Alzet分配器；30.0%負荷處理1持續(xù)6周，處理2-4持續(xù)5周，處理5和6持續(xù)6周。這些處理的ADG、FC和FE示于表5，并與每日注射pGH(A)的處理及陰性對照作了比較。
表5處理編號陰性對照每日注射123456第1周ADG 1.10 1.27 1.15 1.17 1.22 1.15 .51 .74FC 3.11 2.83 2.88 2.84 2.91 2.64 1.45 1.76FE 3.07 2.28 2.60 2.44 2.56 2.35 2.77 2.44第2周ADG .81 1.07 .80 .98 1.13 .88 .76 .84FC 3.49 3.06 3.25 3.12 3.04 2.61 1.69 2.13FE 4.01 2.95 4.10 3.48 2.91 3.02 2.30 2.56第3周ADG 1.02 .97 .97 1.01 .93 .89 1.01 .85FC 2.99 2.63 3.05 3.49 3.00 2.59 1.88 2.19FE 3.00 2.78 3.21 3.54 3.48 3.01 1.89 2.95第4周ADG .78 .82 .75 .75 .84 1.02 .80 .81FC 3.74 3.07 3.40 3.93 3.43 3.08 2.17 2.57FE 4.82 4.64 5.48 6.32 4.25 3.22 2.69 2.96第5周ADG .85 .94 .81 .72 .97 .90 .67 .64FC 3.49 2.94 3.33 3.44 3.48 3.10 1.74 1.63FE 4.06 3.23 .613 12.85 3.59 3.59 2.64 2.43第6周ADG .55 .91 .83 -- -- -- .61 .48FC 3.54 3.21 3.61 -- -- -- 1.98 1.70FE 7.84 3.73 4.81 -- -- -- 3.94 2.36第1－4周ADG .93 1.03 .92 .98 1.03 .98 .81 .82FC 3.33 2.90 3.14 3.35 3.09 2.73 1.85 2.19FE 3.62 2.84 3.47 3.46 3.00 2.78 2.33 2.68第1－6周ADG .85 1.00 .89 -- -- -- .75 .77FC 3.39 2.96 3.76 -- -- -- 1.85 1.96FE 4.04 2.97 3.71 -- -- -- 2.49 2.59
處理1、5和6表明，在整整6周的處理時間內(nèi)，活性pGH(A)都能有效釋放。處理3和4表明在5周的處理過程中有效釋放活性pGH(A)。處理2接近可觀察到效果的閾值。
實施例8以9頭肥育豬為一組分為6組進行研究，比較用推進型滲透分配器以不同的用量施用來自不同制劑的pGH(A)的效果，以及用碳酸氫鹽緩沖液每日注射pGH(A)的效果。分配器以一定的用量施用含30%pGH(A)的制劑，使日劑量為2mg/天。一種制劑是30%pGH(A)、35%甘油和35% 1M磷酸二氫鈉水溶液。另一種制劑含15% pGH(A)。有兩種制劑的配制與含30%pGH(A)的制劑相似，但含有0.07%和0.70%吐溫80潤濕劑。第5種制劑在磷酸鹽/甘油賦形劑中含有40%pGH(A)、0.6%吐溫80。如前面所指出的那樣植入一個或2個分配器，以達到指定的日劑量。這些處理是處理編號處理內(nèi)容12mg／天磷酸鹽甘油；1個分配器(30％負荷)23mg／天磷酸鹽甘油；1個分配器(30％負荷)和1個分配器(15％負荷)34mg／天磷酸鹽甘油；2個分配器(均為30％)4同1，但含0.07%吐溫805同1，但含0.07%吐溫8062.8mg／天磷酸鹽甘油＋0.6%吐溫80；1個分配器(40％負荷)該研究持續(xù)6周時間(處理2除外，該處理在3周后終止)。ADG、FC和FE的結(jié)果示于下表6，并與不施用pGH(A)的陰性對照組和每日注射2mg溶解于pH9.5碳酸氫鹽緩沖液中的pGH(A)的實驗組進行比較。
表6處理編號陰性對照每日注射123456第1周ADG .76 1.18 1.07 .99 1.03 1.03 1.14 1.14FC 3.14 3.04 2.42 2.38 2.25 2.78 2.62 2.85FE 4.18 2.63 2.30 2.43 2.22 2.71 2.36 2.54第2周ADG .89 .93 .77 .89 .76 .78 .80 .76FC 3.32 2.75 2.38 2.44 2.24 2.59 2.60 2.63FE 3.87 3.03 3.18 2.98 3.21 4.16 3.36 3.63第3周ADG .84 .94 .92 .78 .73 .89 .93 .84FC 3.59 3.10 2.98 2.81 2.45 3.08 3.10 2.90FE 4.59 3.34 3.22 3.94 4.52 3.76 3.50 3.53第4周ADG .74 .85 .65 -- .84 .71 .63 .84FC 3.50 3.21 3.15 -- 2.84 3.16 3.15 2.96FE 5.05 3.84 5.17 -- 3.91 4.56 5.02 3.64第5周ADG .84 .94 .81 -- 1.05 .68 1.01 .90FC 3.61 3.41 3.30 -- 3.69 3.44 3.52 3.51FE 4.44 3.69 4.16 -- 3.55 4.44 3.57 4.05第6周ADG .84 .95 .85 -- 1.04 1.01 .87 .95FC 3.70 3.27 3.47 -- 4.05 3.70 3.60 3.75FE 4.57 3.76 4.05 -- 3.89 3.82 4.23 4.13第1－6周ADG .82 .95 .85 -- .92 .84 .89 .90FC 3.49 3.13 2.96 -- 2.99 3.08 3.11 3.11FE 4.25 3.30 3.50 -- 3.24 3.68 3.51 3.47實施例9基本上如實施例3b所述，通過重組DNA的表達來制備pGH(A)(在實施例9-19中稱為“APS”)。通過破碎細胞而后離心，分離出APS折射體。然后在脲和三羥甲基氨基甲烷(TRIS)緩沖劑的溶液中使折射體溶解、折疊和氧化。使APS緩沖液通過裝有DE-52離子交換樹脂的色譜柱。用碳酸氫鈉緩沖液對APS緩沖液進行透析，所得的碳酸氫鹽緩沖液進行無菌過濾并冰凍干燥。該物質(zhì)在下面的實施例中稱為“APS”散裝粉末”。將5.4g該APS溶解于250ml去離子水中，并在4℃下用16倍體積的水透析24小時，其間更換4次水。用350微摩爾的100硫酸銅溶液使透析后的APS在pH6-8下沉淀。用離心法分離出由于加入硫酸銅而形成的沉淀物，并冰凍干燥。所得產(chǎn)物的銅含量為0.43%。
實施例10由如實施例9生產(chǎn)的APS散裝粉末和銅結(jié)合的APS制備壓實制品。制備銅結(jié)合APS時所用的銅與APS的摩爾比在1.2-1.4∶1范圍內(nèi)。將數(shù)量足以達到60mg或90mg劑量的APS裝入直徑為2.4mm或3.2mm的壓片模具中，在Carver C-12型12噸壓片機中壓制，該壓片機帶有面積為21.25cm2(3.294英寸2)的液力壓頭，所施加的負荷為4448牛頓(1000磅)。除指明者外，用1%棕櫚酸鈉(NaP)或5%硬脂酸鎂(MgS)作潤滑劑。將壓實制品腸道外植入商品型雜交繁育的肥育豬體內(nèi)。平均日增重(ADG，kg/天)和飼料效率(FE，定義為飼料日攝取量除以ADG，F(xiàn)E越低越好)，以及植入后的豬與未施用生長激素的陰性對照豬相比較改善的百分比，均進行了測定。這些結(jié)果及每日注射2mg溶液態(tài)APS的陽性對照組豬的結(jié)果概括于表7。試驗期的第一階段為14天，接著是7天的間歇期，接著是14天的第二階段。
表7第一階段類型Cu Cu APS APS直徑3mm 3mm 3mm 3mm劑量60mg 60mg 2×30mg 6×10mg-對照＋對照潤滑劑Nap Nap Nap Nap1(未處理)(2mg/天)部位耳脂肪耳耳ADG(kg) .98 1.11 1.03 1.03 .95 .87FE(飼料／ 4.10 3.24 3.43 3.61 3.73 4.29增重)FE改善％-- -- 16.3% 12.0% 9.0% --第二階段類型 Cu Cu Cu Cu Cu直徑 3mm 3mm 2mm 3mm 3mm劑量 60mg 60mg 60mg 60mg 90mg-對照＋對照潤滑劑Nap Nap Nap2 MgS Nap(未處理) (2mg/天) 部位 耳 脂肪 耳 耳 耳ADG(kg) .90 1.02 1.07 1.05 1.02 1.08 1.12FE(飼料／ 4.81 3.78 3.63 3.74 3.61 3.34 3.19增重)FE改善％ -- -- 24.5% 22.2% 25.0% 30.6% 33.7%1 10%棕櫚酸鈉2 2％棕櫚酸鈉本發(fā)明的植入制品比每日注射要好，與經(jīng)處理的豬相比使增重和飼料效率大大改善。10%含量的棕櫚酸鈉使生長激素的釋放受到不利影響，因此10%棕櫚酸鈉高于潤滑劑的有效量。
實施例11由微生物表達的APS散裝粉末制備壓實制品，所述粉末已如實施例3b所述進行了分離純化。所用的壓實方法大致是實施例10的方法，所不同的是施加17，790牛頓(4000磅)的力制備直徑為6.4mm的60mg制品。在該項研究的第一天，將這些制品用外科手術(shù)方法植入頸背部的脂肪內(nèi)。分別用30mg和60mg生長激素，以4448牛頓(1000磅)制備另一組直徑為3.2mm的制品。用植入槍(implant gun)將這些制品植入頸背部的脂肪內(nèi)。該第二組3.2mm制品在該項研究的第15天植入。所用的豬是商品型雜交繁育的肥育豬，其中有10頭豬施用30mg制品，10頭豬施用60mg制品，10頭豬為進行與受處理豬類似的假手術(shù)操作的對照豬。測定這三組豬的ADG、FE和FE改善百分比，結(jié)果示于表8。
表8對照30mg60mg第1周ADG(kg).87.941.02FE(飼料／增重)3.842.782.53第2周ADG(kg).82.77.67FE(飼料／增重)4.274.624.58第1－2周ADG(kg).85.85.84FE(飼料／增重)3.943.493.30FE改善％--11.4%16.2%第3周ADG(kg).841.151.00FE(飼料／增重)4.412.973.17第4周ADG(kg).95.71.62FE(飼料／增重)3.956.706.31第3－4周ADG(kg).89.93.81FE(飼料／增重)4.013.754.29FE改善％--6.5%--第1－4周ADG(kg).87.89.81FE(飼料／增重)3.913.603.66FE改善％--7.9%6.4%這些數(shù)據(jù)證實，這些壓實制品有一個約1周的有效緩釋期。在每個植入循環(huán)的第二周，受處理的豬顯示出預期的飼料效率下降，這通常是給豬停用生長激素時所觀察到的現(xiàn)象。即使有飼料效率下降的時期，在4周的研究過程中兩種處理方案也使飼料效率提高7.9%和6.4%。
實施例12由如實施例9所制備的APS散裝粉末和銅結(jié)合APS制備壓實制品。制備銅結(jié)合APS時所用的銅與APS摩爾比約為2∶1。所用的壓實方法大致是實施例10所述的方法，所不同的是用5%硬脂酸鎂作潤滑劑。將數(shù)量足以達到60mg和90mg劑量的APS裝入2.4mm或3.2mm模具中，施加4448牛頓(1000磅)的負荷進行壓制。以10頭商品型雜交繁育的肥育豬為一組，以14天和21天的間隔將上述制品植入各組豬頸背部的脂肪內(nèi)。該研究持續(xù)42天。在這42天期間測定ADG、FE和飼料效率相對于陰性對照的改善百分比。結(jié)果示于表9，并與未施用生長激素的陰性對照和每日注射2mg溶液態(tài)APS的陽性對照作了比較。數(shù)據(jù)顯示有一個約1周的有效緩釋期，該緩釋期過后出現(xiàn)預期的飼料效率下降。在整整6周的研究過程中，所有的植入方案都顯示飼料效率比陰性對照有改善，而且大多數(shù)植入方案都顯示出與每日注射的陽性對照大致相等的飼料效率。
表9APS Cu APS劑量: 90mg 60mg 90mg 60mg 90mg 60mg-對照 +對照 間隔: 3周 2周 2周 2周 3周 2周(未處理) (2mg/天) 直徑: 3mm 3mm 3mm 2mm 3mm 3mm第1周ADG(kg/天) .99 1.33 1.03 1.05 1.17 1.14 1.12 1.16FE(飼料/增重) 3.40 2.73 2.99 2.81 2.69 2.71 2.21 2.34第2周ADG(kg/天) .98 .99 .78 .80 .75 .70 .62 .65FE(飼料/增重) 3.84 3.72 4.57 4.46 4.50 5.25 5.21 4.96第3周ADG(kg/天) .99 1.13 .82 1.01 1.16 1.19 .92 1.26FE(飼料/增重) 3.83 3.16 4.00 2.84 2.76 3.05 3.90 2.58第4周ADG(kg/天) .84 1.01 1.28 .95 .70 .82 1.23 .71FE(飼料/增重) 4.62 3.74 3.20 4.16 5.27 4.72 2.60 5.21第5周ADG(kg/天) .79 1.03 .97 .93 1.04 1.05 .69 1.17FE(飼料/增重) 4.34 3.78 3.94 3.70 3.39 3.64 6.08 3.16第6周ADG(kg/天) 1.00 1.19 .78 .99 1.06 1.03 .87 .82FE(飼料/增重) 3.88 3.43 5.87 3.75 3.83 3.84 4.75 4.84第1-6周ADG(kg/天) .93 1.11 .95 .96 .98 .99 .91 .96FE 3.98 3.34 3.82 3.43 3.45 3.58 3.54 3.45FE改善% -- -- 4.0% 13.8% 13.3% 10.1% 11.1% 13.3%實施例13如實施例9所述，由APS散裝粉末和銅結(jié)合APS(銅與APS摩爾比為2∶1)制備含5%硬脂酸鎂潤滑劑的壓實制品，但與實施例9有如下不同。所制備的壓實制品的大小為60mg和30mg，施加4448牛頓(1000磅)壓制成3.2mm直徑，施加8895牛頓(2000磅)壓制成4mm直徑。4mm直徑制品的高度與直徑大致相等，這樣使圓柱體的表面積最小。將一組60mg、3.2mm的制品和一組30mg、3.2mm的制品裝入拉伸的2mm硅橡膠管內(nèi)，管的兩端無包衣。每隔6周在商品型雜交繁育豬頸背部的脂肪內(nèi)植入60mg的劑量。5周期間的結(jié)果示于表10，并與未施用生長激素的對照豬作了比較。施用帶硅橡膠管的植入物的兩組豬的結(jié)果，證實了可以通過控制釋放表面的大小來控制效果。施用2個30mg制品的豬與施用1個60mg制品的豬相比，效果有改善。30mg制品的植入物由于有開放的端部，其釋放表面是60mg制品的兩倍，使效果有所改善。
表10類型: APS APS Cu Cu*Cu*劑量: 60mg 60mg 60mg 60mg 2-30mg對照 直徑: 3mm 4mm 4mm 3mm 3mm第1周ADG(kg/天) .84 1.03 0.94 .82 .93 0.83FE(飼料/增重) 4.23 2.53 3.14 3.58 3.33 3.53第2周ADG(kg/天) .95 .63 .69 .73 .65 .64FE(飼料/增重) 3.69 4.44 4.64 4.08 4.92 9.79第3周ADG(kg/天) 1.02 1.05 .76 .92 .81 .75FE(飼料/增重) 3.66 3.50 4.09 3.44 4.19 3.97第4周(給豬再次植入)ADG(kg/天) .72 .87 .89 .74 .74 .84FE(飼料/增重) 5.35 3.92 3.84 4.42 4.29 3.90第5周ADG(kg/天) .83 .82 .78 .99 .78 .99FE(飼料/增重) 5.58 4.15 3.89 3.15 4.16 3.30第1-5周ADG(kg/天) .87 .88 .81 .84 .78 .81FE(飼料/增重) 3.90 3.53 3.65 3.55 3.98 3.65FE改善% -- 9.5% 6.4% 9.0% -- 6.4%*在硅橡膠管內(nèi)實施例14用以下方法制備銅結(jié)合APS將如實施例9制備的APS散裝粉末以60mg/ml溶于去離子水中。加入足量的100mM CuSO溶液，達到所需的Cu∶APS摩爾比。加入硫酸將pH調(diào)至7，沉淀出生長激素。分離出沉淀物并冰凍干燥。由這些具有指定Cu∶APS摩爾比的銅結(jié)合生長激素制備壓實制品。所用的壓實方法大致是實施例10所述的方法，所不同的是直徑為3.2mm，加入5%硬脂酸鎂作潤滑劑，所施加的負荷為4448牛頓(1000磅)，并按所指出的那樣使用60mg和30mg生長激素。以10頭豬為一組，每隔14天在頸背部的脂肪內(nèi)植入上述制品。在6周的研究期間對豬進行監(jiān)測，結(jié)果示于表11，并與未施用生長激素的陰性對照和每日注射溶液態(tài)APS的陽性對照作了比較。每個處理的有效持續(xù)時間各不相同，但銅比例較低的處理比銅比例較高的處理的有效持續(xù)時間長。
表11-對照 +對照 劑量: 60mg 60mg 2×30mg 2×30mg 2×30mg(未處理) (2mg/天) Cu:APS: 1:1 2:1 1:1 2:1 1.5:1第1周ADG(kg/天) 1.00 1.05 1.05 1.01 .99 .89 .92FE(飼料/增重) 2.83 2.73 2.57 3.08 2.97 2.90 2.95第2周ADG(kg/天) .79 .98 .86 .69 .81 .87 .92FE(飼料/增重) 4.24 2.97 3.73 4.64 3.72 3.33 3.19第3周ADG(kg/天) .95 1.02 1.05 1.21 .91 1.00 1.07FE(飼料/增重) 3.36 2.76 2.35 2.41 2.87 2.84 2.66第4周ADG(kg/天) .99 1.13 .64 .70 .93 1.01 .81FE(飼料/增重) 3.28 2.75 4.69 6.71 3.32 3.24 3.90第5周ADG(kg/天) .81 .97 1.13 1.11 1.05 .99 1.00FE(飼料/增重) 3.90 3.15 2.40 2.95 2.58 3.16 2.94第6周ADG(kg/天) .75 .68 .69 .69 .29 .63 .38FE(飼料/增重) 4.23 4.16 5.86 5.03 7.05 5.69 4.72第1-6周ADG(kg/天) .88 .97 .91 .90 .83 .90 .85FE 3.43 2.85 2.88 3.31 3.17 3.23 3.38FE改善% -- -- 16.0% 3.5% 7.6% 5.8% 1.5%實施例15由如實施例9制備的APS散裝粉末制備壓實制品，該粉末已與足量的CuSO4干混而使Cu與APS達到指定的摩爾比。由具有指定的Cu與APS摩爾比的沉淀的銅結(jié)合APS制備壓實制品。壓實方法大致上如實施例10所述，所不同的是加入5%硬脂酸鎂作潤滑劑，所施加的負荷按所指出的那樣或者是1000牛頓(225磅)，或者是2224牛頓(500磅)。以10頭商品型雜交繁育豬為一組，按所指明的那樣每隔1周或2周在頸背部的脂肪內(nèi)植入上述制品。該項研究的結(jié)果在下面的表12給出。
表12處理*: 1 2 3 4 5 6 7第1周ADG(kg/天) .93 1.24 1.00 1.24 1.13 1.19 1.19FE(飼料/增重) 3.05 2.31 2.71 2.42 2.44 2.34 2.34第2周ADG(kg/天) .89 1.11 .88 1.05 .91 .95 .84FE(飼料/增重) 4.19 2.76 3.28 3.17 3.60 3.17 3.62第3周ADG(kg/天) .93 1.13 .97 1.09 1.14 1.20 1.04FE(飼料/增重) 3.99 2.96 3.32 3.19 3.06 2.70 3.36第4周ADG(kg/天) 1.00 1.21 1.09 1.11 1.08 1.02 .94FE(飼料/增重) 3.31 2.83 3.08 3.40 3.27 3.62 3.83第5周ADG(kg/天) 1.02 1.18 1.12 1.21 1.02 1.08 1.30FE(飼料/增重) 3.54 3.11 3.08 3.08 3.37 3.12 2.68第6周ADG(kg/天) .69 .98 .75 1.01 .73 1.01 .63FE(飼料/增重) 5.29 4.89 4.47 4.18 6.00 4.43 7.06第1-6周ADG(kg/天) .91 1.14 .97 1.12 1.00 1.08 .99FE(飼料/增重) 3.63 2.93 3.23 3.15 3.35 3.07 3.32FE改善% -- -- 11.0% 13.2% 7.7% 15.4% 8.5%
*處理1陰性對照，未施用生長激素處理2陽性對照，每天施用2mg溶液態(tài)APS處理3每周施用21mg APS，無Cu，2.4mm直徑，1000牛頓(225磅)處理4每周施用21mg APS，干混物，Cu∶APS比例2∶1，2.4mm直徑，1000牛頓(225磅)處理5每兩周施用42mg APS，干混物，Cu∶APS比例4∶1，3.2mm直徑，2224牛頓(500磅)處理6每兩周施用60mg APS，沉淀物，Cu∶APS比例1∶1，3.2mm直徑，2224牛頓(500磅)處理7每兩周施用42mg APS，沉淀物，Cu∶APS比例1∶1，3mm直徑，2224牛頓(500磅)實施例16由如實施例9制備的Cu∶APS的摩爾比為1∶1的銅結(jié)合APS沉淀制備壓實制品，并由摩爾比為4∶1的CuSO和APS散裝粉末的干混物制備壓實制品。所用的壓實方法大至是實施例10的方法，所不同的是壓實制品含14mg和21mg生長激素，直徑為2.4mm，含有5%硬脂酸鎂潤滑劑，施加1000牛頓(225磅)的負荷進行壓制。以10頭商品型雜交繁育豬為一組，每周在各組豬頸背部的脂肪內(nèi)植入上述制品。結(jié)果示于表13，并與未施用生長激素的陰性對照和每天施用2mg溶液態(tài)APS的陽性對照作了比較。
表13類型: 沉淀物 干混物 干混物-對照 +對照 Cu:APS比例: 1:1 4:1 4:1(未處理) (2mg/天) 劑量: 14mg 21mg 14mg第1周ADG(kg/天) 1.23 1.15 1.03 1.06 1.21FE(飼料/增重) 2.44 2.32 2.74 2.49 2.32第2周ADG(kg/天) 1.08 1.00 .91 .83 .93FE(飼料/增重) 3.30 3.16 3.15 3.52 3.44第3周ADG(kg/天) 1.02 1.05 .96 1.01 1.00FE(飼料/增重) 3.47 2.64 3.11 2.54 3.22第4周ADG(kg/天) 1.05 .99 .84 .79 .82FE(飼料/增重) 3.62 3.15 4.02 3.89 4.34第5周ADG(kg/天) .78 .86 .99 .75 .84FE(飼料/增重) 5.22 3.49 3.62 4.10 4.01第6周ADG(kg/天) .78 1.27 .88 .99 1.02FE(飼料/增重) 6.45 3.32 4.25 4.95 3.95第1-6周ADG(kg/天) .99 1.05 .93 .90 .97FE(飼料/增重) 3.56 2.73 3.30 3.17 3.28FE改善% -- -- 7.3% 11.0% 7.9%
實施例17由APS散裝粉末和CuSO4的干混物(Cu∶APS摩爾比為2∶1)制備壓實制品，并由通過使Cu∶APS摩爾比為1∶1的APS/CuSO4溶液冰凍干燥而制得的銅結(jié)合APS制備壓實制品。壓實方法大致是實施例10的方法，所不同的是直徑為2.4mm，加5%硬脂酸鎂作潤滑劑，所施加的負荷為1000牛頓(225磅)，每劑量使用21mg生長激素。以10頭商品型雜交繁育的豬為一組，在各組豬頸背部的脂肪內(nèi)每周進行一次植入，共進行4周。結(jié)果示于表14，并與未施用生長激素的陰性對照組豬和每天施用2mg溶液態(tài)APS的陽性對照組豬作了比較。摩爾比為1∶1的銅結(jié)合APS的冰凍干燥溶液，與摩爾比為2∶1的干混物的效果基本相等。
表14-對照＋對照冰凍干燥溶液干混物(未處理)(2mg/天)第1周ADG(kg/天)1.041.32.911.26FE(飼料／增重)2.881.992.792.10第2周ADG(kg/天).791.04.90.79FE(飼料／增重)4.092.843.223.59第3周ADG(kg/天)1.091.26.99.96FE(飼料／增重)3.182.473.163.26第4周ADG(kg/天).76.59.86.77FE(飼料／增重)4.863.503.733.84第1－4周ADG(kg／天).921.05.91.94FE(飼料／增重)3.432.773.053.05FE改善％----11.1%11.1%
實施例18用CuSO4和APS散裝粉末的干混物，以指定的摩爾比和劑量制備壓實制品。壓實方法大致是實施例10的方法，所不同的是加5%硬脂酸鎂作潤滑劑，使用2.4mm模具，所施加的力為1000牛頓(225磅)。以10頭商品型雜交繁育豬為一組，每周在各組豬頸背部的剛好耳后處植入上述壓實制品，共植入6周。該項研究的結(jié)果示于下面的表15，并與未施用生長激素的陰性對照組和每天施用2mg溶液態(tài)APS的陽性對照組作了比較。
表15-對照 +對照 比例: 1:1 2:1 3:1 2:1 2:1 2:1(未處理) (2mg/天) 劑量: 21mg 21mg 21mg 17mg 25mg 21mg第1周ADG(kg/天) .93 1.03 1.02 1.08 1.01 .98 1.09 1.14FE(飼料/增重) 3.79 3.58 3.29 3.11 3.51 3.30 3.68 3.23第2周ADG(kg/天) 1.00 1.20 .98 1.09 1.10 .92 1.13 1.06FE(飼料/增重) 3.88 3.25 3.49 3.30 3.19 3.82 3.11 3.46第3周ADG(kg/天) .81 .94 .94 .79 .93 .92 .97 1.01FE(飼料/增重) 4.71 3.97 3.54 4.02 3.75 3.76 3.63 3.72第4周ADG(kg/天) .86 1.01 .95 .90 1.01 .97 .93 .89FE(飼料/增重) 4.56 3.72 3.73 3.96 3.43 3.82 3.87 7.06第5周ADG(kg/天) .79 1.02 1.05 1.05 .94 .84 .92 1.00FE(飼料/增重) 5.11 3.56 3.61 3.75 3.98 4.63 4.23 4.16第6周ADG(kg/天) .87 1.06 .99 1.03 1.17 .97 1.23 1.09FE(飼料/增重) 4.55 3.73 3.94 3.56 3.51 3.95 3.46 3.73第1-6周ADG(kg/天) .88 1.04 .99 .99 1.03 .93 1.05 1.03FE(飼料/增重) 4.29 3.56 3.52 3.45 3.46 3.76 3.53 3.71FE改善% -- -- 17.9% 19.6% 19.3% 12.4% 17.7% 13.5%實施例19由CuSO4與APS散裝粉末的干混物，以2∶1的Cu∶APS摩爾比制備壓實制品。壓實方法大至是實施例10的方法，所不同的是如所指出的那樣加5%硬脂酸鎂或1%硬脂酸鎂作潤滑劑，所施加的負荷為1000牛頓(225磅)，直徑為2.4mm。以10頭商品型雜交繁育豬為一組，在各組豬頸部剛好耳后處進行植入，每周植入21mg，共植入6周。結(jié)果示于表16，并與未施用生長激素的陰性對照組豬和每天施用2mg溶液態(tài)APS的陽性對照組豬作了比較。在6周的研究期間，1%硬脂酸鎂和5%硬脂酸鎂有相似的效果。
表16-對照 +對照 5%硬脂酸鎂 1%硬脂酸鎂(未處理) (2mg/天)第1周ADG(kg/天) 1.19 1.41 1.26 1.20FE(飼料/增重) 2.48 2.10 2.31 2.36第2周ADG(kg/天) .92 .97 .86 .92FE(飼料/增重) 3.87 3.27 3.91 4.61第3周ADG(kg/天) .92 1.03 .99 .99FE(飼料/增重) 4.28 2.93 3.23 6.02第4周ADG(kg/天) .72 1.13 .85 .96FE(飼料/增重) 3.96 3.07 3.88 3.51第5周ADG(kg/天) .81 1.05 1.03 .80FE(飼料/增重) 5.05 3.52 3.46 4.31第6周ADG(kg/天) .83 .96 .86 1.03FE(飼料/增重) 4.52 3.83 4.28 3.66第1-6周ADG(kg/天) .90 1.09 .97 .94FE(飼料/增重) 3.80 2.99 3.27 3.28FE改善% -- -- 13.9% 13.9%
權(quán)利要求
1.一種組合物，該組合物含有基本上不含豬源蛋白pGH(A)。
2.一種促進豬的成年前生長的方法，該方法包括給豬施用pGH(A)。
3.一種提高豬的飼料轉(zhuǎn)化效率的方法，該方法包括給豬施用pGH(A)。
全文摘要
本發(fā)明提供含有pGH(A)的組合物，以及通過施用pGH(A)來促進豬的成年前生長和提高飼料轉(zhuǎn)化效率的方法。
文檔編號C12NGK1100272SQ9410566
公開日1995年3月22日 申請日期1994年5月10日 優(yōu)先權(quán)日1985年2月22日
發(fā)明者格溫·格拉博斯基·克里瓦 申請人:孟山都公司