專利名稱：羧端帶有前表面抗原1決定簇的重組乙肝疫苗的制作方法
乙型肝炎是一種嚴(yán)重危害人類健康并廣為流行的疾病，特別是在發(fā)展中國家。在我國，乙肝病毒攜帶者達(dá)1億以上，由乙肝或乙肝有關(guān)的疾病導(dǎo)致死亡人數(shù)巨大，危害極大，普遍接種疫苗是控制乙肝的重要措施。
在乙型肝炎病毒(HBV)感染的某些患者血清中存在有42nm具有感染的病毒顆粒，是由病毒衣殼蛋白即表面抗原(HBsAg)，核心抗原(HBcAg)和病毒核酸(DNA)組成。另外還有不具有感染性的20-22nm的球狀和棒狀顆粒，僅含乙肝表面抗原。它能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異抗乙肝病毒抗體，使人體產(chǎn)生免疫力。由病人血清中分離HBsAg，制成的血源疫苗，由于來源困難，成本昂貴，安全性差，不夠理想。
利用基因工程技術(shù)，在不同體系中酵母，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，重組痘苗等表達(dá)乙肝表面抗原，用作基因工程疫苗，比之血源疫苗更為安全，經(jīng)濟(jì)，有效，但就其免疫原性的本質(zhì)與血源疫苗幾乎相同，因而仍有一些不足之處如1)5-10%的人群免疫反應(yīng)低下或無免疫應(yīng)答。2)所需抗原量大。3)免疫持久性4-5年。因此研究高效經(jīng)濟(jì)的新型乙肝疫苗十分必要。
乙肝表面抗原有三種蛋白組分主蛋白(S)，中蛋白(M)和大蛋白(L)，這三種蛋白由HBV中同一閱讀框架的DNA編碼，從不同的起始碼ATG起始翻譯，差別在于M蛋白比S蛋白在氨端多了55個(gè)氨基酸，即前表面抗原2(preS2)區(qū)，而L蛋白比M蛋白在氨端又多了119個(gè)氨基酸，即前表面抗原1(preS1)區(qū)。M和L蛋白主要存在于病毒顆粒的外殼中。
preS1區(qū)含有不同于S的抗原決定簇。preS1區(qū)具有T細(xì)胞和B細(xì)胞水平上的免疫原性，其中氨端第21-47氨基酸的肽段，能與肝細(xì)胞膜結(jié)合(Neurath A.R.等cell 198646.429-436)具有誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的能力，從而能阻斷乙肝病毒與肝細(xì)胞的結(jié)合，以保護(hù)機(jī)體不受感染。另外L蛋白能激活對(duì)preS1特異的T細(xì)胞，克服對(duì)S蛋白和M蛋白的不反應(yīng)性。但L蛋白不易從細(xì)胞中分泌出來，并且還抑制了S蛋白的分泌(Persing，P.H.等，Science，1986，234，1388)。氨端的肉豆蔻酸化和氨端的18個(gè)氨基酸順序都是影響分泌的原因，同時(shí)L蛋白易被降解。因此要獲得含L蛋白的疫苗有一定的困難。
用合成的preS1(21-47)多肽研究證實(shí)，該區(qū)域含有HBV與肝細(xì)胞結(jié)合所必需的位點(diǎn)，抗preS1(21-47)單抗MA18/7和F35.25能有效地抑制HBV與肝細(xì)胞的結(jié)合，具有中和病毒的能力(Petit M.A.等，Virology 1991，180.483-491)。免疫猩猩能使其抵制HBV的攻擊(Neurath A.R.等，Vaccine，1989，7，234-236)。但是，用合成多肽作為疫苗，免疫原性低，距實(shí)際應(yīng)用尚有很大距離。
近來，利用乙肝表面抗原作載體蛋白，成功地將外源基因片段，如人單純皰疹病毒Ⅰ型(HSV-I)(Valenzuela，P.等，Bio-Technology，1985，3，323.)，人免疫缺陷病毒(HIV)(Michel，M-L等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1988，85，7957.)，脊髓灰質(zhì)炎病毒(plio)(Delpeyroux，F(xiàn).等，Science 1986，233，472)都插入preS2區(qū)，在酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得表達(dá)。我們將促生長(zhǎng)素抑制素基因(SS)融合在HBsAg主蛋白的羧端，也獲得了成功(徐文忠等，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1993，25，119-126)。因此，通過將preS1免疫決定簇與HBsAg主蛋白融合的辦法，獲得帶preS1的新型乙肝疫苗不失為一條新的技術(shù)路線。
R.E.Streeck等人曾報(bào)道，將preS1氨端氨基酸順序1-42，在乙肝表面抗原第223位，外加5個(gè)氨基酸的接頭與之融合，在SV40啟動(dòng)子控制下，獲得了暫時(shí)表達(dá)。雖然他們也發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)和培液中都有S和preS1的表達(dá)，能形成顆粒，但尚未構(gòu)建穩(wěn)定的表達(dá)株和對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性進(jìn)行研究(Machein L，等，Arch.Virol，1992，4，133-136)。另外，他們使用的片段(1-42)中N端的20個(gè)氨基酸，可能會(huì)影響表達(dá)產(chǎn)物的分泌。
本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)阻斷乙肝病毒感染的新型乙肝重組疫苗，即一個(gè)含有乙肝表面抗原S基因與preS1肝細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的抗原決定簇基因融合的重組痘苗病毒(Vaccinia Virus)，能穩(wěn)定地表達(dá)并分泌乙肝表面抗原與preS1的融合顆粒。顆粒同時(shí)具有乙肝HBsAg和preS1的雙重抗原性，具良好的免疫性，免疫動(dòng)物能迅速產(chǎn)生高滴度的雙重抗體，這就具備了發(fā)展成高效、速效的新型乙肝疫苗的可能。本發(fā)明所提供的重組痘苗病毒能大量分泌產(chǎn)生HBsAg和preS1的融合顆粒。經(jīng)分離純化，可制成更為安全高效的新型乙肝基因工程顆粒疫苗。該重組痘苗病毒也可用于制備成新型乙肝活疫苗。
我們利用PCR技術(shù)，人工合成了preS1基因中對(duì)應(yīng)氨基酸第21-47的核苷酸順序，去除了可能影響S抗原分泌的氨端20個(gè)氨基酸。在乙肝表面抗原基因羧端，在對(duì)應(yīng)氨基酸第223位與合成的preS1核苷酸片段相融合。獲得了含有乙肝表面抗原S基因與preS1(21-47)的融合基因。并構(gòu)建了含有該融合基因的重組痘苗病毒，成功地表達(dá)了帶HBsAg和preS1雙重抗原的顆粒。實(shí)驗(yàn)證明，我們的設(shè)計(jì)方案既不影響乙肝表面抗原顆粒的形成和白細(xì)胞的分泌，也不影響HBsAg的免疫原性，卻同時(shí)帶有preS1的免疫原性。免疫動(dòng)物能高水平地產(chǎn)生抗HBsAg和抗preS1的抗體。
本發(fā)明提供將HBsAg主蛋白羧端與preS1抗原決定簇融合，以及組建一個(gè)能穩(wěn)定表達(dá)分泌HBsAg主蛋白和preS1蛋白融合顆粒的重組痘苗病毒的方法，包括1.含肝細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的preS1抗原決定簇(21-47)的PCR法合成和克隆(pWR/PS1)。
2.乙肝表面抗原基因(S)羧端與合成的preS1(21-47)基因融合的克隆構(gòu)建(pUC/PSA-28)。
3.含融合基因的重組痘苗表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建(pGJPSA-28)。
4.含乙肝S基因與preS1(21-47)基因的重組痘苗病毒的構(gòu)建和篩選(vSA-28)。
5.重組痘苗病毒的增殖和帶preS1的乙肝表面抗原的表達(dá)。
本發(fā)明的示意圖說明如下

圖1.含肝細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的preS1抗原決定簇(21-47)基因的PCR合成和克隆示意圖。
圖中符號(hào)說明StStuⅠ(限制酶);XXbaⅠ;PvPvuⅡ;EEcoRⅠ;SSacⅠ;SmSmaⅠ;BBamHⅠ;SaSa1Ⅰ;PsPstⅠ;HHindⅢ。
圖2A.乙肝S基因3′端與preS1(21-47)的融合和克隆示意圖。
圖中符號(hào)說明■ S基因，□ PreS1;SpSpel;PfpflmⅠ;AcAccⅠ;余者同圖1。
圖2B.乙肝S基因3′端與preS1(21-47)融合在痘苗表達(dá)載體上的克隆示意圖。
圖3.重組痘苗病毒vSA-28的Southern雜交鑒定ECL顯影照片。
1.天壇株，2.pGJPSA-28，3.vSA-28。
圖4.重組痘苗病毒vSA-28表達(dá)產(chǎn)物具S抗原和preS1雙重抗原性。
圖4A.培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解液中35S甲硫氨酸標(biāo)記的乙肝表面抗原與抗HBsAg免疫沉淀，經(jīng)蛋白電泳的放射性自顯影圖。
圖4B.培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解液中35S甲硫氨酸標(biāo)記的乙肝preS1抗原與抗preS1單抗MA18/7免疫沉淀，經(jīng)蛋白電泳的放射自顯影圖。
圖中Mock對(duì)照;S帶HBsAg的重組痘苗vTH-2;SA-28重組痘苗vSA-28。
M.為標(biāo)準(zhǔn)分子量m.為培養(yǎng)液C.為細(xì)胞裂解液箭頭表示糖苷化和非糖苷化的S和SA-28蛋白圖5.重組痘苗病毒vSA-28表達(dá)產(chǎn)物的分泌性測(cè)定。在不同細(xì)胞(CV-1，Vero，CEC)中分泌性水平的比較。
培養(yǎng)液;■細(xì)胞裂介液。
圖6.重組痘苗病毒vSA-28表達(dá)產(chǎn)物顆粒性鑒定。
圖6A.vTH-2(上)和vSA-28(下)融合顆粒的CsCl密度超離心測(cè)定。
圖6B.vSA-28融合顆粒的電子顯微鏡觀察照片(×12000)。
圖7.重組痘苗病毒vSA-28表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性測(cè)定。
本發(fā)明的內(nèi)容具體描述如下1.preS1(21-47)基因片段的PCR合成及克隆;
我們選定乙肝病毒adr亞型含有肝細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的preS1抗原決定簇，氨基酸序號(hào)第21-47位，以含preS1基因的克隆作模板，用PCR法合成了與preS1(21-47)相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列。為便于克隆，在此片段的5′端和3′端分別引入一個(gè)StuⅠ和XbaⅠ酶切點(diǎn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)上述酶雙酶解后，克隆入PWR13質(zhì)粒得PWR13質(zhì)粒得PWR/PS1，在通過順序測(cè)定驗(yàn)證后備用(見圖1)。
2.乙肝表面抗原基因(adr型)羧端與合成的preS1(21-47)基因融合克隆在含有preS1(21-47)的克隆上，將XbaⅠ切點(diǎn)打開，再補(bǔ)平重連，在preS1(21-47)片段3′端造成一個(gè)終止碼TAG。為了在preS1(21-47)片段5′端與乙肝表面抗原基因融合后，仍保持閱讀框架正確，在preS1片段5′端，裝上10個(gè)寡核苷長(zhǎng)的SmaⅠ接頭，而在S基因3′端，對(duì)應(yīng)第223氨基酸處，即AccⅠ酶切點(diǎn)，經(jīng)同樣酶切開補(bǔ)平，造成平頭與preS1(21-47)氨端SmaⅠ接頭連接，完成乙肝表面抗原基因與preS1(21-47)的基因融合。含preS1與HBsAg223位融合基因的重組質(zhì)粒為PUC/SA-28(見圖2A)。我們將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中保存，此菌種為Escherichia coli TG-1/PGJPSA-28存放標(biāo)記CCTCC NOM93074。
3.融合基因在重組痘苗表達(dá)質(zhì)粒上的構(gòu)建為實(shí)現(xiàn)設(shè)計(jì)的融合基因與痘苗病毒的重組，首先必須將融合基因插入痘苗表達(dá)質(zhì)粒。我們選擇已成功用于多種外源基因表達(dá)的痘苗通用表達(dá)質(zhì)粒pGJP-5(吳雪等，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)1987，19(5)395)。該質(zhì)粒帶有痘苗啟動(dòng)子p7.5和痘苗TK基因順序，其間帶有幾個(gè)克隆位點(diǎn)，若在中間插入外源基因，即可造成TK基因的失活，而可用作重組病毒的選擇標(biāo)記。另外還帶有氨芐青霉素(APr)耐藥標(biāo)記，可作為大腸桿菌中組建克隆時(shí)的重組子選擇標(biāo)記。將用BamHI切下的融合基因插在pGJP-5質(zhì)粒的BamHI位點(diǎn)上，得重組質(zhì)粒pGJPSA-28(見圖2B)。
4.含S與preS1(21-47)基因融合與低毒痘苗病毒天壇株的重組及痘苗病毒的篩選。
我們選用已知的低毒痘苗病毒株，天壇株(Vaccinia Virus Tian Tan)，由中華人民共和國衛(wèi)生部北京生物制品所獲得。其特點(diǎn)是，由此產(chǎn)生的重組痘苗病毒用作活疫苗時(shí)，其毒性低，這已為長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐所證明。
將重組痘苗表達(dá)質(zhì)粒pGJPSA-28從菌種CCTCC NO93074中取出，按下述實(shí)施例的具體敘述制備方法獲得的質(zhì)粒DNA和天壇痘苗病毒引入CV-1細(xì)胞，由于表達(dá)質(zhì)粒上的TK基因與痘苗TK基因具有同源順序和彼此的親和力，因而有可能同源交換，而發(fā)生體內(nèi)重組，也即將表達(dá)質(zhì)粒上失活的TK基因所包含的痘苗啟動(dòng)子p7.5和相連的乙肝表面抗原S與preS1(21-47)的融合基因重組到痘苗病毒基因組中去，再通過對(duì)TK-的多次選擇，即可得純化的重組痘苗病毒vSA-28(見圖2B)。
5.重組痘苗病毒的增殖和帶有preS1乙肝表面抗原的表達(dá)。
經(jīng)過篩選的重組痘苗病毒vSA-28，并通過Southern雜交和產(chǎn)物的分析驗(yàn)證后，感染Vero，CV-1或者CEC細(xì)胞，即可進(jìn)行病毒的增殖，以大量獲得重組痘苗病毒。重組痘苗病毒感染細(xì)胞后能表達(dá)并分泌具有S和preS1雙重免疫原性的融合的乙肝表面抗原顆粒，可用于生產(chǎn)高效和新型基因工程乙肝疫苗。vSA-28也可用作活疫苗使用。
本發(fā)明的內(nèi)容在以下實(shí)施例的具體敘述材料和方法a.基因重組所用限制酶，連接酶，Klenow聚合酶，SmaI接頭，皆為Boehringer產(chǎn)品;
細(xì)胞培養(yǎng)基，DMEM/HG高葡萄糖培液，胎牛血清(FCS)，無甲硫氨酸培液(RPM1-1640，Met-Free)，無甲硫氨酸胎牛血清(Met-Free，F(xiàn)CS)皆為GIBCO產(chǎn)品;
5-溴脫氧尿苷(BUdR)為FLUKA產(chǎn)品;
35S-標(biāo)記甲硫氨酸(L-35S-Met)為Amersham產(chǎn)品;
PCR用試劑盒和Tag DNA聚合酶為Biolabs產(chǎn)品;
b.所用胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因缺陷型細(xì)胞Human Tk-143細(xì)胞，在含25μg/ml BUdR和5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。痘苗病毒天壇株(Vaccinia Virus Tian Tan)由衛(wèi)生部北京生物制品所提供。原代雞胚細(xì)胞(CEC)，用10日令雞胚制備在10%小牛血清的DMEM中培養(yǎng)。CV-1細(xì)胞由德國馬普生化所提供，Vero細(xì)胞由上海醫(yī)科大學(xué)聞?dòng)衩方淌谔峁?br> c.細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。CV-1細(xì)胞，經(jīng)痘苗病毒天壇株感染兩小時(shí)后，用磷酸鈣共沉淀的DNA(含10μg質(zhì)粒和10μg魚精DNA)轉(zhuǎn)染，37℃培養(yǎng)5小時(shí)后，吸去轉(zhuǎn)染液，加入新鮮培液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后收獲細(xì)胞。
d.質(zhì)粒DNA的制備。用堿變性法，經(jīng)Sepharose 2B純化。
e.質(zhì)粒的重組和細(xì)菌轉(zhuǎn)化。參照Sambrook，J.等人“分子克隆”書上的方法進(jìn)行，所用受體菌為TG-1或JM105。
f.重組痘苗病毒的篩選和病毒DNA抽提。痘苗病毒DNA制備參見文獻(xiàn)(Espostto，J.等，J.Virol.Meth 1980，2，175)方法進(jìn)行。TK-重組病毒按照Weir等的方法(Weir，J.P.等，Proc.Natl.Acd.Sci.USA1982，79，1210)，在BUdR存在下，選擇空斑并進(jìn)行分析鑒定。
g.HBsAg和preS1的測(cè)定。HBsAg的測(cè)定用AUSRIA藥盒(Abbott公司產(chǎn)品)或北京生物制品所乙肝表面抗原放免檢測(cè)藥盒。preS1抗原的測(cè)定，采用Organon Teknika公司檢測(cè)藥盒，或由本所張祖?zhèn)鹘M提供的ELISA檢測(cè)試劑進(jìn)行。分泌至培養(yǎng)液中的抗原，可直接用培液測(cè)定或細(xì)胞內(nèi)的抗原經(jīng)PBS懸浮后，用干冰凍融四次，離心后的上清液為凍融細(xì)胞液樣品，也可用細(xì)胞的裂解液樣品進(jìn)行測(cè)定(參見方法Ⅰ項(xiàng))。所用抗preS1單抗(MA18/7)由聯(lián)邦德國W.H.Gerlich博士所贈(zèng)。
h.表達(dá)產(chǎn)物的蛋白電泳分析。采用SDS聚丙烯酰胺電泳參照Laemmli法進(jìn)行(Laemmli，U.K.等 Nature，1970，227.680)。
i.表達(dá)產(chǎn)物的35S-甲硫氨酸標(biāo)記及免疫沉淀。取磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染后20小時(shí)的細(xì)胞，去培液，用無甲硫氨酸培液洗滌后，在無甲硫氨酸FCS和無甲硫氨酸培液中，培養(yǎng)1小時(shí)，再經(jīng)無甲硫氨酸培液洗滌后，加入50-80uci35S-標(biāo)記的甲硫氨酸培養(yǎng)3小時(shí)，然后換成DMEM/HG培液過夜。收集標(biāo)記的細(xì)胞，經(jīng)預(yù)冷的PBS洗滌二次后懸于0.8mlHypotonic緩沖液，再加入0.2ml 5×lysis緩沖液，振搖，離心后上清-20℃保存?zhèn)溆脼榧?xì)胞裂解液。
標(biāo)記的細(xì)胞裂解液或細(xì)胞培液，分別加入S抗體或抗preS1抗體，混勻，0℃30分鐘后，離心棄上清。沉淀用RIPA緩沖液洗三次，懸于上樣緩沖液，100℃4分鐘，離心收集上清，進(jìn)行電泳分析。電泳膠抽干后，壓片自顯影。
j.ECL非放射性標(biāo)記檢測(cè)試劑和標(biāo)記操作方法，詳細(xì)參見Amersham公司提供的操作步驟。
下面分步描述實(shí)施的具體步驟實(shí)施例1，含肝細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的preS1(21-47)抗原決定簇基因的合成和克隆。
我們選定含肝細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的preS1抗原決定簇，氨基酸序號(hào)第21-47位。用含有preS1的重組質(zhì)粒DNA作為模板(pUC/LS-1)，采用PCR法擴(kuò)增了含有第21-47位的preS1的DNA片段，所用5’端引物為5'CTTTCTGTTCCCAGGCCTCTGGG 3'StuI共長(zhǎng)23個(gè)核苷酸，其中劃線部分為設(shè)計(jì)引入的一個(gè)StuⅠ酶切點(diǎn)順序。3’端引物為5' CTGGCCAGTGATCTCTAGAGGGTTGAAG 3'XbaI共長(zhǎng)29個(gè)核苷酸，其中劃線部分為設(shè)計(jì)引入的一個(gè)XbaⅠ切點(diǎn)順序。PCR反應(yīng)體系參見Biolabs方法。PCR擴(kuò)增的片段用StuI和XbaI雙酶解后，插入到質(zhì)粒pWR13的StuI和XbaI位置上，得含preS1(21-47)的重組克隆pWR/PS1，preS1(21-47)經(jīng)DNA順序測(cè)定驗(yàn)證(見圖1)。
實(shí)施例2，preS1(21-47)與S基因融合克隆pUC/SA-28的組建。
為實(shí)現(xiàn)preS1(21-47)片段與S抗原羧端的融合，我們首先將含preS1(21-47)基因片段的質(zhì)粒(pWR/PS1)，用XbaI酶解，再用大片段聚合酶將其補(bǔ)平后連接，造成一個(gè)終止碼TAG，同時(shí)也使XbaI切點(diǎn)丟失。另外為保持由S基因到preS1(21-47)片段閱讀框架正確無誤，我們?cè)趐reS1(21-47)上StuI酶切點(diǎn)處經(jīng)StuI酶解后，加上10個(gè)核苷酸SmaI接頭得pUC/10preS1(21-47)TAG。
選定S基因?qū)?yīng)氨基酸序號(hào)第223處AccI切點(diǎn)為preS1(21-47)片段的融合點(diǎn)。將帶有S基因的重組質(zhì)粒pWR/HBS-4△SalI，先將AccI酶切打開，再經(jīng)大片段酶補(bǔ)齊。再將3’端補(bǔ)平的S基因用SacI酶切下，插在pUC/10 preS1(21-47)TAG的SacI和SmaI雙酶解的位點(diǎn)上，產(chǎn)生pUC/SA-28，經(jīng)順序測(cè)定，驗(yàn)證S基因與preS1(21-47)融合處框架正確，并在preS1(21-47)羧端含有終止碼后，再構(gòu)建含融合基因的重組痘苗表達(dá)質(zhì)粒(見圖2A)。
實(shí)施例3，含S基因與preS1(21-47)基因融合的重組痘苗表達(dá)質(zhì)粒pGJPSA-28的構(gòu)建。
重組質(zhì)粒pUC/SA-28，經(jīng)BamHI酶解后完整地分出含有S基因與preS1(21-47)融合的DNA片段，直接插入經(jīng)BamHI酶切的重組痘苗表達(dá)質(zhì)粒pGJP-5，得重組質(zhì)粒pGJPSA-28，經(jīng)BamHI回切，得長(zhǎng)約0.78Kb的融合基因。這樣該重組質(zhì)粒的上游依次為TK基因，痘苗啟動(dòng)子p7.5，ATGS(1-223)+Val，Trp，Gly+preS1(21-47)+Ser，Ser+TAG，質(zhì)粒多用酶切點(diǎn)，TK基因。重組質(zhì)粒pGJPSA-28還有APr耐藥標(biāo)記，可在大腸桿菌中轉(zhuǎn)化(如TG-1)，選擇和擴(kuò)增，以制備重組質(zhì)粒DNA(見圖2B)。含重組質(zhì)粒pGJPSA-28的大腸桿菌Escherichia coli TG-1/pGJPSA-28保存于編號(hào)為CCTCC NO93074。
實(shí)施例4，含有S和preS1(21-47)基因融合的重組痘苗病毒的篩選和vSA-28的鑒定。
重組的痘苗是通過重組痘苗表達(dá)質(zhì)粒pGJPSA-28和天壇株病毒在CV-1細(xì)胞體內(nèi)發(fā)生重組而產(chǎn)生。再通過感染TK-143細(xì)胞，在BUdR存在下，選擇重組痘苗空斑。由于表達(dá)質(zhì)粒TK基因中插有p7.5啟動(dòng)子和融合基因，TK已失去活性，即TK-，在發(fā)生體內(nèi)重組后，重組痘苗病毒也是TK-的，也即BUdR存在下，只有重組的TK-才能存活下來，經(jīng)過兩次空斑純化，并經(jīng)HBsAg和preS1抗原表達(dá)的測(cè)定為陽性后，選擇得到重組的痘苗病毒vSA-28。
對(duì)重組痘苗病毒vSA-28在DNA水平上進(jìn)行了Southern blot鑒定。
制備vSA-28 DNA，以天壇株痘苗病毒DNA和融合基因的表達(dá)質(zhì)粒pGJPSA-28 DNA為對(duì)照，都經(jīng)BamHI酶解電泳后，再轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用S基因?yàn)樘结樳M(jìn)行雜交，結(jié)果由圖3所示。已知重組表達(dá)質(zhì)粒pGJPSA-28，BamHI酶解片段包含有完整的S和preS1融合基因長(zhǎng)約0.78Kb，而重組痘苗vSA-28 DNA，BamHI酶解的片段中能與S基因雜交的也是0.78Kb的片段，天壇株對(duì)照則呈陰性，這表明，融合基因已正確的插在重組痘苗病毒DNA中。
實(shí)施例5，重組痘苗病毒vSA-28表達(dá)產(chǎn)物具有S和preS1雙重抗原性的鑒定。
我們用35S-甲硫氨酸標(biāo)記vSA-28感染20小時(shí)后的CV-1細(xì)胞，追蹤20小時(shí)后收集1ml細(xì)胞裂解液和3ml培液，取100μl細(xì)胞裂解液和300μl培液，用免抗S血清沉淀后電泳，用vTH-2(僅含S主蛋白的重組痘苗病毒)感染的CV-1細(xì)胞和未經(jīng)感染的CV-1細(xì)胞作對(duì)照。由圖4A可見，在vTH-2中有特異的24KD沉淀帶和糖苷化的27KD帶，而在vSA-28中也有能和S抗體特異沉淀的27KD和糖苷化的29KD條帶，同樣在培液中也有能被S抗體結(jié)合的條帶，但被糖苷化的比細(xì)胞內(nèi)的略大，這可能是在分泌過程中，糖苷化的程度增加的原故。
另外，表達(dá)產(chǎn)物用抗preS1(29-36)單抗MA18/7，進(jìn)行免疫沉淀后電泳，結(jié)果見圖4B，由于vTH-2只表達(dá)S抗原，因而不能與單抗MA18/7特異結(jié)合而沉淀。而在vSA-28表達(dá)產(chǎn)物中無論在培液和細(xì)胞內(nèi)，用preS1(29-36)單抗MA18/7都有特異的條帶24KD和29KD出現(xiàn)，結(jié)果與圖4A中用S抗血清結(jié)合沉淀的條帶大小一致。這表明vSA-28的表達(dá)產(chǎn)物既能被抗S抗體所識(shí)別又能被抗preS1抗血清所識(shí)別，即vSA-28的表達(dá)產(chǎn)物SA-28蛋白，同時(shí)具有S抗原和preS1抗原的雙重抗原性。
實(shí)施例6，vSA-28表達(dá)產(chǎn)物SA-28蛋白的分泌性。
由脈沖標(biāo)記追蹤--免疫沉淀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，在培液中可檢測(cè)到SA-28蛋白存在，這表明產(chǎn)物具有分泌性。
我們進(jìn)一步測(cè)定了SA-28蛋白在不同細(xì)胞CV-1，Vero和CEC中的分泌情況。在感染Vero和CEC細(xì)胞后96小時(shí)取樣，分別測(cè)定培液和細(xì)胞裂解液中的S抗原量為指標(biāo)的SA-28量，結(jié)果見圖5。與vTH-2相似，vSA-28在CV-1中分泌表達(dá)較差，在Vero細(xì)胞和CEC細(xì)胞表達(dá)和分泌水平較高，尤以Vero細(xì)胞最好，SA-28與vTH-2相比表達(dá)S抗原的水平和分泌性非常相似。在培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解液中檢測(cè)到的抗原量接近相當(dāng)，這表明大約有占總共S抗原的一半是分泌到培液中的。
用ELISA方法檢測(cè)preS1的結(jié)果與S抗原的結(jié)果是一致的(數(shù)據(jù)未列)。
實(shí)施例7，重組痘苗病毒vSA-28表達(dá)的SA-28蛋白顆粒性的分析。
我們用vTH-2和vSA-28分別感染Vero細(xì)胞，96小時(shí)后培液中表達(dá)的S抗原和融合的SA-28的S抗原經(jīng)氯化銫密度梯度離心后進(jìn)行了測(cè)定。在vTH-2和vSA-28培液中，可找到密度分別為1.20g/ml和1.23g/ml的S抗原放免測(cè)定陽性峰(見圖6B)，在除去氯化銫，再經(jīng)濃縮和負(fù)染后，在電鏡下可見直徑約為25(μm)的SA-28顆粒(見圖6A)。融合蛋白的顆粒與S抗原顆粒在密度和大小上沒有十分明顯的區(qū)別。
實(shí)施例8，vSA-28表達(dá)的SA-28的免疫原性分析我們將vSA-28感染CV-1細(xì)胞48小時(shí)的培液，離心去痘苗后，經(jīng)過疏水介質(zhì)JL-QT6S-C4(A)柱層析和Sepharose 4B柱純化，收集S抗原活性峰，得到部分純化的SA-28蛋白。免疫Balb/C小鼠，取1.9μg SA-28蛋白以氫氧化鋁為佐劑，經(jīng)同樣方法純化的HBsAg3.2μg為對(duì)照，每組小鼠6-7只腹腔注射，21天后同樣量加強(qiáng)，在第21天和第49天，即加強(qiáng)后的第28天，采血測(cè)定抗S抗體和抗preS1抗體含量，結(jié)果見圖7。SA-28免疫Balb/C小鼠有良好的免疫原性，無論是在一次免疫或兩次免疫以后，SA-28樣品與用標(biāo)準(zhǔn)疫苗相比，產(chǎn)生抗S抗體幾乎處在同一水平上。
在一次免疫以后，即有較高水平的抗preS1抗體產(chǎn)生，這提示抗preS1抗體可能早于抗S抗體的產(chǎn)生。而在兩次免疫后有更大幅度的提高，顯示了SA-28也具有良好的preS1免疫原性。
我們的結(jié)果表明，與合成的多肽相比，我們發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于vSA-28表達(dá)的SA-28蛋白的顆粒性為SA-28良好的免疫原性，提供了基礎(chǔ)。而SA-28顆粒良好的分泌性，為制備新型乙肝基因工程亞單位疫苗的分離純化提供了有利條件。
已知抗preS1(21-47)抗體具有中和病毒的能力而具保護(hù)作用。因而SA-28抗原，發(fā)展成新型乙肝疫苗有可能具有以下優(yōu)越性1.除產(chǎn)生抗S抗體外，還能產(chǎn)生抗preS1抗體。能在中和病毒和阻斷病毒與肝細(xì)胞結(jié)合兩個(gè)環(huán)節(jié)上起作用。因此能得到更徹底的保護(hù)。
2.能較早的高水平的產(chǎn)生抗preS1抗體，提供更早的保護(hù)作用。
3.臨床上約有10%的人群對(duì)S抗原不能產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，應(yīng)用SA-28產(chǎn)生抗preS1抗體阻斷病毒粒子與肝細(xì)胞的結(jié)合，也有可能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗S抗體從而達(dá)到保護(hù)作用。
4.慢性乙肝患者是在于T細(xì)胞水平上對(duì)S抗原無反應(yīng)，但在體內(nèi)preS1抗原在T細(xì)胞水平上的免疫反應(yīng)要大大高于S抗原。因而有可能在高劑量的SA-28作用下使T細(xì)胞反應(yīng)幫助產(chǎn)生preS1抗體和抗S抗體，以中和并清除病毒顆粒，達(dá)到治療的目的。
權(quán)利要求
1.一種用基因重組技術(shù)完成的重組痘苗，即用于乙肝的預(yù)防和乙肝治療的疫苗，其特征在于a.選定乙肝病毒adr亞型含有肝細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的preS1/抗原決定簇，利用PCR技術(shù)，人工合成了preS1基因中對(duì)應(yīng)氨基酸第21-47的核苷酸順序，去除了可能影響S抗原分泌的氨端20個(gè)氨基酸，為了便于克隆，在此片段的5′端和3′端分別引入一個(gè)StrI和XbaI酶切點(diǎn)，PCR產(chǎn)物經(jīng)上述雙酸解后，克隆入PWR13質(zhì)粒得PWR/PS1；b.在乙肝表面抗原基因羧端對(duì)應(yīng)的第223位與合成的preS1核苷酸片段相融合，獲得了含有乙肝表面抗原S基因與preS1(21-47)的融合基因；c.含preS1(21-47)與HBsAs223位融合基因的重組質(zhì)粒為PUC/SA-28；d.重組痘苗病毒使用的重組表達(dá)質(zhì)粒pGJP-5和帶有融合基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pGJPSA-28；e.將該重組表達(dá)質(zhì)粒pGJPSA-28轉(zhuǎn)入大腸桿菌，存放標(biāo)記為CCTCCNO∶M93074；f.重組痘苗病毒所用表達(dá)質(zhì)粒含有痘苗表達(dá)啟動(dòng)子P7.5和乙肝表面抗原基因3′端與帶肝細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的preS1抗原決定簇基因融合插在TK序列中，重組痘苗有TK-特征；g.重組痘苗病毒帶有乙肝表面抗原基因與有肝細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的preS1抗原決定簇融合基因，能穩(wěn)定地產(chǎn)生具有分泌性的顆粒形式表達(dá)的融合蛋白SA-28，具有乙肝表面抗原和乙肝preS1抗原的雙重抗原性質(zhì)，能使動(dòng)物產(chǎn)生高滴度的抗S抗體和抗preS1抗體等特點(diǎn)，因此可發(fā)展為新型的亞單位乙肝疫苗以及新型的活疫苗，能用于乙肝的預(yù)防和治療。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的含有乙肝表面抗原S基因與preS1(21-47)的融合基因，其特征在于包括所用在乙肝表面抗原羧端第223位處(及其它位點(diǎn))與其它任何抗原決定簇及外源基因的融合;
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的重組痘苗病毒出發(fā)株其特征在于為低毒株，天壇株和廣9株;
4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的基因融合，其特征在于在重組痘苗表達(dá)體系外的任何表達(dá)系統(tǒng)，包括哺乳動(dòng)物體系、酵母體系、大腸桿菌體系、昆蟲病毒體系等，包括表達(dá)株和表達(dá)產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明是用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的新型乙肝疫苗，將含有肝細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的preS1(21－47)的抗原決定簇的基因片段與乙肝病毒表面抗原主蛋白S基因3′端融合，并將該融合基因插入痘苗表達(dá)載體，構(gòu)建重組痘苗病毒vSA－28。該重組病毒能穩(wěn)定的表達(dá)乙肝表面抗原和prsS1抗原的融合顆粒，具有良好的雙重免疫原性，分泌性和穩(wěn)定性。作為新型乙肝亞單位顆粒疫苗，用于乙肝的預(yù)防和治療，也可用于制備新型乙肝活疫苗。
文檔編號(hào)C12P21/00GK1108306SQ94112069
公開日1995年9月13日 申請(qǐng)日期1994年3月10日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月10日
發(fā)明者李光地, 徐諧, 汪垣 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所