專利名稱：從紫杉的胚胎培養(yǎng)物中產(chǎn)生紫杉酚和塔三烷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從體細胞胚和/或培養(yǎng)基中生產(chǎn)紫杉酚及其衍生物的方法，特別是涉及培養(yǎng)合子胚或體細胞胚以得到體細胞多胚或胚發(fā)生愈傷組織的方法。
紫杉酚是一種已從紫杉屬植物中分離的生物堿，并對包括B16黑素瘤在內(nèi)的多種腫瘤細胞系表現(xiàn)有顯著的抗腫瘤活性。已知紫杉酚主要含在短干紫杉(Taxus brevifolia)的樹皮中，約為其克干重的0.02%。
雖然已證明紫杉酚的總合成方法是成功的，但這種方法因成本高而似乎不適于商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。此外，也使用漿果赤霉素Ⅲ或10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ成功地半合成了紫杉酚樣化合物(例如taxotere)。但這種方法也同樣存在上述問題。
因此，只能從這種稀有天然來源，例如收獲的紫杉的粗原料得到紫杉酚。因為紫杉樹中紫杉酚的含量很低，所以為生產(chǎn)1kg紫杉酚必須伐倒2000至4000棵樹，并且，天然來源生產(chǎn)足夠需要的紫杉酚將會導(dǎo)致森林經(jīng)濟體系的嚴(yán)重破壞。因此，試圖從紫杉種的細胞和組織培養(yǎng)物中生產(chǎn)紫杉酚及其相關(guān)化合物。
例如，美國專利5，019，504號公開了一種在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)紫杉種的樹皮、形成層、針葉和根組織以產(chǎn)生愈傷組織或懸浮細胞培養(yǎng)物，然后從中回收紫杉酚或紫杉酚樣生物堿的方法。但上述方法從1升細胞懸浮培養(yǎng)基中產(chǎn)生1.0-3.0mg紫杉酚。上述專利述及，紫杉樹樹皮能直接得到最佳產(chǎn)率的紫杉酚，并可通過培養(yǎng)這些組織以誘導(dǎo)未分化的細胞團(愈傷組織)和/或從增殖的愈傷組織構(gòu)成細胞懸浮培養(yǎng)物而產(chǎn)生紫杉酚。
迄今，上述使用各種紫杉組織的方法尚未商業(yè)化，其部分原因是由于相關(guān)細胞的紫杉酚產(chǎn)率低，或者由于未能充分建立大規(guī)模生產(chǎn)次級目的代謝物的工藝。
國際專利WO92-13961號公開了培養(yǎng)紫杉屬植物的組織，特別是其雌性配子母細胞并從愈傷組織或由之得到的懸浮培養(yǎng)細胞中回收紫杉酚。該方法可得到占懸浮培養(yǎng)細胞干重0.05%的紫杉酚。
這些方法不能以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)足夠量的紫杉酚，迄今仍有待改善紫杉酚生產(chǎn)能力。這些事實提示，需要提供一種增加細胞和/或培養(yǎng)基中紫杉酚含量及篩選高紫杉酚生產(chǎn)細胞系的改良方法，以適應(yīng)工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的最終目的。
在這些情況下，本發(fā)明人為建立一種工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)紫杉酚的方法而進行了深入地研究。結(jié)果，我們第一次不可預(yù)見地發(fā)現(xiàn)合子胚比迄今報導(dǎo)的含紫杉酚的其他組織含有更大量的紫杉酚(基于同樣干重)。
因為胚胎本身對于發(fā)展工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)紫杉酚的方法來說其體積太小，故本發(fā)明人為提供一種增加胚胎質(zhì)量的方法而作了進一步的探索。結(jié)果，我們令人驚奇地發(fā)現(xiàn)當(dāng)將胚胎培養(yǎng)在營養(yǎng)培養(yǎng)基上以誘導(dǎo)體細胞胚或胚發(fā)生愈傷組織時，胚胎質(zhì)量可比原來大小增加幾十萬倍。
基于上述發(fā)現(xiàn)而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的一個目的是通過提取紫杉的組織生產(chǎn)紫杉酚的方法，特征在于所說的組織是合子胚。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種培養(yǎng)紫杉的組織并從愈傷組織或培養(yǎng)基中回收紫杉酚以產(chǎn)生紫杉酚或其衍生物的方法，特征在于所說的組織是合子胚。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種生產(chǎn)紫杉酚或其衍生物的方法，該方法包括下述步驟(a)從紫杉屬植物提供活的合子胚并消毒之;
(b)在培養(yǎng)基上培養(yǎng)已消毒的胚胎以從胚胎產(chǎn)生愈傷組織;
(c)培養(yǎng)步驟(b)中得到的愈傷組織以從所說的愈傷組織產(chǎn)生體細胞胚;
(d)培養(yǎng)步驟(a)中得到的消毒的胚胎或步驟(c)中得到的體細胞胚以產(chǎn)生胚胎發(fā)生愈傷組織;
(e)液體培養(yǎng)步驟(c)中得到的體細胞胚或步驟(d)中得到的胚發(fā)生愈傷組織;以及(f)從培養(yǎng)基中和從細胞中回收紫杉酚或紫杉酚衍生物。
本發(fā)明有別于上面列舉的現(xiàn)有技術(shù)在于它是基于發(fā)現(xiàn)合子胚不可預(yù)見地含有大量紫杉酚，并通過誘導(dǎo)體細胞胚或胚發(fā)生愈傷組織而進一步增加胚胎的質(zhì)量，并且因為它使液體培養(yǎng)體細胞胚或胚發(fā)生愈傷組織以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)紫杉酚成為可能而優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)。
通過下列描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將很容易了解本發(fā)明的其他特征和應(yīng)用。


圖1(A)是標(biāo)準(zhǔn)品塔三烷(taxane)的HPLC層析圖。
圖1(B)是得自實施例7的純化之培養(yǎng)基的HPLC層析圖。
圖2(A)顯示實驗實施例1中沒有處理的大鼠腫瘤細胞的照片。
圖2(B)是顯示實驗實施例中用實施例7的提取物處理的大鼠腫瘤細胞的照片。
圖3(A)是ELISA數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖3(B)是實驗實施例2中所得ELISA數(shù)據(jù)的曲線。
圖4是顯示實施例8中生產(chǎn)培養(yǎng)基對紫杉酚生產(chǎn)之影響的圖解。
本發(fā)明人分析了種植在韓國國家林地的24，000株東北紫杉(Taxus cuspidata)的紫杉酚含量。雖然每棵樹的含量有明顯的不同，但發(fā)現(xiàn)收集自優(yōu)良樹的100g干胚中含有5g紫杉酚。而從同樣量干樹皮和針葉則分別得到4.5mg和2.0mg紫杉酚。
因此，本發(fā)明的第一個目的是提供一種從紫杉屬的胚胎中提取紫杉酚的生產(chǎn)紫杉酚的方法。對紫杉樹木的種類沒有限制，只要是屬于紫杉屬的，任何樹木均可利用，但優(yōu)選利用的是東北紫杉。
對從胚胎中生產(chǎn)紫杉酚的提取方法沒有限制。然而，一般可用在醇，特別是甲醇中浸漬冷凍干燥的胚胎粉末的方法從胚胎中提取紫杉酚。
不幸的是，合子胚的體積很小且胚胎中含有90%以上的水。須用很大量的胚胎才只生產(chǎn)出小量的紫杉酚，而且從經(jīng)濟角度看從胚胎中直接提取紫杉酚是不利的。
因此，本發(fā)明人已進行了深入地研究，以提供一種以經(jīng)濟方式生產(chǎn)紫杉酚而沒有上文認(rèn)定的問題的方法，而且作為其結(jié)果可因使用組織培養(yǎng)技術(shù)，特別是通過誘導(dǎo)體細胞胚和胚發(fā)生愈傷組織而使胚胎質(zhì)量增加幾十萬倍。因此，本發(fā)明的第二個目的是提供一種通過從紫杉屬的合子胚誘導(dǎo)體細胞胚或胚發(fā)生愈傷組織，使用搖瓶或生物反應(yīng)器在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所說的體細胞胚或胚發(fā)生愈傷組織，并從培養(yǎng)基和細胞中回收紫杉酚以生產(chǎn)紫杉酚或其衍生物的方法。
本發(fā)明的一個特征是本發(fā)明可通過誘導(dǎo)體細胞胚或胚發(fā)生愈傷組織以使胚胎的質(zhì)量增加數(shù)萬至數(shù)十萬倍，而從除胚胎以外的各種組織簡單地進行愈傷組織誘導(dǎo)則難以達到這樣一個擴增效果，這可能是由所用分生組織的細胞分化能力不同。具體地說，誘導(dǎo)胚發(fā)生愈傷組織有可能使胚胎質(zhì)量增加幾十萬倍，因此是很重要的。
下文將描述從合子胚誘導(dǎo)體細胞胚或胚發(fā)生的愈傷組織并生產(chǎn)紫杉酚的方法。
為了無菌培養(yǎng)胚胎，應(yīng)將8至11月份從紫杉樹上收集的種子消毒或作表面除菌?？墒褂贸Ｒ?guī)技術(shù)進行表面除菌消毒。例如，將種子在70%乙醇中浸沒30-60秒種，用無菌水洗2或3次并用1-3%(v/v)次氯酸鈉溶液除菌24小時。用無菌水將表面除菌的種子淋洗5次并分離胚胎。
可按上述提取技術(shù)從胚胎中提取紫杉酚。
也可將胚胎放在固體培養(yǎng)基上以由之誘生愈傷組織。可用PEDC(前胚胎發(fā)生決定細胞)或IEDC(誘導(dǎo)的胚發(fā)生決定細胞)程序進行體細胞胚的誘導(dǎo)。
按下述步驟使用PEDC方式誘導(dǎo)體細胞胚將胚胎培養(yǎng)在添加有1-萘乙酸(以下稱為“NAA”)、激動素和愈傷組織誘導(dǎo)用之2.4-D的固體培養(yǎng)基上。一旦誘導(dǎo)了愈傷組織，即將愈傷組織的小片再培養(yǎng)在含有適當(dāng)濃度主營養(yǎng)素、微量營養(yǎng)素及維生素的培養(yǎng)基上使之增殖。
為了誘導(dǎo)和增殖愈傷組織，可使用常規(guī)植物組織培養(yǎng)基而沒有什么限制。例如，可使用mB5(改進的Gamborg氏B5培養(yǎng)基)、Durzan，MS((Marashige和Skoog培養(yǎng)基)、WPM(Lloyd & McCown)、DKW(Driver-Kuniyuk-Walnut)、GD(Gresshoff &Doy)、SH(Schenk & Hildebrandt培養(yǎng)基)或LP(Quoirin & Lepiover)。
當(dāng)然可以對這些培養(yǎng)基進行改動，如加入除去不同的成分，或改變比例。其中優(yōu)選的是mB5或Durzan。作為體細胞胚發(fā)生的一個中間步驟，可使用與用于迅速增殖愈傷組織的培養(yǎng)基相同或不同的培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)。從可得到最大數(shù)目體細胞胚的角度看，應(yīng)優(yōu)先使用mB5培養(yǎng)基。
因為上述的大多數(shù)培養(yǎng)基都是可從商業(yè)途徑得到的或已很成熟的，所以公眾可以很容易地取得。因此，確定和/或最佳選擇用于誘導(dǎo)和迅速增殖愈傷組織的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員力所能及的。例如，優(yōu)先用于本發(fā)明的mB5培養(yǎng)基是稍加改動的Gamberg′s B5培養(yǎng)基，且其組成如表1所示。

此外，可在另外加有不同的植物生長激素的上文列舉的培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚胎，以完成生產(chǎn)體細胞胚的IEDC方法。
對于初始培養(yǎng)，加入2-4ppm的2，4-D。當(dāng)從胚胎表面生成愈傷組織并且細胞團增加10-20倍時，通常使用加入半量濃度植物生長素的同樣培養(yǎng)基進行再培養(yǎng)。
因為可能從未繁殖的細胞中分泌酚化合物，而使大多數(shù)愈傷組織失去其生長能力，所以要摻入0.5%(w/v)活性碳或1-2%(w/v)聚乙烯聚吡咯烷。在沒有生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上再培養(yǎng)愈傷組織2-4個月，以從愈傷組織的分生組織生成體細胞胚。
如此生成的體細胞胚含有大量的紫杉酚或紫杉酚衍生物(下文稱為“塔三烷”(“taxanes”))并且可將其用以提取塔三烷?？墒褂贸Ｒ?guī)方法，特別是下文所述方法從體細胞胚中提取塔三烷。但為了進一步增加細胞質(zhì)量最好使用體細胞胚誘生胚發(fā)生的愈傷組織。
根據(jù)本發(fā)明，可以經(jīng)提取胚發(fā)生的愈傷組織及如上產(chǎn)生的體細胞胚而制得相對高比例的塔三烷?？山?jīng)培養(yǎng)以上述PEDC或IEDC方法得到的體細胞胚或合子胚來產(chǎn)生胚發(fā)生的愈傷組織。生產(chǎn)胚發(fā)生的愈傷組織的方法如下所述在添加了1.0-4.0ppmNAA和0.5-2.0ppm激動素，較好添加2.0ppm NAA和10ppm激動素的適于培養(yǎng)愈傷組織的固體培養(yǎng)基中將消毒的胚胎或體細胞胚培養(yǎng)2-4個月?？上蚺囵B(yǎng)基中加入1-4ppm 2，4-D以代替NAA加激動素。然后在添加1-5ppm細胞分裂素如芐胺嘌呤、N-異戊烯基氨基嘌呤、激動素或玉米素的同樣培養(yǎng)基中將被誘導(dǎo)的愈傷組織培養(yǎng)1-2個月，以在愈傷組織的表面上形成胚狀體，并將此胚狀體放在添加2-10ppm，2，4-D的同樣培養(yǎng)基上，于26℃及16/8小時(光照/黑暗)條件下培養(yǎng)2-3個月。該培養(yǎng)能夠以很大量，即高達原胚組織質(zhì)量數(shù)十萬倍的量得到胚發(fā)生的愈傷組織。胚發(fā)生的愈傷組織可顯示廣泛的顏色，例如從黃色、褐色到綠色。
為了誘生和增殖胚發(fā)生的愈傷組織，可沒有限制地使用任何一種可用于常規(guī)植物細胞和組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基。
如上產(chǎn)生的胚發(fā)生的愈傷組織含有大量的紫杉酚并可直接用以提取紫杉酚和塔三烷。
可用常規(guī)技術(shù)，特別是下文所述的方法提取胚發(fā)生的愈傷組織。
為了以工業(yè)規(guī)模擴增胚發(fā)生愈傷組織的質(zhì)量，將胚發(fā)生愈傷組織剪切成單個細胞或小的細胞聚集物。為建立細胞懸浮培養(yǎng)物，將10%(V/V)的這些細胞接種到含有50ml添加了2ppm 2，4-D之液體培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中。為便于進行連續(xù)培養(yǎng)最好使用氣升式或葉輪型生物反應(yīng)器。
可使用兩種不同的培養(yǎng)基進行生物反應(yīng)器培養(yǎng)一種是用于細胞生長的(生長培養(yǎng)基)，另一種是用于產(chǎn)生塔三烷的(生產(chǎn)培養(yǎng)基)。生長培養(yǎng)基較好是添加2-4ppm 2，4-D的mB5培養(yǎng)基，生產(chǎn)培養(yǎng)基較好是添加2-10ppm NAA的MS培養(yǎng)基。
具體地說，生產(chǎn)培養(yǎng)基較好含有誘發(fā)劑以增加紫杉酚生產(chǎn)。誘發(fā)劑可選自真菌誘發(fā)劑、雌性配子母細胞提取物(1-5ml/l)、苯丙酸(50-300mM)和GA3(0.5-1.0ppm)、真菌誘發(fā)劑包括由Cytospora abietis ATCC No.38688和Penicillium minioluteum(Dierckx)NRRL18467經(jīng)粉碎和一系列提取而得到的提取物。另外，也可優(yōu)先選擇和培養(yǎng)Pestalotiopsis的真菌，并將其提取物以0.5-1.0ml/L的量加到培養(yǎng)基中。
紫杉酚存在于細胞中以及分泌到培養(yǎng)基中。因此，培養(yǎng)后可用已知技術(shù)培養(yǎng)物或培養(yǎng)基中回收紫杉酚和塔三烷?？捎秒x心法(例如1000xg，5-10分鐘)或傾析法從培養(yǎng)基中分離細胞。如果利用后一種技術(shù)進行分離，可將培養(yǎng)液放置約24小時以沉淀細胞并傾去培養(yǎng)基。使用吸管經(jīng)真空抽吸除去仍保留在收集的細胞中的培養(yǎng)基。
可用醇或甲醇與二氯甲烷的1∶1混合物提取體細胞胚或胚發(fā)生的愈傷組織以及培養(yǎng)基，以從中回收紫杉酚。可使用超聲波粉碎器(Branson 250)破碎離心期間形成的沉淀物，并進行提取。
根據(jù)本發(fā)明，回收紫杉酚本身及各種紫杉酚衍生物。紫杉酚衍生物包括10-脫乙酰漿果赤毒素Ⅲ、漿果赤霉素Ⅲ、10-脫乙酰紫杉酚、cephanolmanin和7-表-10-脫乙酰紫杉酚(參見圖1(B))。紫杉酚衍生物可以如此使用，或者必要時以半合成法轉(zhuǎn)化成紫杉酚。
可用HPLC、細胞毒性試驗及使用由NCI提供的作為標(biāo)準(zhǔn)品的紫杉酚及六種(6)紫杉酚衍生物進行的ELISA鑒定由體細胞胚和來源于合子胚的胚之胚發(fā)生愈傷組織產(chǎn)生的塔三烷。
下面借助非限制性實施例更詳細地描述本發(fā)明。
實施例1從紫杉的合子胚中回收紫杉酚從優(yōu)良的東北紫杉樹上收獲種子。在約40℃的真空烘箱中干燥胚胎組織3天至水含量少于10%并稱重。然后用液氮冷凍胚胎并粉碎之。將粉碎的胚在約含有100倍重量甲醇的約28℃恒溫箱中浸大約7天。通過濾膜(孔徑0.2um)過濾所得提取物，并使用HPLC方法分析紫杉酚的含量。
處理從同一樹上收集的樹皮和針葉并按上述同樣方法分析紫杉酚含量。結(jié)果示于表2中。
表2組織 干組織(100g)中的紫杉酚含量胚胎 5g樹皮 4.5mg針葉 2.0mg實施例2使用PEDC方式從胚胎產(chǎn)生體細胞胚。
將從東北紫杉的選擇的基因型得到的種子在70%乙醇和2%過氯酸鈉中分別浸泡50秒和24小時，并在各步驟終止后用無菌蒸餾水淋洗3至5分鐘。
使用添加2.0ppm NAA、0.5ppm激動素和0.5ppm 2，4-D的mB5培養(yǎng)基(具有如上文表1中所示的成分和組成)。在調(diào)整到26℃的生長室中體外培養(yǎng)8周。
在前8周培養(yǎng)期間，胚胎增大并從大多數(shù)胚的表面誘生了愈傷組織。切掉愈傷組織中的綠色斑點并使之在沒有任何生長調(diào)節(jié)劑的mB5培養(yǎng)基中培養(yǎng)3個月以誘生體細胞胚。
實施例3使用IEDC方式從合子胚產(chǎn)生體細胞胚。
按實施例2中方法消毒東北紫杉的種子并從中分離胚胎。胚胎在添加2ppm 2，4-D的Durzan培養(yǎng)基中23-28℃培養(yǎng)2周。培養(yǎng)2周后，所有胚胎都被從中誘生的愈傷組織完全包被。培養(yǎng)4周后愈傷組織的質(zhì)量達到原來質(zhì)量的幾十倍。
為了避免因其分泌的酚抑制愈傷組織生成或選成死亡，使用補充約1%聚乙烯聚吡咯烷酮的同樣培養(yǎng)基再培養(yǎng)愈傷組織。8周培養(yǎng)后，當(dāng)愈傷組織的平均直徑達到1-1.5cm時將愈傷組織移入不含植物生長調(diào)節(jié)劑的mB5培養(yǎng)基中，愈傷組織在其生長以誘生體細胞胚。某些胚中觀察到根的分化。
實施例4為了誘導(dǎo)胚發(fā)生的愈傷組織培養(yǎng)物，用實施例2中滅菌的合子胚和實施例3與4中的體細胞胚作為起始材料。
將上述材料在補充2.0ppm NAA和1.0ppm激動素的mB5培養(yǎng)基中23-28℃培養(yǎng)約2.5個月以誘導(dǎo)愈傷組織。完成愈傷組織誘導(dǎo)后，使用加有3ppm玉米素的同樣培養(yǎng)基進行亞培養(yǎng)約6周，以得到綠色到帶黃色的胚狀體。
在16/8(光照/黑暗)小時條件下，將胚狀體在含有3ppm 2，4-D的同樣培養(yǎng)基中26℃培養(yǎng)2個月，以產(chǎn)生質(zhì)量達原胚幾十萬倍的胚發(fā)生愈傷組織。所得到的胚發(fā)生愈傷組織在形態(tài)學(xué)上與來源于各種類型紫杉組織的正常愈傷組織差不多，且有時產(chǎn)生合子胚的相似外觀。
然而，胚發(fā)生愈傷組織的表面由多種不同色澤范圍的顏色構(gòu)成，包括紅、黃、暗綠、淺褐、深褐及黑色。用刀片將各個帶顏色的細胞團塊切成片以得到小的細胞聚集體，然后亞克隆到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-4周。從液體培養(yǎng)物中除去大的細胞團后，將單個細胞和/或小的細胞聚集體接種到有20ml培養(yǎng)基的塑料平皿上。摻入的方法是在培養(yǎng)4周后進行液體鋪板并選擇不同的帶顏色細胞系。經(jīng)常規(guī)肉眼選擇得到不同的帶顏色細胞系。
實施例5于25℃干燥實施例2或3得到的體細胞胚或?qū)嵤├?中得到的胚發(fā)生愈傷組織，并溶解在1μ二氯甲烷中。加入1μl蒸餾水并將此混合物攪拌10秒鐘，然后離心(25，000xg)。于25℃干燥沉淀物，溶解在50μl甲醇中并通過0.2μm濾膜過濾以得到提取物。
用裝有反相微孔柱進行HPLC，使用外部標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(校正系數(shù)0.999)分析提取物。HPLC結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)塔三烷的峰和含有上述提取物中的塔三烷的峰在同一滯留時間(14.3分鐘)出現(xiàn)。
實施例6按下述方法提取實施例2和3中得到的體細胞胚和實施例4中得到的胚發(fā)生愈傷組織，以產(chǎn)生塔三烷將實施例2和3中的體細胞胚和實施例4中的胚發(fā)生愈傷組織各0.5g放在離心管中，并加入2μl已烷。用玻璃棒充分混合該混合物并在-20℃保存12小時，然后于25℃，25，500xg離心20分鐘。
向沉淀物中加入甲醇氯化乙烯的混合溶液，用使用超聲波粉碎器(Branson 250)進行超聲處理。離心(25，000xg)所得溶液并于60℃干燥所得沉淀物，得到干燥的提取物。
分離提取的紫杉酚含量并得到下列結(jié)果實施例2的體細胞胚的提取物含有0.21-0.27mg/每克干細胞(總紫杉酚含量為0.5-1.2mg);實施例3的體細胞胚的提取物含有0.20-0.27mg(總紫杉酚含量為0.55-1.1mg);且實施例4的胚發(fā)生愈佃組織的提取物含有0.23-0.28mg(總紫杉酚含量為0.6-1.4mg)。
實施例7使了大量生產(chǎn)胚發(fā)生愈傷組織，使用葉輪型生物發(fā)生器培養(yǎng)實施例4的胚發(fā)生愈傷組織。
將實例4的胚發(fā)生愈傷組織以10%PCV(堆積細胞體積)接種于含有50ml液體mB5培養(yǎng)基(其中加有2ppm的2，4-D)的250ml培養(yǎng)瓶中。當(dāng)在無菌條件下于25-28℃培養(yǎng)18天時達到靜止期。
將培養(yǎng)物放在含有MS生產(chǎn)培養(yǎng)基(補充有2ppm NAA)的5升葉輪型生物反應(yīng)器中。在通氣條件下將培養(yǎng)物于25-28℃保持30天。培養(yǎng)30天后，將培養(yǎng)液放置24小時以沉淀細胞，并從培養(yǎng)基中分離出細胞。用吸管從細胞中徹底除去培養(yǎng)基。
按實施例5中所述的同樣方法提取如此分離的細胞和培養(yǎng)基以得到紫杉酚及其衍生物。
HPLC結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)品紫杉酚和其衍生物的峰(圖1(A))與含在上述提取物中的紫杉酚和其衍生物的峰(圖1(B))出現(xiàn)在同一滯留時間，表明這些化合物是相同的。
已計算出每克干細胞含有0.09mg紫杉酚，而培養(yǎng)基每升約含8mg紫杉酚。
實施例8為了檢測不同類型培養(yǎng)基對紫杉酚生產(chǎn)的影響，將實施例7的培養(yǎng)物接種在各種不同的培養(yǎng)基如MS、mB5、WPM、DKW、Durzan、White、LP、GD、B5、DCR或SH培養(yǎng)基上。所有被試培養(yǎng)基均補加2.0ppmNAA，并平衡調(diào)整包括微環(huán)境條件在內(nèi)的其他因素。培養(yǎng)周期減少到20天。
結(jié)果示于圖4中。從圖中可以看出，培養(yǎng)基的類型對紫杉酚的產(chǎn)生有很大影響，而且可見MS和mB5可給出最高的紫杉酚產(chǎn)量。
實施例9可在生產(chǎn)培養(yǎng)基中加入各種誘發(fā)劑以增加紫杉酚和塔三烷生產(chǎn)量。按下述方法估計誘發(fā)劑時紫杉酚產(chǎn)生的影響(1)為本發(fā)明目的，在培養(yǎng)基中加入作為紫杉酚之誘發(fā)劑的出現(xiàn)在紫杉中之真菌Pestalotiopsis sp.的提取物。
將植物組織如種子和內(nèi)層樹皮浸在70%乙醇中，使用15%H2O2表示消毒15分鐘后再次浸入70%乙醇中。用無菌蒸餾水將組織淋洗4次或4次以上以除去余留的試劑。將如此表面消毒的組織放在培養(yǎng)基上麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)基(麥芽提取物20.0g、胨5.0g、瓊脂15.0g和蒸餾水1升)、生長瓊脂培養(yǎng)基(葡萄糖40g、bacto soyton 10g、乙酸鈉1g、苯甲酸鈉50mg、瓊脂20.0g和蒸餾水1升)及水培養(yǎng)基(瓊脂20.0g和蒸餾水1升)，并維持在12/12(光照/黑暗)小時光照設(shè)備的恒溫控制的生長室中。
當(dāng)Pestalotiopsis sp.真菌在培養(yǎng)后3天內(nèi)顯現(xiàn)時，將真菌進一步在麥芽提取物和生長瓊脂培養(yǎng)基(酵母浸膏3g、bacto soyton 5g、MgSO40.5g、葡萄糖5g、蔗糖10g/L)培養(yǎng)4天。收獲時，離心培養(yǎng)物以從培養(yǎng)基中分離出細胞。干燥細胞后，粉碎并用甲醇提取以得到碳水化合物部分。
將如此得到的Restalotiopsis sp.的碳水化合物提取物加到生產(chǎn)培養(yǎng)基中至1ppm濃度、并按實施例7中所述方法進行培養(yǎng)和分析。結(jié)果示于表3中。
(2)向生產(chǎn)培養(yǎng)基中加入作為誘發(fā)劑的雌性配子母細胞提取物2ml/L、苯丙氨酸100mM和赤霉酸1ppm，重復(fù)實施例7的方法。結(jié)果示于表3中。

實驗實施例1使用大鼠腫瘤細胞進行細胞毒性試驗，從驗證得自紫杉樹脂胚胎培養(yǎng)物的紫杉酚。
通?；谧仙挤幽軌蜻x擇性地殺死處于細胞分裂中間的腫瘤細胞這一事實，而使用大鼠腫瘤細胞進行細胞毒性試驗以證實紫杉酚的活性。將由Central Research and Development Center of Pacific Corporation，Kyounggi-do，Korea提供的大鼠腫瘤細胞培養(yǎng)在含有動物細胞培養(yǎng)基的塑料培養(yǎng)瓶中。在培養(yǎng)的早期階段，當(dāng)發(fā)生細胞分裂時，向一個瓶中加入1滴實施例7的提取物(處理)，而不向另一個瓶內(nèi)加提取物(對照)。然后檢查各腫瘤細胞的細胞分裂和存活性。結(jié)果示于圖2(A)和圖2(B)中。
如可從圖2(A)和2(B)中看到的，對照組顯示腫瘤細胞的旺盛生長(圖2(A))，而處理組則顯示腫瘤細胞死亡(圖2(B))。在處理后3小時顯現(xiàn)有腫瘤細胞死亡，并在其后約24小時完全死亡。因此，不需要檢測細胞分裂或存活性。
實驗實施例2還按下述方法使用單克隆抗體的ELISA方法(酶聯(lián)免疫吸附法)鑒定得自紫杉樹胚胎培養(yǎng)物的塔三烷本實驗中使用購自Hawaii Biotechnology Group的對紫杉酚起特異反應(yīng)的TA01藥盒和對塔三烷起特異反應(yīng)的TA03藥盒。用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)將紫杉酚和塔三烷稀釋100倍，并將各100μl稀釋液分加于ELSA板小井中。25℃保溫1小時后，用TBS-7(洗滌緩沖液)溶液將平板至少洗4次，并向其中加入50μl PBST(磷酸鹽緩沖鹽水-吐溫)。將紫杉酚標(biāo)準(zhǔn)品、塔三烷標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)嵤├?的提取物以連續(xù)三倍稀釋方式分配到小井中。
用PBST將紫杉酚抗體和塔三烷抗體分別稀釋100倍和1000倍，并分配各50μl稀釋液。25℃保溫1小時后，用洗滌緩沖液洗平板4次。將用PBST稀釋2000倍的100μl HRP(辣根過氧化物酶)分配到小井中并于25℃保溫1小時，然后用洗滌緩沖液洗4次。加入200μl OPD(鄰苯二胺)并于25℃保溫1小時以顯色。使用ELISA讀數(shù)器測出490nm吸光率。圖3(A)中所示的紫杉酚的檢測結(jié)果和圖3(B)中所示的實施例7之培養(yǎng)基的檢測結(jié)果證明了紫杉之胚胎培養(yǎng)物的紫杉酚活性。
應(yīng)明確的是，上文的詳細描述只是以舉例說明的方式給出的，顯然可以在不背離本發(fā)明精神和范圍的情況下對發(fā)明作出改動和改變。
權(quán)利要求書按照條約第19條的修改1.(刪除)2.培養(yǎng)紫杉的組織并從愈傷組織或培養(yǎng)基中回收紫杉或其衍生物以生產(chǎn)紫杉酚或其衍生物的方法，特征在于所說的組織是合子胚。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中該方法包括以下步驟(a)從紫杉的種子提供活的合子胚并消毒之，(b)培養(yǎng)接種至培養(yǎng)基中的所說的消毒的胚胎以由胚胎產(chǎn)生愈傷組織；(c)培養(yǎng)(b)中得到的愈傷組織以從所說的愈傷組織產(chǎn)生體細胞胚；(d)培養(yǎng)(a)中得到的消毒的胚胎或(c)中得到的體細胞胚以產(chǎn)生胚發(fā)生的愈傷組織；(e)液體培養(yǎng)(c)中得到的體細胞胚或(d)中得到的胚發(fā)生的愈傷組織；以及(f)從培養(yǎng)基中和細胞中回收紫杉酚或紫杉酚衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中步驟(c)是利用PEDC(前胚發(fā)生決定細胞)或IEDC(誘導(dǎo)的胚發(fā)生決定細胞)程序誘導(dǎo)體細胞胚而完成的。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中液體培養(yǎng)(e)由使用生長培養(yǎng)基的生長階段和使用生產(chǎn)培養(yǎng)基的紫杉酚生產(chǎn)階段組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中生長培養(yǎng)基是改動的含2－5ppm，2，4－D的Gamborg B5(mB5)培養(yǎng)基，且生產(chǎn)培養(yǎng)基是添加1－2ppm NAA的MS或mB5培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中生產(chǎn)培養(yǎng)基含有作為誘發(fā)劑的得自存在于紫杉中之真菌的碳水化合物部分提取物、紫杉的雌性配子母細胞的提取物、苯丙氨酸或赤霉酸，用以提高紫杉酚生產(chǎn)能力。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中真菌是pestatotiopsis sp.。
9.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中步驟(d)是經(jīng)在含有1.0-4.0ppm NAA和0.5-2.0ppm激動素的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(b)中的胚胎或步驟(c)中的體細胞胚以由之誘生愈傷組織、在含有1－5ppm細胞分尿素、芐胺嘌呤、N－異戊烯基氨基嘌呤、激動素或玉米素的同樣培養(yǎng)基中培養(yǎng)愈傷細胞以在愈傷組織表面上形成胚狀體，并在含有2－10ppm、2，4－D的同樣培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚狀體以產(chǎn)生胚發(fā)生的愈傷組織。
10.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中提取步驟(c)中的體細胞胚以產(chǎn)生紫杉酚或其衍生物。
11.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中提取步驟(d)中的胚發(fā)生的愈傷組織以產(chǎn)生紫杉酚或其衍生物。
12.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中紫杉種是東北紫杉。
13.(刪除)14.(刪除)
權(quán)利要求
1.提取紫杉的組織以生產(chǎn)紫杉酚的方法，特征在于所說的組織是合子胚。
2.培養(yǎng)紫杉的組織并從愈傷組織或培養(yǎng)基中回收紫杉或其衍生物以生產(chǎn)紫杉酚或其衍生物的方法，特征在于所說的組織是合子胚。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中該方法包括以下步驟(a)從紫杉的種子提供活的合子胚并消毒之，(b)培養(yǎng)接種至培養(yǎng)基中的所說的消毒的胚胎以由胚胎產(chǎn)生愈傷組織;(c)培養(yǎng)(b)中得到的愈傷組織以從所說的愈傷組織產(chǎn)生體細胞胚;(d)培養(yǎng)(a)中得到的消毒的胚胎或(c)中得到的體細胞胚以產(chǎn)生胚發(fā)生的愈傷組織;(e)液體培養(yǎng)(c)中得到的體細胞胚或(d)中得到的胚發(fā)生的愈傷組織;以及(f)從培養(yǎng)基中和細胞中回收紫杉酚或紫杉酚衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中步驟(c)是利用PEDC(前胚發(fā)生決定細胞)或IEDC(誘導(dǎo)的胚發(fā)生決定細胞)程序誘導(dǎo)體細胞胚而完成的。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中液體培養(yǎng)(e)由使用生長培養(yǎng)基的生長階段和使用生產(chǎn)培養(yǎng)基的紫杉酚生產(chǎn)階段組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中生長培養(yǎng)基是改動的含2-4ppm，2，4-D的Gamborg B5(mB5)培養(yǎng)基，且生產(chǎn)培養(yǎng)基是添加1-2ppm NAA的MS或mB5培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中生產(chǎn)培養(yǎng)基含有作為誘發(fā)劑的得自存在于紫杉中之真菌的碳水化合物部分提取物、紫杉的雌性配子母細胞的提取物、苯丙氨酸或赤霉酸，用以提高紫杉酚生產(chǎn)能力。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中真菌是pestalotiopsis sp.。
9.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中步驟(d)是經(jīng)在含有1.0-4.0ppm NAA和0.5-2.0ppm激動素的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(b)中的胚胎或步驟(c)中的體細胞胚以由之誘生愈傷組織、在含有1-5ppm細胞分裂素、芐胺嘌呤、N-異戊烯基氨基嘌呤、激動素或玉米素的同樣培養(yǎng)基中培養(yǎng)愈傷細胞以在愈傷組織表面上形成胚狀體，并在含有2-10ppm、2，4-D的同樣培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚狀體以產(chǎn)生胚發(fā)生的愈傷組織。
10.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中提取步驟(c)中的體細胞胚以產(chǎn)生紫杉酚或其衍生物。
11.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中提取步驟(d)中的胚發(fā)生的愈傷組織以產(chǎn)生紫杉酚或其衍生物。
12.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中紫杉種是東北紫杉。
13.來自紫杉種之合子胚分離塊的體細胞胚培養(yǎng)物，其為在權(quán)利要求3的步驟(c)中得到的。
14.來自紫杉種之合子胚分離塊的胚發(fā)生的愈傷組織培養(yǎng)物，其為在權(quán)利要求3的步驟(d)中得到的。
全文摘要
本發(fā)明公開了通過提取紫杉的組織或其細胞培養(yǎng)物生產(chǎn)紫杉酚和塔三烷的方法。經(jīng)提取紫杉的組織和/或培養(yǎng)基生產(chǎn)紫杉酚及其衍生物的方法特征在于所說的組織是合子胚。可經(jīng)誘導(dǎo)體細胞胚或胚發(fā)生的愈傷組織來進行紫杉合子胚的細胞培養(yǎng)。
文檔編號C12R1/91GK1111911SQ94190464
公開日1995年11月15日 申請日期1994年7月6日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月6日
發(fā)明者李輔植, 孫圣鎬 申請人:大韓民國山林廳林木育種研究所