專利名稱：利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)重組多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)重組多肽及產(chǎn)生具有預(yù)期特性的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動(dòng)物的方法。
已經(jīng)有大量關(guān)于異源基因在低等生物如單細(xì)胞細(xì)菌、酵母菌、絲狀真菌以及諸如哺乳動(dòng)物細(xì)胞等高等細(xì)胞中表達(dá)的文獻(xiàn)。另外亦有許多轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的報(bào)導(dǎo)，其中絕大多數(shù)是有關(guān)轉(zhuǎn)基因鼠的報(bào)告。某些實(shí)驗(yàn)已獲得轉(zhuǎn)基因豬(Miller，K.F.，etal，(1989)，J.Endocrin，，120，481-488，Vize，P.D.，etal.(1988)，J.Cell Sci.，90，295-300，Ebert，k，etal，(1988)，Mol.Endocrin.，2，277-283)，轉(zhuǎn)基因羊(Nancarrow，etal，(1987)Therigenology，27，263；Clark，A，J.，etal.(1989)Bio/Technology7，487-482；Simang，J.，Etal.(1988)，Bio/Technology6，179-183)，轉(zhuǎn)基因兔(Hanorer，S.V.，etal，(1987)DeutcheTierarztliche Wochenschrift，94，476-478)，但是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因母牛方面沒有獲得任何成功。到目前為止還沒有見到用轉(zhuǎn)基因母牛生產(chǎn)重組多肽的論文。
許多實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了編碼不同蛋白質(zhì)的DNA在乳腺中的組織特異性表達(dá)和利用轉(zhuǎn)基因鼠，羊的乳汁生產(chǎn)各種蛋白質(zhì)。例如，Simmons，J.P.(1987，Nature，328，530-532)報(bào)導(dǎo)將編碼β-乳球蛋白(BNG)的16.2KP基因片段(包括4Kb5’序列，4.9KbBLG轉(zhuǎn)錄單位和7.3Kb3’一旁側(cè)序列顯微注射至小數(shù)鼠受精卵內(nèi)，并在乳腺中表達(dá)了羊β-乳球蛋白(BLG)，轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中BLG的濃度約在3.0-23mg ml范圍內(nèi)。當(dāng)將編碼人因子IX或人a-1抗胰蛋白酶的cDNA插入基因的5’-非翻譯區(qū)并顯微注射至羊受精卵內(nèi)(Sirmmons，J.P.，etal.(1988)Bio/Technology6，179-183)，人因子IX或a-1抗胰蛋白酶的產(chǎn)量顯著降低(因子IX25ng/ml，a-1抗胰蛋白酶10mg /ml；參見Calrd，A.J.，etal.(1989)Bio/Technorloy，487-492)。
類似的報(bào)道還有將包括完整的7.6kp大鼠a-酪蛋白基因和3.5kb-5’，3.0kb-3’旁側(cè)基因的14kb的基因組克隆顯微注射至小鼠受精卵內(nèi)(Lee，etal，(1988)Nucl，AcidsRes，1610271041)。將含有編碼人-tpA的基因及其同源的分泌序列的cDNA在2.6kb5’-鼠乳清基因啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)時(shí)，人血纖維蛋白溶酶原激活劑(t-pA)在小鼠乳汁中的表達(dá)產(chǎn)量在0.2-0.4μg/ml(Gordon，K.，et al.(1987)Bio/Technology5，1183-1187，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究表明不同的轉(zhuǎn)基因乳汁中的tPA產(chǎn)量在20ng/ml至50μg/ml范圍內(nèi)(Pittius，C.W，et al，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85.5874-5878)。
通過對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的回顧，顯然需要更有效地產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物(特別是非鼠類哺乳動(dòng)物)的方法，特別是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因牛的新種類的方法，該法所得的轉(zhuǎn)基因牛應(yīng)能在其乳汁中產(chǎn)生如人乳蛋白，人血清蛋白等重組多肽。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供檢測(cè)附植前的胚胎的基因整合的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因牛的種類，其能夠生產(chǎn)重組多肽(包括分泌型和非分泌型)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是產(chǎn)生能在乳汁中產(chǎn)生人乳蛋白、人血清蛋白等重組多肽的轉(zhuǎn)基因牛的種群。
本發(fā)明的另一個(gè)目的的提供補(bǔ)充有來源于轉(zhuǎn)基因牛奶中的重組多肽的食品配方，例如補(bǔ)充了人乳鐵蛋白的嬰兒食品配方。
本發(fā)明的更進(jìn)一步的目的是提供能夠控制在轉(zhuǎn)基因牛奶中產(chǎn)生重組多肽的轉(zhuǎn)移基因。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明包括可在轉(zhuǎn)基因牛奶中生產(chǎn)重組多肽的轉(zhuǎn)移基因。含有一種或多種重組多肽的轉(zhuǎn)基因牛奶無需任何加工便可供人類消費(fèi)。轉(zhuǎn)移基因包括編碼分泌信號(hào)序列的分泌DNA序列和編碼重組多肽的重組DNA序列，這些DNA序列連接成分泌一重組DNA序列。如此構(gòu)建的轉(zhuǎn)移基因能夠控制分泌-重組DNA在轉(zhuǎn)移基因牛分泌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
另外，本發(fā)明包括產(chǎn)生上述轉(zhuǎn)移基因牛的種類的方法。該方法包括把上述轉(zhuǎn)移基因?qū)肱Ｅ咛?，把?dǎo)入基因后的牛胚胎移植入受體母牛內(nèi)，至少確證一頭能夠在乳汁中產(chǎn)生重組多肽的母牛后代。
更進(jìn)一步，本發(fā)明也包括產(chǎn)生具有預(yù)期表型的非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的方法。首先將編碼所需表型的轉(zhuǎn)移基因甲基化，然后將其導(dǎo)入哺乳動(dòng)物受精卵內(nèi)使之與受精卵基因組融合，將此受精卵培養(yǎng)成胚胎，從每個(gè)胚胎上至少取出一個(gè)細(xì)胞并分離基DNA，分離出的DNA用限制性內(nèi)切酶消化，那些融合了轉(zhuǎn)移基因的胚胎帶有不能被限制性內(nèi)切酶裂解的基因，消化產(chǎn)物經(jīng)PCR擴(kuò)增和標(biāo)記探針雜交后通過電泳可方便地檢測(cè)出成功的基因整合。
本發(fā)明也包括產(chǎn)生攜帶相同基因型的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物種群的方法。本方法是上述檢測(cè)早期基因整合方法的具體體現(xiàn)。在本方法中，甲基化的轉(zhuǎn)移基因被導(dǎo)入受精卵并培養(yǎng)成胚胎，將每個(gè)胚胎分成兩部分，一部分用上述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)移基因整合分析，待確定已進(jìn)行成功的基因整合后，將另一部分胚胎克隆形成轉(zhuǎn)基因胚泡并移植入受體母牛體內(nèi)，以產(chǎn)生具有相同基因型的轉(zhuǎn)基因牛種群。
本發(fā)明所指的非人類哺乳動(dòng)物包括所有能夠產(chǎn)生合適的表型的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的哺乳動(dòng)物，包括非人靈長(zhǎng)類、鼠、牛、犬等種類。更為可取的哺乳動(dòng)物是牛。
轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的合適表型包括(決非局限于)用雌性轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳汁產(chǎn)生重組多肽，還包括疾病模型的動(dòng)物、抗病能力強(qiáng)的動(dòng)物、以及在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物血、尿等體液中產(chǎn)生重組多肽。本發(fā)明的更具體的體現(xiàn)是用轉(zhuǎn)基因牛在其乳汁中產(chǎn)生重組人乳鐵蛋白，人血清蛋白和人C-蛋白。
這里所說的重組多肽是指異源或同源多肽。異源多肽指那些不能由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物正常產(chǎn)生的多肽如人乳蛋白(乳鐵蛋白、溶菌酶、分泌型免疫球蛋白、人乳白蛋白)；人血清蛋白(白蛋白、免疫球蛋白、因子VII、因子IX、C-蛋白)；工業(yè)用酶(蛋白酶，幾丁酶.脂酶)。重組DNA序列包括基因組基因和編碼重組多肽的cDNA序列。
同源多肽是指轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的內(nèi)源性多肽，如牛乳蛋白(aS1，aS2，β-，k-酪蛋白，β-乳球蛋白、乳鐵蛋白，溶菌酶，膽固醇水解酶)牛血清蛋白(血清白蛋白)牛蛋白類激素(生長(zhǎng)激素等)。編碼同源多肽的重組DNA轉(zhuǎn)入動(dòng)物后以隨機(jī)整合的方式與其基因組融合。
無論同源或異源多肽都由特殊的氨基酸或核甘酸序列表現(xiàn)其特性。這樣的序列包括自然產(chǎn)生的基因變異和重組方式產(chǎn)生的變異(通過替換、插入和/或刪除一個(gè)或多個(gè)核苷酸從而導(dǎo)致重組多肽中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、插入、或刪除)。
當(dāng)轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)生合適的表型(如產(chǎn)生重組多肽)是必需的，轉(zhuǎn)移基因應(yīng)包括和重組子或分泌-重組DNA連接的5’-和合適的3’-端表達(dá)調(diào)控序列。這些表達(dá)調(diào)控序列除了控制轉(zhuǎn)錄外，還對(duì)RNA的穩(wěn)定性起作用。
表達(dá)調(diào)控序列按照重組子或分泌-重組DNA在組織或細(xì)胞中的專一性表達(dá)來選擇。一旦選擇在某種組織或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物，5’-和隨意的3’表達(dá)調(diào)控序列便被確定。一般地，5’-表達(dá)調(diào)控基因序列包括翻譯起始序列上游的內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)寫部分(5’-非翻譯區(qū)或5’-UTR)和啟動(dòng)子上游的旁側(cè)序列。
當(dāng)最終目的是分泌重組多肽時(shí)，編碼分泌功能信號(hào)肽的分泌DNA序列應(yīng)該與產(chǎn)生重組多肽的轉(zhuǎn)移基因連接。
分泌DNA序列一般來自編碼分泌蛋白的同種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因組。
將待移基因片段導(dǎo)入胚胎的方法有顯微注射法、胚胎干細(xì)胞法和逆轉(zhuǎn)錄病毒法。比較可取的方法是顯微注射法。受精卵先用通用方法進(jìn)行顯微注射，體外培養(yǎng)為胚胎，(這樣的胚胎包含16-150個(gè)細(xì)胞)。16-32細(xì)胞期胚胎，通常為桑椹胚，含有32以上個(gè)細(xì)胞的胚胎通稱為胚泡。采用標(biāo)準(zhǔn)方法將胚胎移入受體母體內(nèi)并使之發(fā)育到期，嵌合體的動(dòng)物可以繼續(xù)繁殖至形成真正的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物種群。
由于基因整合的頻率通常是比較低的，檢測(cè)移植前胚胎中基因整合的方法應(yīng)該有較高的靈敏性，一般是從胚胎中取部分細(xì)胞，分離其DNA，用限制性內(nèi)切消化后用PCR方法擴(kuò)增，電泳后分析檢測(cè)結(jié)果。
含有重組多肽的轉(zhuǎn)基因牛奶既可直接應(yīng)用亦可進(jìn)一步分離純化。這部分依賴于乳汁中重組多肽的種類及其最終用途。當(dāng)重組多肽是用來提高牛奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值時(shí)便沒有必要進(jìn)行純化。例如含有人乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因牛奶可防止嬰兒腸道感染同時(shí)提高嬰兒對(duì)鐵的吸收。
轉(zhuǎn)基因牛奶中的重組多肽亦可用于配方食品。例如含有從轉(zhuǎn)基因牛奶中提取的人乳鐵蛋白的嬰兒食品有助于治療新生兒的腹瀉。同樣，轉(zhuǎn)基因牛奶中的人酪蛋白和人溶菌酶都具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
當(dāng)轉(zhuǎn)基因牛奶中的重組多肽用作藥物時(shí)，需要進(jìn)行分離純化工作。純化方式的選擇與具體的重組多肽有關(guān)，并可采用通常的純化手段。如先進(jìn)行酪蛋白的分步分離，然后將含有重組多肽的部分進(jìn)行層析分離。所提到的層析法包括親合層析，離子交換層析，凝膠排阻層析和高壓液相色譜(HPLC)。
本發(fā)明的一個(gè)具體體現(xiàn)是在轉(zhuǎn)基因牛乳汁中產(chǎn)生人乳鐵蛋白(HLF)。人乳鐵蛋白是鍵合兩個(gè)鐵離子的單鏈糖蛋白，該蛋白能抑制不同細(xì)菌的生長(zhǎng)。人乳鐵蛋白是人乳中主要的金屬離子結(jié)合蛋白質(zhì)，可促進(jìn)小腸中金屬離子的吸收。體內(nèi)試驗(yàn)表明人乳對(duì)大腸桿菌的抑制主要?dú)w功于HLF。
轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的人乳鐵蛋白提供了人乳鐵蛋白的新來源。該乳汁可在巴氏滅菌后直接應(yīng)用，也可進(jìn)一步分離純化。另外若將人乳鐵蛋白或含有人乳鐵蛋白的牛奶與溶菌酶協(xié)同使用則效果更好?？稍谝艳D(zhuǎn)入HLF基因的轉(zhuǎn)基因牛的胚胎中再轉(zhuǎn)入編碼溶菌酶的基因序列，這樣所得的轉(zhuǎn)基因?？僧a(chǎn)生不止一種重組多肽。
本發(fā)明的另一個(gè)體現(xiàn)是在轉(zhuǎn)基因牛乳汁中產(chǎn)生人血清白蛋白(HSA)。人血清白蛋白是含有584個(gè)氨基酸殘基的血清蛋白，它是人血清中含量最豐富的蛋白，發(fā)揮著非常重要的生理功能。血清白蛋白能夠調(diào)節(jié)血液滲透壓和運(yùn)輸脂肪組織中的脂肪酸。實(shí)施例1牛卵母細(xì)胞在體外的發(fā)育、受精和培養(yǎng)從牛卵巢內(nèi)分離得到大量未受精卵，體外培養(yǎng)然后進(jìn)行授精。將編碼人乳鐵蛋白的待轉(zhuǎn)移基因?qū)氲绞芫训脑藘?nèi)。顯微注射后的受精卵在培養(yǎng)液中培養(yǎng)至桑椹期晚期或囊胚期，然后用非手術(shù)方式移入受體母牛體內(nèi)，以使其繼續(xù)發(fā)育。
(一)體外發(fā)育從牛卵巢中分離出卵母細(xì)胞，沖洗后置于添加10％小牛血清的M199培養(yǎng)液內(nèi)，39℃孵育24小時(shí)(Sirard et al.(1988)Bio.Reprod.39，546-552)。
(二)體外受精成熟的卵母細(xì)胞可用新鮮或解凍的精子授精。使用的精子應(yīng)預(yù)先進(jìn)行“活力檢查”。
(三)體外培養(yǎng)常規(guī)的培養(yǎng)體系并不能促進(jìn)8-16細(xì)胞期的牛胚胎的發(fā)育。若將牛胚胎與輸卵管組織共同培養(yǎng)，可使之由8-16細(xì)胞期體外發(fā)育成囊胚。實(shí)施例2HLF顯微注射至牛受精卵前核用限制性內(nèi)切酶將含有HLF表達(dá)單元的DNA片段切下，瓊脂糖電泳分離，酚一氯仿抽提，乙醇沉淀。所得DNA片段溶于10mmol/l Tris，0.1mmol/l EDTA(PH7.2)中并透析至濃度為1-2μg/ml，并將此DNA溶液克滿顯微注射針。注射應(yīng)在卵受精后18-24小時(shí)進(jìn)行。
將受精牛卵母細(xì)胞置于Eppendorf管內(nèi)，加入1mL Tyrdes-hepdes液，14500g離心8分鐘后將卵移入栽玻片的Tyrodes-hepes液滴內(nèi)(載玻片用礦物油覆蓋)，置于倒置顯微鏡下，移動(dòng)持卵管使其靠近一個(gè)卵，增加負(fù)壓使吸住卵，聚焦以顯示原核。必要時(shí)調(diào)節(jié)卵與持卵管的相對(duì)位置，可將卵吹離，略施壓力使其輕微旋轉(zhuǎn)至原核清晰可見時(shí)再吸住。將注射針通過透明帶指向原核，此時(shí)持卵管、注射針與卵均聚焦清晰，繼續(xù)前推注射針使其進(jìn)入原核，推注射器活塞或踩壓力泵將1-3plDNA(20-100拷貝)注入原核內(nèi)。
實(shí)施例3
轉(zhuǎn)基因牛乳汁中人血清白蛋白(HSA)的純化下面的步驟被用來純化轉(zhuǎn)基因牛乳中的HSA1.調(diào)節(jié)乳汁pH值為4.5，加入凝乳酶使酪蛋白和其他脂肪沉淀，乳清中含有白蛋白；2.用瓊脂糖親和層析除去雜蛋白，并將白蛋白用pH值為7.5的0.15mol/l氯化納和20mmol/l水楊酸鈉溶液洗脫，濃縮；3.Sephadex G-25交換層析在0.025mol/l乙酸鈉溶液中脫鹽，調(diào)pH至5.2，過濾；4.陰離子交換層析(DEAE-Sepharose)；在pH值為4.5條件下，洗脫；5，陽(yáng)離子交換層析(CM-Sepharose)用p H為5.5的0.11mol/l的乙酸鈉溶液洗脫，經(jīng)超濾后白蛋白的濃度為6％(W/V)；6.凝膠層析除去高分子量的蛋白質(zhì)(如多聚白蛋白、致熱原)，白蛋白單體經(jīng)超濾濃縮得到成品。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)移基因動(dòng)物的方法，所說的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能在其乳汁中產(chǎn)生重組多肽。
2.權(quán)利要求1所說的轉(zhuǎn)移基因至少包括調(diào)控表達(dá)序列、分泌-重組DNA序列。
3.權(quán)利要求1所說的重組多肽包括人分泌型免疫球蛋白、人乳鐵蛋白、人乳球蛋白、a-人乳白蛋白、人血清白蛋白、人免疫球蛋白、人因子VII、人因子IX和人C-蛋白。
4.含有轉(zhuǎn)基因牛乳汁中產(chǎn)生的重組多肽的配方食品。
5.一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因整合的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)重組多肽及產(chǎn)生具有預(yù)期特性的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動(dòng)物的方法，其包括<1>分離得到動(dòng)物胚胎；<2>把編碼重組多肽的轉(zhuǎn)移基因?qū)雱?dòng)物胚胎；<3>將上述胚胎移植入假孕母體內(nèi)并檢測(cè)其基因整合；<4>確定獲得的雌性動(dòng)物能在其乳汁中產(chǎn)生重組多肽。
文檔編號(hào)C12N5/06GK1114357SQ94107318
公開日1996年1月3日 申請(qǐng)日期1994年7月1日 優(yōu)先權(quán)日1994年7月1日
發(fā)明者唐勇煒 申請(qǐng)人:唐勇煒