專利名稱：新多肽及編碼該多肽的dna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來自鱟的(1→3)-β-D-葡聚糖敏感性因子(以下稱G因子)的以氨基酸順序表示的多肽及編碼該多肽的DNA。特別是G因子的a亞基以氨基酸順序表示的多肽及編碼該多肽的DNA。
背景技術(shù)：
人們歷來知道使用鱟的溶解液測定內(nèi)毒素的方法。該方法以用鱟的溶解液凝固10-9g的數(shù)量級的微量內(nèi)毒素為基礎(chǔ)，后來從生物化學(xué)上闡明了這一反應(yīng)是由幾個凝固因子分階段的激活機制構(gòu)成的(也稱作級聯(lián)反應(yīng))(中村隆范他，日本細菌學(xué)雜志38，781-803(1983))。

圖1所示為用日本產(chǎn)的鱟(Tachypleustridentatus)所進行的凝固級聯(lián)反應(yīng)。關(guān)于圖1所示的三種絲氨酸蛋白酶前體(C因子、B因子、凝固酶前體)和凝膠化的蛋白質(zhì)(稱作凝固素原)，通過cDNA克隆化，闡明了它們的結(jié)構(gòu)(T.Muta et al(1991)J.Biol.Chem.，266，6554-6561、T.Muta et al(1991)J.Biol.Chem.，265，22426-22433、T.Miyata et al(1986)J.Biochem.，100，213-220)。
另一方面，也已知用這種溶解物與真菌及酵母菌備胞壁中存在的(1→3)-β-D-葡聚糖反應(yīng)，靈敏度達10-8～10-9數(shù)量級，引起凝膠化(參見圖1)。作為這種與(1→3)-β-D-葡聚糖相互作用啟動凝膠化反應(yīng)的因子，即為G因子。G因子和其它的因子同樣為絲氨酸蛋白酶的前體，已經(jīng)知道是72kDa的a亞基和37kDa的b亞基以非共價鍵結(jié)合的糖蛋白(1991年第64回日本生化學(xué)會上發(fā)表)。
此外，目前認為G因子的a亞基上具有(1→3)β-D-葡聚糖的特異結(jié)合部位，而且b亞基上具有絲氨酸蛋白酶區(qū)域，(1→3)-β-D-葡聚糖在a亞基上的結(jié)合使G因子激活從而顯示出絲氨酸蛋白酶的功能。但是，G因子的全構(gòu)造尚不清楚。發(fā)明的公開本發(fā)明考慮到上述的狀況，把來自鱟的G因子，特別是具有(1→3)-β-D-葡聚糖結(jié)合部位的a亞基分離純化，并弄清了它的全構(gòu)造。
本發(fā)明的目的是提供含有G因子的(1→3)-β-D-葡聚糖結(jié)合部位的多肽及編碼該多肽的cDNA。
本發(fā)明的另一個目的是提供G因子的a亞基的多肽及編碼該多肽的DNA。
本發(fā)明還有一個目的是提供含有a亞基的G因子的多肽及編碼該多肽的DNA。
因此，本發(fā)明涉及含有至少一個以Gln-Gln-Trp-Ser氨基酸順序表示的結(jié)構(gòu)單元的多肽，編碼這種多肽的單鏈DNA或由該DNA與互補DNA所構(gòu)成的雙鏈DNA以及以該氨基酸順序表示的多肽。
此外，本發(fā)明涉及編碼下面的氨基酸順序或與之有同源性的順序所表示的多肽的單鏈DNA或由該DNA與互補DNA構(gòu)成的雙鏈DNA以及該氨基酸順序所表示的多肽。
SerHisGluProLysTrpGlnLeuValTrpSerAspGluPheThrAsnGlyIleSerSerAspTrpGluPheGluMetGlyAsnGlyLeuAsnGlyTrpGlyAsnAsnGluLeuGlnTyrTyrArgArgGluAsnAlaGlnValGluGlyGlyLysLeuValIleThrAlaLysArgGluAspTyrAspGlyPheLysTyrThrSerAlaArgLeuLysThrGlnPheAspLysSerTrpLysTyrGlyLysIleGluAlaLysMetAlaIleProSerPheArgGlyValTrpValMetPheTrpMetSerGlyAspAsnThrAsnTyrValArgTrpProSerSerGlyGluIleAspPheIleGluHisArgAsnThrAsnAsnGluLysValArgGlyThrIleHisTrpSerThrProAspGlyAlaHisAlaHisHisAsnArgGluSerAsnThrAsnGlyIleAspTyrHisIleTyrSerValGluTrpAsnSerSerIleValLysTrpPheValAsnGlyAsnGlnTyrPheGluValLysIleGlnGlyGlyValAsnGlyLysSerAlaPheArgAsnLysValPheValIleLeuAsnMetAlaIleGlyGlyAsnTrpProGlyPheAspValAlaAspGluAlaPheProAlaLysMetTyrIleAspTyrValArgValTyrGlnAspAlaSerThrSerSerProValGlyAspThrSerLeuAspGlyTyrTyrPheValGlnAsnArgHisSerGluLeuTyrLeuAspValThrAspAlaSerAsnGluAspGlyAlaPheLeuGlnGlnTrpSerTyrSerGlyAsnGluAsnGlnGlnPheAspPheGluHisLeuGluAsnAsnValTyrLysIleThrAsnLysLysSerGlyLysSerLeuAspValTyrAsnPheGlyThrGluAsnGlyValArgIleGlnGlnTrpSerTyrGlyGlyAlaArgAsnGlnGlnPheThrValGlnSerValGlyAspGlyTyrTyrLysIleIleProArgGlySerGlyLysIleValGluValAlaAspPheSerLysAspAlaGlyGlyLysIleGlnGlnTrpSerAsp
AsnAsnGlnLeuSerGlyGlnTrpLysLeuIleLysSerLysSerTyrSerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheAspSerSerLysValGlnLeuGluAspThrSerAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspAsnGluGlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlyAsnTyrArgIleGluTyrArsValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspValProSerThrGlyGlyTrpGlnLysTrpThrThrIleSerHisThrValAsnValAspSerGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnArgAlaSerTrpAsnIleAsnTrpIleLysIleThrLysIleProGluGlnSerAsnLeuAsnGlnGlyArgArgAsnSerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheSerTyrSerGluValGlnLeuGluAspThrLeuAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspLysGluGlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlySerTyrArgValGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspIleProSerThrGlyGlyLeuGlnLysTrpThrThrIleSerHisIleValAsnValAspLeuGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnLysAlaSerTrpAsnIleAsnTrpIleArgIleThrLysVal至今已知有四種鱟，就這四種來說，對于發(fā)揮變形細胞(アメボサイト)成分的凝固素原的功能所必要的結(jié)構(gòu)部分彼此非常相似(73～99％)。據(jù)此，推測本發(fā)明的多肽在4種鱟之間，氨基酸順序和凝固素原的情況有同樣程度的類似。
于是，多肽之間有相同性的場合，盡管氨基酸順序不全同，但由于這種類似的氨基酸順序，而發(fā)揮相同或類似的功能，所以本發(fā)明不僅包括上述氨基酸順序而且還包括與之有相同性的氨基酸順序，對此，從事本行業(yè)的人是容易理解的。
下面對本發(fā)明作詳細說明。
首先G因子的純化可從鱟的血球抽提液，經(jīng)各種柱層析操作，例如葡聚糖硫酸瓊脂糖CL-6B(Dextran sulfate-Sapharose CL-6B)和伴刀豆球蛋白A-瓊脂糖4B(Con A-Sepharose-4B)親和層析，然后用Sephacryl S-200HR進行凝膠過濾層析加以精制(T.Morita et al 1981 FEBS Lett.，129(2)，318-321，特公平3-399號公報)。進一步，可以用G因子的變性劑(表面活性劑等)使構(gòu)成G因子的a亞基和b亞基變性，用分子篩高速液相色譜法(HPLC)分部分離得到a和b亞基。將各亞基還原、烷化后用酶消化，用肽順序測定儀等測定，得到肽片斷的氨基酸順序，從而可測得各亞基的部分氨基酸順序。然后，從鱟血球分離出的poly(A)+RNA制作的cDNA庫，根據(jù)上述各亞基的部分氨基酸順序合成的寡核苷酸或用各亞基的抗體將編碼各亞基的cDNA分離出來，用雙脫氧核苷酸終止法等可測定其堿基順序(proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.74，5463-5467(1977)Sanger，F(xiàn).et al.)。然后，根據(jù)如此測定的堿基順序和上述的部分氨基酸順序就可確定各亞基的氨基酸順序。
用以上方法，弄清了順序號1的編碼G因子的a亞基多肽的cDNA(AGC……GTG；堿基編號114～2075)和與其對應(yīng)的氨基酸順序(Ser……Val；氨基酸編號1～654)。
接著，根據(jù)G因子a亞基氨基酸順序確定其具有區(qū)域結(jié)構(gòu)。
即，在a亞基的氨基末端一側(cè)(Pro……Ala；氨基酸編號4～236)存在具有與β-1，3-葡聚糖酶的羧基末端順序相似順序的葡聚糖酶區(qū)域(參見圖2)。另一方面，在羧基末端一側(cè)存在著由126個氨基酸構(gòu)成的重復(fù)結(jié)構(gòu)(Ser……Ile；氨基酸編號391～516和Ser……Val；氨基酸編號529～654)，并且該順序和木聚糖酶Z的氨基末端順序相似(參見圖3)。然后，在葡聚糖酶區(qū)域和木聚糖酶區(qū)域之間具有一個QQWS(Gln-Gln-Trp-Ser)基本結(jié)構(gòu)，并存在著重復(fù)了三次的與木聚糖酶A的順序類似的順序(Leu……Leu，氨基酸編號247～293、G1u……Val；氨基酸編號294～340.和Gly……Ser；氨基酸編號341～387)(參見圖4)。
圖2至圖4中用一個字母表示各氨基酸。
本發(fā)明中，制備了含有編碼這些肽的DNA的重組DNA載體，然后將其整合進縮主，培養(yǎng)或增殖，以所謂基因工程的方法生產(chǎn)出這些肽。
圖1表示鱟血球的內(nèi)毒素敏感性和(1→3)-β-D-葡聚糖敏感性凝固級聯(lián)反應(yīng)的機制。
圖2表示G由子的a亞基的葡聚糖酶區(qū)域(氨基酸編號4～236)的氨基酸順序。圖中FGA表示G因子的a亞基的氨基酸編號4～236的氨基酸順序，βG1Al表示β-1，3-葡聚糖酶的氨基酸編號421～682的氨基酸順序。
圖3表示G因子的a亞基的氨基酸編號391～654區(qū)域。圖中FGA表示G因子的a亞基的氨基酸編號391～654的氨基酸順序，XynZ表示木聚糖酶Z的氨基酸編號295～434的氨基酸順序。
圖4表示G因子的a亞基的氨基酸編號247～387區(qū)域。圖中FGA表示G因子的a亞基的氨基酸編號247～387的氨基酸順序，XlnA表示木聚糖酶A的氨基編號351～477的氨基酸順序。發(fā)明的最佳實施方案以下說明本發(fā)明的具體實施例，但是本發(fā)明不限于這些實施例。實施例11.G因子的純化(1)血球抽提液的制備在113g鱟(Tachypleustridentatus)的血球中加入400ml0.02m Tris-鹽酸緩沖液，pH8.0(含有50mm氯化鈉)，在高速勻漿器(商品名，ヒスコトロン，日本精密工業(yè)(株)制造)中勻漿3分鐘后，8000rpm離心30分鐘，得到上清液。然后在離心生成的沉淀物中加入300ml同一緩沖液，采用同上的操作進行勻漿和離心再得到上清液。沉淀物中再加入同一緩沖液，離心回收上清液，再如此重復(fù)二次，收集離心操作所得的全部上清液，共得1250ml血球抽提液。
(2)由血球抽提液純化G因子的方法a.葡聚糖硫酸-瓊脂糖-Cl-6B柱層析將上述1250ml抽提液加到預(yù)先以抽提用緩沖液平衡過的葡聚糖硫酸-瓊脂糖-CL6B柱(5×17.8cm)(準備柱子的方法參照特公平3-399號公報的制備例2)上，用相同的緩沖液充分洗凈后，用0.02M Tris-HCl緩沖流pH8.0(含有0.15M NaCl)將吸附在柱上后多余的蛋白質(zhì)洗去。然后，用0.02M Tris-HCl緩沖液pH8.0(含有0.25M NaCl)將吸附在柱上的蛋白質(zhì)洗脫出來，得到G因子部分。
b.伴刀豆球蛋白A-瓊脂糖4B柱層析將上述G因子部分加到預(yù)先用0.02M Tris-Hcl緩沖液pH8.0(含有0.25M NaCl)平衡過的ConA-Sepharose 4B柱(Pharmacia Biotech(公司)生產(chǎn))(2×16cm)上，用平衡化緩沖液充分洗凈后，再用0.02M Tris-HCl緩沖液pH8.0(含有0.5M NaCl)把柱子充分洗凈。洗凈后用0.02M Tris-HCl緩沖液pH8.0(含0.5M NaCl，0.5M甲基-α-D-葡糖苷)將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來，得到G因子部分。
C.Sephacryl S-200 HR柱層析將上述G因子部分用超濾法濃縮后加到預(yù)先用0.05M磷酸鈉緩沖液pH6.5平衡過的Sephacryl S-200 HR柱(PharmaciaBiotech公司產(chǎn)品)(2.7×98cm)上，用相同緩沖液將蛋白質(zhì)洗脫出來。用這一層析法最后洗脫出并收集，280nm波長處僅顯示一點點吸收的蛋白質(zhì)部分。這樣得到的蛋白質(zhì)，就作為G因子的最終精制標準品。從113g血球最后得到按牛血清白蛋白換算約300μgG因子。
2.G因子的a亞基的部分順序的測定(a)G因子的a亞基和b亞基的分離為了進行G因子的a亞基和b亞基的cDNA克隆化，須弄清楚必要的G因子的a、b亞基的部分氨基酸順序，為此先分離G因子的a亞基和b亞基。將上述1所得的G因子脫鹽并濃縮，用甲醇和氯仿沉淀(Methods in Enzymology vol.182，p78-79，(1990))后，溶解在2％SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液中，100℃加熱5分鐘。將此加熱過的試樣，用二根連接起來的TSK凝膠G3000SW進行凝膠過濾，以0.1M磷酸鈉緩沖液pH7.0(含0.1％SDS)作為流動相，將G因子的a、b亞基分離開。
(2)G因子的a亞基的酶消化在上述2(a)中得到的G因子的a亞基的部分中加入最終濃度為17.4％(w/v)的三氯乙酸(TCA)，沉淀G因子的a亞基。按照Paul Matsu-daira的方法(A Practical Guide to Protein and Pep-tide Purification for Microsequencing，p42-43，1989，AcademicPress，Inc.出版)將沉淀的G因子的a亞基溶解在0.4M碳酸氫銨(含8M尿素)中、用碘乙酰胺進行還原烷化，然后加水將尿素濃度稀釋到4M之后，以酶-底物1∶60重量比加入賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶((ly-syl endopeptidase，和光純藥工業(yè)(株))37℃下酶解20小時。將此消化產(chǎn)物加到預(yù)先用0.06％v/v三氟乙酸平衡過的μBondasphere 5μC8-300(2.1×150mm)(ウオ-タ-ズ社)上，將柱子充分洗凈后，用乙腈濃度連續(xù)上升的直線濃度梯度法，5分鐘后0％(v/v)，65分鐘后24％(v/v)，125分鐘后56％(v/v)、135分鐘后達到80％(v/v)，以0.2ml/min的流速將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。這時洗脫出的各肽，用210nm紫外吸收進行監(jiān)測，全部分別收集。
(3)部分氨基酸順序的測定用氣相順序儀47 7A(Applied Biosystems Japan公司)測定所得到的各肽的氨基酸順序。此結(jié)果表示于表1。
但是Xaa表示自然界存在的一個氨基酸。
表1肽 1Ser-Xaa-Glu-Pro-Lys-Xaa-Gln-Leu-Val-肽 2Arg-Glu-Asp-Tyr-Asp-Gly-Phe-Lys肽 3Tyr-Thr-Ser-Ala-Arg-Leu-Lys肽 4Thr-Gln-Phe-Asp-Lys肽 5Ser-Trp-Lys肽 6Tyr-Gly-Lys肽 7Met-Ala-Ile-Pro-Ser-Phe-Arg-Gly-Val-Trp-Val-Met-Phe-Trp-Met-Ser-Gly-Xaa-Asn-Thr-Asn-Tyr-Val-Xaa-Xaa-Pro-肽 8Ser-Ala-Phe-Arg-Asn-Lys肽 9Val-Phe-Val-Ile-Leu-Asn-Met-Ala-Ile-Gly-Gly-Asn-Xaa-Pro-Gly-Phe-Xaa-Val-Ala-肽 10Ile-Ile-Pro-Arg-Gly-Ser-Gly-Lys肽 11Val-Gln-Leu-Glu-Asp-Thr-Ser-Asp-Val-Gly-Gly-Gly-Lys肽 12Cys-Asp-Asn-Glu-Gly-Ala-Trp-Met-Ala-Tyr-Lys肽 13Asp-Ile-Asp-Phe-Pro-Ser-Ser-Gly-Asn-Tyr-Xaa-Ile-Glu-Tyr-Xaa-Val-Ala-肽 14Leu-Ile-Gln-Ala-Glu-Xaa-Tyr-Phe-Xaa-Tyr-Xaa-Glu-Val-Gln-Leu-Glu-肽 15Glu-Gly-Ala-Trp-Met-Ala-Tyr-Lys肽 16Val-Arg-Gly-Thr-Ile-His-Trp-Ser-Thr-Pro-Asp-Gly-Ala-His-Ala-His-His-Asn-Arg-
3.寡核苷酸的合成由表1中的測定的氨基酸順序，利用2種氨基酸順序A-Glu-Asp-Tyr-Asp-Gly-Phe-，B-Trp-Val-Met-Phe-Trp-Met-將A逆翻譯為意義鏈，B逆翻譯成反義鏈，然后在5′末端加上限制酶識別順序和保護DNA的2個堿基，用DNA合成儀-380A(AppliedBiosystems Japan公司)合成了如下面所示的25個堿基與26個堿基的寡核苷酸的混合物。
A′5′-CGGAGCTCGAAGATTATGATGGTTT-3′ 25個核苷酸G C C C CAGB′3′-ACCCATTACAAAACCTACCTTAAGGC-5′ 26個核苷酸CGAG〔式1〕這里所示的寡核苷酸A′和B′分別包括相當于A和B的順序或互補的順序的全部可能性(但是，A的phe密碼z(TT(C/T))中的第3個核苷酸(T，C)例外)。
4.含有編碼G因子的mRNA的poly(A)+RNA的制備從鱟的血球純化了G因子，從而從鱟的血球分離出poly(A)+RNA。
(1)總RNA的制備用AGPC法(參見實驗醫(yī)學(xué)Vol.9，p1937～1940)從11.8g鱟的血球中分離出約11mg總RNA。
(2)poly(A)+RNA的制備取2mg分離出的總RNA用Oligotex-dT 30 Super試劑盒(日本ロシユ(株)生產(chǎn))分離poly(A)+RNA。然后，為了提高一次分離的poly(A)+RNA的純度，再重復(fù)一次同樣的操作。由如此進行的二次Oligotex-dT30 Super試劑盒操作，從2mg總RNA獲得了34.5μg高純度的poly(A)+RNA。
5.鱟血球cDNA庫的制備(1)cDNA的合成由上述4中制備的poly(A)+RNA 34.5μg中取出5μg poly(A)+RNA，用Amecrsham公司的cDNA合成試劑盒合成了cDNA。
(2)cDNA庫的制備由(1)中合成的cDNA，用Amersham公司的cDNA克隆系統(tǒng)λgt10接頭法制備了鱟的血球cDNA庫。
6.G因子a亞基的cDNA克隆以上述4(2)中獲得到的poly(A)+RNA為模板，再用上述3合成的寡核苷酸，采用PCR法Saiki，R.K.et al，Science，239，487-491，1988)擴增了編碼G因子a亞基一部分的cDNA片段。用多引物DNA標記試劑盒(日本基因株式會社生產(chǎn))以[α-32P]dCTP標記此cDNA片段，將其用作探針，對上述5(2)中制備的cDNA庫進行篩選，獲得了含最長約為2,400dp的插入cDNA的二個陽性克隆。這二個克隆的插入cDNA除5′末端和3′末端的長度有數(shù)個堿基的差異之外全部相同。然后測定了這二者的堿基順序，它們復(fù)合起來的堿基順序含有起始密碼子和poly(A)+尾巴。大小為2400bp。
7.編碼G因子的a亞基的cDNA堿基順序的測定將上述6中得到的插入cDNA重組進了pUC118和pBlue-script II SK載體中。為了測定克隆在pUC118載體和pBluescript IISK載體中的cDNA全堿基順序，利用cDNA片段上的限制酶識別位點以及長鏈缺失試劑盒(寶酒造公司產(chǎn)品)進行缺失和亞克隆。使用鱟光標記的核苷酸引物和DNA順序分析儀-370A(AppliedBiosystems Japan公司產(chǎn)品)測定了以上述方法制備的克隆中的cDNA的堿基順序。(Smith L.M.et al(1986)Nature 321，674-679)。
順序表的順序號1表示這樣測定的G因子a酸基的cDNA的堿基順序，以及由此弄清楚的氨基酸順序。在此氨基酸順序中全部包含了2(3)中測定的部分氨基酸順序(表1)，確定了該堿基順序的插入cDNA確實是編碼G因子的a亞基的密碼子。
8.G因子或其它基的表達及純化由上述得到的克隆，用超聲波處理、限制酶處理或這一技術(shù)領(lǐng)域已知的其它方法將編碼G因子的a亞基的基因的全部或一部分分離出來并重組進適當?shù)妮d體。載體是用能在宿主微生物體內(nèi)或細胞內(nèi)自主增殖的噬菌體或質(zhì)粒經(jīng)基因重組而構(gòu)建的，即所謂含有裝上適當?shù)膯幼?、SD順序、翻譯起始密碼子ATG或者再有適當?shù)慕Y(jié)構(gòu)基因的載體都是適用的。這樣構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)移入適當?shù)乃拗魃矬w或細胞可得到轉(zhuǎn)化子，各種大腸桿菌株、各種酵母菌株、鼷鼠、大鼠、中國倉鼠等動物的卵母細胞(CHO)之類的動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、動植物昆蟲宿主等都可作為宿主。將這樣得到的轉(zhuǎn)化子用營養(yǎng)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，或者用營養(yǎng)食物飼喂就可穩(wěn)定地生產(chǎn)大量的G因子或其亞基(以下稱作G因子等)。轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)或飼育條件盡管在生產(chǎn)G因子等的范圍內(nèi)可作適當改變，而所用宿主的繁殖，可用該技術(shù)領(lǐng)域中一般公知的條件。培養(yǎng)物中的或喂養(yǎng)物中的G因子、含菌體或細胞的培養(yǎng)液或用適當?shù)臋C械方法破碎了的個體的抽提液，也可以就這樣采取使用。然而，一般按通常的方法，當G因子等存在于培養(yǎng)液中或抽提液中時，用過濾、離心分離等方法將含G因子等的溶液與菌體細胞或個體的破碎的碎片分離之后再使用。當G因子等存在于菌體內(nèi)，細胞內(nèi)或個體內(nèi)臟膜內(nèi)時，將獲得的培養(yǎng)物或碎片先用過濾或離心分離等方法收集菌體，細胞或碎片，然后將其用機械的方法或超聲波處理或溶菌酶等酶方法或添加EDTA等螯合劑和/或表面活性劑使G因子等溶解之后加以分離。從這樣得到的含有G因子等的溶液分離G因子等可以使用通常人們知道的蛋白質(zhì)純化方法。
這時若G因子等以嵌合的多肽表達的話，則可以利用其他蛋白質(zhì)的性質(zhì)容易地進行分離。比如利用其他的蛋白質(zhì)對某種物質(zhì)的親和性，用親和層析法就可以容易地分離出來。
實際上G因子α亞基可以用下面的方法來表達。
先合成具有5′-AGCCACGAACCAAAGTGGCA-3′順序的寡核苷酸，然后將5′端磷酸化。再將此寡核苷酸與編碼G因子α亞基的基因摻入的質(zhì)粒制備的單鏈DNA進行雜交，用Klenow片段等DNA聚合酶進行延伸反應(yīng)，用綠豆核酸酶等DNA酶切斷這時生成的單鏈部分，得到雙鏈DNA。用限制酶SphI將此雙鏈DNA切斷，這時產(chǎn)生的連接末端，用DNA聚合酶或Klenow片段或用削平試劑盒將其弄成平頭。預(yù)先用NcoI限制酶切斷此雙鏈DNA，這時產(chǎn)生的連接末端用T4DNA聚合酶或Klenow片段或削平試劑盒弄成平頭，重組進了pTV118N(含氨芐青霉素抗性基因)。將此質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli JM109或E.coli MV1184得到轉(zhuǎn)化子。這時可以利用質(zhì)粒的性質(zhì)以一般的方法選擇必要的轉(zhuǎn)化子。即在含有氨芐青霉素的LB平板(預(yù)先涂布了(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)/異丙基硫半乳糖苷(IPTG))上培養(yǎng)，將導(dǎo)入了目標質(zhì)粒的白色菌落挑選出來。然后用合成寡核苷酸5′AAACAGACCAT-GAGCCACGAACCA-3′做探針可以篩選得到具有正確順序的質(zhì)粒。然后用RV-N引物(寶酒造公司產(chǎn)品)作為順序分析引物進行DNA順序分析，就可以確認正確質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。將具有正確順序的質(zhì)粒導(dǎo)入E.Co1i JM 109或MV1184，用含有100μg/ml氨芐青霉素和1mM IPTG的3％營養(yǎng)肉湯(日水制藥公司產(chǎn)品)30℃下培養(yǎng)此細菌24小時。使用一般的方法，從此培養(yǎng)物的上清液或菌體抽提液純化出G因子的a亞基。這時使用抗體或與G因子的a亞基有親和性的配基進行親和層析，就可以比較簡單地純化出來。實施例21.G因子的b亞基的部分氨基酸順序的測定(1)G因子b亞基的分離實施例1的2(1)中由于把G因子分離成了a亞基的b亞基，因而同樣也得到了b亞基。
(2)G因子的b亞基的酶消化用和實施例1的2(2)相同的方法，由上述(1)中得到的G因子的b亞基得到了肽片段。
(3)部分氨基的順序的測定按和實施例1的2(3)相同的方法測定了所得的各肽的氨基酸順序。此結(jié)果列于表2。
表2肽lGly-Ile-Asn-Glu-Lys肽2Xaa-Xaa-Gly-Phe-Xaa-Pro-Val-Ile-Thr-肽3Ile-Ile-Gly-Gly-Gly-Ile-Ala-Thr-Pro-His-Ser-Xaa-Pro-Xaa-Met-Val-Gly-Ile-Phe-肽4Val-Asn-Pro-肽5Val-Xaa-Val-Val-Thr-Ala-Ala-His-Cys-Leu-Val-Thr-Gln-Phe-Gly-Asn-Arg-Gln-Xaa-Tyr-Ser-Ile-Phe-Val-Arg-Val-Gly-Ala-His-Xaa-Ile-Xaa-Asn-Ser-Gly-Thr-Asn-肽6Val-Val-Ile-Thr-Gly-Trp-Gly-Val-Thr-Gly-Lys肽7Asn-Val-Leu-Arg-Glu-Leu-Glu-Leu-Pro-Val-Val-Thr-Asn-Glu-Gln-Cys-Xaa-Lys肽8Ser-Tyr-Gln-Thr-Leu-Pro-Phe-Ser-Lys肽9Leu-Asn-Arg-Gly-Ile-Thr-Asn-Asp-Met-Ile-Cys-Ala-Gly-Phe-Pro-Glu-Gly-Gly-Lys肽10Asp-Ala-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Met-Tyr-Gln-Asn-Pro-Thr-Thr-Gly-Arg-Val-Lys2.寡核苷酸的合成根據(jù)測定的氨基酸順序，利用2種氨基酸順序C-Asn-Glu-Gln-Gys-(Asn)-Lys，D-Met-Tyr-Gln-Asn-Pro-Thr-順序，逆翻譯C成意義鏈，逆翻譯D成反義鏈，用和實施例1的3相同的方法合成了如下所示的各25個寡核苷酸C′和D′的混合物。上述C中的-(Asn)-表示推測為Asn。
C′5′-CGGAGCTCAATGAACAATGTAATAA-3′ 25個核苷酸C G G C CD′3′-TACATAGTTTTAGGTTGCTTAAGGC-5′ 25個核苷酸G C G CAG〔式2〕這里所示的寡核苷酸C′及D′，包括了和C及D相同的或互補的順序的全部可能的(但是C和D的C末端氨基酸的Lys，以及D的Thr的各密碼子(AA(A/G)和(AC(A/C/G/T))第三核苷酸(各A，G和T，C，A，G)除外)。
4.G因子的b亞基的cDNA克隆。
以實施例1的4(2)中得到的poly(A)+RNA做模板，再用上述2中合成的寡核苷酸，用和實施例1的6相同的方法進行實驗，得到了含有1979bp的cDNA的陽性克隆。分析此克隆的插入cDNA的堿基順序時，證實它含有與來自上述1(2)中所得的G因子b亞基的肽的氨基酸順序相當?shù)膲A基順序，并見存在添加poly A信號，根據(jù)其大小推想這個克隆是全長的cDNA。
5.編碼G因子的b亞基的cDNA堿基順序的測定用和實施例1的7相同的方法測定了G因子的b亞基的cDNA堿基順序。這樣分析的結(jié)果，弄清楚了以G因子b亞基的cDNA的堿基順序以及由此弄清楚的G因子的b亞基的氨基酸順序，列于第2號順序表中。
由于在這一氨基酸順序中完全含有實施例2的1(3)測定的部分氨基酸順序(表2)，所以現(xiàn)在測定堿基順序的插入cDNA確實是編碼G因子b亞基的。
含有編碼實施例2中提取的多肽的cDNA的重組DNA載體，在轉(zhuǎn)移進有可能復(fù)制的宿主微生物，適當?shù)膭游锛毎?、昆蟲或昆蟲細胞之后，以載體的標記和結(jié)合(1→3)-β-D-葡聚糖的能力作為指標，篩選得到了保持該重組DNA載體的微生物，動物細胞、昆蟲或昆蟲細胞，經(jīng)過培養(yǎng)或飼養(yǎng)就可以提取本發(fā)明的多肽。工業(yè)上的應(yīng)用性用本發(fā)明分離純化了鱟的變形細胞溶解液的G因子的a亞基，測定了它的氨基酸順序和編碼它的cDNA堿基順序。
其結(jié)果，在此順序中含有(1→3)-β-D-葡聚糖結(jié)合部位，利用它們的cDNA，借助基因工程的方法可以得到相當于結(jié)合部位的多肽。得到的多肽顯示出如下種種的效果。
(1)近年來伴隨著免疫不全患者的增加和高齡化，由于白色念珠菌屬，曲霉菌屬等類通常致病性弱的二次病原體引起的條件真菌感染明顯增加。然而，特別是因真菌引起的內(nèi)臟等的深部真菌病，除了一部分特殊的病型以外，不靠侵襲性手段的有限臨床診斷是困難的，因此多是在解剖檢查后做出初步診斷(參見微生物學(xué)辭典、1989年，技報堂)。
上述深部感染的真菌病口診斷，可以用含有該(1→3)-β-D-葡聚糖結(jié)合部位的多肽或?qū)?1→3)-β-D-葡聚糖用放射性同位素、酶、螢光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)等標記物質(zhì)標記了的結(jié)合部位多肽，用配基-受體檢測法測定(1→3)-β-D-葡聚糖。此外也可以使用將此多肽結(jié)合在微型平板，試管或小珠等固相上，特異地捕捉檢出(1→3)-β-D-葡聚糖等的測定方法。用這樣的測定方法能特異地測定體液中的來自真菌的可1→3)-β-D-葡聚糖，可以對深部真菌病進行簡便迅速的診斷。
(2)此外，含有(1→3)-β-D-葡聚糖結(jié)合部位的多肽上結(jié)合了抗真菌劑的藥物對病灶具有很強的親和性，就有可能制出對細胞壁上存在(1→3)-β-D-葡聚糖的病灶中的真菌有特異性殺菌作用的新的選擇性抗真菌劑。
(3)其次，伴隨著近年來基因操作技術(shù)的發(fā)展，在表達目的蛋白質(zhì)時，將酵母菌作為含有編碼目的蛋白質(zhì)的基因的載體的宿主，進行繁殖。這樣，因為可與細菌同時大量培養(yǎng)，從而可生產(chǎn)糖蛋白。但是，問題在于，產(chǎn)物中大多含有酵母菌的殘渣，殘渣帶有極微量的作為構(gòu)成成分的(1→3)-β-D-葡聚糖，必須將它定量和清除。這時使用將含有(1→3)-β-D-葡聚糖結(jié)合部位的多肽結(jié)合在支持體上的親和載體進行親和層析，可以特異地除去酵母菌的殘渣，或者進行定量，而且確認除去殘渣后的產(chǎn)物中不含有酵母菌菌體成分，如(1)中所述的使用含有(1→3)-β-D-葡聚糖結(jié)合部位的多肽進行的定量法，比起使用鱟變形細胞溶解物，可以更簡便地，高度特異性地確認。
順序表順序編號1順序長度2408順序類型雙鏈拓撲結(jié)構(gòu)直鏈起源鱟血球順序10203040GTGGGGGGTTTAGTTGAAACAGTAAATACGTTAACTGTTTAATCT5060708090TGTTAATTGCAATGTTGGTGTTGCTGTGTTGTGTTGTTTTGCATGMetLeuValLeuLeuCysCysValValLeuHisVal-15-10100 110 120 130TTGGTGTTGCAAGAATTTGCTGTAGCCACGAACCAAAGTGGCAGCGlyValAlaArgIleCysCysSerHisGluProLysTrpGlnLeu-5 -1 1 5140 150 160 170 180TCGTCTGGTCGGATGAATTTACCAATGGAATAAGTTCTGATTGGGValTrpSerAspGluPheThrAsnGlyIleSerSerAspTrpGlu10 15 20190 200 210 220AATTTGAAATGGGCAATGGCCTCAATGGTTGGGGTAATAACGAACPheGluMetGlyAsnGlyLeuAsnGlyTrpGlyAsnAsnGluLeu
2530 35230 240 250 260 270TGCAATATTATCGTCGTGAAAATGCCCAAGTTGAGGGAGGGAAACGlnTyrTyrArgArgGluAsnAlaGlnValGluGlyGlyLysLeu40 45 50280 290 300 310TGGTAATTACTGCTAAAAGAGAAGACTATGATGGCTTCAAATACAValIleThrAlaLysArgGluAspTyrAspGlyPheLysTyrThr55 60 65320 330 340 350 360CTTCTGCTAGGCTGAAAACCCAGTTTGATAAATCTTGGAAGTATGSerAlaArgLeuLysThrGlnPheAspLysSerTrpLysTyrGly70 7580370 380 390 400GTAAAATTGAAGCCAAAATGGCGATTCCATCATTTCGGGGAGTCTLysIleGluAlaLysMetAlaIleProSerPheArgGlyValTrp85 90 95410 420 430 440 450GGGTGATGTTCTGGATGTCAGGAGACAACACTAATTATGTTAGATValMetPheTrpMetSerGlyAspAsnThrAsnTyrValArgTrp100105110460 470 480 490GGCCATCTTCTGGTGAAATTGACTTTATTGAACATAGAAACACTAProSerSerGlyGluIleAspPheIleGluHisArgAsnThrAsn115120125500 510 520 530 540ACAATGAAAAAGTCAGAGGAACTATTCACTGGTCCACTCCTGACGAsnGluLysValArgGlyThrIleHisTrpSerThrProAspGly130135140550 560 570 580GTGCTCATGCGCATCATAACAGAGAAAGTAATACAAATGGGATTGAlaHisAlaHisHisAsnArgGluSerAsnThrAsnGlyIleAsp145150155590 600 610 620 630ATTATCACATTTATTCTGTAGAGTGGAATTCTTCCATTGTTAAATTyrHisIleTyrSerValGluTrpAsnSerSerIleValLysTrp160165170640 650 660 670GGTTTGTTAATGGAAATCAATACTTTGAAGTGAAAATTCAGGGAGPheValAsnGlyAsnGlnTyrPheGluValLysIleGlnGlyGly175180185680 690 700 710 720GAGTAAATGGGAAAAGTGCATTTCGTAACAAAGTTTTCGTTATTTValAsnGlyLysSerAlaPheArgAsnLysValPheValIleLeu190195200
730 740 750 760TAAACATGGCGATTGGTGGAAACTGGCCAGGATTCGATGTTGCTGAsnMetAlaIleGlyGlyAsnTrpProGlyPheAspValAlaAsp205210215770 780 790 800 810ACGAGGCTTTCCCTGCTAAAATGTACATTGATTATGTCCGTGTATGluAlaPheProAlaLysMetTyrIleAspTyrValArgValTyr220225230820 830 840 850ACCAGGATGCCAGTACATCTTCTCCTGTTGGGGATACCTCTTTAGGlnAspAlaSerThrSerSerProValGlyAspThrSerLeuAsp235240245860 870 880 890 900ATGGTTACTATTTTGTCCAAAACAGGCACAGTGAATTGTATCTTGGlyTyrTyrPheValGlnAsnArgHisSerGluLeuTyrLeuAsp250255260910 920 930 940ATGTCACTGATGCCAGTAACGAAGATGGAGCATTTCTGCAACAATValThrAspAlaSerAsnGluAspGlyAlaPheLeuGlnGlnTrp265270275950 960 970 980 990GGTCTTATAGTGGTAATGAGAACCAACAGTTTGATTTTGAGCATCSerTyrSerGlyAsnGluAsnGlnGlnPheAspPheGluHisLeu2802852901000 1010 1020 1030TCGAAAATAATGTTTATAAAATTACTAATAAAAAAAGTGGAAAATGluAsnAsnValTyrLysIleThrAsnLysLysSerGlyLysSer2953003051040 1050 1060 1070 1080CTTTGGATGTTTATAATTTTGGGACTGAGAATGGTGTTAGAATCCLeuAspValTyrAsnPheGlyThrGluAsnGlyValArgIleGln3103153201090 1100 1110 1120AACAGTGGTCATATGGAGGGGCTCGCAATCAGCAGTTTACTGTACGlnTrpSerTyrGlyGlyAlaArgAsnGlnGlnPheThrValGln3253303351130 1140 1150 1160 1170AAAGTGTTGGTGATGGTTATTATAAGATTATTCCACGCGGCAGTGSerValGlyAspGlyTyrTyrLysIleIleProArgGlySerGly3403453501180 1190 1200 1210GAAAGATAGTGGAAGTAGCAGATTTTAGTAAAGATGCAGGAGGGALysIleValGluValAlaAspPheSerLysAspAlaGlyGlyLys3553603651220 1230 1240 1250 1260AGATACAACAATGGTCTGATAACAACCAATTATCTGGACAGTGGAIleGlnGlnTrpSerAspAsnAsnGlnLeuSerGlyGlnTrpLys3703753801270 1280 1290 1300AACTTATTAAAAGTAAAAGTTATTCTAAATTAATTCAGGCAGAAALeuIleLysSerLysSerTyrSerLysLeuIleGlnAlaGluSer3853903951310 1320 1330 1340 1350GTTATTTTGATTCCTCAAAAGTACAATTGGAAGATACCTCAGATGTyrPheAspSerSerLysValGlnLeuGluAspThrSerAspVal4004054101360 1370 1380 1390TAGGAGGTGGGAAGAATGTTAAATGTGATAATGAAGGAGCCTGGAGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspAsnGluGlyAlaTrpMet4154204251400 1410 1420 1430 1440TGGCTTATAAGGATATTGATTTCCCCAGTTCAGGTAATTATCGAAAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlyAsnTyrArgIle4304354401450 1460 1470 1480TAGAATACAGAGTAGCAAGTGAACGTGCAGGAGGAAAGCTGTCTCGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeu44545045514901500151015201530TGGATTTGAATGCAGGCTCTATAGTTCTTGGCATGCTGGATGTTCAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspValPro4604654701540 1550 1560 1570CTTCAACAGGAGGATGGCAGAAGTGGACCACCATTTCCCATACAGSerThrGlyGlyTrpGlnLysTrpThrThrIleSerHisThrVal4754804851580 1590 1600 1610 1620TGAATGTGGATTCAGGTACATATAACTTGGGGATCTATGTTCAACAsnValAspSerGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnArg4904955001630 1640 1650 1660GAGCCAGCTGGAATATCAACTGGATAAAGATTACAAAAATACCTGAlaSerTrpAsnIleAsnTrpIleLysIleThrLysIleProGlu5055105151670 1680 1690 1700 1710AACAGTCAAATTTGAATCAAGGGCGTCGTAATTCTAAATTAATTCGlnSerAsnLeuAsnGlnGlyArgArgAsnSerLysLeuIleGln520525530
1720 1730 1740 1750AGGCAGAAAGTTATTTTAGTTACTCAGAAGTACAACTGGAAGATAAlaGluSerTyrPheSerTyrSerGluValGlnLeuGluAspThr5355405451760 1770 1780 1790 1800CCTTAGATGTAGGAGGTGGAAAGAATGTTAAATGTGATAAAGAAGLeuAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspLysGluGly5505555601810 1820 1830 1840GGGCCTGGATGGCTTACAAGGATATTGATTTCCCCAGTTCAGGAAAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlySer5655705751850 1860 1870 1880 1890GTTATCGAGTAGAATACAGAGTGGCAAGTGAACGTGCAGGAGGAATyrArgValGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLys5805855901900 1910 1920 1930AGCTGTCCCTAGATTTGAATGCAGGCTCTATAGTGCTTGGCATGCLeuSerLeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeu5956006051940 1950 1960 1970 1980TGGATATTCCTTCAACAGGAGGATTGCAGAAGTGGACCACCATTTAspIleProSerThrGlyGlyLeuGlnLysTrpThrThrIleSer
610 615 6201990 2000 2010 2020CTCATATAGTGAATGTGGATTTAGGTACATATAACTTGGGAATTTHisIleValAsnValAspLeuGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyr6256306352030 2040 2050 2060 2070ATGTTCAAAAAGCCAGTTGGAATATCAATTGGATTAGAATTACAAValGlnLysAlaSerTrpAsnIleAsnTrpIleArgIleThrLys6406456502080 2090 2100 2110AAGTGTAGGATACAAGAGCAAACCAATTGTATTATTTTGAAGAAAVal6542120 2130 2140 2150 2160CAACAGCTGTTGACCATAATCTTTGTTCATTGAGAATTTATCCAA2170 2180 2190 2200CTGTTATAGAATCTATCACCTTTCCAGATGTACGCATTGCTGATG2210 2220 2230 2240 2250GTTTTGAACTAATAAATGAGGAGATTATAAGTGCTAATGTGTTTG2260 2270 2280 2290TTATATCTTTAATTTTTAAAAACAAATTATCAACTAACTTTTCAA2300 2310 2320 2330 2340TTCAGGCATGGTGTTTCTCTTTTTAATCTGTATTTCTAATAAATT2350 2360 2370 2380AATGTCTTTAAGAGTTGTTTTGTTTACAATAAATAAAGTTTGATT2390 2400GTGTGGGATAAAAAAAAAAAAAA順序編號2順序長度1979順序類型雙鏈拓撲結(jié)構(gòu)直鏈起源鱟血球順序10203040GAAGACAAGAGAGTTGAAACAACCATAGCCTGTTTGCTTATGACT5060708090TTCAATAAGAGATACTCGGCTTAAAGGGAACTGACTTATTCGTAG100 110 120 130AGGCTATACCATGGATATCAGTTTCCTGGTTTTTATCACACTGTCMetAspIleSerPheLeuValPheIleThrLeuSer-30-25-20140 150 160 170 180TATGGCTCTCTTCTCGAGCAACGTGACAGGAACGTCAGTAACATCMetAlaLeuPheSerSerAsnValThrGlyThrSerValThrSer-15-10 -5190 200 210 220AAGGGTACGACGTGGAATAAATGAAAAACATTGTGGGTTCCGACCArgValArgArgGlyIleAsnGluLysHisCysGlyPheArgPro-1 1 5 10230 240 250 260 270AGTAATTACAAGAATTATTGGTGGAGGAATAGCGACGCCTCATTCValIleThrArgIleIleGlyGlyGlyIleAlaThrProHisSer15 20 25280 290 300 310ATGGCCGTGGATGGTTGGAATTTTCAAAGTAAATCCTCACCGTTTTrpProTrpMetValGlyIlePheLysValAsnProHisArgPhe30 35 40320 330 340 350 360CCTTTGTGGTGGATCTATTATTAATAAAGTCTCTGTTGTTACTGCLeuCysGlyGlySerIleIleAsnLysValSerValValThrAla45 50 55370 380 390 400CGCCCATTGTCTTGTGACGCAGTTTGGAAACAGACAGAATTATTCAlaHisCysLeuValThrGlnPheGlyAsnArgGlnAsnTyrSer60 65 70410 420 430 440 450TATCTTCGTAAGAGTTGGAGCCCATGACATAGACAATTCGGGTACIlePheValArgValGlyAlaHisAspIleAspAsnSerGlyThr75 80 85460 470 480 490AAATTATCAAGTGGATAAAGTTATTGTTCACCAGGGCTACAAACAAsnTyrGlnValAspLysValIleValHisGlnGlyTyrLysHis90 95100500 510 520 530 540CCATTCACACTACTACGATATCGGTTTGATTTTACTCTCGAAACCHisSerHisTyrTyrAspIleGlyLeuIleLeuLeuSerLysPro105110115550 560 570 580AGTCGAATACAACGACAAAATACAGCCTGTCTGTATTCCTGAGTTValGluTyrAsnAspLysIleGlnProValCysIleProGluPhe120125130590 600 610 620 630CAACAAACCTCACGTGAACTTGAACAATATTAAGGTCGTCATTACAsnLysProHisValAsnLeuAsnAsnIleLysValValIleThr135140145640 650 660 670TGGTTGGGGTGTTACTGGGAAAGCTACTGAGAAACGTAACGTTCTGlyTrpGlyValThrGlyLysAlaThrGluLysArgAsnValLeu
150 155 160680 690 700 710 720TCGTGAATTGGAGTTGCCCGTGGTTACAAACGAACAGTGCAACAAArgGluLeuGluLeuProValValThrAsnGluGlnCysAsnLys165170175730 740 750 760ATCTTATCAGACACTCCCATTCTCAAAATTGAACCGAGGAATCACSerTyrGlnThrLeuProPheSerLysLeuAsnArgGlyIleThr180185190770 780 790 800 810TAACGACATGATTTGTGCGGGGTTTCCGGAAGGAGGGAAAGATGCAsnAspMetIleCysAlaGlyPheProGluGlyGlyLysAspAla195200205820 830 840 850TTGTCAGGGCGACTCTGGTGGTCCCCTGATGTATCAGAATCCAACCysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuMetTyrGlnAsnProThr210215220860 870 880 890 900AACAGGAAGAGTGAAAATAGTTGGAGTTGTATCATTTGGGTTCGAThrGlyArgValLysIleValGlyValValSerPheGlyPheGlu225230235910920 930 940AATGTGCTCGTCCCAACTTCCCCGGTGTTTACACGCGCCTCTCGAGCysAlaArgProAsnPheProGlyValTyrThrArgLeuSerSer240245250950 960 970 980 990CTACGTTAACTGGCTCCAGGAAATCACCTTCGGACAGTCACTCGCTyrValAsnTrpLeuGlnGluIleThrPheGlyGlnSerLeuAla2552602651000 1010 1020 1030TTCTTTATTTGAAGTTGTACCAATATTTATACCCGAGTGAGACTGSerLeuPheGluValValProIlePheIleProGlu2702751040 1050 1060 1070 1080AAGATAAATATTGAAGAGAAATCTAGAATAATGTACAATATAAGA1090 1100 1110 1120AGCCTGAAATTACTGAAATAGAAAGGCGCGTGATGAGAAATACGT1130 1140 1150 1160 1170TTCAAATTTTATTTTTTATTAACTTTATTGTGTTTAACTATTCTT1180 1190 1200 1210TACGTGGGACATGAAATATAAATCTTTATTTCTTCTTTATATACT1220 1230 1240 1250 1260TTAGATTTTCATTTCATCTATCTTTATCAGTTTTGTAATGTTACT
1270 1280 1290 1300AATAATATTTCTTATGGCACGGATCGAGCCTCGTGAATCACAGTA1310 1320 1330 1340 1350AATAATAATAATTATAAAATCACACATTATTAAAAGCAATAGCAT1360 1370 1380 1390TCAGAGTGAGTAACATATAAACTTCACTATGAGTGGACTTTTTTA1400 1410 1420 1430 1440TTCACATTTTAAGTTCATTACTAACTGTTGGGAGGTCTTTATATT1450 1460 1470 1480GTTGTATATTTATATATTAATTAGGTTGGTTTAGTACATTGTTGT1490 1500 1510 1520 1530TAATGGTGGAATAGGGCGTAGGTTTTAAATGTGTTTGCAAAAAAA1540 1550 1560 1570CAAACAAAACAAGTAATGGTGGATGATGGTTCCAAAGTAACCGAA1580 1590 1600 1610 1620AGAACACTTTGAACATTTTTATACAAAAATTTATGTTTTAAAATA1630 1640 1650 1660CGAGTATATACAATCGATCTCTAAGTACAAGAAAAACTGAAGTGT1670 1680 1690 1700 1710TCATTCAGGTTTAACAGTGCAACTTAAATCAACAGTTAGTTGTTC1720 1730 1740 1750ACTAAACATTACAATTTGATCCTTTATAAACGCTAATACTGTTTA1760 1770 1780 1790 1800AACAGTCAGTAATAATACAGTATCATAGCATATCATATATGAAGG1810 1820 1830 1840TATTTTAACATTCTATATACAAAGCCAGAATTGAAAACGGTAATA1850 1860 1870 1880 1890TTTTGTACGATTAGTGAATTATTGTTTTTAAGAACAAACTGGTAT1900 1910 1920 1930CAAATTTAAAATATGAATCTGTGATTTAATATTTTTTACAACGTT1940 1950 1960 1970CTAACTTACCACTTTTGTTGTGAATAAAGGTGTTTACAAATGGA
權(quán)利要求
1.編碼含有至少一個如下氨基酸順序所示的基本結(jié)構(gòu)的多肽的單鏈DNA或由該DNA與互補DNA構(gòu)成的雙鏈DNA。Gln-Gln-Trp-Ser
2.如權(quán)利要求1所述的氨基酸順序所表示的多肽。
3.編碼如下氨基酸順序所示的含有三個Gln-Gln-Trp-Ser基本構(gòu)造的多肽(順序表1的氨基酸編號247～387)或編碼與其基本相同的氨基酸順序的多肽的單鏈DNA或由該DNA與互補DNA構(gòu)成的雙鏈DNA。LeuAspGlyTyrTyrPheValGlnAsnArgHisSerGluLeuTyrLeuAspValThrAspAlaSerAsnGluAspGlyAlaPheLeuGlnGlnTrpSerTyrSerGlyAsnGluAsnGlnGlnPheAspPheGluHisLeuGluAsnAsnValTyrLysIleThrAsnLysLysSerGlyLysSerLeuAspValTyrAsnPheGlyThrGluAsnGlyValArgIleGlnGlnTrpSerTyrGlyGlyAlaArgAsnGlnGlnPheThrValGlnSerValGlyAspGlyTyrTyrLysIleIleProArgGlySerGlyLysIleValGluValAlaAspPheSerLysAspAlaGlyGlyLysIleGlnGlnTrpSerAspAsnAsnGlnLeuSerGlyGlnTrpLysLeuIleLysSer
4.如權(quán)利要求3所述的氨基順序所表示的多肽。
5.編碼如下氨基酸順序所示的葡聚糖酶區(qū)域多肽(順序表1的氨基酸編號4～236)或編碼與其基本相同的氨基酸順序的多肽的單鏈DNA或由該DNA與互補DNA構(gòu)成的雙鏈DNA。ProLysTrpGlnLeuValTrpSerAspGluPheThrAsnGlyIleSerSerAspTrpGluPheGluMetGlyAsnGlyLeuAsnGlyTrpGlyAsnAsnGluLeuGlnTyrTyrArgArgGluAsnAlaGlnValGluGlyGlyLysLeuValIleThrAlaLysArgGluAspTyrAspGlyPheLysTyrThrSerAlaArgLeuLysThrGlnPheAspLysSerTrpLysTyrGlyLysIleGluAlaLysMetAlaIleProSerPheArgGlyValTrpValMetPheTrpMetSerGlyAspAsnThrAsnTyrValArgTrpProSerSerGlyGluIleAspPheIleGluHisArgAsnThrAsnAsnGluLysValArgGlyThrIleHisTrpSerThrProAspGlyAlaHisAlaHisHisAsnArgGluSerAsnThrAsnGlyIleAspTyrHisIleTyrSerValGluTrpAsnSerSerIleValLysTrpPheValAsnGlyAsnGlnTyrPheGluValLysIleGlnGlyGlyValAsnGlyLysSerAlaPheArgAsnLysValPheValIleLeuAsnMetAlaIleGlyGlyAsnTrpProGlyPheAspValAlaAspGluAlaPheProAlaLysMetTyrIleAspTyrValArgValTyrGlnAspAla
6.如權(quán)利要求5所述的氨基酸順序所表示的多肽。
7.編碼如下氨基酸順序所示的木聚糖酶區(qū)域的多肽(順序表1的氨基酸編號391～654)或編碼與其基本相同的氨基酸順序的多肽的單鏈DNA或由該DNA與互補DNA構(gòu)成的雙鏈DNA。SerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheAspSerSerLysValGlnLeuGluAspThrSerAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspAsnGluGlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlyAsnTyrArgIleGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspValProSerThrGlyGlyTrpGlnLysTrpThrThrIleSerHisThrValAsnValAspSerGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnArgAlaSerTrpAsnIleAsnTrpIleLysIleThrLysIleProGluGlnSerAsnLeuAsnGlnGlyArgArgAsnSerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheSerTyrSerGluValGlnLeuGluAspThrLeuAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspLysGluGlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlySerTyrArgValGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspIleProSerThrGlyGlyLeuGlnLysTrpThrThrIleSerHisIleValAsnValAspLeuGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnLysAlaSerTrpAsnIleAsnTrpIleArgIleThrLysVal
8.如權(quán)利要求7所述的氨基酸順序所表示的多肽。
9.編碼如下氨基酸順序所示(1→3)-β-D-葡聚糖敏感性因子a亞基的多肽的單鏈DNA或由該DNA與互補DNA構(gòu)成的雙鏈DNA。SerHisGluProLysTrpGlnLeuValTrpSerAspGluPheThrAsnGlyIleSerSerAspTrpGluPheGluMetGlyAsnGlyLeuAsnGlyTrpGlyAsnAsnGluLeuGlnTyrTyrArgArgGlnAsnAlaGlnValGluGlyGlyLysLeuValIleThrAlaLysArgGluAspTyrAspGlyPheLysTyrThrSerAlaArgLeuLysThrGlnPheAspLysSerTrpLysTyrGlyLysIleGluAlaLysMetAlaIleProSerPheArgGlyValTrpValMetPheTrpMetSerGlyAspAsnThrAsnTyrValArgTrpProSerSerGlyGluIleAspPheIleGluHisArgAsnThrAsnAsnGluLysValArgGlyThrIleHisTrpSerThrProAspGlyAlaHisAlaHisHisAsnArgGluSerAsnThrAsnGlyIleAspTyrHisIleTyrSerValGluTrpAsnSerSerIleValLysTrpPheValAsnGlyAsnGlnTyrPheGluValLysIleGlnGlyGlyValAsnGlyLysSerAlaPheArgAsnLysValPheValIleLeuAsnMetAlaIleGlyGlyAsnTrpProGlyPheAspValAlaAspGluAlaPheProAlaLysMetTyrIleAspTyrValArgValTyrGlnAspAlaSerThrSerSerProValGlyAspThrSerLeuAspGlyTyrTyrPheValGlnAsnArgHisSerGluLeuTyrLeuAspValThrAspAlaSerAsnGluAspGlyAlaPheLeuGlnGlnTrpSerTyrSerGlyAsnGluAsnGinGlnPheAspPheGluHisLeuGluAsnAsnValTyrLysIleThrAsnLysLysSerGlyLysSerLeuAspValTyrAsnPheGlyThrGluAsnGlyValArgIleGlnGlnTrpSerTyrGlyGlyAlaArgAsnGlnGlnPheThrValGlnSerValGlyAspGlyTyrTyrLysIleIleProArgGlySerGlyLysIleValGluValAlaAspPheSerLysAspAlaGlyGlyLysIleGlnGlnTrpSerAspAsnAsnGlnLeuSerGlyGlnTrpLysLeuIleLysSerLysSerTyrSerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheAspSerSerLysValGlnLeuGluAspThrSerAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspAsnGluGlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlyAsnTyrArgIleGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspValProSerThrGlyGlyTrpGlnLysTrpThrThrIleSerHisThrValAsnValAspSerGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnArgAlaSerTrpAsnIleAsnTrpIleLysIleThrLysIleProGluGlnSerAsnLeuAsnGlnGlyArgArgAsnSerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheSerTyrSerGluValGlnLeuGluAspThrLeuAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspLysGluGlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlySerTyrArgValGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspIleProSerThrGlyGlyLeuGlnLysTrpThrThrIleSerHisIleValAsnValAspLeuGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnLysAlaSerTrpAsnIleAsnTrpIleArgIleThrLysVal
10.如權(quán)利要求9所述的氨基酸順序所表示的多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的多肽和順序編號2的順序表所示的G因子b亞基的氨基酸順序(氨基酸編號1～278)所示的多肽構(gòu)成的多肽。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于順序編號1所示的DNA和該DNA所編碼的氨基酸順序。來自鱟變形細胞的(1→3)-β-D-葡聚糖酶感性因子a亞基的DNA和氨基酸順序?qū)φ婢毎诘?1→3)-β-D-葡聚糖具有強親和性。對于真菌的臨床診斷，作為與抗真菌劑結(jié)合而成的抗菌劑或除真菌劑都是有用的。
文檔編號C12N15/12GK1111909SQ94190466
公開日1995年11月15日 申請日期1994年6月29日 優(yōu)先權(quán)日1993年6月29日
發(fā)明者巖永貞昭, 弁田達史, 關(guān)典昭, 小田俊男 申請人:生化學(xué)工業(yè)株式會社 被以下專利引用 (1),