專利名稱：應(yīng)用金黃地鼠腎原代細(xì)胞生產(chǎn)流行性出血熱滅活疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及流行性出血熱疫苗，特別是涉及應(yīng)用金黃地鼠腎細(xì)胞為細(xì)胞基質(zhì)和以適應(yīng)于金黃地鼠腎細(xì)胞的流行性出血熱病毒株為毒種，生產(chǎn)流行性出血熱滅活疫苗的方法。
流行性出血熱又名腎綜合癥出血熱(簡(jiǎn)稱EHF或HFRS)，是以鼠作為傳播媒介的自然疫源性疾病，是一種嚴(yán)重危害人民健康的病毒性急性傳染病。近年來(lái)，全世界每年有15萬(wàn)病例，死亡率達(dá)3%～10%。流行疫區(qū)在不斷擴(kuò)大，重癥型疫區(qū)主要發(fā)生在亞洲和歐洲的東部，輕癥型遍及全世界。在中國(guó)，已有26個(gè)省、市、自治區(qū)有本病的發(fā)生和不同程度的流行。1986年曾發(fā)生11萬(wàn)病例，這對(duì)人民的健康和國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展均造成嚴(yán)重影響。為此，對(duì)疫區(qū)高危人群以及將進(jìn)入疫區(qū)工作或旅游的人們進(jìn)行特異性免疫接種，是降低發(fā)病率，有效控制本病的暴發(fā)流行的根本途徑。
八十年代初期，韓國(guó)李鎬汪首先報(bào)告從自然界分離到流行性出血熱病原確認(rèn)病毒(LeeHW.eTal.JinfectDis146，638，1982)，此后，國(guó)內(nèi)外許多研究者都著手進(jìn)行流行性出血熱滅活疫苗的研究。韓國(guó)LeeHW首先研制出乳鼠腦提純疫苗(LeeHW.eTal.Archvirol[suppl，Ⅰ]，35，1990)，朝鮮金洛濟(jì)等研制出白鼠和地鼠乳鼠腦提純疫苗(金洛濟(jì)等，中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志5，487，1991)。在中國(guó)，蘭州生研所亦研制出鼠腦提純疫苗(孫柱臣等，中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志3〈特刊7期〉，203，1992)，上海生研所和浙江省防疫站研制出長(zhǎng)瓜沙鼠腎細(xì)胞疫苗(朱智勇等，中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志3〈特刊7期〉，279，1992)，流研所研制了雞胚細(xì)胞疫苗(嚴(yán)玉臣等，中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志3166，1992)，檢定所研制了Vero細(xì)胞疫苗(聶子林等中國(guó)生物制品學(xué)雜志417，1991)。
本發(fā)明的主要目的是提供一種以金黃地鼠腎細(xì)胞作為感染病毒的細(xì)胞基質(zhì)，制備流行性出血熱滅活疫苗的方法。其要點(diǎn)是選用已知的JR毒株或L99毒株感染金黃地鼠腎細(xì)胞，以制備Ⅰ型(野鼠型)或Ⅱ型(家鼠型)或雙價(jià)型流行性出血熱滅活疫苗。
本發(fā)明的另一個(gè)主要目的是提供一種對(duì)流行性出血熱病毒株敏感的金黃地鼠腎細(xì)胞的制備方法。該方法包括在無(wú)菌室內(nèi)取10～14日齡金黃地鼠腎臟，用胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)2-3日，得到可供感染病毒的細(xì)胞單層。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種對(duì)流行性出血熱疫苗半成品進(jìn)行濃縮提純的方法。該方法是將半成品疫苗液經(jīng)高速離心和G2濾球過(guò)濾后進(jìn)行超濾透析濃縮，再經(jīng)CellufinlSulfategel層析柱提純。
Ⅰ、流行性出血熱疫苗毒種的制備將分離自吉林省延邊地區(qū)的發(fā)病家兔的腎組織標(biāo)本[即JR毒株，引自《中國(guó)公共衛(wèi)生學(xué)報(bào)》9(2)74，1990]或分離自江西省羅賽鼠的肺組織標(biāo)本[即L99毒株，引自《江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)》(3)1，1984]，先于2-4日齡乳鼠腦腔接種傳代適應(yīng)，當(dāng)病毒感染乳鼠腦腔LD50達(dá)到8.0Log時(shí)，轉(zhuǎn)種于地鼠腎細(xì)胞，并以終末稀釋傳代方法連續(xù)傳10代以上。進(jìn)行到最后一次傳代時(shí)，待毒株感染地鼠腎細(xì)胞7-9天后，用免疫熒光法(IFA)檢查細(xì)胞內(nèi)病毒抗原，當(dāng)感染細(xì)胞IFA達(dá)到+++～++++時(shí)收獲病毒液，加10-20%牛血清分裝后，置-60℃保存。毒種在地鼠腎細(xì)胞進(jìn)行感染性滴定，滴度≥8.5LogTCLD50/ml，支原體檢查和無(wú)菌試驗(yàn)均為陰性。同時(shí)應(yīng)用單克隆抗體分型試劑確定毒種的抗原性和血清型的特異性并且證明毒種內(nèi)無(wú)外源因子。以此毒種作為生產(chǎn)流行性出血熱疫苗的毒種。
Ⅱ、疫苗生產(chǎn)1、制備地鼠腎細(xì)胞選用10-14日齡健康的金黃地鼠，以無(wú)菌手續(xù)取出腎組織，剪碎后加入0.125%胰酶，置4-8℃18-20小時(shí)，棄去胰酶液，用含有0.2%乳白蛋白水解物Earle's液并加有8%小牛血清的營(yíng)養(yǎng)液分散細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，注入10立升培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶注入細(xì)胞懸液1500ml。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置37℃恒溫室，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)2-3日，可形成均勻、致密的細(xì)胞單層。
2、病毒接種與疫苗半成品收獲選擇細(xì)胞單層生長(zhǎng)良好的細(xì)胞培養(yǎng)瓶供感染病毒。如果生產(chǎn)Ⅰ型疫苗需感染JR毒種；如果生產(chǎn)Ⅱ疫苗則需感染L99毒種。感染病毒劑量為3-4LogTCID50/1.0ml。感染用液為2%牛血清，0.2%乳白蛋白水解物Earle's液。將已感染病毒的細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于32-35℃恒溫室內(nèi)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)1-3天，用Earle's液沖洗細(xì)胞，然后再加入0.1%人白蛋白0.07‰半胱氨酸Earle's液浸泡20小時(shí)左右后，再用同法沖洗一次，然后再換入0.2%人白蛋白199綜合培養(yǎng)液，置32-35℃恒溫室繼續(xù)培育。感染病毒后7-9天收獲，先收集培養(yǎng)液，再將細(xì)胞撞下，置-60℃凍融后再與培養(yǎng)液混合，通過(guò)絹布過(guò)濾，抽樣做無(wú)菌試驗(yàn)和病毒滴定。將濾過(guò)后的培養(yǎng)液和細(xì)胞液混合液加入1/4000甲醛溶液(滅活劑)，先置33-37℃24小時(shí)后，轉(zhuǎn)置2-8℃滅活，此即為滅活疫苗的半成品。?、裥秃廷蛞呙绨氤善返攘炕旌峡芍瞥闪餍行猿鲅獰犭p價(jià)疫苗。
如此制得的半成品疫苗液，按新生物制品檢定規(guī)程要求，進(jìn)行原液病毒滴度測(cè)定、抗原量測(cè)定、殘余牛血清含量，滅活安全試驗(yàn)和效力試驗(yàn)等一系列檢驗(yàn)合格后，即可分裝進(jìn)行成品檢查。成品檢定包括無(wú)菌試驗(yàn)，PH值應(yīng)為7.0-8.0、氫氧化鋁含量為0.4-0.7mg/ml、游離甲醛含量不準(zhǔn)超過(guò)0.025%、硫柳汞含量不準(zhǔn)超過(guò)0.01%，小鼠毒性試驗(yàn)4只鼠應(yīng)健存。
3、疫苗的純化濃縮選合格的半成品疫苗液，經(jīng)高速離心(7000rpm40分鐘)去掉大部分細(xì)胞碎片，再用G2濾球過(guò)濾一次，之后經(jīng)超濾進(jìn)行透析濃縮(透析液為PH7.20.2MPB)，用PH7.20.2MPB平衡CellufineSulfategel層析柱，將透析平衡好的疫苗樣品上柱，之后用相同緩沖液洗柱至無(wú)蛋白流出(A280nm監(jiān)測(cè))，換PH8.50.2MPB洗脫病毒蛋白，收集洗脫峰部分，留樣后加防腐劑(120000硫柳汞)放4℃保存。提純樣品檢測(cè)包括殘存牛血清含量測(cè)定(＜50ng/ml)效力檢定(≥120，陽(yáng)轉(zhuǎn)率≥3/4)上述檢測(cè)均合格后，提純疫苗進(jìn)行除菌過(guò)濾，加AL(OH)，至0.5mg/ml，然后，做無(wú)菌試驗(yàn)和熱原試驗(yàn)，合格后進(jìn)行分裝凍干，即為成品。成品檢定包括無(wú)菌試驗(yàn)、毒性試驗(yàn)、防腐劑試驗(yàn)、甲醛測(cè)定，AL(OH)測(cè)定，PH測(cè)定、汞測(cè)定，凍干疫苗的水份含量測(cè)定等，質(zhì)量指標(biāo)以滅活疫苗指標(biāo)為準(zhǔn)。
Ⅲ、人群臨床試用1989年衛(wèi)生部批準(zhǔn)Ⅱ型疫苗首次進(jìn)行臨床觀察，人體接種無(wú)明顯不良反應(yīng)，血清中和抗體全部陽(yáng)轉(zhuǎn)。1990年衛(wèi)生部批準(zhǔn)雙價(jià)疫苗進(jìn)行人體臨床觀察，我們對(duì)206名免疫前血清抗體反應(yīng)陰性的志愿者肌肉注射2針(0-28)，肌肉注射3針(0-28-42；0-7-28)，第一針疫苗接種后56天檢查血清IFAT抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率為95.9%；用ElisA法檢查，抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率為93.5%。用酶斑減少中和試驗(yàn)(EFRNT)檢查對(duì)Ⅱ型病毒中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率為100%；對(duì)Ⅰ型病毒為88.2%。1992年衛(wèi)生部批準(zhǔn)Ⅱ型單價(jià)苗三批進(jìn)行中試1500人Ⅱ期臨床觀察。注射2針(0-28)MCPENT法檢測(cè)中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率為96%，注射3針(0-28-42)陽(yáng)轉(zhuǎn)率為99%。Ⅰ型疫苗于1993年批準(zhǔn)進(jìn)行Ⅱ期臨床觀察，每批觀察500人，注射2針(0-28)中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率為92%，注射3針為93%。Ⅰ型和Ⅱ型疫苗中試三批臨床觀察共接種4000多人，注射第一針出現(xiàn)中強(qiáng)反應(yīng)者為8人，注射第二針和第三針均為22人。中強(qiáng)反應(yīng)率＜1%。證明流行性出血熱Ⅰ型，Ⅱ型和雙價(jià)型疫苗均安全有效。
實(shí)施例時(shí)間94年4月8日～7月19日取12-14日齡的金黃地鼠，處死后用0.3%新潔爾滅消毒。無(wú)菌取腎，剪碎，洗凈血球，加入PH8.0的0.125%的胰酶液，置8℃進(jìn)行冷消化，18-19小時(shí)后取出。棄去胰酶液，用Earle's液洗滌，加少量玻璃珠輕搖5～6次，收集各次懸液，經(jīng)2層紗布過(guò)濾，使細(xì)胞懸干生長(zhǎng)液中(生長(zhǎng)液為8%牛血清乳白蛋白液)，搖勻后分裝到15立升瓶中，每瓶1500毫升，置37℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，三日后，細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層。
選取已長(zhǎng)成致密單層的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，棄去原瓶?jī)?nèi)的生長(zhǎng)液，將毒種稀釋于2%牛血清的乳白蛋白液中，振搖均勻后分裝于培養(yǎng)瓶中，每瓶1500毫升。置33-35℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)2天，棄去病毒液，用Earle's液噴洗，然后加入浸泡液，每瓶1500毫升。浸泡液為0.07‰半胱氨酸Earle's液，含0.1%人白蛋白。浸泡20小時(shí)后，棄去浸泡液，用同上方法再噴洗一次，然后換入細(xì)胞維持液1500毫升。維持液為199綜合培養(yǎng)液含0.2%人白蛋白。將細(xì)胞瓶置33-35℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。8天后進(jìn)行收獲，先收各瓶培養(yǎng)液1200毫升，留存300毫升，將細(xì)胞瓶置-60℃凍5-6小時(shí)后取出，震搖細(xì)胞使其破碎，然后將培養(yǎng)液與細(xì)胞液混合過(guò)濾。按液量加入福爾馬林至14000，硫柳汞120000，充分振搖后置37℃24小時(shí)，再轉(zhuǎn)置4℃14天，在這期間，每天振搖疫苗2次。安全試驗(yàn)合格后加氫氧化鋁佐劑至0.5mg/ml。
上述所收獲的疫苗為半成品，經(jīng)無(wú)菌試驗(yàn)，病毒滴定、抗原量測(cè)定、殘余牛血清含量、病毒滅活安全試驗(yàn)、效力試驗(yàn)等檢定合格之后，進(jìn)行分裝，每支1.2毫升。分裝后進(jìn)行成品檢定，成品檢定包括無(wú)菌試驗(yàn)，外觀檢查、PH值、氫氧化鋁含量、游離甲醛含量、硫柳汞含量、毒性試驗(yàn)等，成品檢定合格后即為流行性出血熱滅活疫苗。
權(quán)利要求
1.一種制備流行性出血熱滅活疫苗的方法。該方法包括應(yīng)用對(duì)流行性出血熱病毒敏感的金黃地鼠腎細(xì)胞作為感染病毒的細(xì)胞基質(zhì)，分別感染JR毒株、L99毒株，制備Ⅰ型、Ⅱ型和雙價(jià)型流行性出血熱滅活疫苗，并對(duì)疫苗進(jìn)行濃縮提純。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的金黃地鼠腎細(xì)胞是指取10-40日齡金黃地鼠腎臟用胰酶消化后，制成細(xì)胞懸液，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)施轉(zhuǎn)培養(yǎng)，制備的單層細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的對(duì)疫苗進(jìn)行濃縮提純是指將半成品疫苗液經(jīng)高速離心，G2濾球過(guò)濾后進(jìn)行超濾透析濃縮，再經(jīng)Cellufine Sulfate gel層析柱提純。
全文摘要
本發(fā)明提供了應(yīng)用對(duì)流行性出血熱病毒敏感的細(xì)胞系統(tǒng)——金黃地鼠腎細(xì)胞制備流行性出血熱I型疫苗、II型疫苗和I型、II型雙價(jià)疫苗以及對(duì)疫苗進(jìn)行濃縮純化的方法。
文檔編號(hào)C12N5/071GK1109782SQ9411520
公開(kāi)日1995年10月11日 申請(qǐng)日期1994年9月21日 優(yōu)先權(quán)日1994年9月21日
發(fā)明者黃永成, 李淑蘭, 郝富勇, 鄭曉麗, 惠連, 王偉, 回良杰, 付增武, 王曉宏, 王琪, 韓亮 申請(qǐng)人:衛(wèi)生部長(zhǎng)春生物制品研究所