專利名稱：高溫、高傳真脫氧核糖核酸(DNA)聚合酶(HiFi Bst)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于DNA順序測定的聚合酶和它的分析系統(tǒng)。
我們從嗜熱脂防芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)中制備得到DNA聚合酶，進(jìn)而又用Subtilisin將此DNA聚合酶水解成二個片段。其中一個大片段定名為Bst。經(jīng)過反復(fù)研究，證明Bst具有如下九個重要的技術(shù)指標(biāo)(1)Bst可在65—70℃測定DNA順序，從而消除堆積現(xiàn)象；(2)在此高溫條件下，無非專一的引物與模塊的結(jié)合，從而消除了雜帶；(3)包括胞嘧啶在內(nèi)的所有四種核苷酸都能均勻地滲入，消除了“C”不清的現(xiàn)象；(4)此高溫DNA順序測定系統(tǒng)既可用于標(biāo)準(zhǔn)的Sanger一步法，也可用于將同位素標(biāo)記和聚合—終止反應(yīng)分開的二步法；(5)此高溫體系同樣適用于雙鏈DNA順序測定；(6)此高溫體系同樣適用于36S標(biāo)記和32P標(biāo)記的核苷酸；(7)二種去壓縮劑—7-deaza-dGTP和dITP均可在此高溫體系中使用；(8)此高溫體系在室溫可放置二個星期而不失活力，充分滿足了DNA順序測定自動化的高穩(wěn)定性要求；(9)此高溫體系既適用于熒光法自動化DNA順序測定，也適用于放射性同位素法自動化DNA順序測定。
經(jīng)與其他DNA聚合酶比較，Bst的特點總結(jié)如下；
從上表可看出，Bst的特性使它成為測定DNA順序的理想的酶。從上表也可看出，關(guān)于Bst的3′→5′外切酶的特性不知。而其余的酶均沒有3′→5′活力(Klenow具有較低的3′→5′活力。由于Klenow的延伸率不高，條帶均一性差，及順序測定溫度低，在DNA順序測定中已不應(yīng)用)。
我們用紫外線處理Bacillus Stearothermophilus獲得高產(chǎn)菌Mo-1。從Mo-1中獲得HiFi Bst。用雙鏈DNA作模板，證明HiFi Bst有3′→5′外切酶活力，并具有如下兩個特性；(1)它切除配對的核苷酸，也切除不配對的核苷酸。(2)切除不配對的核苷酸的速度大于切除配對核苷酸的速度。這兩個特性是目前國際上所有用于DNA順序測定的DNA聚合酶所沒有的，從而使HiFi Bst具有特殊的高度校正活力。本發(fā)明提供了DNA順序測定中校正活力最好的DNA聚合酶HiFi Bst，因為HiFi Bst可以有效切除不配對的核苷酸，使DNA順序反應(yīng)具有獨特的專一性，從而保證了DNA順序測定圖譜的高質(zhì)量。
本文中簡寫說明TE100mmol/L Tris(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)HiFi Bst反應(yīng)緩沖液15mM Tris-Cl，pH8.5，15mM MgCl2DE-81whatman產(chǎn)品

圖1是活力測定結(jié)果 HiFi Bst切除非配對核苷酸的活力反應(yīng)■HiFi Bst切除配對核苷酸的活力反應(yīng)X軸單位小時Y軸計數(shù)/30秒(由FH-408自動定標(biāo)器測定)在下述的實施例中對本發(fā)明進(jìn)行具體的描述實施例1高溫、高傳真DNA聚合酶(HiFi Bst)的制備嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)，經(jīng)紫外線處理獲得高產(chǎn)菌Mo-1，經(jīng)制備得到DNA聚合酶，進(jìn)而用枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin)將此DNA聚合酶水解成二個片段[Ye，S.and Hong，G.，Scientia Sinica，30，503-506(1987)]，其中大片段即是高溫、高傳真DNA聚合酶(HiFi Bst)。
實施例2引物的設(shè)計5′ C A T T T T G C T G C C G G T C A3′
實施例3DNA模板設(shè)計(a)3′——G T A A A A C G A C G G C C A G T C T T——5′(b)3′——G T A A A A C G A C G G C C A G T C G G——5′實施例4引物的同位素標(biāo)記5′ C A T T T T G C T G C C G G T C A3′——G T A A A A C G A C G G C C A G T C T T——↓ α32pdATP，dGTP，Taq酶C A T T T T G C T G C C G G T C A G A* A*(*表示32P標(biāo)記)實施例5將標(biāo)記引物與DNA模板配對引物＋ ＋DNA模板(a) DNA模板(b) 5′C A T T T T G C T G C C G G T C A G A*A* 3′3′——G T A A A A C G A C G G C C A G T C G G——5′5′C A T T T T G C T G C C G G T C A G A* A* 3′3′——G T A A A A C G A C G G C C A G T C T T —5′實施例6HiFi Bst切除配對核苷酸的活力的測定將退火的模板DNA(a)和標(biāo)記的引物混合物溶于10μl TE中，加入4μl HiFi Bst反應(yīng)緩沖液，2單位HiFi Bst酶，加水至20μl，充分混合后，以3μl/管分裝入多個0.5ml微型離心管中，再加3μl石蠟油封管，置65℃水浴中保溫。每間隔一定時間取出一管，將管內(nèi)反應(yīng)混合物滴到DE-81紙上，在定標(biāo)儀上進(jìn)行初級計數(shù)。然后用0.3M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)洗滌三次，每次10分鐘，然后進(jìn)行第二次計數(shù)，二次計數(shù)之差即為被HiFi Bst切除的游離的同位素的量。外切酶活力以單位時間內(nèi)產(chǎn)生游離同位素的量表示。
實施例7HiFi Bst切除非配對核苷酸的活力的測定將退火的模板DNA(b)和標(biāo)記的引物混合物溶于10μl TE中，加入4μl Bst反應(yīng)緩沖液，2單位HiFi Bst酶加水至20μl，充分混勻后，以3μl/管分裝入多個0.5ml微型離心管中，再加入3μl石蠟油封管，置65℃水浴中保溫。每間隔一定時間取出一管，將管內(nèi)反應(yīng)混合物滴到DE-81紙上，在定標(biāo)儀上進(jìn)行初級計數(shù)。然后用0.3M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)洗滌三次，每次10分鐘，然后進(jìn)行第二次計數(shù)，二次計數(shù)之差即為被HiFi Bst切除的游離的同位素的量。外切酶活力以單位時間內(nèi)產(chǎn)生游離同位素的量表示。
權(quán)利要求
1.一種用于DNA順序測定的高溫、高傳真DNA聚合酶(HiFi Bst)和它的分析系統(tǒng)，其特征在于(1)它切除配對的核苷酸，也切除不配對的核苷酸；(2)切除不配對的核苷酸的速度大于切除配對核苷酸的速度；(3)引物的設(shè)計為5′ C A T T T T G C T G C C G G T C A3′(4)DNA模板設(shè)計(a)3′——G T A A A A C G A C G G C C A G T C T T——5′(b)3′——G T A A A A C G A C G G C C A G T C G G——5′(5)引物的同位素標(biāo)記5′ C A T T T T G C T G C C G G T C A3′——G T A A A A C G A C G G C C A G T C T T——↓ α32pdATP，dGTP，Taq酶C A T T T T G C T G C C G G T C A G A* A*(*表示32P標(biāo)記)(6)將標(biāo)記引物與DNA模板配對引物＋ ＋DNA模板(a) DNA模板(b) 5′C A T T T T G C T G C C G G T C A G A* A* 3′3′——G T A A A A C G A C G G C C A G T C G G——5′5′C A T T T T G C T G C C G G T C A G A* A* 3′3′——G T A A A A C G A C G G C C A G T C T T —5′
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的高溫、高傳真DNA聚合酶(HiFi Bst)其特征在于是用紫外線處理嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearother-mophilus)，獲得高產(chǎn)菌，從中制備的DNA聚合酶，再經(jīng)枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin)將此酶水解成二個片段，其中大片段即是HiFi Bst。
全文摘要
本發(fā)明表明，一種將嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)，經(jīng)紫外線等處理制備所獲得的高溫、高傳真DNA聚合酶(HiFi Bst)。具有高效地切除不配對的核苷酸的活力，使DNA順序反應(yīng)具有獨特的專一性，從而保證了DNA順序測定圖譜的高質(zhì)量。
文檔編號C12N9/12GK1123328SQ94113990
公開日1996年5月29日 申請日期1994年11月17日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月17日
發(fā)明者洪國藩, 翟峰 申請人:中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所