專利名稱：酵母凝集基因及含這些基因的醇母的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及凝集酵母的凝集基因及含這些基因的酵母。
在發(fā)酵工業(yè)中，酵母凝集是工業(yè)中的一個重要現(xiàn)象。人們致力于凝集酵母應(yīng)用的研究并力圖揭示引起酵母凝集的原因。目前已經(jīng)知道，酵母凝集是受許多基因控制的，其中，研究得較深入的是一個被稱作FL01的凝集基團(tuán)，它位于酵母染色體I的右臂。
對于由酵母Saccharomyces cerevisiae得到的凝集基因FL01的結(jié)構(gòu)，人們一直未能完全了解。但在1989年，本發(fā)明者等人首先將其克隆，并確定了它的限制酶切圖譜(Watari等，Agricultural andBiological Chemistry.，53(3)，901-903，1989)。(然而，它的堿基序列仍然不清楚)。
我們曾經(jīng)報導(dǎo)過，通過將凝集基因FL01導(dǎo)入各種工業(yè)酵母中，可以將非凝集性工業(yè)酵母轉(zhuǎn)變成可實(shí)際應(yīng)用的凝集酵母(Watari等.，Agricultural and Biological Chemistry.，55(6)，1547-1552，1991)；但是，并不總是能夠使所有工業(yè)酵母具有強(qiáng)而穩(wěn)定的凝集特性。
在這之后，我們繼續(xù)致力于FL01基因的研究，并發(fā)現(xiàn)了我們曾作為FL01基因報導(dǎo)的基因(Watari等.，Agricultural and Bio-logical Chemistry，53(3)，901-903，1989)并不是存在于酵母Sac-charomyces cerevisiae菌株ABXL-1D的染色體I上的完整的FL01基因，而是在大腸桿菌菌株K12中含有完整的FL01基團(tuán)的質(zhì)粒的維持期間，有一部分缺失了的FL01基因(以下，稱該基因?yàn)镕L01S)。
本發(fā)明的目的在于確立完整的FL01基因的結(jié)構(gòu)(以下稱該基因?yàn)镕L01)。并且提供一種能賦予各種工業(yè)酵母更強(qiáng)、更穩(wěn)定的凝集特性的技術(shù)。
現(xiàn)在，本發(fā)明者在對FL01基因進(jìn)行了各種研究的基礎(chǔ)上，已成功地分離出完整的FL01L基因，或者說FL01L基因，測定了該基因的全部堿基序列，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與使用FL01S基因相比，使用FL01L基因能夠培育出具有更強(qiáng)、更穩(wěn)定的凝集能力的可實(shí)際應(yīng)用的各種酵母，由此完成了本發(fā)明。
換言之，本發(fā)明涉及酵母中編碼顯示凝集活性的多肽的4.7±0.2Kb片段的凝集基團(tuán)，本發(fā)明涉及由酵母Saccharomyces cere-visiae得到的、由

圖1的限制酶切圖譜所定義的上述凝集基因。更進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及編碼與順序1所示氨基酸順序大體對應(yīng)的上述凝集基因。
本發(fā)明還涉及酵母中編碼顯示凝集活性的多肽的2.6±0.2Kb片段的凝集基因。本發(fā)明尤其涉及由酵母Saccharomyces cerevisiae得到的、由圖2的限制酶切圖譜所定義的凝集基因。更進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及編碼與順序2所示氨基酸順序大體對應(yīng)的凝集基因。
本發(fā)明還進(jìn)一步涉及含有上述凝集基因或具有凝集特性的酵母。
本說明書中所述的“凝集基因”系用于表示控制酵母凝集的基因。
如上所述，本發(fā)明中的凝集基因可賦予非凝集性酵母Saccha-romyces cerevisiae凝集特性。這里，在發(fā)酵工業(yè)中使用凝集酵母的意義在于1)在發(fā)酵完成后，可迅速地將細(xì)胞從發(fā)酵醪中分離。這樣，可簡化工序，而不需要包括使用離心分離器等的其它(將酵母從發(fā)酵醪中進(jìn)行分離的)分離工序；2)發(fā)酵醪的澄清度高，這樣，減少了最終過濾發(fā)酵醪時的負(fù)擔(dān)，提高了生產(chǎn)能力；3)對于固定化細(xì)胞，可在同樣模式的基礎(chǔ)上、進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵，而不需要反應(yīng)器或其它特殊設(shè)備。此外，對于凝集酵母的培育，過去一直是嘗試采用誘導(dǎo)法、雜交育種法和細(xì)胞融合法等以得到天然或人工突變體。然而，有許多報導(dǎo)指出，采用這些方法時，常伴隨有被培育的原始菌株的基因特性的變化，而且，通常會破壞原始菌株中人們所需要的特性。但是，采用本發(fā)明的方法，只要通過簡單地導(dǎo)入本發(fā)明中的(凝集)基因，就可使所繁殖的菌株提高凝集特性，而且，本發(fā)明的最大優(yōu)點(diǎn)是，這些方法不損害原始菌株的其它人們所需要的特性。
圖1本發(fā)明的FL01L基因的限制酶切圖譜。
圖中，各限制酶的酶切位點(diǎn)分別用Ac表示AccI，Bg表示Bg1II，RV表示EcoRV，K表示KpnI，和Pv表示Pvu II。
圖2本發(fā)明的FL01S基因的限制酶切圖譜。
圖中，各限制酶的酶切位點(diǎn)分別用Ac表示AccI，Bg表示Bg1II，RV表示EcoRV，K表示KpnI，和Pv表示Pvu II。
圖3用于直接選擇酵母的、含凝集基因FL01S和FL01L的質(zhì)粒YRpGLF 14S和YRpGLF8L的構(gòu)建流程圖。
圖4YCpHF19S(20.00Kb)。
圖5YIpHF19S(15.80Kb)。
圖6含F(xiàn)L01S基因的YCpHF19S的5.8Kb的BamHI-XhoI片段。
圖7YCpHF19L(22.10Kb)。
圖8含F(xiàn)L01L基因的YCpHF19L的7.9Kb的BamHI-XhoI片段。
圖9YRpGL10(9.10Kb)。
圖10YRpGLF14S(15.50Kb)。
圖11YRpGLF8L(17.66Kb)。
圖12用于參入酵母染色體上的、含凝集基因FL01S和FL01L的質(zhì)粒pBR-ADH1-FL01S和pBR-ADH1-FL01L的構(gòu)建流程圖。
圖13pAAH5(12.60Kb)。
圖14BamHI-消化的pAAH5(12.60Kb)。
圖15pBR322(4.30Kb)。
圖16pBR322-dH(4.30kb)。
圖17pBR-dEP1(2.50Kb)。
圖18用PCR制備的FL01S的開放閱讀框架。
圖19pBR-dEP1-FLO1S(5.10Kb)。
圖20FL01S的開放閱讀框架。
圖21pBR-dH-ADH1(6.20Kb)。
圖22pBR-ADH1-FL01S(8.80Kb)。
圖23YCpHF19L(22.10Kb)。
圖24EcoRV+Bg1II-消化的YCpHF19L。
圖25pBR-dEP1-FL01L(7.20Kb)。
圖26FL01L的開放閱讀框架。
圖27pBR-ADH1-FL01L(10.80Kb)。
下面，詳細(xì)說明本發(fā)明。凝集基因本發(fā)明中可賦予酵母Saccharomyces cerevisiae凝集特性的基因包括酵母中為一個編碼顯示凝集活性的多肽的4.7±0.2Kb片段的基因和由上述凝集基因得到的2.6±0.2Kb片段的基因，這些基因分別與由上述酵母Saccharomyces cerevisiae的凝集基因FL01得到的FL01L基因(簡稱FL01L)和FL01S相對應(yīng)。FL01S系缺失了一部分堿基順序的FL01L基因。此外，如后面所述，F(xiàn)L01基因還包括這樣一些基因，這些基因系由FL01L基因人工地或天然地產(chǎn)生的產(chǎn)物，雖然它們的開放閱讀框架的長度可能不同，但仍具有凝集活性。這里，F(xiàn)L01L為酵母Saccharomyces cerevisiae的染色體I上的完整的FL01基因，而FL01S為開放閱讀框架缺失了一部分的FL01L基因。這里，具有特征性意義的是，F(xiàn)L01L基因可使其被導(dǎo)入的宿主酵母細(xì)胞產(chǎn)生比較強(qiáng)的凝集特性，而FL01S與FL01L相比，其賦予宿主酵母細(xì)胞的凝集活性相對較弱。
本發(fā)明的凝集基因以將該基因作為其成分含有的質(zhì)粒的形式和以插入宿主基因組的形式存在于酵母Saccharomyces cerevisiae中。另外，為在酵母中穩(wěn)定地表達(dá)凝集基因，可將本發(fā)明的凝集基因置于合適的啟動子和終止子的控制之下，并以質(zhì)粒的形式或以插入基因組的形式存在。所用的啟動子和終止子可以是醇脫氫酶基因(ADH1)、磷酸甘油酸激酶基因(PGK)等已知基因的適當(dāng)組合。由基因編碼的多肽本發(fā)明的FL01L基因由該基因所編碼的多肽的氨基酸順序確定。該多肽具有凝集活性，其氨基酸順序大體如順序1所示。這里“其氨基酸順序大體如順序1所示“一語表示只要多肽具有凝集活性，其中的一些氨基酸可以缺失或被取代，或加入一些其它的氨基酸。
本發(fā)明的能夠顯示凝集活性的典型多肽含有如順序1所示氨基酸順序，由1537個氨基酸構(gòu)成，并且該氨基酸順序以前一直未被確定。
如上所述，本發(fā)明中“其氨基酸順序大體如順序1所示”一語表示只要多肽具有凝集活性，其中的一些氨基酸可以缺點(diǎn)失或被取代，或加入一些其它的氨基酸。具有改變的氨基酸的多肽的一個具體例子是如順序1(FL01L順序)所示氨基酸順序中的第329位至1003位氨基酸缺失(FL01S順序，見順序2)的多肽，盡管略為微弱，該多肽仍然具有凝集活性。如果發(fā)酵期間酵母的凝集活性太強(qiáng)，則懸浮的酵母細(xì)胞的數(shù)量將會減少，而這一般將導(dǎo)致降低發(fā)酵的速度。因此，在繁殖酵母時，希望能夠賦予各發(fā)酵系統(tǒng)適當(dāng)強(qiáng)度的凝集特性。當(dāng)導(dǎo)入FL01L基因時，(酵母)的凝集特性可能會太強(qiáng)，因此，有時以導(dǎo)入FL01S基因?yàn)橐?。從這個意義上來講，盡管本發(fā)明的多肽的長度基本上系順序1所示順序，但一些氨基酸的缺失、取代和增加等對確立各種酵母的所希望強(qiáng)度的凝集活性是十分重要的。即，如此變化的多肽屬于本發(fā)明的具有凝集活性的多肽范圍。凝集基因的堿基順序FL01L基因的DNA鏈具有順序表中順序1所示的堿基順序或其簡并異構(gòu)體，和具有與順序1所示的氨基酸順序相對應(yīng)的堿基順序或其簡并異構(gòu)體。這里，“簡并異構(gòu)體”表示只在簡并密碼子上存在差異，但仍然具有編碼同一多肽能力的DNA鏈。
利用雙脫氧法測得的如順序1所示的DNA鏈堿基順序?yàn)橛蒘accharomyces cerevisiae菌株ABXL-1D(Yeast Genetic StockCenter，University of California，USA)所得到的FL01基因。凝集基因的DNA鏈的收集目前，尚無任何有關(guān)具有凝集活性的FL01基因的產(chǎn)物的資料(由FL01基因編碼的多肽的氨基酸順序)可供利用，所以，無法通過常用的、使用由氨基酸順序化學(xué)合成的DNA探針的雜交方法來克隆FL01基因。因此，本發(fā)明者利用一種酵母/大腸桿菌穿梭載體質(zhì)粒，建立了Saccharomyces cerevisiae菌株ABXL-1D的完整的DNA基因庫，并以此轉(zhuǎn)化非凝集性酵母，以獲得凝集性克隆，從轉(zhuǎn)化的菌株中回收質(zhì)粒(詳細(xì)參見下面的實(shí)施例)。酵母中凝集基因的導(dǎo)入用生物工程方法，通過將由上述方法得到的本發(fā)明的凝集基因的DNA鏈導(dǎo)入發(fā)酵工業(yè)中使用的酵母，如啤酒酵母、葡萄酒酵母、威士忌酵母、日本酒酵母、燒酒酵母和酒精生產(chǎn)酵母等(所有的Sac-charomyces cerevisiae)，可以將非凝集性菌株轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，或使具凝集特性的菌株的凝集特性加?qiáng)。
酵母本發(fā)明中所轉(zhuǎn)化的酵母屬于The YeastsA Taxonomic Study，3rd Ed.(Yarrow，D.，ed.by N.J.W.Kreger-Van Rij.BlsevierScience Publishers B.V.，Amsterdam，1984，p.379)中描述的Sac-charomyces cerevisiae屬酵母，或它們的異名同物和突變體；但是，根據(jù)本發(fā)明的目的，以Saccharomyces cerevisiae屬的各種工業(yè)酵母，例如啤酒酵母、葡萄酒酵母、威士忌酵母、日本酒酵母、燒酒酵母和酒精生產(chǎn)酵母為優(yōu)選。
具體的例子包括下面啤酒酵母W164(Munich Institute of Technology，Germany)，W204(Munich Institute of Technology，Germany)，SMA-S(Berlin In-stitute of Technology)，H.H.(Berlin Institute of Technology)，上面啤酒酵母obg.160(Berlin Institute of Technology，Germany)，葡萄酒酵母IAM4175(Tokyo University)，威士忌酵母AHU3200(Hokkaido University)，日本酒酵母Association No.6(Japan Brewing Association)，燒酒酵母IFO 0282(FermentationResearch Institute Foundation)，酒精生產(chǎn)酵母IFO 0216(Proper-ty of Fermentation Research Institute)等。這些工業(yè)酵母經(jīng)過了多年的選擇和純化培育，形成為適用于發(fā)酵工業(yè)的品種，即，該品種可成為高效發(fā)酵的發(fā)酵源，可生產(chǎn)具有醇和風(fēng)味的酒精，其遺傳特性穩(wěn)定等。轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體的制備工藝和方法可以是分子生物學(xué)和遺傳工程領(lǐng)域中常用的那些工藝和方法，也可以是如本發(fā)明下面述及的工藝和方法之外的手段，只要這些工藝和方法使用常規(guī)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)即可。為了在酵母中表達(dá)本發(fā)明的凝集基因，首先需要將該基因插入能夠穩(wěn)定地存在于酵母中的質(zhì)粒載體。這里所使用的質(zhì)粒載體可以是任何已知的，如YRp、YEp、YCp、YIp等。這些質(zhì)粒載體不僅已由文獻(xiàn)公開報道，而且容易制備。
本發(fā)明中用于選擇所希望的轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記基因可以是抗藥性基因，如G418等。因?yàn)樵诠I(yè)酵母中，設(shè)有特別合適的需要氨基酸或核酸等的內(nèi)源遺傳標(biāo)記。然而，由于本發(fā)明的凝集基因是顯性表達(dá)的，因此，可以用凝集基因本身進(jìn)行標(biāo)記，從而得到轉(zhuǎn)化體。
將本發(fā)明的凝集基因的DNA鏈插入質(zhì)粒中以及將其導(dǎo)入酵母中是容易實(shí)現(xiàn)的，但是，在另一方面，該類型的質(zhì)粒通常不能穩(wěn)定地保持于細(xì)胞中，經(jīng)常從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中脫離。
為了以更穩(wěn)定的方式將本發(fā)明的凝集基因的DNA鏈保持于酵母中，可以將其插入至酵母的基因組中。特別是對食品工業(yè)中使用的酵母而言，僅使用酵母基因來改良酵母而不使其含有存在于最終重組體中、卻來源于大腸桿菌的非酵母的DNA片段(如果質(zhì)粒在大腸桿菌中生長，則包含于質(zhì)粒載體中)是尤其優(yōu)選的方法。這里，本發(fā)明者選擇用Penttila等的共轉(zhuǎn)化法和只將酵母基因參入至染色體DNA的基因置換法(Current Genetics，12，413-420，1987)來僅僅導(dǎo)入酵母基因。也可通過使用任何分子生物學(xué)和遺傳工程學(xué)領(lǐng)域中常用的、適合要求方法，如Hinnen等的原生質(zhì)體法(Proceedings ofNational Academy of Sciences of the United States of America，75，1929-1933，1978)、Itoh等的醋酸鋰法(Journal of Bacteriology，153，163-168，1983)等進(jìn)行轉(zhuǎn)化。按照本發(fā)明如此制得的酵母除了導(dǎo)入的外源DNA外，具有與導(dǎo)入前的原始菌株完全相同的遺傳特性，而且，通過使用染色體導(dǎo)入法(其中，只有本發(fā)明的凝集基因的DNA鏈通過上述共轉(zhuǎn)化法和基因置換法被導(dǎo)入)。不含有多余的載體順序。因此，所得的重組酵母沒有所使用的載體的任何特性。其結(jié)果，原始菌株的優(yōu)良特性不會受到任何破壞，因此可以培育其凝集特性通過特定方法得到改良的工業(yè)酵母。
酒精飲料的生產(chǎn)通過使用上述的用本發(fā)明的凝集基因轉(zhuǎn)化的酵母作為發(fā)酵源的發(fā)酵，可以達(dá)到上述效果。顯而易見地，發(fā)酵源是根據(jù)發(fā)酵目的進(jìn)行選擇的。例如，麥芽汁用于生產(chǎn)啤酒和威士忌，果汁用于葡萄酒的生產(chǎn)，日本酒曲用于日本酒的生產(chǎn)，淀粉或碳水化合物源用于燒酒的生產(chǎn)，糖漿、淀粉或碳水化合物源用于粞精的生產(chǎn)。此外，發(fā)酵條件可以與傳統(tǒng)使用的條件相同，而且，當(dāng)采用本發(fā)明時，不需要改變現(xiàn)有的發(fā)酵工藝或設(shè)備。
由于使用的酵母在由其生產(chǎn)的酒精飲料中能夠顯示凝集活性，因此，在發(fā)酵完成后，酵母迅速地凝集，并且沉降在發(fā)酵桶底部，酵母細(xì)胞可容易地從發(fā)酵醪中分離。實(shí)施例下面結(jié)合實(shí)施例，詳細(xì)說明本發(fā)明。實(shí)施例1(控制酵母凝集的基因的收集)進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)以獲得本發(fā)明的凝集基因之一的FL01S基因(Watari等，Agricultural and Biological Chemistry，53(3)，901-903，1989)。按Cryer等的方法(Methods of Cell Biology，12，39-44，1975)制備Saccharomyces cerevisiae菌株ABX-1D(基因型MATaFL01，Yeast Genetic Stock Center，University of Califor-nia，USA)的染色體DNA。所得的染色體DNA用限制酶Sau3AI部分消化，通過蔗糖密度梯度離心，回收5Kb以上的DNA片段，然后在體外，通過連接反應(yīng)將DNA片段插入含有組氨酸合成基因HIS4作為選擇標(biāo)志的克隆載體YCpH4的BamHI區(qū)域(Watari等，Agricaltural and Biological Chemistry，53(3)，901-903，1989)。用連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)菌株MC1061〔基因型hsdRmcrB araD 139^(ara ABC-Leu)7679^lac×74gal U glak rpsLthi〕，從轉(zhuǎn)化體抽提質(zhì)粒，制備菌株ABXL-1D的基因庫。大腸桿菌菌株MC1061是一種被廣泛應(yīng)用于重組DNA技術(shù)領(lǐng)域的菌株。
使用該基困庫，對需要組氨酸的非凝集性面包酵母Saccha-romyces cerevisiae菌株YJW6(基因型MAT-adel ural his4canlkarl)(Agricaltural and Biological Chemistry，53(3)，901-903，1989)轉(zhuǎn)化。Saccharomyces cerevisiae菌株YJW6的轉(zhuǎn)化基本按I-toh等的醋酸鋰法(Journal of Bacteriology，153，163-168，1983)進(jìn)行。即，用一菌環(huán)的菌株YJW6接種100ml的YPD液體培養(yǎng)基(1％酵母抽提物、2％細(xì)菌蛋白胨、2％葡萄糖)于30℃將細(xì)胞培養(yǎng)過夜，翌晨離心分離，接種至同一組分的新鮮培養(yǎng)基中，于30℃繼續(xù)培養(yǎng)3小時，用40ml的無菌水洗滌收集的細(xì)胞，最后，將其懸浮于20ml的TE溶液(含1mM EDTA的10mM Tris-HCl緩沖液，pH7.5)中。從中取出5ml移至L形試管(蒙諾德氏培養(yǎng)管)中，再加入5ml的0.2M醋酸鈉溶液，室溫下以100轉(zhuǎn)/分的速率振蕩混合液1小時。取出0.1ml混合液，加入至1.5ml的已加入經(jīng)乙醇沉淀、風(fēng)干的50μg重組質(zhì)粒的Eppendorf管中。充分?jǐn)嚢枭鲜龌旌弦海?0℃靜置30分鐘。然后再充分?jǐn)嚢?，加?.1ml的70％聚乙二醇4000，繼續(xù)充分?jǐn)嚢杌旌弦?，?0℃靜置1小時。再將該混合液于42℃加熱5分鐘(熱擊處理)，然后冷卻至室溫，用無菌水洗滌。最后，將細(xì)胞懸浮于0.5ml無菌水中，然后取出其中的0.1ml，一次加入至不含組氨酸的基本培養(yǎng)基(不含氨基酸的Difco酵母氮堿，2％葡萄糖，40μg/ml硫酸腺嘌呤，40μg/ml尿嘧啶，2％Difco細(xì)菌瓊脂)中，以得到非組氨酸需要型的轉(zhuǎn)化體。重復(fù)該轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)10次，以得到約10,000個非組氨酸需要型的轉(zhuǎn)化體克隆。
接著，從轉(zhuǎn)化體中篩選出凝集克隆。用牙簽從培養(yǎng)板中一次取出一個突變體，接種在96孔微量培養(yǎng)板〔每孔含200μl的基本液體培養(yǎng)基(除去瓊脂的上述基本培養(yǎng)基)〕中，于25℃培養(yǎng)3日。培養(yǎng)結(jié)束后，用微量培養(yǎng)板混合器(Titech micromixer)劇烈振蕩微量培養(yǎng)板60秒種，檢查凝集情況，用肉眼尋出凝集克隆?？梢詮募s6000個非組氨酸需要型的突變體中得到一個具有較強(qiáng)凝集特性的克隆。將該菌株在非選擇性YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果，該克隆將失去所得到的質(zhì)粒，成為組氨酸需要型的克隆。此外，當(dāng)從最初得到的凝集轉(zhuǎn)化體回收DNA時，從大腸桿菌菌株MC1061回收質(zhì)粒，然后再重新轉(zhuǎn)化菌株YJW6，所得到的非組氨酸需要型的轉(zhuǎn)化體，都是凝集性的。從上述結(jié)果，可以得出以下結(jié)論，即，轉(zhuǎn)化的菌株顯示凝集活性并不是由于宿主細(xì)胞的基因突變，而是由轉(zhuǎn)化的菌株中的質(zhì)粒引起的。這里，本發(fā)明者將含控制凝集的基因順序的質(zhì)粒命名為YCpHF19S。其限制酶切圖譜示于圖4。
從使用微量培養(yǎng)板的凝集酵母篩選試驗(yàn)可以推測，上述含凝集基因的質(zhì)?？梢杂米鲝牟缓瑯?biāo)記的酵母中選擇凝集酶母的標(biāo)記，以得到轉(zhuǎn)化體。同樣地，在該實(shí)驗(yàn)中，已導(dǎo)入了上述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體實(shí)際上是從非凝集性酵母中得到的。換言之，該類型的凝集基因可以清楚地用于獲得屬于Saccharomyces cerevisiae的酵母的轉(zhuǎn)化體而不需要任何基因標(biāo)記。而且，在篩選過程中，具有基本上不需要準(zhǔn)備用于篩選轉(zhuǎn)化體的特殊培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基或含抗生素的培養(yǎng)基)的優(yōu)點(diǎn)，可以在普通培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。另外，目前用于獲得酵母轉(zhuǎn)化體的來自酵母的基因標(biāo)記很少，上述凝集基因在酵母的自身克隆實(shí)驗(yàn)中是非常有用的。實(shí)施例2(克隆的凝集基因的定位和鑒定)為鑒定實(shí)施例1中克隆的凝集基因是否是酵母染色體I上的FL01基團(tuán)，用上述凝集基因進(jìn)行了下述物理圖譜實(shí)驗(yàn)(Watari等，Agricultural and Biological Chemistry，53(3)，901-903，1989)。
將取自含控制凝集基因的質(zhì)粒YCpHF19S的DNA區(qū)域的EcoRV片段(2.6Kb)作為探針，通過染色體DNA電泳(正電場電泳)進(jìn)行染色體上的上述基因片段的物理圖譜定位。即，使用Carle等的方法(Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America，82，3756-3760，1985)和Biorad CHEF電泳裝置進(jìn)行Saccharomyces cerevisiae菌株ABXL-1D的染色體電泳，制備樣品。電泳結(jié)束后，將電泳凝膠上的DNA帶用Maniatis等的方法(Molecular Cloning，382-389，Clod Spring Harbor Labo-ratory，1982)進(jìn)行分子檢測和雜交。其結(jié)果，雜交在菌株ABXL-1D的染色體I上的上述EcoRV片段(2.6Kb)指出，用本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)所克隆的凝集基因系染色體I上的基因。
接著，嘗試進(jìn)行所克隆的凝集基因的系譜定位(Watari等，A-gricultural and Biological Chemistry 55(6)，1547-1552，1991)。用限制酶XbaI部分消化YCpHF19S，除去酵母著絲點(diǎn)基因(CEN4)和酵母復(fù)制起始點(diǎn)ARS1，制備用于參入的YIp質(zhì)粒YIpHF19S(見圖5)。為提高克隆的凝集基因部分參入酵母的效率，用限制酶BamHI消化該質(zhì)粒后，用前述方法轉(zhuǎn)化Saccharomyces cerevisiae菌株YJW2A(基因型MATaFL01his4)，得到非組氨酸需要型的轉(zhuǎn)化體。所得菌株與Saccharomyces cerevisiae菌株YJW6(基因型MAT-adel ural his4canl karl)雜交，得到二倍體，使該二倍體形成孢子并進(jìn)行基因分析(四分體分析)。其結(jié)果，在His+性狀(非組氨酸需要型)和染色體I上的ADE1之間完成了系譜連結(jié)(親代雙型∶非親雙型∶四型＝22∶0∶7)，并清楚地顯示出質(zhì)粒YIpHF19S上的克隆的凝集基因部分已參入至菌株YJW2A的染色體I上。
從上述物理和系譜定位的結(jié)果，本發(fā)明者得出結(jié)論，克隆的凝集基因系酵母染色體I上的FL01基因。但是，此時尚不知道這里所得的FL01基因不是存在于酵母染色體上的完整的FL01基因(或FL01L基因)，而是如下所述的缺失一部分FL01L的DNA順序的FL01S基因。實(shí)施例3(FL01S的堿基序列的分析)本發(fā)明者進(jìn)行了測定上面得到的FL01基因(實(shí)際上是FL01S基團(tuán))的堿基序列的實(shí)驗(yàn)。
重新進(jìn)行克隆的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)FL01S基因中表現(xiàn)凝集作用所必需的區(qū)域包括質(zhì)粒YCpHF19S的BamHI-(BamHI/Sau3AI)之間的4.1Kb的DNA片段。
因此，在順序載體pUC118和pUC119(都是Takara BrewingCo.的產(chǎn)品)的復(fù)聯(lián)結(jié)子位點(diǎn)處重新進(jìn)行了亞克隆。然后，將各亞克隆按Henikoff等的方法(Gene，28，351-359，1984)和Yanisch-Perron等的方法，用核酸外切酶III和mangbean核酸酶處理其質(zhì)粒的插入片段，由此制備得到插入的片段部分缺失并因此鏈長度存在差異的各種克隆的短片段。在該過程中，使用了千序列缺失試劑盒(Takara Brewing Co.產(chǎn)品)。接著，對產(chǎn)生的插入各種克隆的DNA片段用Sanger等的雙脫氧法(Science，214，1205-1210，1981)和Applied Biosystems Japan，Inc.的自動DNA順序測試儀測定上述4.1Kb DNA片段的堿基順序。分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)存在一個可為分子量約為89,368的、含862個氨基酸的多肽編碼的2,586bp的開放閱讀框架(順序2)。實(shí)施例4(分子雜交實(shí)驗(yàn))如上所述，實(shí)施例1中所得的凝集基因清楚地位于酵母染色體I上的FL01處，但為了確定其是否是完整的FL01基因，進(jìn)行了如下所述的分子雜交實(shí)驗(yàn)。首先，從克隆到凝集基因的酵母Saccha-romyces cerevisiae菌株ABXL-1D中抽提所有的DNA，然后，用限制酶EcoRV完全消化，進(jìn)行電泳，再使用含實(shí)施例2中所述的開放閱讀框架的2.6Kb EcoRV DNA片段作為探針，進(jìn)行基因組分子雜交分析。這里，分子檢測和雜交按Maniatis等的方法(MolecularCloning，382-389，Cold Spring Harbor Laboratory，1982)進(jìn)行。
令人驚奇的是，結(jié)果，在相應(yīng)于約2.6Kb的位置，未檢出任何雜交信號，而在相應(yīng)于約4.7Kb的位置，得到雜交信號。這引導(dǎo)本發(fā)明者猜測，所克隆到的凝集基因可能不是菌株ABXL-1D的FL01基因的同一物，而可能是完整的FL01基因在克隆過程中由于某種原因丟失了一部分DNA順序后的產(chǎn)物。實(shí)施例5〔PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))實(shí)驗(yàn)〕在本實(shí)施例中，本發(fā)明者為了確定ABXL-1D的FL01基因的結(jié)構(gòu)，通過PGR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))法進(jìn)行了如下所述的實(shí)驗(yàn)。首先，用實(shí)施例3中所述的堿基順序化學(xué)合成DNA鏈。即，用DNA合成儀(ABI Co.的產(chǎn)品)化學(xué)合成包含該基團(tuán)的開放閱讀框架的起始密碼子區(qū)域的33堿基的DNA順序，并用作PCR5′端探針。(順序3)聯(lián)結(jié)子位置(在從上述序列的5′末端起的第14個堿基起始的ATG-是FL01S的5′末端順序)。
此外，用相同的方法化學(xué)合成一個包括含該凝集基因的開放閱讀框架的終止密碼子的區(qū)域中的互補(bǔ)鏈(反向鏈)的33堿基的DNA順序，并用作PCR3′端的探針(順序4)。終止(順序4)聯(lián)結(jié)子位置〔在從上述序列的5′末端起的第10個堿基起始的TTA-是FL01S的3′末端順序(反向鏈)〕。
接著，使用這些5′和3′探針，用Saccharomyces cerevisiae菌株ABXL-1D的全部DNA作模板，進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。
使用AB-1800型酶反應(yīng)器(Ato Co.產(chǎn)品)進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，PfuDNA聚合酶(Stratagene Co.)被用來作為DNA聚合酶。PCR實(shí)驗(yàn)的條件也與Inis等的方法相同(PCR Technology，3-12，StocktonPress，ed.Henry A.Erlich，1989)。再用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定了PCR實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的DNA條帶后，在約4.7Kb區(qū)域得到了一條單獨(dú)的條帶，由此推測菌株ABXL-1D的FL01的開放閱讀框架約為4.7Kb。而且，本發(fā)明者在用含克隆到的凝集基因的質(zhì)粒YCpHF19作模板進(jìn)行的對照實(shí)驗(yàn)中，在約2.6kb的區(qū)域得到了一個條帶。從上述結(jié)果，本發(fā)明者得出結(jié)論，存在于酵母Saccha-romyces cerevisiae菌株ABXL-1D的FL01基因上的完整的開放閱讀框架約為4.7Kb，而不是約2.6Kb。
由此，本發(fā)明者得出結(jié)論，本發(fā)明者得到的凝集基因系FL01基因由于某一原因(很可能是在大腸桿菌菌株MC1061的YCpHF19的保持過程中分子內(nèi)重組的結(jié)果)缺失一部分后的產(chǎn)物。實(shí)施例6FL01基因的收集)在本實(shí)施例中，本發(fā)明者基于在克隆FL01的過程中，含完整的FL01基因的質(zhì)?？赡茉谧畛醯膹拇竽c桿菌中回收的YCpHF19S質(zhì)粒溶液中發(fā)生污染這一猜測，進(jìn)行了復(fù)查。首先，取出一部分質(zhì)粒溶液，用限制酶進(jìn)行消化，并在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了由YCpHF19S得來的2.6Kb帶之外，在4.7Kb區(qū)域還有一條很淡、但清晰可見的條帶。這表明質(zhì)粒溶液是二種質(zhì)粒的混合液。于是，本發(fā)明者使用該質(zhì)粒溶液進(jìn)行了大腸桿菌菌株JA221(基因型recAl，lacY LeuB trp ^E5thr thi hsd RhsdM)的轉(zhuǎn)化，從所得的轉(zhuǎn)化體中抽提質(zhì)粒并進(jìn)行了檢測，除了YCpHF19S之外，還分離到較YCpHF19S大2.1Kb的質(zhì)粒。因此，命名最初克隆到的質(zhì)粒為YCpHF19S，從YCpHF19S質(zhì)粒溶液分離到的、較YCpHF19S長2.1Kb的質(zhì)粒為YCpHF19L。同時，對YCpHF19S和YCpHF19L的各限制酶切型式進(jìn)行分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)除了含凝集基因的開放閱讀框架的DNA區(qū)域外，在其他任何DNA區(qū)域質(zhì)粒均不存在任何差異(見圖4和7)。即，顯示出YCpHF19L的凝集基因的開放閱讀框架較YCpHF19S的長2.1Kb。由此得出下述結(jié)論對完整的FL01基團(tuán)(即FL01L)的最初的克隆是成功的，但在大腸桿菌菌株MC1061中的YCpHF19L質(zhì)粒的保持過程中，由于體內(nèi)的分子內(nèi)重組，F(xiàn)L01L基團(tuán)的開放閱讀框架的一部分缺失了，F(xiàn)L01L轉(zhuǎn)化為FL01S，即YCpHF19L轉(zhuǎn)化為YCpHF19S。因此，推測在閱讀框架的一部分缺失后，所生成的FL01S仍然具有編碼顯示凝集特性的多肽的能力。
下面，對在YCpHF19S上的凝集基因FL01S和在YCpHF19L上的凝集基因FL01L進(jìn)行了區(qū)分。
而且，缺失的發(fā)生頻率受保持YCpHF19L質(zhì)粒的大腸桿菌的類型的影響很大，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)例如，對于菌株MC1061(基團(tuán)型hsdR mcrB araD139^(araABC-leu)7679 ^lacX74galU galK rpsLthi)和菌株DH5-(基因型supE 44 ^lacU169(-80lacZ ^M15)hs-dR17-recAl endAl gyrA96thi-l relAl)，會發(fā)生高比例的轉(zhuǎn)變，而菌株JA221(基因型recAl lacY leuB trp ^B5thr hsdR hsdM)則較少轉(zhuǎn)變。因此，當(dāng)質(zhì)粒保持于大腸桿菌中時，本發(fā)明者主要使用菌株JA221。然而，目前對這種轉(zhuǎn)變的原因尚不清楚。實(shí)施例7(FL01L的堿基順序的分析)從上面得到的YCpHF19L質(zhì)粒上切除含F(xiàn)L01L的DNA片段，用與實(shí)施例3中同樣的方法測定所有堿基順序。結(jié)果確定，F(xiàn)L01L的開放閱讀框架是一個為預(yù)計(jì)分子量160,692、氨基酸1537個的多肽(順序1)編碼的4,611bp的堿基順序。并顯示出FL01S系缺失一部分DNA鏈的FL01L，缺失的DNA鏈包括從開放閱讀框架的起始密碼子起的第985至3009位的堿基(相應(yīng)于氨基酸順序的第329至1003位氨基酸)(見順序1和2)。
此外，對FL01L的氨基酸順序的分析結(jié)果進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)在序列的第278至1087位氨基酸中有一個由45個氨基酸組成的重復(fù)順序(正向重復(fù))〔基本如下列順序所示，其中括號內(nèi)用“/”分開的氨基酸表示供選擇的氨基酸。
ThrThrThr(Glu/Gln)ProTrp(Asn/Thr/Asp)(Gly/Asp/Ser)ThrPheThrSerThrSer(Thr/Ala)Glu(Met/Leu/Val)(Thr/Ser)Thr(Val/Ile)ThrGlyThrAsnGly(Leu/Val/Gln)(Pro/Arg)ThrAspGluThr(Val/Ile)IleVal(Ile/Vla)(Arg/Lys)ThrProThr(Thr/Ser)(Ala/Glu)(Thr/Gly/Ser/Ile)(Thr/Leu/Ser)(Ala/Ile/Val/Ser)(Met/Ser/Ile/Thr)，在FL01L中有18個這樣的重復(fù)順序。另一方面，在FL01S中，該重復(fù)順序中的大部分區(qū)域是缺失的(FL01S缺失了FL01L的氨基酸順序中的第329至1003位氨基酸)，只有該重復(fù)順序的3個拷貝存在。本發(fā)明者此刻相信，F(xiàn)L01L和FL01S在凝集能力上的差異(前者較之后者賦予宿主細(xì)胞更強(qiáng)的凝集特性)與這些正向重復(fù)順序的數(shù)目有關(guān)。本發(fā)明者推測，今后可以得到對每一個細(xì)胞的理想的凝集能力，即，通過調(diào)節(jié)正向重復(fù)的數(shù)目，來自由調(diào)節(jié)凝集能力。實(shí)施例8〔為應(yīng)用目的在各種酵母菌株中導(dǎo)入FL01L基團(tuán)(1使用質(zhì)粒載體)〕將上面獲得的凝集基因FL01S和FL01L導(dǎo)入各種工業(yè)酵母(所有非凝集性酵母)中，以確定它們對培育實(shí)際應(yīng)用的凝集酵母是否確實(shí)有效。首先，制備含有可直接選擇的FL01S和FL01L基因的質(zhì)粒，以用于工業(yè)酵母的轉(zhuǎn)化(流程圖示于圖3。流程圖中各質(zhì)粒和開放閱讀框架旁邊的數(shù)字與詳細(xì)示于圖4-11的質(zhì)粒和開放閱讀框架旁邊的數(shù)字相對應(yīng))。將含YCpHF19S的FL01S基因的5.8KbBamHI-XhoI片段(圖6)插入用于直接選擇的質(zhì)粒YRpGL10(在酵母內(nèi)，含有直接選擇用的標(biāo)記基因G418-抗性Tn 903基因和作為復(fù)制起始點(diǎn)的ARS1順序。見圖9)的BamHI-SalI之間的空隙中，以制備YRpGLF14S質(zhì)粒(圖10)。此外，將YCpHF19L中的7.9Kb的BamHI-Xhol片段(圖8)插入YRpGL10的BamHI-SalI之間的空隙中，以制備含有FL01L基因的相似質(zhì)粒YRpGLF8L(圖11)。
下面說明使用質(zhì)粒進(jìn)行工業(yè)酵母轉(zhuǎn)化的方法。用于工業(yè)酵母的轉(zhuǎn)化方法與實(shí)施例1中所述的用于實(shí)驗(yàn)酵母的轉(zhuǎn)化方法相同，但本發(fā)明者作了如下所示的稍許改進(jìn)(Watari等，Agricultrual and Bio-logical Chemistry，55(6)，1547-1552，1991)。即，在100mlYPD液體培養(yǎng)基(1％酵母抽提物，2％細(xì)菌蛋白胨，2％葡萄糖)中接種一菌環(huán)細(xì)胞，于30℃培養(yǎng)過夜，翌晨離心分離，接種至一新的具有相同組分的培養(yǎng)基中，于30℃再培養(yǎng)3小時。用40ml的無菌水洗滌收集的細(xì)胞，最后將其懸浮于約20ml的TE溶液(含1m MEDTA的10mM Tris-HCl緩沖液，pH7.5)。(不過，此處使用了血紅蛋白計(jì)，用于調(diào)節(jié)懸浮液的濃度，使其最終的細(xì)胞濃度為約2×108cell/ml)。將其中5ml移至一L形試管(蒙諾德氏培養(yǎng)管)中，再加入0.2M醋酸鈉溶液5ml，室溫下以100轉(zhuǎn)/分的速度振蕩混合液1小時。從該混合液中取出0.1ml，加入至1.5mlEppendorf管(Eppen-dorf管中已加入50μg經(jīng)乙醇沉淀、風(fēng)干的重組質(zhì)粒)中，充分?jǐn)嚢柙摶旌弦海缓笥?0℃靜置30分鐘。充分?jǐn)嚢鐴ppendorf管，再加入0.1ml的70％聚乙二醇#4000，再充分?jǐn)嚢杌旌弦?，?0℃靜置1小時。接著，將混合液升溫至42℃加熱5分鐘(熱擊處理)，再冷卻至室溫，然后用無菌水洗滌細(xì)胞。最后，將細(xì)胞懸浮于Eppendorf管中的1.4mlYPD溶液中，于30℃靜置16-20小時進(jìn)行培養(yǎng)。然后，一次取出培養(yǎng)液0.1ml加入至含200/lg/ml的G418的YPD瓊脂培養(yǎng)基中，于30℃恒溫培養(yǎng)2-3日，以獲得轉(zhuǎn)化體。
使用該方法對各種工業(yè)酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果示于表1。此外，評價凝集能力的方法如下所述將各轉(zhuǎn)化體接種至已加入10mlYPD液體培養(yǎng)基(含100μg/ml的G418)的L形試管中，于28℃振蕩培養(yǎng)3日(100轉(zhuǎn)/分)，用肉眼檢驗(yàn)評價凝集，評價凝集程度的等級按Johnston等的評價方法(Yeast GeneticsFundamental andApplied Aspects，205-224，Springer Verlag，New York，ed byJ.F.T.Spencer，D.M.Spencer，A.R.W.Smith，1983)作出。
表1為應(yīng)用目的在各種酵母中的凝集基因FLO1S和FLO1L的導(dǎo)入及其表達(dá)酵母/質(zhì)粒下面啤酒酵母W204/W164/SMA-S/H.H.上面啤酒酵母obg.160威士忌酵母 AHU 3200葡萄酒酵母 IAM 4175日本酒酵母 Association No.6燒酒酵母IFO 0282酒精酵母IFO 0216注凝集的評價用6個等級(0-5)表示。
0無凝集性1凝集性很弱2凝集性弱3凝集性中等4凝集性強(qiáng)5凝集性很強(qiáng)上述結(jié)果顯示，通過導(dǎo)入凝集基因FLO1S和FLO1L，可以將各種非凝集性工業(yè)酵母都轉(zhuǎn)變成凝集酵母，盡管它們在凝集程度上存在差異。無須多言，導(dǎo)入載體質(zhì)粒YRp GL10，宿主細(xì)胞仍然保持非凝集性。
而且，很明顯地，導(dǎo)入FLO1L基團(tuán)可在宿主菌株中產(chǎn)生較導(dǎo)入FLO1S基因更強(qiáng)的凝集特性。實(shí)施例9〔為應(yīng)用目的在各種酵母菌株中導(dǎo)入FLO1L基因(2參入至酵母染色體中)〕一般而言，當(dāng)以質(zhì)粒形式將外源性基因?qū)胨拗骷?xì)胞時，在非選擇性壓力下，連續(xù)培養(yǎng)的結(jié)果會使質(zhì)粒從細(xì)胞脫離。實(shí)際上，當(dāng)不用G418施加選擇壓力時可以觀察到質(zhì)粒容易地從實(shí)施例8中所得的轉(zhuǎn)化體脫離。因此，為了穩(wěn)定地在酵母中保持FLO1基因，本發(fā)明者試圖將FLO1基團(tuán)參入至酵母染色體中。(i)用于參入的FLO1表達(dá)盒的制備(流程圖示于圖12。流程圖中各質(zhì)粒和開放閱讀框架(ORF)旁邊的數(shù)字與詳細(xì)示于圖13-27中的質(zhì)粒和開放閱讀框架旁邊的數(shù)字相對應(yīng))。
為高頻率地在酵母中表達(dá)FLO1基因，在控制酵母酒精脫氫酶基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯的單位中，于FLO1基因的開放閱讀框架的5′末端的上游處參入啟動子，于3′末端的下游處參入終止子。即，在含酵母酒精脫氫酶基因的啟動子和終止子順序的質(zhì)粒pB R-dH-AD-HI的HindIII位點(diǎn)分別插入FLO1S或FLO1L的開放閱讀框架順序，以獲得pBR-ADH1-FLO1S(圖22)和pBR-ADH1-FLO1L(圖27)。在用PCR法(PCR實(shí)驗(yàn)與實(shí)施例5中的相同)制備FLO1S的開放閱讀框架的同時，制備表達(dá)盒。根據(jù)限制酶分析和DNA定序的結(jié)果，本發(fā)明者確認(rèn)，用上述方法制備的FLO1S基因的堿基順序與由實(shí)施例3的結(jié)果所得的圖2的限制酶切圖譜所示和順序2所列的堿基順序完全相同。
(ii)通過共轉(zhuǎn)化法在啤酒酵母染色體組中參入FLO1表達(dá)盒的實(shí)施例通過Penttila等的共轉(zhuǎn)化方法(Current Genetics，12，413-420，1987)，將含由非載體得到的順序(由載體質(zhì)粒pBR 322得到的順序)的FLO1表達(dá)盒參入酵母(非凝集性下面啤酒酵母W204)的染色體DNA中。即，用限制酶Bam HI消化50μg的在(i)中獲得的質(zhì)粒pBR-ADH1-FLO1S或pBR-ADH1-FLO1L，并進(jìn)行苯酚/氯仿處理，然后，再加入50μg G418抗性質(zhì)粒YRpG L10，用乙醇沉淀。將DNA樣品風(fēng)干，按上述實(shí)施例8中所述方法轉(zhuǎn)化酵母。以G418抗性作為標(biāo)記選擇轉(zhuǎn)化體，用微量培養(yǎng)板測定法(見實(shí)施例1)篩選獲得的轉(zhuǎn)化體以得到凝集菌株。下面將詳細(xì)說明微量培養(yǎng)板測定法。用牙簽一次從一個培養(yǎng)板上挑出所得的轉(zhuǎn)化體，將其接種到96孔微量培養(yǎng)板(各孔含200μl的YPD液體培養(yǎng)基)中，于25℃培養(yǎng)3日。用微量培養(yǎng)板混合器(Titech Co.產(chǎn)品)培養(yǎng)后劇烈振蕩微量培養(yǎng)板60秒種，然后用肉眼尋找凝集克隆，確定凝集程度。
將用上述方法獲得的凝集菌株非選擇性地在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-20代，然后將細(xì)胞適當(dāng)稀釋，并涂布于YPD瓊脂培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)2-3日。將培養(yǎng)板上積聚的克隆復(fù)制在一含200μg/ml的G418的YPD瓊脂培養(yǎng)基和另一不含G418的YPD瓊脂培養(yǎng)基上，檢查克隆的G418抗性，回收顯示無G418抗性的菌株。這些菌株細(xì)胞中的YRpGL 10質(zhì)粒已丟失，但可以認(rèn)為，通過使用ADH1基因的同源順序部分的體內(nèi)基因置換，F(xiàn)LO1表達(dá)盒(即，ADH1啟動子和ADH1終止子的表達(dá)的控制下的FLO1S或FLO1L基因的開放閱讀框架已被參入至染色體的ADH1位上。
命名參入FLO1S表達(dá)盒的菌株為W204-FLO1S，參入FLO1L表達(dá)盒的菌株為W204-FLO1L。這些菌株經(jīng)過50代的培養(yǎng)后，仍然保持與培養(yǎng)前同一水平的凝集特性。通過對W204-FLO1S和W204-FLO1L菌株的基因組分子雜交分析，本發(fā)明者確證所有的FLO1表達(dá)盒都已被參入至染色體DNA中。
(iii)發(fā)酵試驗(yàn)使用(ii)中所得的W204-FLO1S和W204-FL1L菌株進(jìn)行2升的小規(guī)模啤酒發(fā)酵試驗(yàn)。即，下列方法系歐洲釀造研究所的標(biāo)準(zhǔn)方法(Journal of the Institute of Brewing，EBC Analytica Microbio-logica，Method 2.5.4.，Tubes E.B.C.，83，117--118，1977)。將細(xì)胞于20℃在50ml的麥芽汁中靜置培養(yǎng)3日，然后將其全部加入至1升的麥芽汁中，于15℃繼續(xù)靜置培養(yǎng)1周。用離心分離法(5000rpm×10分鐘)收集成熟的細(xì)胞。將所得的酵母細(xì)胞加入至11°P(plateau degrees)的麥芽汁(事先已調(diào)節(jié)至9ppm氧濃度)中，使其濃度達(dá)到0.5％(濕體v/v)。于10℃靜置發(fā)酵10日。然后比較其凝集和沉降情況，非凝集性的親株W204出現(xiàn)少量的酵母沉淀，回收的酵母量與最初加入的酵母量基本相等(即，100％回收率)。然而，參入FLO1L表達(dá)盒的W204-FLO1L菌株顯示出強(qiáng)的凝集特性，回收的酵母量為最初加入的酵母量的二倍或更多(即，200％或更多)。但是，參入FLO1S表達(dá)盒的W204-FLO1菌株只顯示出很微弱的凝集特性，回收的酵母量不超過W204菌株。可以認(rèn)為，這表明引入FLO1S的單拷貝并不能導(dǎo)致宿主細(xì)胞在麥芽汁中的足夠的凝集(而導(dǎo)入實(shí)施例8中所得的FLO1S的多拷貝，則W204即使在麥芽汁中也顯示出凝集)。
盡管如此，在染色體中導(dǎo)入了FLO1S的單拷貝的W204-FLO1S菌株在YPD培養(yǎng)基中顯示出中等程度的凝集，而在麥芽汁中不顯示凝集的原因目前尚不清楚。
在上述的發(fā)酵(預(yù)發(fā)酵)完成后，進(jìn)行其上清液的陳釀(后發(fā)酵)。即，在后發(fā)酵工藝(5℃×2周和0℃×1周)完成后，用濾膜過濾發(fā)酵液，并在0℃、2個大氣壓下碳酸飽充2日，然后進(jìn)行化學(xué)分析和樣品品嘗。結(jié)果顯示，W204和204-FLO1L之間不存在任何差異。因此，上述結(jié)果清楚顯示按照本發(fā)明的方法使用酵母釀造啤酒，只有酵母的凝集特性得到了改善而并未引起對照菌株的香味成分的任何變化。保藏由在大腸桿菌菌株JA221導(dǎo)入含本發(fā)明的DNA鏈(FLO1L基因的開放閱讀框架)的質(zhì)粒pBR-dEP1-FLO1L(圖25)而得到的轉(zhuǎn)化菌株Escherichia coliFLO1L保藏在MITI National Institute ofBioscience and Human Technology，保藏日期1993年1月13日，保藏編號FERM BP-4136。
順序表順序數(shù) 1順序長度4614順序類型核酸鏈股雙鏈拓?fù)鋵W(xué) 線性分子類型基因組DNA原始源Saccharomyces cerevisiaeABXL-1D順序1
ATG ACA ATG CCT CAT CGC TAT ATG TTT TTG GCA GTC TTT ACA CTT CTGMet Thr Met Pro His Arg Tyr Met Phe Leu Ala Val Phe Thr Leu Leu15GCA CTA ACT AGT GTG GCC TCA GGA GCC ACA GAG GCG TGC TTA CCA CCAAla Leu Thr Ser Val Ala Ser Gly Ala Thr Glu Ala Cys Leu Pro Ala30GGC CAG AGG AAA AGT GGG ATG AAT ATA AAT TTT TAC CAG TAT TCA TTGGly Gln Arg Lys Ser Gly Met Asn Ile Asn Phe Tyr Gln Tyr Ser Leu45AAA GAT TCC TCC ACA TAT TCG AAT GCA GCA TAT ATG GCT TAT GGA TATLys Asp Ser Ser Thr Tyr Ser Asn Ala Ala Tyr Met Ala Tyr Gly Tyr60GCC TCA AAA ACC AAA CTA GGT TCT GTC GGA GGA CAA ACT GAT ATC TCGAla Ser Lys Thr Lys Leu Gly Ser Val Gly Gly Gln Thr Asp Ile Ser75ATT GAT TAT AAT ATT CCC TGT GTT AGT TCA TCA GGC ACA TTT CCT TGTIle Asp Tyr Asn Ile Pro Cys Val Ser Ser Ser Gly Thr Phe Pro Cys90CCT CAA GAA GAT TCC TAT GGA AAC TGG GGA TGC AAA GGA ATG GGT GCTPro Gln Glu Asp Ser Tyr Gly Asn Trp Gly Cys Lys Gly Met Gly Ala105TGT TCT AAT AGT CAA GGA ATT GCA TAC TGG AGT ACT GAT TTA TTT GGTCys Ser Asn Ser Gln Gly Ile Ala Tyr Trp Ser Thr Asp Leu Phe Gly120TTC TAT ACT ACC CCA ACA AAC GTA ACC CTA GAA ATG ACA GGT TAT TTTPhe Tyr Thr Thr Pro Thr Asn Val Thr Leu Glu Met Thr Gly Tyr Phe135TTA CCA CCA CAG ACG GGT TCT TAC ACA TTC AAG TTT GCT ACA GTT GACLeu Pro Pro Gln Thr Gly Ser Tyr Thr Phe Lys Phe Ala Thr Val Asp150GAC TCT GCA ATT CTA TCA GTA GGT GGT GCA ACC GCG TTC AAC TGT TGTAsp Ser Ala Ile Leu Ser Val Gly Gly Ala Thr Ala Phe Asn Cys Cys165GCT CAA CAG CAA CCG CCG ATC ACA TCA ACG AAC TTT ACC ATT GAC GGTAla Gln Gln Gln Pro Pro Ile Thr Ser Thr Asn Phe Thr Ile Asp Gly180ATC AAG CCA TGG GGT GGA AGT TTG CCA CCT AAT ATC GAA GGA ACC GTCIle Lys Pro Trp Gly Gly Ser Leu Pro Pro Asn Ile Glu Gly Thr Val195TAT ATG TAC GCT GGC TAC TAT TAT CCA ATG AAG GTT GTT TAC TCG AACTyr Met Tyr Ala Gly Tyr Tyr Tyr Pro Met Lys Val Val Tyr Ser Asn210GCT GTT TCT TGG GGT ACA CTT CCA ATT AGT GTG ACA CTT CCA GAT GGTAla Val Ser Trp Gly Thr Leu Pro Ile Ser Val Thr Leu Pro Asp Gly225 240ACC ACT GTA AGT GAT GAC TTC GAA GGG TAC GTC TAT TCC TTT GAC GATThr Thr Val Ser Asp Asp Phe Glu Gly Tyr Val Tyr Ser Phe Asp Asp
255GAC CTA AGT CAA TCT AAC TGT ACT GTC CCT GAC CCT TCA AAT TAT GCTAsp Leu Ser Gln Ser Asn Cys Thr Val Pro Asp Pro Ser Asn Tyr Ala270GTC AGT ACC ACT ACA ACT ACA ACG GAA CCA TGG ACC GGT ACT TTC ACTVal Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr285TCT ACA TCT ACT GAA ATG ACC ACC GTC ACC GGT ACC AAC GGC GTT CCASer Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Val Pro300ACT GAC GAA ACC GTC ATT GTC ATC AGA ACT CCA ACA ACT GCT AGC ACCThr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Thr Ala Ser Thr315ATC ATA ACT ACA ACT GAG CCA TGG AAC AGC ACT TTT ACC TCT ACT TCTIle Ile Thr Thr Thr Glu Pro Trp Asn Ser Thr Phe Thr Ser Thr Ser330ACC GAA TTG ACC ACA GTC ACT GGC ACC AAT GGT GTA CGA ACT GAC GAAThr Glu Leu Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Val Arg Thr Asp Glu345ACC ATC ATT GTA ATC AGA ACA CCA ACA ACA GCC ACT ACT GCC ATA ACTThr Ile Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Thr Ala Thr Thr Ala Ile Thr360ACA ACT GAG CCA TGG AAC AGC ACT TTT ACC TCT ACT TCT ACC GAA TTGThr Thr Glu Pro Trp Asn Ser Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Leu375ACC ACA GTC ACC GGT ACC AAT GGT TTG CCA ACT GAT GAG ACC ATC ATTThr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Leu Pro Thr AsP Glu Thr Ile Ile390GTC ATC AGA ACA CCA ACA ACA GCC ACT ACT GCC ATG ACT ACA ACT CAGVal Ile Arg Thr Pro Thr Thr Ala Thr Thr Ala Met Thr Thr Thr Gln405CCA TGG AAC GAC ACT TTT ACC TCT ACA TCC ACT GAA ATG ACC ACC GTCPro Trp Asn Asp Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val420ACC GGT ACC AAC GGT TTG CCA ACT GAT GAA ACC ATC ATT GTC ATC AGAThr Gly Thr Asn Gly Leu Pro Thr Asp Glu Thr Ile Ile Val Ile Arg435ACA CCA ACA ACA GCC ACT ACT GCT ATG ACT ACA ACT CAG CCA TGG GACThr Pro Thr Thr Ala Thr Thr Ala Met Thr Thr Thr Gln Pro Trp Asp450GAC ACT TTT ACC TCT ACA TCC ACT GAA ATG ACC ACC GTC ACC GGT ACCAsp Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr465 480AAC GGT TTG CCA ACT GAT GAA ACC ATC ATT GTC ATC AGA ACA CCA ACAAsn Gly Leu Pro Thr Asp Glu Thr Ile Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr495ACA GCC ACT ACT GCC ATG ACT ACA ACT CAG CCA TGG AAC GAC ACT TTTThr Ala Thr Thr Ala Met Thr Thr Thr Gln Pro Trp Asn Asp Thr Phe510
ACC TCT ACA TCC ACT GAA ATG ACC ACC GTC ACC GGT ACC AAT GGT TTGThr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Leu525CCA ACT GAT GAG ACC ATC ATT GTC ATC AGA ACA CCA ACA ACA GCC ACTPro Thr Asp Glu Thr Ile Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Thr Ala Thr540ACT GCC ATG ACT ACA ACT CAG CCA TGG AAC GAC ACT TTT ACC TCT ACAThr Ala Met Thr Thr Thr Gln Pro Trp Asn Asp Thr Phe Thr Ser Thr555TCC ACT GAA ATG ACC ACC GTC ACC GGT ACC AAC GGT TTG CCA ACT GATSer Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Leu Pro Thr Asp570GAA ACC ATC ATT GTC ATC AGA ACA CCA ACA ACA GCC ACT ACT GCC ATAGlu Thr Ile Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Thr Ala Thr Thr Ala Ile585ACT ACA ACT GAG CCA TGG AAC AGC ACT TTT ACC TCT ACT TCT ACC GAAThr Thr Thr Glu Pro Trp Asn Ser Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu600TTG ACC ACA GTC ACC GGT ACC AAT GGT TTG CCA ACT GAT GAG ACC ATCLeu Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Leu Pro Thr Asp Glu Thr Ile615ATT GTC ATC AGA ACA CCA ACA ACA GCC ACT ACT GCC ATG ACT ACA ACTIle Val Ile Arg Thr Pro Thr Thr Ala Thr Thr Ala Met Thr Thr Thr630CAG CCA TGG AAC GAC ACT TTT ACC TCT ACA TCC ACT GAA ATG ACC ACCGln Pro Trp Asn Asp Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr645GTC ACC GGT ACC AAC GGT TTG CCA ACT GAT GAA ACC ATC ATT GTC ATCVal Thr Gly Thr Asn Gly Leu Pro Thr Asp Glu Thr Ile Ile Val Ile660AGA ACA CCA ACA ACA GCC ACT ACT GCC ATG ACT ACA ACT CAG CCA TGGArg Thr Pro Thr Thr Ala Thr Thr Ala Met Thr Thr Thr Gln Pro Trp675AAC GAC ACT TTT ACC TCT ACA TCC ACT GAA ATG ACC ACC GTC ACC GGTAsn Asp Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly690ACC AAC GGT TTG CCA ACT GAT GAG ACC ATC ATT GTC ATC AGA ACA CCAThr Asn Gly Leu Pro Thr Asp Glu Thr Ile Ile Val Ile Arg Thr Pro705 720ACA ACA GCC ACT ACT GCC ATG ACT ACA ACT CAG CCA TGG AAC GAC ACTThr Thr Ala Thr Thr Ala Met Thr Thr Thr Gln Pro Trp Asn Asp Thr735TTT ACC TCT ACA TCC ACT GAA ATG ACC ACC GTC ACC GGT ACC AAC GGCPhe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly750GTT CCA ACT GAC GAA ACC GTC ATT GTC ATC AGA ACT CCA ACT AGT GAAVal Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu765GGT CTA ATC AGC ACC ACC ACT GAA CCA TGG ACT GGT ACT TTC ACC TCT
Gly Leu Ile Ser Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser780ACA TCC ACT GAG ATG ACC ACC GTC ACC GGT ACT AAC GGT CAA CCA ACTThr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr795GAC GAA ACC GTG ATT GTT ATC AGA ACT CCA ACC AGT GAA GGT TTG GTTAsp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Val810ACA ACC ACC ACT GAA CCA TGG ACT GGT ACT TTT ACT TCT ACA TCT ACTThr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ssr Thr Ser Thr825GAA ATG ACC ACC ATT ACT GGA ACC AAC GGC GTT CCA ACT GAC GAA ACCGlu Met Thr Thr Ile Thr Gly Thr Asn Gly Val Pro Thr Asp Glu Thr840GTC ATT GTC ATC AGA ACT CCA ACC AGT GAA GGT CTA ATC AGC ACC ACCVal Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Ile Ser Thr Thr855ACT GAA CCA TGG ACT GGT ACT TTT ACT TCT ACA TCT ACT GAA ATG ACCThr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr870ACC ATT ACT GGA ACC AAT GGT CAA CCA ACT GAC GAA ACC GTT ATT GTTThr Ile Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val885ATC AGA ACT CCA ACT AGT GAA GGT CTA ATC AGC ACC ACC ACT GAA CCAIle Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Ile Ser Thr Thr Thr Glu Pro900TGG ACT GGT ACT TTC ACT TCT ACA TCT ACT GAA ATG ACC ACC GTC ACCTrp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr915GGT ACC AAC GGC GTT CCA ACT GAC GAA ACC GTC ATT GTC ATC AGA ACTGly Thr Asn Gly Val Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr930CCA ACC AGT GAA GGT CTA ATC AGC ACC ACC ACT GAA CCA TGG ACT GGCPro Thr Ser Glu Gly Leu Ile Ser Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly945 960ACT TTC ACT TCG ACT TCC ACT GAG GTT ACC ACC ATC ACT GGA ACC AACThr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Val Thr Thr Ile Thr Gly Thr Asn975GGT CAA CCA ACT GAC GAA ACT GTG ATT GTT ATC AGA ACT CCA ACC AGTGly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser990GAA GGT CTA ATC AGC ACC ACC ACT GAA CCA TGG ACT GGT ACT TTC ACTGlu Gly Leu Ile Ser Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr1005TCT ACA TCT GCT GAA ATG ACC ACC GTC ACC GGT ACT AAC GGT CAA CCASer Thr Ser Ala Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro1020ACT GAC GAA ACC GTG ATT GTT ATC AGA ACT CCA ACC AGT GAA GGT TTGThr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu
1035GTT ACA ACC ACC ACT GAA CCA TGG ACT GGT ACT TTT ACT TCG ACT TCCVal Thr Thr Thr Thr Glu PCo Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser1050ACT GAA ATG TCT ACT GTC ACT GGA ACC AAT GGC TTG CCA ACT GAT GAAThr Glu Met Ser Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Leu Pro Thr Asp Glu1065ACT GTC ATT GTT GTC AAA ACT CCA ACT ACT GCC ATC TCA TCC AGT TTGThr Val Ile Val Val Lys Thr Pro Thr Thr Ala Ile Ser Ser Ser Leu1080TCA TCA TCA TCT TCA GGA CAA ATC ACC AGC TCT ATC ACG TCT TCG CGTSer Ser Ser Ser Ser Gly Gln Ile Thr Ser Ser Ile Thr Ser Ser Arg1095CCA ATT ATT ACC CCA TTC TAT CCT AGC AAT GGA ACT TCT GTG ATT TCTPro Ile Ile Thr Pro Phe Tyr Pro Ser Asn Gly Thr Ser Val Ile Ser1110TCC TCA GTA ATT TCT TCC TCA GTC ACT TCT TCT CTA TTC ACT TCT TCTSer Ser Val Ile Ser Ser Ser Val Thr Ser Ser Leu Phe Thr Ser Ser1125CCA GTC ATT TCT TCC TCA GTC ATT TCT TCT TCT ACA ACA ACC TCC ACTPro Val Ile Ser Ser Ser Val Ile Ser Ser Ser Thr Thr Thr Ser Thr1140TCT ATA TTT TCT GAA TCA TCT AAA TCA TCC GTC ATT CCA ACC AGT AGTSer Ile Phe Ser Glu Ser Ser Lys Ser Ser Val Ile Pro Thr Ser Ser1155TCC ACC TCT GGT TCT TCT GAG AGC GAA ACG AGT TCA GCT GGT TCT GTCSer Thr Ser Gly Ser Ser Glu Ser Glu Thr Ser Ser Ala Gly Ser Val1170TCT TCT TCC TCT TTT ATC TCT TCT GAA TCA TCA AAA TCT CCT ACA TATSer Ser Ser Ser Phe Ile Ser Ser Glu Ser Ser Lys Ser Pro Thr Tyr1185 1200TCT TCT TCA TCA TTA CCA CTT GTT ACC AGT GCG ACA ACA AGC CAG GAASer Ser Ser Ser Leu Pro Leu Val Thr Ser Ala Thr Thr Ser Gln Glu1215ACT GCT TCT TCA TTA CCA CCT GCT ACC ACT ACA AAA ACG AGC GAA CAAThr Ala Ser Ser Leu Pro Pro Ala Thr Thr Thr Lys Thr Ser Glu Gln1230ACC ACT TTG GTT ACC GTG ACA TCC TGC GAG TCT CAT GTG TGC ACT GAAThr Thr Leu Val Thr Val Thr Ser Cys Glu Ser His Val Cys Thr Glu1245TCC ATC TCC CCT GCG ATT GTT TCC ACA GCT ACT GTT ACT GTT AGC GGCSer Ile Ser Pro Ala Ile Val Ser Thr Ala Thr Val Thr Val Ser Gly1260GTC ACA ACA GAG TAT ACC ACA TGG TGC CCT ATT TCT ACT ACA GAG ACAVal Thr Thr Glu Tyr Thr Thr Trp Cys Pro Ile Ser Thr Thr Glu Thr1275ACA AAG CAA ACC AAA GGG ACA ACA GAG CAA ACC ACA GAA ACA ACA AAAThr Lys Gln Thr Lys Gly Thr Thr Glu Gln Thr Thr Glu Thr Thr Lys1290
CAA ACC ACG GTA GTT ACA ATT TCT TCT TGT GAA TCT GAC GTA TGC TCTGln Thr Thr Val Val Thr Ile Ser Ser Cys Glu Ser Asp Val Cys Ser1305AAG ACT GCT TCT CCA GCC ATT GTA TCT ACA AGC ACT GCT ACT ATT AACLys Thr Ala Ser Pro Ala Ile Val Ser Thr Ser Thr Ala Thr Ile Asn1320GGC GTT ACT ACA GAA TAC ACA ACA TGG TGT CCT ATT TCC ACC ACA GAAGly Val Thr Thr Glu Tyr Thr Thr Trp Cys Pro Ile Ser Thr Thr Glu1335TCG AGG CAA CAA ACA ACG CTA GTT ACT GTT ACT TCC TGC GAA TCT GGTSer Arg Gln Gln Thr Thr Leu Val Thr Val Thr Ser Cys Glu Ser Gly1350GTG TGT TCC GAA ACT GCT TCA CCT GCC ATT GTT TCG ACG GCC ACG GCTVal Cys Ser Glu Thr Ala Ser Pro Ala Ile Val Ser Thr Ala Thr Ala1365ACT GTG AAT GAT GTT GTT ACG GTC TAT CCT ACA TGG AGG CCA CAG ACTThr Val Asn Asp Val Val Thr Val Tyr Pro Thr Trp Arg Pro Gln Thr1380GCG AAT GAA GAG TCT GTC AGC TCT AAA ATG AAC AGT GCT ACC GGT GAGAla Asn Glu Glu Ser Val Ser Ser Lys Met Asn Ser Ala Thr GlV Glu1395ACA ACA ACC AAT ACT TTA GCT GCT GAA ACG ACT ACC AAT ACT GTA GCTThr Thr Thr Asn Thr Leu Ala Ala Glu Thr Thr Thr Asn Thr Val Ala1410GCT GAG ACG ATT ACC AAT ACT GGA GCT GCT GAG ACG AAA ACA GTA GTCAla Glu Thr Ile Thr Asn Thr Gly Ala Ala Glu Thr Lys Thr Val Val1425 1440ACC TCT TCG CTT TCA AGA TCT AAT CAC GCT GAA ACA CAG ACG GCT TCCThr Ser Ser Leu Ser Arg Ser Asn His Ala Glu Thr Gln Thr Ala Ser1455GCG ACC GAT GTG ATT GGT CAC AGC AGT AGT GTT GTT TCT GTA TCC GAAAla Thr Asp Val Ile Gly His Ser Ser Ser Val Val Ser Val Ser Glu1470ACT GGC AAC ACC AAG AGT CTA ACA AGT TCC GGG TTG AGT ACT ATG TCGThr Gly Asn Thr Lys Ser Leu Thr Ser Ser Gly Leu Ser Thr Met Ser1485CAA CAG CCT CGT AGC ACA CCA GCA AGC AGC ATG GTA GGA TAT AGT ACAGln Gln Pro Arg Ser Thr Pro Ala Ser Ser Met Val Gly Tyr Ser Thr1500GCT TCT TTA GAA ATT TCA ACG TAT GCT GGC AGT GCC AAC AGC TTA CTGAla Ser Leu Glu Ile Ser Thr Tyr Ala Gly Ser Ala Asn Ser Leu Leu1515GCC GGT AGT GGT TTA AGT GTC TTC ATT GCG TCC TTA TTG CTG GCA ATTAla Gly Ser Gly Leu Ser Val Phe Ile Ala Ser Leu Leu Leu Ala Ile1530ATT TAAIle ***
順序數(shù) 2順序長度2589順序類型核酸鏈股雙鏈拓?fù)鋵W(xué) 線性分子類型基因組DNA原始源Saccharomyces cerevisiaeABXL-1D順序2
ATG ACA ATG CCT CAT CGC TAT ATG TTT TTG GCA GTC TTT ACA CTT CTGMet Thr Met Pro His Arg Tyr Met Phe Leu Ala Val Phe-Thr Leu Leu15GCA CTA ACT AGT GTG GCC TCA GGA GCC ACA GAG GCG TGC TTA CCA GCAAla Leu Thr Ser Val Ala Ser Gly Ala Thr Glu Ala Cys Leu Pro Ala30GGC CAG AGG AAA AGT GGG ATG AAT ATA AAT TTT TAC CAG TAT TCA TTGGly Gln Arg Lys Ser Gly Met Asn Ile Asn Phe Tyr Gln Tyr Ser Leu45AAA GAT TCC TCC ACA TAT TCG AAT GCA GCA TAT ATG GCT TAT GGA TATLys Asp Ser Ser Thr Tyr Ser Asn Ala Ala Tyr Met Ala Tyr Gly Tyr60GCC TCA AAA ACC AAA CTA GGT TCT GTC GGA GGA CAA ACT GAT ATC TCGAla Ser Lys Thr Lys Leu Gly Ser Val Gly Gly Gln Thr Asp Ile Ser75ATT GAT TAT AAT ATT CCC TGT GTT AGT TCA TCA GGC ACA TTT CCT TGTIle Asp Tyr Asn Ile Pro Cys Val Ser Ser Ser Gly Thr Phe Pro Cys90CCT CAA GAA GAT TCC TAT GGA AAC TGG GGA TGC AAA GGA ATG GGT GCTPro Gln Glu Asp Ser Tyr Gly Asn Trp Gly Cys Lys Gly Met Gly Ala105TGT TCT AAT AGT CAA GGA ATT GCA TAC TGG AGT ACT GAT TTA TTT GGTCys Ser Asn Ser Gln Gly Ile Ala Tyr Trp Ser Thr Asp Leu Phe Gly120TTC TAT ACT ACC CCA ACA AAC GTA ACC CTA GAA ATG ACA GGT TAT TTTPhe Tyr Thr Thr Pro Thr Asn Val Thr Leu Glu Met Thr Gly Tyr Phe135TTA CCA CCA CAG ACG GGT TCT TAC ACA TTC AAG TTT GCT ACA GTT GACLeu Pro Pro Gln Thr Gly Ser Tyr Thr Phe Lys Phe Ala Thr Val Asp150GAC TCT GCA ATT CTA TCA GTA GGT GGT GCA ACC GCG TTC AAC TGT TGTAsp Ser Ala Ile Leu Ser Val Gly Gly Ala Thr Ala Phe Asn Cys Cys165GCT CAA CAG CAA CCG CCG ATC ACA TCA ACG AAC TTT ACC ATT GAC GGTAla Gln Gln Gln Pro Pro Ile Thr Ser Thr Asn Phe Thr Ile Asp Gly180ATC AAG CCA TGG GGT GGA AGT TTG CCA CCT AAT ATC GAA GGA ACC GTCIle Lys Pro Trp Gly Gly Ser Leu Pro Pro Asn Ile Glu Gly Thr Val195TAT ATG TAC GCT GGC TAC TAT TAT CCA ATG AAG GTT GTT TAC TCG AACTyr Met Tyr Ala Gly Tyr Tyr Tyr Pro Met Lys Val Val Tyr Ser Asn210GCT GTT TCT TGG GGT ACA CTT CCA ATT AGT GTG ACA CTT CCA GAT GGT
Ala Val Ser Trp Gly Thr Leu Pro Ile Ser Val Thr Leu Pro Asp Gly225 240ACC ACT GTA AGT GAT GAC TTC GAA GGG TAC GTC TAT TCC TTT GAC GATThr Thr Val Ser Asp Asp Phe Glu Gly Tyr Val Tyr Ser Phe Asp Asp255GAC CTA AGT CAA TCT AAC TGT ACT GTC CCT GAC CCT TCA AAT TAT GCTAsp Leu Ser Gln Ser Asn Cys Thr Val Pro Asp Pro Ser Asn Tyr Ala270GTC AGT ACC ACT ACA ACT ACA ACG GAA CCA TGG ACC GGT ACT TTC ACTVal Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr285TCT ACA TCT ACT GAA ATG ACC ACC GTC ACC GGT ACC AAC GGC GTT CCASer Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Val Pro300ACT GAC GAA ACC GTC ATT GTC ATC AGA ACT CCA ACA ACT GCT AGC ACCThr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Thr Ala Ser Thr315ATC ATA ACT ACA ACT GAG CCA TGG ACT GGT ACT TTC ACT TCT ACA TCTIle Ile Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser330ACT GAA ATG ACC ACC GTC ACC GGT ACT AAC GGT CAA CCA ACT GAC GAAThr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu345ACC GTG ATT GTT ATC AGA ACT CCA ACC AGT GAA GGT TTG GTT ACA ACCThr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Val Thr Thr360ACC ACT GAA CCA TGG ACT GGT ACT TTT ACT TCG ACT TCC ACT GAA ATGThr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met375TCT ACT GTC ACT GGA ACC AAT GGC TTG CCA ACT GAT GAA ACT GTC ATTSer Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Leu Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile390GTT GTC AAA ACT CCA ACT ACT GCC ATC TCA TCC AGT TTG TCA TCA TCAVal Val Lys Thr Pro Thr Thr Ala Ile Ser Ser Ser Leu Ser Ser Ser405TCT TCA GGA CAA ATC ACC AGC TCT ATC ACG TCT TCG CGT CCA ATT ATTSer Ser Gly Gln Ile Thr Ser Ser Ile Thr Ser Ser Arg Pro Ile Ile420ACC CCA TTC TAT CCT AGC AAT GGA ACT TCT GTG ATT TCT TCC TCA GTAThr Pro Phe Tyr Pro Ser Asn Gly Thr Ser Val Ile Ser Ser Ser Val435ATT TCT TCC TCA GTC ACT TCT TCT CTA TTC ACT TCT TCT CCA GTC ATTIle Ser Ser Ser Val Thr Ser Ser Leu Phe Thr Ser Ser Pro Val Ile450TCT TCC TCA GTC ATT TCT TCT TCT ACA ACA ACC TCC ACT TCT ATA TTTSer Ser Ser Val Ile Ser Ser Ser Thr Thr Thr Ser Thr Ser Ile Phe465 480TCT GAA TCA TCT AAA TCA TCC GTC ATT CCA ACC AGT AGT TCC ACC TCTSer Glu Ser Ser Lys Ser Ser Val Ile Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser
495GGT TCT TCT GAG AGC GAA ACG AGT TCA GCT GGT TCT GTC TCT TCT TCCGly Ser Ser Glu Ser Glu Thr Ser Ser Ala Gly Ser Val Ser Ser Ser510TCT TTT ATC TCT TCT GAA TCA TCA AAA TCT CCT ACA TAT TCT TCT TCASer Phe Ile Ser Ser Glu Ser Ser Lys Ser Pro Thr Tyr Ser Ser Ser525TCA TTA CCA CTT GTT ACC AGT GCG ACA ACA AGC CAG GAA ACT GCT TCTSer Leu Pro Leu Val Thr Ser Ala Thr Thr Ser Gln Glu Thr Ala Ser540TCA TTA CCA CCT GCT ACC ACT ACA AAA ACG AGC GAA CAA ACC ACT TTGSer Leu Pro Pro Ala Thr Thr Thr Lys Thr Ser Glu Gln Thr Thr Leu555GTT ACC GTG ACA TCC TGC GAG TCT CAT GTG TGC ACT GAA TCC ATC TCCVal Thr Val Thr Ser Cys Glu Ser His Val Cys Thr Glu Ser Ile Ser570CCT GCG ATT GTT TCC ACA GCT ACT GTT ACT GTT AGC GGC GTC ACA ACAPro Ala Ile Val Ser Thr Ala Thr Val Thr Val Ser Gly Val Thr Thr585GAG TAT ACC ACA TGG TGC CCT ATT TCT ACT ACA GAG ACA ACA AAG CAAGlu Tyr Thr Thr Trp Cys Pro Ile Ser Thr Thr Glu Thr Thr Lys Gln600ACC AAA GGG ACA ACA GAG CAA ACC ACA GAA ACA ACA AAA CAA ACC ACGThr Lys Gly Thr Thr Glu Gln Thr Thr Glu Thr Thr Lys Gln Thr Thr615GTA GTT ACA ATT TCT TCT TGT GAA TCT GAC GTA TGC TCT AAG ACT GCTVal Val Thr Ile Ser Ser Cys Glu Ser Asp Val Cys Ser Lys Thr Ala630TCT CCA GCC ATT GTA TCT ACA AGC ACT GCT ACT ATT AAC GGC GTT ACTSer Pro Ala Ile Val Ser Thr Ser Thr Ala Thr Ile Asn Gly Val Thr645ACA GAA TAC ACA ACA TGG TGT CCT ATT TCC ACC ACA GAA TCG AGG CAAThr Glu Tyr Thr Thr Trp Cys Pro Ile Ser Thr Thr Glu Ser Arg Gln660CAA ACA ACG CTA GTT ACT GTT ACT TCC TGC GAA TCT GGT GTG TGT TCCGln Thr Thr Leu Val Thr Val Thr Ser Cys Glu Ser Gly Val Cys Ser675GAA ACT GCT TCA CCT GCC ATT GTT TCG ACG GCC ACG GCT ACT GTG AATGlu Thr Ala Ser Pro Ala Ile Val Ser Thr Ala Thr Ala Thr Val Asn690GAT GTT GTT ACG GTC TAT CCT ACA TGG AGG CCA CAG ACT GCG AAT GAAAsp Val Val Thr Val Tyr Pro Thr Trp Arg Pro Gln Thr Ala Asn Glu705 720GAG TCT GTC AGC TCT AAA ATG AAC AGT GCT ACC GGT GAG ACA ACA ACCGlu Ser Val Ser Ser Lys Met Asn Ser Ala Thr Gly Glu Thr Thr Thr735AAT ACT TTA GCT GCT GAA ACG ACT ACC AAT ACT GTA GCT GCT GAG ACGAsn Thr Leu Ala Ala Glu Thr Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Glu Thr750
ATT ACC AAT ACT GGA GCT GCT GAG ACG AAA ACA GTA GTC ACC TCT TCGIle Thr Asn Thr Gly Ala Ala Glu Thr Lys Thr Val Val Thr Ser Ser765CTT TCA AGA TCT AAT CAC GCT GAA ACA CAG ACG GCT TCC GCG ACC GATLeu Ser Arg Ser Asn His Ala Glu Thr Gln Thr Ala Ser Ala Thr Asp780GTG ATT GGT GAG AGC AGT AGT GTT GTT TCT GTA TCC GAA ACT GGC AACVal Ile Gly His Ser Ser Ser Val Val Ser Val Ser Glu Thr Gly Asn795ACC AAG AGT CTA ACA AGT TCC GGG TTG AGT ACT ATG TCG CAA CAG CCTThr Lys Ser Leu Thr Ser Ser Gly Leu Ser Thr Met Ser Gln Gln Pro810CGT AGC ACA CCA GCA AGC AGC ATG GTA GGA TAT AGT ACA GCT TCT TTAArg Ser Thr Pro Ala Ser Ser Met Val Gly Tyr Ser Thr Ala Ser Leu825GAA ATT TCA ACG TAT GCT GGC AGT GCC AAC AGC TTA CTG GCC GGT AGTGlu Ile Ser Thr Tyr Ala Gly Ser Ala Asn Ser Leu Leu Ala Gly Ser840GGT TTA AGT GTC TTC ATT GCG TCC TTA TTG CTG GCA ATT ATT TAAGly Leu Ser Val Phe Ile Ala Ser Leu Leu Leu Ala Ile Ile ***855順序數(shù) 3順序長度 33順序類型 核酸鏈股 單鏈拓?fù)鋵W(xué) 線性分子類型 其他核酸/合成DNA
順序3CCCAAGCTTA AAATGACAA TGCCTCATCG CTA順序數(shù)4順序長度 33順序類型 核酸鏈股 單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型 其他核酸/合成DNA順序4CCCAAGCTTT TAAATAATTG CCAGCAATAA GGA
權(quán)利要求
1.一種凝集基因，其特征在于，存在于酵母中，分子大小為4.7±0.2Kb，能夠編碼顯示凝集活性的多肽。
2.一種凝集基因，其特征在于，存在于酵母中，分子大小為2.6±0.2Kb，能夠編碼顯示凝集活性的多肽。
3.如權(quán)利要求1所述的凝集基因，其特征在于，從酵母Saccha-romyces cerevisiae中得到，由圖1的限制酶切圖譜所定義。
4.如權(quán)利要求1或3所述的凝集基因，其特征在于，該基因?qū)嶋H上編碼順序表中順序1所表示的氨基酸順序。
5.如權(quán)利要求2所述的凝集基因，其特征在于，從酵母Saccha-romyces cervisiae中得到，由圖2的限制酶切圖譜所定義。
6.如權(quán)利要求2或5所述的凝集基因，其特征在于，該基因?qū)嶋H上編碼順序表中順序2所表示的氨基酸順序。
7.含如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的凝集基因及具有凝集活性的酵母。
全文摘要
酵母中能夠編碼顯示凝集活性的多肽的4.7±0.2Kb的凝集基因。
文檔編號C12N5/10GK1107640SQ9419009
公開日1995年8月30日 申請日期1994年2月24日 優(yōu)先權(quán)日1993年2月26日
發(fā)明者渡淳二, 高田善浩, 小川雅裕, 彭蒂萊·默加, 奧內(nèi)拉·馬伊亞-利娜, 凱萊納恩·西卡 申請人:三寶樂啤酒株式會社, 奧伊, 帕尼莫實(shí)驗(yàn)室-布賴吉實(shí)驗(yàn)室