專利名稱：發(fā)酵制造乳酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的新方法。
乳酸在制造日本清酒(日本的一種用稻米發(fā)酵制得的酒精飲料)、保鮮飲料、泡菜、醬油、面包或啤酒中被用作食品添加劑，工業(yè)上還用于皮革、紡織原料、塑料、藥品或農(nóng)用化學(xué)品的制造。
近來，業(yè)已發(fā)現(xiàn)合成乳酸的衍生物或中間體，即乳酸酯如乳酸乙酯和乳酸丁酯具有作為安全性較高的溶劑和洗滌劑的效用。并且，聚乳酸，即乳酸的聚合物被預(yù)計(jì)具有生物降解聚合物的作用。
迄今為止，作為制造乳酸的方法，用糖和淀粉作為原料并利用乳酸菌的作用的發(fā)酵方法已被廣泛地采用。此方法通常是這樣完成乳酸制造的在培養(yǎng)基中用乳清、玉米漿、酵母抽提物等作為乳酸菌的營養(yǎng)來源，向培養(yǎng)基中加入碳酸鈣作為其中形成的乳酸的中和劑，將乳酸菌接種到培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)發(fā)酵形成乳酸。
此方法依靠碳酸鈣來中和培養(yǎng)基中積累起來的乳酸，但是，這不僅耗費(fèi)了大量的時間和工作來完成必要的提純，而且已形成的乳酸會對發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用。特別是當(dāng)已形成的乳酸在培養(yǎng)基中積累到一個較高的濃度時，發(fā)酵的速度就降低，發(fā)酵設(shè)備的生產(chǎn)率也嚴(yán)重下降。
作為一種提高發(fā)酵設(shè)備生產(chǎn)率的方法，高密度培養(yǎng)法采用諸如菌細(xì)胞固定化或用膜分離菌細(xì)胞的作法。但是，這些方法沒能免除已形成的乳酸對發(fā)酵的抑制作用。
作為消除產(chǎn)物對發(fā)酵的抑制并提高生產(chǎn)率的方法，可構(gòu)思出從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離出形成的乳酸的方法，抽提發(fā)酵法和電透析發(fā)酵法。
抽提發(fā)酵法包括連續(xù)抽提以回收培養(yǎng)基中積累的乳酸，從而消除產(chǎn)物造成的抑制作用，同時得到粗產(chǎn)物。但是此方法至今未得到充分開發(fā)，這是因?yàn)榘l(fā)酵所需的最佳pH與抽提所需的最佳pH不同;還因?yàn)槌樘崴玫某樘釀?xì)胞產(chǎn)生的毒性通常是(抽提)功效越高毒性比例強(qiáng)度越大。
電滲析發(fā)酵法最先是由Nomura等人開發(fā)的(Applied and Environmental Microbiology，1986年8月，314-319頁)。此電滲析發(fā)酵的裝置是陰極、陰離子交換膜、陽離子交換膜和陽極按所述順序依次排列構(gòu)成，操作方法是將發(fā)酵液引入陰極室，產(chǎn)生的乳酸滲析通過陰離子交換膜。這樣，可以得到游離的乳酸。
但是此方法不能使生產(chǎn)率大幅度提高，因?yàn)榘l(fā)酵所用的培養(yǎng)基的pH受乳酸電滲析的控制，結(jié)果，發(fā)酵液中乳酸的濃度降低，其時的電滲析效率也成比例地降低，進(jìn)一步的原因是，磷酸根離子與乳酸一起滲出，陰極室內(nèi)的菌細(xì)胞因接觸到電極和陰離子交換膜而受到破壞。
Toda等人證明了使電滲析發(fā)酵法更為有效地發(fā)揮作用的方法，即會發(fā)酵液中的乳酸以鹽的形式而非游離乳酸的形式存在，從而減輕產(chǎn)物所造成的抑制作用，并使發(fā)酵即使是在發(fā)酵液中的乳酸濃度調(diào)節(jié)到2-3%時仍能大量而迅速地進(jìn)行，防止了菌細(xì)胞由于被膜分開而受到破壞，將發(fā)酵液引入電滲析裝置的陰極室，誘導(dǎo)其中的乳酸滲析，該電滲析裝置由陰極、陰離子交換膜、陽離子交換膜、陽極按所述順序排列而成的。(J.Gen.Appl.Microbiol.，36，111-125，1990)。
Boyaval等人也闡述了一種乳酸鈉的滲析方法，是通過引導(dǎo)發(fā)酵液通過超濾膜進(jìn)入一個陰極和陽極之間插有多組陽離子交換膜和陰離子交換膜的電滲析裝置來完成的。(Biotechnology Letters，卷9，No.3，207-212頁，1987)。
至今，現(xiàn)有技術(shù)中還沒有一種能經(jīng)濟(jì)有效地從乳酸鈉中回收高純度乳酸并使鈉再生的方法。
當(dāng)菌細(xì)胞按Toda等人或Boyaval等人所提議的那樣在發(fā)酵液被引入電滲析裝置之前經(jīng)受精濾或超濾時，由于經(jīng)受過濾的發(fā)酵液的狀態(tài)需含有低濃度的乳酸以達(dá)到發(fā)酵液中乳酸濃度保持低水平時提高生產(chǎn)率的目的，在這種情形下經(jīng)過濾的發(fā)酵液量是普通連續(xù)發(fā)酵中含有10%左右濃度的乳酸的發(fā)酵液量的幾倍、幾十倍，且膜的表面積也成比例地大。故，討論的這些方法的缺點(diǎn)是不經(jīng)濟(jì)。
已知乳酸銨容易被含有4個或更多個碳原子的醇酯化。一種能有效地從產(chǎn)生乳酸銨的發(fā)酵液中獲得高純度乳酸的方法已被Miura，本發(fā)明的發(fā)明人之一，及其同事揭示出來(日本專利申請05-230428)。此方法包括向含乳酸銨的發(fā)酵液中加入正丁醇，令其酯化同時使大部分的氨釋放便于回收，然后向發(fā)酵液中加入硫酸進(jìn)一步完成酯化，從而誘導(dǎo)有效地形成乳酸丁酯，然后蒸餾提純?nèi)樗岫□?，再將提純后的乳酸丁酯水解得到高純度的乳酸。但至今尚不知道如何用現(xiàn)行發(fā)酵設(shè)備經(jīng)濟(jì)有效地制造乳酸銨，并消除產(chǎn)物造成的抑制作用。
考慮到上述的各種問題，本發(fā)明的目的是提供一種乳酸發(fā)酵的新方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用切實(shí)可行的電滲析發(fā)酵法制得乳酸鹽，特別是乳酸銨的方法。
本發(fā)明人為了解決上述問題，在尋找一種乳酸發(fā)酵生產(chǎn)的新方法上做了辛勤的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以通過以下手段提高發(fā)酵設(shè)備的生產(chǎn)率，即通過加堿調(diào)節(jié)發(fā)酵的pH值，和將含有菌細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)基引入電滲析裝置的一個稀釋室，滲析其中的乳酸鹽，從而使乳酸容易以高電流效率地從發(fā)酵液中分離出來。作為結(jié)果，完成了本發(fā)明。
特別地，本發(fā)明的目的是這樣達(dá)到的，通過(1).一種乳酸發(fā)酵生產(chǎn)的方法，特征在于令發(fā)酵液能在培養(yǎng)基中積累乳酸的微生物進(jìn)行培養(yǎng)的發(fā)酵部分和電滲極裝置之間循環(huán)，并用電滲析裝置除去發(fā)酵液中的乳酸。
本發(fā)明目的進(jìn)一步由下述方法達(dá)到，(2).上文(1)所描述的方法，其中的電滲析裝置的操作間歇進(jìn)行。
本發(fā)明目的進(jìn)一步由下述方法達(dá)到，(3).上文(1)所描述的方法，其中電滲析裝置與多個發(fā)酵部分相連，該多個發(fā)酵部分中的發(fā)酵液可在也可不在電滲析裝置和發(fā)酵部分之間循環(huán)。
本發(fā)明目的進(jìn)一步由下述方法達(dá)到，(4).上文(2)或(3)所描述的方法，其中，提供發(fā)酵原料的方式是在電滲析裝置的操作中斷時，向發(fā)酵部分中進(jìn)行補(bǔ)充。
本發(fā)明目的進(jìn)一步由下述方法達(dá)到，(5).上文(4)所描述的方法，其中，通過向發(fā)酵部分中部分補(bǔ)充供給發(fā)酵用的原料是糖和/或無機(jī)鹽。
本發(fā)明目的進(jìn)一步由下述方法達(dá)到，(6).上文(1)所描述的方法，其中，電滲析裝置的操作受發(fā)酵培養(yǎng)基的電導(dǎo)率所控制。
本發(fā)明目的進(jìn)一步由下述方法達(dá)到，(7).上文(1)所描述的方法，其中的能積累乳酸鹽的微生物是屬于乳酸桿菌、乳球菌、芽孢桿菌、芽孢乳桿菌屬之一的微生物。
本發(fā)明目的進(jìn)一步由以下方法達(dá)到，(8).上文(7)所描述的方法，其中，將發(fā)酵液引入到電滲析裝置中，而微生物細(xì)胞已經(jīng)通過微生物細(xì)胞分離裝置從該發(fā)酵液中分離出去。
本發(fā)明目的進(jìn)一步由以下方法達(dá)到，(9).上文(1)所描述的方法，其中，能夠積累乳酸鹽的微生物是屬于根霉屬的微生物，而其中含有微生物細(xì)胞的發(fā)酵液則通過殺菌裝置殺菌后被引入到電滲析裝置中。
本發(fā)明目的進(jìn)一步由以下方法達(dá)到，(10).上文(1)所描述的方法，其中，發(fā)酵部分中的培養(yǎng)基和微生物細(xì)胞被部分抽提，為了使發(fā)酵連續(xù)進(jìn)行，向發(fā)酵部分中加入新的培養(yǎng)基。
本發(fā)明目的進(jìn)一步由以下方法達(dá)到，(11).上文(1)描述的方法，其中的乳酸鹽是乳酸銨，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值受氨的控制。
本發(fā)明的方法具有很大優(yōu)點(diǎn)，能容易地制得粗加工的乳酸鹽特別是乳酸銨的水溶液，還能同時提高發(fā)酵裝置的生產(chǎn)效率。


圖1示意了本發(fā)明操作的實(shí)施方案;
圖2示意了依據(jù)本發(fā)明的電滲析裝置的一個方案;
圖3示意了實(shí)施例1-3中所用的實(shí)驗(yàn)裝置，圖4示意了實(shí)施例4所用的實(shí)驗(yàn)裝置。
下面詳述本發(fā)明。
至今，已經(jīng)開發(fā)的乳酸發(fā)酵電滲析發(fā)酵法主要是針對以游離乳酸作為產(chǎn)品的體系。這些體系的方法有兩種類型，一種類型包括電滲析發(fā)酵液中的游離乳酸，另一種類型包括暫時把乳酸轉(zhuǎn)化成鹽，然后利用電解作用從發(fā)酵液中滲析分離出乳酸。這些方法的通病是，由于發(fā)酵液需要通過陰極室，微生物細(xì)胞在陰極表面及陰離子交換膜上會被殺死。為克服此缺點(diǎn)，通常采用的方法包括，在把發(fā)酵液引入電滲析設(shè)備之前，令發(fā)酵液通過一個使用膜或離心分離器的分離裝置，從發(fā)酵液中分離出微生物細(xì)胞，然后再將分離出的微生物細(xì)胞返回到發(fā)酵部分中。由于電滲析發(fā)酵的基本特性要求發(fā)酵部分的乳酸濃度保持在低水平，從而減輕產(chǎn)物造成的抑制作用，微生物細(xì)胞分離部分的乳酸濃度也就低，不可避免地，待處理的發(fā)酵液的量相對于要用電滲析分離的乳酸的量也就較大。這就帶來嚴(yán)重的問題。作為阻止微生物細(xì)胞與陰極接觸的辦法，可以設(shè)想在陰極和陰離子交換膜之間插入另一個陰離子交換膜，并令發(fā)酵液在兩個相對的陰離子交換膜之間通過。由于電滲析室是靠電解使入口到出口之間產(chǎn)生pH梯度，微生物細(xì)胞的破壞仍然會發(fā)生，而且陰離子交換膜數(shù)量的提高使電阻升高，結(jié)果是工作電壓會上升，電功損耗也將上升。
另外，由于電滲析是從發(fā)酵液的其他成分中分離乳酸或乳酸鹽，獲得的產(chǎn)物多少還是粗加工的狀態(tài)。但是，此純度的產(chǎn)品不適合作食品添加劑或工業(yè)生產(chǎn)。為了使此分離產(chǎn)物達(dá)到高純度，還需進(jìn)行附加的提純工序。前述的直接用正丁醇酯化乳酸銨的方法可以作為一種可行的、制得高純?nèi)樗岬姆椒?。此方法通過單純得到乳酸銨來充分實(shí)現(xiàn)其功能，根本不需要在發(fā)酵部分得到游離態(tài)的乳酸。用正丁醇酯化乳酸銨的方法使含乳酸銨的發(fā)酵液能夠以不經(jīng)改善的狀態(tài)投入使用，即不需為后續(xù)過程分離微生物細(xì)胞。發(fā)酵培養(yǎng)基的成分偶而可能會嚴(yán)重地粘附于反應(yīng)裝置上，這取決于所用的發(fā)酵原料。故，含有乳酸銨的發(fā)酵液最好是已經(jīng)粗提純過的。既使含乳酸銨的發(fā)酵液可以按其未改善的形式使用，對其進(jìn)行粗提純，可以使蒸餾分離出乳酸丁酯后留在發(fā)酵液中的殘余物量降低，還能使殘余物的粘度下降，結(jié)果，蒸餾提純將順利進(jìn)行，蒸餾產(chǎn)率有所提高。
容易理解，在此情況下本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)在于易于制得粗提純的乳酸鹽特別是乳酸銨的水溶液，同時提高發(fā)酵裝置的生產(chǎn)效率。
下面將更具體地描述本發(fā)明乳酸發(fā)酵生產(chǎn)的方法。
首先，可用于本發(fā)明的微生物沒有特別的限制，僅要求其能夠積累乳酸鹽。作為微生物具體的例子;可以用乳酸菌類的乳桿菌屬、乳球菌屬、芽孢桿菌屬和芽孢乳桿菌和真菌，及根霉屬的乳酸菌類。這里所用的術(shù)語“微生物”指酵母、霉菌、真菌、細(xì)菌、放線菌、單細(xì)胞海藻、病毒(viruses)、原生動物，進(jìn)一步包括在動物、植物和組織培養(yǎng)物之間沒有變異的細(xì)胞。
微生物積累的乳酸鹽最好是乳酸銨，因?yàn)楸阌谕ㄟ^下步提純工序得到高純度的乳酸。但并不限于乳酸銨也可用乳酸鈉或乳酸鉀來代替。這些鹽可溶于水，完全無害，被FDA評定為GRAS，允許代替乳酸作為食品添加劑。
本發(fā)明中可有效使用的培養(yǎng)基可以是任何用于培養(yǎng)微生物的普通培養(yǎng)基。此處可用的培養(yǎng)基的具體例子有YM培養(yǎng)基、馬鈴薯、葡萄糖培養(yǎng)基、Gorodkova培養(yǎng)基、醋酸鈉培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、麥芽浸膏培養(yǎng)基、蔬菜汁培養(yǎng)基、石膏培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基、馬鈴薯酵母浸液、葡萄糖培養(yǎng)基、蔡氏(Czapek′s)培養(yǎng)基、Sabouraud′s培養(yǎng)基、燕麥粉培養(yǎng)基、合成毛霉(Mucor)培養(yǎng)基、YpSs培養(yǎng)基、葡萄糖-干酵母培養(yǎng)基、肉汁培養(yǎng)基、酵母-麥芽培養(yǎng)基、淀粉-無機(jī)鹽培養(yǎng)基、甘油-天門冬酰胺培養(yǎng)基、蛋白胨-酵母-鐵培養(yǎng)基、thyrosine培養(yǎng)基、和Pridham-Gotrieb培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基可以以液態(tài)使用或用明膠或瓊脂將其固化后使用。
盡管能用于本發(fā)明的發(fā)酵原料可以根據(jù)所用微生物的種類而變化，但對它們的最基本的需要是可以被吸收。通常用于乳酸發(fā)酵生產(chǎn)的原料包括例如D-葡萄糖、蔗糖、乳糖、D-和L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-果糖、L-山梨糖、麥芽糖、乳糖、密二糖、纖維素二糖、海藻糖、棉子糖、松三糖、α-甲基-D-葡糖苷、D-葡糖胺、N-乙酰氨基葡糖、熊果苷、糊精、可溶性淀粉、菊粉、甲醇、乙醇、阿東糖醇、赤熊果苷、糊精、可溶性淀粉、菊粉、甲醇、乙醇、阿東糖醇、赤蘚醇、肌醇、D-甘露糖醇、D-山梨糖醇、半乳糖醇、D-葡糖酸酯、甘油、正十六烷和淀粉。含有雜質(zhì)如廢糖蜜、和乳清的糖源也可以使用。
當(dāng)所用的微生物是乳酸桿菌屬、乳球菌屬、芽孢桿菌屬、或芽孢乳桿菌屬的乳酸菌時，通常加入第二原料氮源，如酵母提取液、蛋白胨、和玉米漿，這些對微生物的生長是基本的。必要時允許加入無機(jī)鹽如伯磷酸鉀、仲磷酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、氯化錳、硫酸鋅和碳酸鈣。當(dāng)使用根霉屬的微生物時，只要加入糖和其他原料和上面提到的無機(jī)鹽就行了。
圖1示意了發(fā)酵裝置，下面結(jié)合圖1描述依本發(fā)明方法的乳酸發(fā)酵生產(chǎn)裝置。
參見圖1，在制造乳酸的發(fā)酵裝置10中，當(dāng)發(fā)酵液借助發(fā)酵液循環(huán)泵13在能于培養(yǎng)基中積累乳酸鹽的微生物進(jìn)行培養(yǎng)的發(fā)酵部分11和電滲析裝置12之間循環(huán)，接著電滲析裝置12進(jìn)行滲析時，濃縮乳酸鹽則經(jīng)過回收乳酸循環(huán)泵14，由乳酸抽提泵15從發(fā)酵液中被抽提出來，抽提出乳酸鹽的發(fā)酵液同時加到發(fā)酵部分11中。部分這樣返回的發(fā)酵液，被廢微生物細(xì)胞-廢培養(yǎng)基抽提泵16抽提排出發(fā)酵設(shè)備10，從而阻止微生物死細(xì)胞在培養(yǎng)基中的量過度上升。另外，在制造乳酸的發(fā)酵裝置10中，用原料泵17將發(fā)酵原料適當(dāng)?shù)丶尤氚l(fā)酵部分11，以保證連續(xù)發(fā)酵得到乳酸鹽，并且測定發(fā)酵部分11中發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值，當(dāng)測得的pH值需要調(diào)整到下文將特別敘述的預(yù)定值時，就通過堿供給泵18將堿溶液加入培養(yǎng)基中。
發(fā)酵部分11是上述發(fā)酵裝置10的組成部分，對它沒有特別的限制。可以是普通的攪拌型發(fā)酵罐、裝有膠粒的柱式反應(yīng)器，膠?？扇缟厦婀潭ㄓ性鲋澄⑸锛?xì)胞的褐藻酸鈣膠體顆粒，或膜式反應(yīng)器，膜上有高密度吸著的微生物細(xì)胞。發(fā)酵裝置11最好裝有各種傳感裝置，能夠測定以下數(shù)值，如乳酸濃度、培養(yǎng)基的pH值或電導(dǎo)率，這些下文將特別敘述。
對于電滲極裝置12，只要求它能夠從發(fā)酵液中滲析乳酸鹽，而不限是什么類型的結(jié)構(gòu)。例如可以使用一種適應(yīng)于連續(xù)操作的電滲析裝置，其中裝有多個滲析室，如圖2所示的用于實(shí)施本發(fā)明方法的電滲析裝置的結(jié)構(gòu)即可采用。
如圖2所示，用于本發(fā)明方法的電滲析裝置20就總體結(jié)構(gòu)而言具有陰極21、多組(圖中所示為7組)陽離子交換膜22和陰離子交換膜23、一個陰離子交換膜23、以及陽極24，所述各構(gòu)件按提及的次序連續(xù)排布，使得由離子交換膜22和23分隔成的各區(qū)域順續(xù)構(gòu)成陰極室25、多對(圖中所示為7對)稀釋室26和濃縮室27、以及陽極室28。當(dāng)發(fā)酵液到達(dá)稀釋室26時，堿性離子透過陽離子交換膜22朝陰極21的方向運(yùn)動，乳酸根離子透過陰離子交換膜23朝陽極24的方向運(yùn)動，乳酸在濃縮室27中被濃縮。當(dāng)使用氨來實(shí)現(xiàn)pH的調(diào)整時，硫酸銨環(huán)流至陰極室25和陽極室28。其結(jié)果是，陰極室25和陽極室28中的液體可選擇性地循環(huán)流動，已從與陰極室25相鄰的稀釋室26中流入陰極室25的堿從陽極室28運(yùn)動至與陽極室28相鄰的濃縮室27。在電滲析裝置20中，由于發(fā)酵液既不允許與電極21和24接觸也不允許在稀釋室26的內(nèi)部形成任何可注意到的pH梯度，因而甚至當(dāng)發(fā)酵液直接加入到電滲析裝置20中時也不會殺死發(fā)酵液中所含的微生物細(xì)胞。這一事實(shí)構(gòu)成本發(fā)明的一個特征。
再有，電滲析裝置20可實(shí)現(xiàn)對乳酸鹽全部程度的提純，因?yàn)樗粌H能從由電滲析所得到的乳酸鹽中除去微生物細(xì)胞而且還能除去非離子性的有機(jī)物質(zhì)和大分子化合物。與使發(fā)酵液通過膜的通用分離相比較，所述電滲析裝置還能大量節(jié)約能量實(shí)現(xiàn)微生物細(xì)胞的分離，因?yàn)樵陔姖B析裝置20中滲析的量少，而且在離子交換膜22和23的表面沉積損失的微生物細(xì)胞的數(shù)量成比例地減少。
當(dāng)連續(xù)發(fā)酵使微生物細(xì)胞密度增加，并因而使電滲析裝置的離子交換膜22和23堵塞或使電流效率嚴(yán)重降低的情況下，在發(fā)酵液流經(jīng)電滲析裝置20之前必須從發(fā)酵液中分離并除去微生物細(xì)胞。用于這種分離的裝置沒有特別的限制。它可以是適于通過使用膜或經(jīng)離心分離實(shí)現(xiàn)這種分離的任何通用裝置。
當(dāng)所述分離微生物細(xì)胞的裝置與電滲析裝置分開安裝時，這一分離裝置會有不可避免的大體積，如上所述的這一事實(shí)成為經(jīng)濟(jì)上的障礙。用于本發(fā)明的電滲析裝置就其自身的結(jié)構(gòu)來說比用于生產(chǎn)游離乳酸的電解裝置便宜的多。因而，包含上述裝置的整體系統(tǒng)證明是足夠經(jīng)濟(jì)的。
當(dāng)微生物細(xì)胞是根霉菌(Rhizopus)屬微生物時，則不再必須安裝上述用于分離的特殊裝置，因?yàn)榕囵B(yǎng)基和微生物細(xì)胞的分離易于實(shí)現(xiàn)。但在這種情況下需要安裝一個滅菌裝置，它應(yīng)能夠殺死微生物細(xì)胞，目的在于防止菌絲或孢子流入電滲析裝置并防止微生物細(xì)胞固定在電滲析裝置上并在該處生長。考慮到操作的簡便性在這種情況下滅菌裝置以依靠熱作用的類型為好。自然地允許采用使用其經(jīng)滅菌手段的裝置來替代。
在本發(fā)明的電滲析發(fā)酵方法中，最好在全部發(fā)酵過程中將用于發(fā)酵的培養(yǎng)基的pH控制在4至8的最佳范圍內(nèi)，優(yōu)選5至7，pH的控制考慮到在發(fā)酵部分微生物的培養(yǎng)基通過添加堿來實(shí)現(xiàn)，考慮到隨后的提純過程通過添加氨或氨水來實(shí)現(xiàn)。在這種方法中，發(fā)酵能夠以高效率進(jìn)行而不會引起任何由產(chǎn)物造成的抑制，其手段是通過電滲析從發(fā)酵液中將形成的乳酸鹽分離，回收滲析的乳酸鹽，使?jié)B析后余留的發(fā)酵液經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)返回至發(fā)酵部分，將pH值、電導(dǎo)率、以及用于發(fā)酵的全部培養(yǎng)基中包括發(fā)酵液在內(nèi)的乳酸鹽的濃度控制在所需的值。
通過使存在于發(fā)酵部分的發(fā)酵液中的乳酸鹽濃度保持在可能的最低值，發(fā)酵速率可被提高。然而當(dāng)乳酸鹽濃度降低時，用于發(fā)酵的培養(yǎng)基的電導(dǎo)率成比例地下降，處理具該性質(zhì)的發(fā)酵液的電滲析過程的電流效率降低，電滲析裝置的生產(chǎn)率減少，而且同時，要滲析的其它組分的數(shù)量增加，工序中發(fā)酵的選擇性從而受到不利影響。因而，在發(fā)酵液中乳酸鹽的濃度適宜于保持在0.2至2%(重量)范圍內(nèi)。
可通過任何通用方法來實(shí)現(xiàn)對發(fā)酵液中乳酸鹽濃度的控制。當(dāng)發(fā)酵液中乳酸鹽濃度低時，發(fā)酵速率可被提高，然而，當(dāng)電滲析裝置以發(fā)酵液中這樣低的乳酸鹽濃度連續(xù)操作時，電滲析裝置的產(chǎn)率降低，因?yàn)榻档土藛挝浑x子交換膜表面積上電流，從而降低了電流密度。通過設(shè)定發(fā)酵液中乳酸鹽濃度的上限和下限并經(jīng)把乳酸鹽濃度保持在該范圍的開-關(guān)控制重復(fù)電滲析裝置的起動和停止操作，可實(shí)現(xiàn)所述系統(tǒng)的高操作效率。在未分離微生物細(xì)胞的發(fā)酵液直接循環(huán)至電滲析裝置的情況下，具有圖2所示結(jié)構(gòu)的電滲析裝置例如適宜于下述設(shè)計(jì)而成通過中斷向電滲析裝置的電極流通電流使乳酸鹽的滲析操作獨(dú)自停止，而不是停止發(fā)酵液的循環(huán)，來防止微生物細(xì)胞在電滲析裝置內(nèi)部沉積，發(fā)酵液可向下經(jīng)由離子交換膜分隔成的稀釋室流過并循環(huán)。
流向電滲析裝置的電極的電流流動中斷直接導(dǎo)致電滲析裝置的操作速率降低。按如下手段實(shí)際上可使電滲析裝置的操作速率增加至100%，即，使一個電滲析裝置負(fù)責(zé)多個發(fā)酵部分，并按照它們在發(fā)酵液循環(huán)中的預(yù)定的選擇性將這些發(fā)酵部分與電滲析裝置接通從而控制乳酸鹽濃度。
通過測量用于發(fā)酵部分發(fā)酵液的培養(yǎng)基的電導(dǎo)率可以容易地選定啟動或停止電滲析裝置操作的時間或接通上述發(fā)酵部分的時間。通常是通過電導(dǎo)率來控制電滲析。在電滲析生產(chǎn)乳酸的通用方法中，是根據(jù)發(fā)酵部分發(fā)酵液中乳酸鹽濃度的測量進(jìn)行電滲析裝置控制的。本發(fā)明人的研究證實(shí)，既使用于發(fā)酵的培養(yǎng)基含有大量的其它無機(jī)鹽以及外來物質(zhì)并具有大的緩沖能力，測量電導(dǎo)率即可滿意地推算乳酸鹽濃度。根據(jù)這一知識，通過使用與電滲析發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的通用方法中采用的類似傳感器相比很簡單的電導(dǎo)率傳感器，本發(fā)明的方法能夠?qū)崿F(xiàn)對電滲析發(fā)酵的控制。因?yàn)樗紤]的電導(dǎo)率與乳酸鹽濃度相關(guān)連，所以僅需使之對應(yīng)于介于上述0.2至2%(重量)范圍內(nèi)的乳酸濃度。具體地說，該電導(dǎo)率適宜于調(diào)整至落入1至30ms/cm的范圍內(nèi)，優(yōu)選5至15ms/cm。當(dāng)電滲析裝置如上所述間歇操作時，設(shè)定發(fā)酵部分電導(dǎo)率的上限和下限，使得當(dāng)發(fā)酵部分隨著發(fā)酵的進(jìn)行乳酸鹽濃度增加且用于發(fā)酵的培養(yǎng)基的電導(dǎo)率達(dá)到上限時起動電滲析裝置的操作，當(dāng)隨著電滲析的進(jìn)行發(fā)酵部分乳酸濃度下降且用于發(fā)酵的培養(yǎng)基的電導(dǎo)率達(dá)到下限時停止電滲析裝置操作。當(dāng)一個電滲析裝置負(fù)擔(dān)多個發(fā)酵部分時，通過設(shè)定電導(dǎo)率的下限并重復(fù)一工作步驟來實(shí)現(xiàn)，該步驟包括當(dāng)正在進(jìn)行滲析操作的發(fā)酵部分的發(fā)酵培養(yǎng)基的電導(dǎo)率達(dá)到下限時，將滲析操作中發(fā)酵部分轉(zhuǎn)換至另一個發(fā)酵部分，該部分的發(fā)酵培養(yǎng)基的電導(dǎo)率高于下限，從而對多個發(fā)酵部分逐次連續(xù)地進(jìn)行所述操作。
就電滲析發(fā)酵的控制而言，必須進(jìn)行乳酸鹽電滲析發(fā)酵方法的一個優(yōu)點(diǎn)是該系統(tǒng)能夠穩(wěn)定地進(jìn)行操作而不會產(chǎn)生任何明顯的故障，因?yàn)槌姖B析的控制之外還通過添加堿如氨水對發(fā)酵部分的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH進(jìn)行了控制，因?yàn)樵诓僮髦邪l(fā)酵部分乳酸濃度的偶然增加實(shí)際上不會產(chǎn)生故障。
對于電滲析的選擇性來說，很明顯，作為微生物培養(yǎng)基的其它必要組分即無機(jī)鹽在乳酸滲析時從發(fā)酵液中被滲析除去。然而在電滲析發(fā)酵分批進(jìn)行的情況下，已經(jīng)證實(shí)當(dāng)發(fā)酵開始前使所述無機(jī)鹽以適當(dāng)?shù)牧看嬖谟谂囵B(yǎng)基中時，在發(fā)酵的進(jìn)程中其發(fā)酵液中不重新添加無機(jī)鹽就可以完成發(fā)酵過程。這一情況可由如下的推測來解釋，即，在發(fā)酵的初始階段，所存在的無機(jī)鹽被包含在微生物細(xì)胞內(nèi)，而所述微生物細(xì)胞提供了足夠的無機(jī)鹽來進(jìn)行一批發(fā)酵。例如含有足夠必需無機(jī)鹽的玉米漿不需要補(bǔ)加無機(jī)鹽，無論電滲析發(fā)酵是分批還是連續(xù)進(jìn)行。在使用酵母提取物作為營養(yǎng)源且必需另外添加無機(jī)鹽的情況下，按如下手段使所述微生物有效地利用無機(jī)鹽，即，為了提高電滲析的選擇性和防止無機(jī)鹽的損失在開始發(fā)酵時使無機(jī)鹽少量存在，在開始電滲析后，當(dāng)按上述的電滲析控制方法電滲析裝置中斷操作或當(dāng)先前正進(jìn)行電滲析的發(fā)酵部分轉(zhuǎn)換成另一個發(fā)酵部分并隨之與電滲析裝置分開時，向該發(fā)酵部分中補(bǔ)加無機(jī)鹽。
構(gòu)成發(fā)酵主要原料包含在發(fā)酵部分培養(yǎng)基中的糖例如是如上所述的D-葡萄糖、蔗糖和乳糖。由于在乳酸鹽電滲析的同時經(jīng)過上述圖2所示結(jié)構(gòu)的裝置中的隔離離子交換膜這些糖從稀釋室向濃縮室運(yùn)動，糖成分的循環(huán)和回收比值下降，其選擇性也成比例下降。一般來說，給定物質(zhì)透過離子交換膜的容易程度隨著該物質(zhì)的分子量的減少而成比例地增加。在使用葡萄糖作為原料中的糖組分用于分批電滲析發(fā)酵的情況下，例如，在充填的原料中糖濃度是10%(重量)時，則充填的葡萄糖的5至10%(重量)在發(fā)酵結(jié)束時不可避免的會向濃縮室運(yùn)動，雖然根據(jù)離子交換膜的種類和電滲析的操作條件其數(shù)量有所改變。因而通過如下途徑可將由于移至濃縮室而損失的糖組分的量抑制在一低值，即，添加的糖組分的量為能使發(fā)酵液中糖的濃度類似于無機(jī)鹽一樣維持在一低值，且特別是在電滲析的操作啟動之后，當(dāng)按上述的電滲析控制方法電滲析裝置的操作中斷時或當(dāng)先前正進(jìn)行電滲析的發(fā)酵部分轉(zhuǎn)換成另一個發(fā)酵部分并隨之與電滲析裝置分開時，向發(fā)酵部分補(bǔ)加糖組分。
另外，發(fā)酵原料的損失通過使用大分子量物質(zhì)淀粉、或淀粉的部分水解物糊精作為發(fā)酵原料得以大大抑制。常常，如淀粉這類一般具有大分子量的物質(zhì)不易被乳酸菌吸收。在這種情況下，發(fā)酵液可含有液化酶或糖化酶作為輔助組分。
當(dāng)本發(fā)明的電滲析發(fā)酵采用連續(xù)操作時，可采用高密度培養(yǎng)方法用于發(fā)酵培養(yǎng)基中的微生物細(xì)胞。通過連續(xù)或間歇向發(fā)酵部分添加新的培養(yǎng)基并除去和回收由電滲析形成的乳酸鹽從而使微生物細(xì)胞在發(fā)酵部分積累達(dá)到一高密度，則連續(xù)電滲析發(fā)酵能夠獲得比分批電滲析發(fā)酵高的產(chǎn)率。
然而，在發(fā)酵液引入電滲析裝置之前不從發(fā)酵液中分離微生物細(xì)胞的情況下，應(yīng)使用能夠防止微生物細(xì)胞在電滲析裝置內(nèi)沉積并同時將微生物細(xì)胞的密度控制在規(guī)定值以下的裝置。對于普通乳酸菌來說，其細(xì)胞的密度適宜于控制在低于50克/升(以濕物為基準(zhǔn))。對于微生物細(xì)胞密度的控制，可采用例如在電滲析裝置的出口處將返回至發(fā)酵部分的部分細(xì)胞棄掉的方法。
在發(fā)酵液引入電滲析裝置之前經(jīng)透過膜或通過離心從發(fā)酵液中分離微生物細(xì)胞的情況下，發(fā)酵液中微生物細(xì)胞密度不具體限定但可以經(jīng)膜分離裝置或離心分離裝置控制。在這種情況下，可以采用例如通過在用于分離微生物細(xì)胞的裝置的出口處棄掉部分微生物細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)微生物細(xì)胞密度控制的方法。
下面參照工作實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體說明。
實(shí)施例1使用在這一實(shí)施例中所敘述的結(jié)構(gòu)如圖3所示的通過電滲析發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的實(shí)驗(yàn)儀器來實(shí)施本發(fā)明的發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的方法。
如圖3所示，在用于通過電滲析發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的實(shí)驗(yàn)儀器30中，內(nèi)容積為3升的發(fā)酵器罐31與電滲析裝置32(由Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生產(chǎn)，以Microacylizer的商標(biāo)市售;可利用的起電表面積0.55dm2，15cp，離子交換膜片(Cartridge) AC-220)相互連接形成一循環(huán)系統(tǒng)。向發(fā)酵器罐31中提供含有200g葡萄糖和80g玉米漿并用高壓消毒鍋滅菌的1920ml培養(yǎng)基。向發(fā)酵器罐31的培養(yǎng)基中添加通過在下面表1所示組成的培養(yǎng)基中培養(yǎng)之rhamnosus乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus)IFO 3863所預(yù)先獲得的菌種培養(yǎng)液80ml，以啟動發(fā)酵。
表1<
連于發(fā)酵器罐31上的加熱器和攪拌器在42℃的發(fā)酵溫度100rpm的攪拌速率下開動和操作，也與發(fā)酵器罐31相連的pH電極33施壓測量發(fā)酵器罐31中的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH。當(dāng)如此測量的pH低于規(guī)定值時，pH電極33發(fā)出信號開動氨水加料泵34由氨水存貯器35向發(fā)酵器罐31中添加10%的氨水，將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH維持在6.0左右。
然后，在發(fā)酵開始后，當(dāng)連接于發(fā)酵器罐31的電導(dǎo)率電極36所測量的發(fā)酵培養(yǎng)基的電導(dǎo)率達(dá)到26ms/cm時，起動發(fā)酵液循環(huán)泵37向電滲析裝置32添加發(fā)酵液，同時電導(dǎo)率電極36發(fā)出信號啟動電滲析裝置32電極的電源。當(dāng)電導(dǎo)率電極36測量的電導(dǎo)率達(dá)至12ms/cm時，電導(dǎo)率電極36發(fā)出信號關(guān)閉電源。供給電極的電源中斷直到電導(dǎo)率電極36測量的電導(dǎo)率恢復(fù)到26ms/cm。在啟動發(fā)酵液循環(huán)泵37操作的同時開動回收的乳酸銨水溶液循環(huán)泵38，以回收在乳酸銨水溶液回收容器39中濃縮并分離的乳酸銨。之后，通過類似地執(zhí)行電滲析裝置32的電極供給電源的開-關(guān)控制使發(fā)酵繼續(xù)進(jìn)行。以固定的電流強(qiáng)度1.0A進(jìn)行通電。在系統(tǒng)開始操作后發(fā)酵液循環(huán)泵37和乳酸銨水溶液回收容器39不停地工作直到發(fā)酵結(jié)束，不論接通電滲析裝置32電極的電源是開啟/關(guān)閉。
由于通過上述電導(dǎo)率對電滲析進(jìn)行了控制，發(fā)酵液中乳酸銨的濃度恒定保持在2.0至1.0%(重量)的范圍內(nèi)，且36小時后發(fā)酵結(jié)束。通電總時間為4.0小時。在回收容器39中漏入的葡萄糖是初始充填葡萄糖重量的5.9%。
當(dāng)以相同的培養(yǎng)基經(jīng)普通的分批發(fā)酵時，完成發(fā)酵所需的總時間是57小時。
實(shí)施例2按照實(shí)施例1所述的步驟進(jìn)行發(fā)酵，不同之處是在經(jīng)電滲析開-關(guān)控制的每批量電滲析結(jié)束時在發(fā)酵器罐32的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加以下表2所示的無機(jī)鹽。
表2
發(fā)酵基本上如同實(shí)施例1那樣平穩(wěn)地進(jìn)行，并在36小時后結(jié)束。通電總時間為4.3小時。在回收容器39中漏入的葡萄糖是初始充填葡萄糖重量的6.7%。
實(shí)施例3按照與實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行發(fā)酵，其中對通向電滲析裝置32電極的電源持續(xù)進(jìn)行開-關(guān)控制使得由電導(dǎo)率電極36測量的電導(dǎo)率保持在6至13ms/cm的范圍內(nèi)。電源的電流強(qiáng)度恒定為0.7A。
發(fā)酵液中乳酸銨的濃度恒定保持在0.5至1.0%(重量)，完成發(fā)酵的時間縮短至28小時。通電總時間為6.8小時。在回收容器39中漏入的葡萄糖是初始充填葡萄糖重量的9.6%。
實(shí)施例4使用結(jié)構(gòu)如圖4所示的實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)施本發(fā)明發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的方法，且按照本實(shí)施例所敘述通過電滲析發(fā)酵來生產(chǎn)乳酸。
圖4中的實(shí)驗(yàn)儀器40等同于實(shí)施例1中敘述的圖3中的實(shí)驗(yàn)儀器，不同之處是，在發(fā)酵部分31和電滲析裝置32之間插入與精密過濾膜組件42配用的循環(huán)泵41、精密過濾膜組件42(由Asahi Medical K.K.生產(chǎn)，以產(chǎn)品碼“AHF-Ma”市售，使用內(nèi)徑為370μm、長183mm、孔尺寸為0.2μm的二乙酸纖維素空心纖維)、以及連接精密過濾膜組件42和電滲析裝置32的液體貯存器43。在這一實(shí)驗(yàn)儀器的實(shí)際操作中，按照實(shí)施例1中的步驟進(jìn)行發(fā)酵，而當(dāng)由電導(dǎo)率電極36測量的電導(dǎo)率達(dá)到26ms/cm之后，起動配置于精密過濾膜組件的循環(huán)泵41以將發(fā)酵液輸送至精密過濾膜組件42并將經(jīng)膜分離微生物細(xì)胞后余下的發(fā)酵液輸送至液體貯存器43，并接著起動發(fā)酵液循環(huán)泵37以將液體貯存器43中的發(fā)酵液添加到電滲析裝置32中使之在其中電滲析。為精密過濾膜組件配置的循環(huán)泵41在系統(tǒng)開始操作后不停地操作，直到發(fā)酵結(jié)束，不論通向電滲析裝置32電極的電源是開啟/關(guān)閉狀態(tài)。
發(fā)酵液中乳酸銨濃度保持在2.0至1.0%(重量)的范圍內(nèi)，完成發(fā)酵所需的時間是36小時，與實(shí)施例1的時間相同。通電總時間是3.5小時。回收容器39中漏入的葡萄糖是初始充填葡萄糖重量的5.9%。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的方法，特征在于令發(fā)酵液在能于培養(yǎng)基中積累乳酸鹽的微生物進(jìn)行培養(yǎng)的發(fā)酵部分和電滲析裝置之間循環(huán)，并用所述的電滲析裝置將所述的乳酸鹽從所述的發(fā)酵液中除去。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的電滲析裝置的操作間歇進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的電滲析裝置與多個發(fā)酵部分相連，在所述的多個發(fā)酵部分中的發(fā)酵液可在也可不在所述電滲析裝置和所述發(fā)酵部分之間循環(huán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中發(fā)酵用原料是借助在所述電滲析裝置操作中止時，向所述發(fā)酵部分中補(bǔ)充而提供的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中通過向所述發(fā)酵部分中部分補(bǔ)充供給的發(fā)酵用原料是糖和/或無機(jī)鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，所述電滲析裝置的操作受發(fā)酵培養(yǎng)基的電導(dǎo)率的控制。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的能夠積累乳酸鹽的微生物是屬于乳酸桿菌、乳球菌、芽孢桿菌、芽孢乳桿菌屬之一的微生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中，將發(fā)酵液引入到所述電滲析裝置中，而所述微生物的細(xì)胞已經(jīng)通過微生物細(xì)胞分離裝置從該發(fā)酵液中分離出去。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，所述的能夠積累乳酸鹽的微生物是屬于根霉屬的微生物，而其中含有微生物細(xì)胞的發(fā)酵液經(jīng)過殺菌裝置的介質(zhì)殺菌后被引入到電滲析裝置中。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，所述發(fā)酵部分中的培養(yǎng)基和微生物細(xì)胞被部分抽提，并向所述發(fā)酵部分中加入新的培養(yǎng)基使發(fā)酵能連續(xù)進(jìn)行。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，所述的乳酸鹽是乳酸銨，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值受氨的控制。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用現(xiàn)行電滲析發(fā)酵制乳酸，特別是乳酸銨的方法。實(shí)現(xiàn)發(fā)酵制造的方法的特征是令發(fā)酵液在能于培養(yǎng)基中積累乳酸鹽的微生物進(jìn)行培養(yǎng)的發(fā)酵部分與電滲析裝置之間循環(huán)，用電滲析裝置將形成的乳酸從發(fā)酵部分中除去。本發(fā)明最大的優(yōu)點(diǎn)是易于制得粗提純?nèi)樗猁}特別是乳酸銨的水溶液，并能提高電滲析裝置的生產(chǎn)效率。
文檔編號C12R1/225GK1108304SQ9411279
公開日1995年9月13日 申請日期1994年12月8日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月8日
發(fā)明者三浦重信, 熊谷晃 申請人:株式會社武藏野化學(xué)研究所