專利名稱：快速大腸桿菌類檢測系統(tǒng)的制作方法
本申請是申請日為1991年2月8日的美國申請?zhí)枮?7/653,869的部分繼續(xù)申請，而07/653,869號申請是現(xiàn)在已放棄的美國申請?zhí)枮?7/117,481(申請日為1987年11月5日)的繼續(xù)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及檢測人類消費或使用產(chǎn)品中的微生物之快速方法，更具體地說(但不是以限定的方式)，涉及檢測水源中是否存在糞便大腸桿菌類細菌。
由于報道了許多水源性疾病的病例，U.S.EPA于1991年頒布了新法規(guī)，要求更嚴(yán)格地監(jiān)測飲水的衛(wèi)生質(zhì)量。在世界范圍內(nèi)同樣存在這一問題。在發(fā)展中國家中，估計80％的發(fā)病率和33％的死亡率由惡劣的水衛(wèi)生質(zhì)量引起。在檢測水衛(wèi)生質(zhì)量的快速方法市場上，本發(fā)明的結(jié)果具有實質(zhì)性的發(fā)展。
盡管迫切和隨時需要對水質(zhì)量進行快速監(jiān)測和控制，但是自從70年前引用“細菌大腸桿菌”作為指示劑后，僅取得了很少的改進。當(dāng)前使用的對“大腸桿菌組”的檢測方法一般仍需24-48小時的培養(yǎng)。
很明顯，依賴于使用或供給一種安全的水質(zhì)量的產(chǎn)業(yè)(例如，水、食品、飲料、藥品和能源)需要對衛(wèi)生變化作出快速反應(yīng)，以便能立即采取行動。
另外的市場方面是軍隊，在戰(zhàn)爭和自然災(zāi)害條件下，需要不斷監(jiān)測和鑒定安全飲水質(zhì)量并防止細菌戰(zhàn)爭。這對于軍事野外作戰(zhàn)，或負(fù)責(zé)公眾衛(wèi)生的軍事人員處理公民緊急事件情況下尤其關(guān)鍵。
市場調(diào)查表明，在飲水產(chǎn)業(yè)中存在下列市場容量斯堪的納維亞每年650到850000次試驗；EEC每年6000到8000000次試驗；世界范圍每年高達20000000次試驗。
使用改進的技術(shù)和由于水產(chǎn)業(yè)中內(nèi)部質(zhì)量控制中心的增多可能增大市場的容量。
使用膜過濾(MF)或最大可能數(shù)(MPN)技術(shù)的評估水衛(wèi)生質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)方法需要24到72小時完成。人們認(rèn)識到這浪費的時間太長而不能對低于法定標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量提供警戒和防止衰弱或威脅生命的疾病的發(fā)生。根據(jù)參考的標(biāo)準(zhǔn)方法(美國公共衛(wèi)生協(xié)會，1989，檢查水和廢水的標(biāo)準(zhǔn)方法，第17版，美國公共衛(wèi)生協(xié)會，華盛頓，D.C)，依據(jù)不同的檢測原理，有許多種快速方法。然而，這些方法一般要么缺乏靈敏性，要么需要相當(dāng)長的時間而限制了真正快速檢測的可能性。因此，需要一種快速檢測樣品中糞便大腸桿菌類之存在的系統(tǒng)。本文所用的術(shù)語“存在”定義為每100毫升樣品中出現(xiàn)1個或更多糞便大腸桿菌類細胞。
本發(fā)明概述本發(fā)明的內(nèi)容之一包括一種當(dāng)每100毫升原始液體或液化樣品中至少含一個糞便大腸桿菌類細胞時用于檢測所述細胞存在-不存在的方法。原始樣品或液體樣品分成幾部分(例如3部分)，過濾每個部分以便將存在于樣品中的微生物滯留在濾器上。
按這種方法，原始樣品的第一部分通過第一濾器過濾，原始樣品的第二部分通過第二濾器過濾，原始樣品的第三部分通過第三濾器過濾，等等。
提供了含有用于產(chǎn)生熒光產(chǎn)物的熒光源底物的啟動培養(yǎng)基。還提供第一、第二、和第三樣品的樣品容器以及與樣品同時進行的對照之對照容器。每個容器都含有預(yù)定數(shù)量的啟動培養(yǎng)基。過濾后，第一個濾器放入裝入第一個樣品容器的啟動培養(yǎng)基中，第二個濾器放入裝入第二個樣品容器的啟動培養(yǎng)基中，第三個濾器放入裝入第三個樣品容器的啟動培養(yǎng)基中。
提供了具有熱傳遞介質(zhì)的培養(yǎng)箱，所述的介質(zhì)與設(shè)置在培養(yǎng)箱中的每個容器保持密切物理接觸。第一樣品容器和第一對照容器培養(yǎng)一段短的第一時間長度。幾乎同時開始，第二樣品容器和第二對照容器培養(yǎng)一段第二時間長度，第三樣品容器和第三對照容器培養(yǎng)一段第三時間長度。
經(jīng)過短的第一時間長度后，第一樣品容器的內(nèi)容物和第一對照容器的內(nèi)容物的pH調(diào)成堿性pH。同樣地，第二時間長度后，第二樣品容器的內(nèi)容物和第二對照容器的內(nèi)容物調(diào)成堿性pH，第三時間長度后第三樣品容器的內(nèi)容物和第三對照容器的內(nèi)容物調(diào)成堿性pH。
樣品容器和對照容器的pH調(diào)過后，用預(yù)定激發(fā)波長的光照射樣品和對照容器。經(jīng)過分別照射后，第一樣品熒光值從第一樣品容器中測量，第一對照熒光值從第一對照容器中測量。同樣地，第二樣品熒光值從第二樣品容器中測量，第二對照熒光值從第二對照容器中測量，第三樣品熒光值從第三樣品容器中測量，第三對照熒光值從第三對照容器中測量。
第一對照熒光值和第一樣品熒光值用于產(chǎn)生一個校正因子。然后，第二對照熒光值用于調(diào)整第二樣品熒光值以得到一個調(diào)整的第二樣品熒光值，第三對照熒光值用于調(diào)整第三樣品熒光值以得到一調(diào)整過的第三樣品熒光值。然后，校正因子用于校正調(diào)整過的第二樣品熒光值以得到校正過的第二樣品熒光值，校正因子用于校正調(diào)整過的第三樣品熒光值以得到校正過的第三樣品熒光值。
當(dāng)校正過的第二樣品熒光值為正的，校正過的第三樣品熒光值是正的并超過校正過的第二樣品熒光值時，得出的結(jié)論是每100毫升原始樣品至少含一個糞便大腸桿菌類細胞。


圖1是顯示如何使用本發(fā)明的方法將樣品分成等分試樣，過濾和在44.5℃下培養(yǎng)進行檢測的圖解。
圖2是對本發(fā)明7小時直接計數(shù)法與24小時mFC標(biāo)準(zhǔn)方法的比較。符號代表不同的水來源。(+)Nidelva(Trondheim，Norway)，(c)稀釋的未加工過的污水(Trondheim Norway)，(■)Akerselva(Oslo，Norway)，(O)供水設(shè)備，(Kathmandu，Nepal)。
圖3顯示了4-甲基-傘形酮濃度與熒光單位間的相關(guān)性。
圖4顯示了由未處理過的污水污染的飲用水中的大腸桿菌類從4-MU-β-D-半乳糖苷生成MU(O)；乳糖加入后增強了β-D-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)作用(O)；加入十二烷基硫酸鈉(一種去污劑)后，進一步增強活性( )；酶試驗溫度為41.5℃。
圖5是顯示培養(yǎng)時間對含3個糞便大腸桿菌類細胞濃度的樣品熒光強度的例圖。
圖6是顯示培養(yǎng)時間對含3個糞便大腸桿菌類細胞濃度的樣品熒光強度的另一例圖。
優(yōu)選實施方案描述本發(fā)明依賴于一種或兩種產(chǎn)生熒光產(chǎn)物(4-甲基傘形酮)的熒光源底物(4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷和4-甲基傘形酮-β-D-葡糖苷酸)的酶促水解?？捎脴?biāo)準(zhǔn)熒光計定量測定水解速率或總熒光。
本發(fā)明的方法能適應(yīng)于使用三列或連續(xù)的試驗來檢測大腸桿菌類污染。以這一方式，一種快速甄別階段能在20-30分鐘內(nèi)鑒定出嚴(yán)重污染的水樣品。在第二階段，能在1到6小時內(nèi)鑒定出以每100ml中至少一個大腸桿菌類細胞水平存在的輕度污染水樣品。第三，在大約7小時內(nèi)得到直接菌落計數(shù)以證實早期結(jié)果。圖1是使用第二和第三階段的方法的圖解。
在實際應(yīng)用中，小如2個的樣品，但一般是4到10個的重復(fù)實驗樣品被過濾并在大約44.5℃±.2℃下培養(yǎng)。經(jīng)過各種預(yù)定的培養(yǎng)時間后，依次取出樣品以進行快速甄別或得出存在-不存在的結(jié)論。在優(yōu)選的實施方案中培養(yǎng)期間同時進行。早期檢測不出糞便細胞的存在可能影響在瓊脂培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)以進行微生物菌落直接計數(shù)之樣品的選擇性第三分析(直到大約經(jīng)歷了7小時的培養(yǎng)后進行)。消耗的總時間，甚至包括直接計數(shù)和樣品過濾和資料的獲得的時間一般不會超過7小時。
圖2顯示了使用本發(fā)明方法的6小時直接計數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)方法的24hm-FC方法之間的相關(guān)性。大多數(shù)資料來自對挪威表層水的試驗。該方法的例外是尼泊爾資料，由于高濁度和/或氯化，對樣品進行了7小時培養(yǎng)。7小時是優(yōu)選實施方案直接計數(shù)步驟的培養(yǎng)時間。
本發(fā)明的內(nèi)容之一是一種當(dāng)原始液體或液化樣品中第100毫升至少含1個糞便大腸桿菌類細胞時用于快速檢測所述細胞存在-不存在的方法。原始樣品或液化樣品分成幾部分(例如3部分)，每部分被過濾以便將存在于樣品中的微生物滯留于濾器上。按這種方法，第一部分的原始樣品通過第一濾器過濾，第二部分的原始樣品通過第二濾器過濾，第三部分的原始樣品通過第三濾器過濾，等等。
提供了含有用于產(chǎn)生熒光產(chǎn)物的熒光源底物的啟動培養(yǎng)基。也提供樣品容器和對照容器，樣品容器用于盛放第一、第二和第三樣品，對照容器用于與樣品同時進行對照。每個容器內(nèi)含有預(yù)定數(shù)量的啟動培養(yǎng)基。經(jīng)過過濾步驟后，第一濾器放入裝在第一樣品容器內(nèi)的啟動培養(yǎng)基中，第二濾器放入裝在第二樣品容器內(nèi)的啟動培養(yǎng)基中，第三濾器放入裝在第三樣品容器內(nèi)的啟動培養(yǎng)基中。
提供了具有熱傳遞介質(zhì)的培養(yǎng)箱，所述熱傳遞介質(zhì)與置入培養(yǎng)箱中的每個容器保持密切的物理接觸。第一樣品容器和第一對照容器培養(yǎng)一段短的第一時間長度。幾乎同時開始，第二樣品容器和第二對照容器培養(yǎng)一段第二時間長度，第三樣品容器和第三對照容器培養(yǎng)一段第三時間長度。
經(jīng)過短的第一時間長度后，第一樣品容器的內(nèi)容物和第一對照容器的內(nèi)容物的pH調(diào)成堿性pH。同樣地，第二時間長度后，第二樣品容器的內(nèi)容物和第二對照容器的內(nèi)容物調(diào)成堿性pH，第三樣品容器的內(nèi)容物和第三對照容器的內(nèi)容物在經(jīng)歷第三時間長度后被調(diào)成堿性pH。
當(dāng)樣品容器和對照容器的pH值調(diào)過后，用預(yù)定的激發(fā)波長的光照射樣品容器和對照容器。經(jīng)過各照射步驟后，從第一樣品容器測量出第一樣品熒光值，從第一對照對照容器中測量出第一對照熒光值。同樣地，從第二樣品容器測量出第二樣品熒光值，從第二對照容器中測量出第二對照熒光值，從第三樣品容器中測量出第三樣品熒光值，從第三對照容器中測出第三對照熒光值。
第一對照熒光值和第一樣品熒光值用于獲得一個校正因子，然后，第二對照熒光值用于調(diào)整第二樣品熒光值以獲得一個調(diào)整后的第二樣品熒光值，第三對照熒光值用于調(diào)整第三樣品熒光值以獲得一個調(diào)整后的第三樣品熒光值。然后，校正因子用于校正調(diào)整后的第二樣品熒光值以獲得一個校正后的第二樣品熒光值，校正因子用于校正調(diào)整后的第三樣品熒光值以獲得一個校正后的第三樣品熒光值。
據(jù)此可得出結(jié)論；當(dāng)校正的第二樣品熒光值為正的并且校正的第三樣品熒光值是正的且超出校正后的第二樣品熒光值時，每100毫升原始樣品包含至少一個糞便大腸桿菌類細胞。
另外，該方法可能還包含用過濾的原始樣品第四部分接種瓊脂糖培養(yǎng)基，該瓊脂糖培養(yǎng)基含有啟動培養(yǎng)基，然后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)接種過的培養(yǎng)基大約7小時，接著用預(yù)定的激發(fā)波長照射培養(yǎng)基，獲得在培養(yǎng)基上可見的微生物菌落的直接計數(shù)數(shù)目。這一步驟可能還包含在計數(shù)微生物菌落前給微生物菌落供給一種堿性溶液以增強熒光。
所述的短的時間長度通常大約不超過5分鐘，可能是大約2到5分鐘。第二時間長度可能從大約1小時到大約5小時。第三時間長度可能從大約2小時到大約6小時，前提條件為第3時期大約比第2時期長1小時或更長。
第一時間長度可能在從大約2分鐘到大約5分鐘的范圍內(nèi)，第二時間長度大約1小時，第三時間長度大約2小時。另外，第一時間長度可能不超過大約5分鐘，第二時間長度大約1小時，第三時間長度在從大約2小時到大約6小時的范圍內(nèi)。
第一時間長度可能不超過大約5分鐘，第二時間長度大約2小時，第三時間長度大約4小時。第一時間長度可能不超過大約5分鐘，第二時間長度大約4小時，第三時間長度大約6小時。第二時間長度和第三時間長度可能至少相差大約1小時。
在獲得校正因子的步驟中，可以經(jīng)從第一樣品熒光值中減去第一對照熒光值獲得校正因子。調(diào)整后的樣品熒光值可經(jīng)從樣品熒光值中減去對照熒光值獲得。校正樣品熒光值可經(jīng)從調(diào)整后的樣品熒光值中減去校正因子。
在本發(fā)明中，啟動培養(yǎng)基可能還包含維持活的糞便大腸桿菌細胞之代謝的營養(yǎng)成分，誘導(dǎo)與熒光源底物反應(yīng)以產(chǎn)生熒光產(chǎn)物的反應(yīng)中有效的酶的產(chǎn)生的誘導(dǎo)劑，以及對增強熒光有效的表面活性劑。所述誘導(dǎo)劑可以是乳糖，對增強熒光有效的表面活性劑可以是十二烷基硫酸鈉，所述酶可以是β-D-半乳糖苷酶，熒光源底物可以是4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷，熒光部分可以是4-甲基傘形酮。啟動培養(yǎng)基可以含有4-甲基-傘形酮-β-D-葡糖苷酸作為第二種熒光源底物，使用β-D-葡糖苷酸酶作為降解第二底物的酶。在照射步驟中，優(yōu)選使用大約為365nm的激發(fā)波長，它能引起從熒光產(chǎn)物中發(fā)射大約465nm的波長。培養(yǎng)箱中的熱傳遞介質(zhì)可以是液體(如水或油)，或是固體(如金屬)。當(dāng)調(diào)節(jié)容器內(nèi)的pH值時，可以將pH調(diào)到高于11或更優(yōu)選的是調(diào)到pH大約為13。
本發(fā)明的另一種方法可能還包含原始樣品的第四部分，按照上述第一、第二和第三部分進行過濾和處理。在這一方面，當(dāng)?shù)玫较旅娼Y(jié)果時，可推測出每100毫升原始樣品含至少一個糞便大腸桿菌類細胞(1)校正后的第二樣品熒光值為正的且校正后的第三樣品熒光值超出校正后的第二樣品熒光值，或(2)校正的第三樣品熒光值是正的且校正的第四樣品熒光值超出校正的第三樣品熒光值。
當(dāng)按上面所述分析第四部分時，短的時間長度可能不超過大約5分鐘，可以是大約2到5分鐘。第二時間長度可以是大約1小時到大約4小時。第三時間長度可以從大約2小時到大約5小時條件是第三時間長度大約比第二時間長度長1小時或更長。第四時間長度可以從大約3小時到大約5小時，條件是第四時間長度比第三時間長度大約長1小時或更長。
在一種優(yōu)選形式中，第一時間長度的范圍可以從大約2分鐘到大約5分鐘的范圍內(nèi)，第二時間長度大約2小時，第三時間大約4小時，第4時間大約6小時。
第一時間長度可以不超過大約5分鐘，第二時間長度大約1到2小時，第三時間長度從大約3小時到大約5小時的范圍內(nèi)，第四時間長度從大約4小時到大約6小時的范圍內(nèi)，第三時間長度至少比第二時間長度長1小時，第四時間長度至少比第三時間長度長大約1小時。第二時間長度和第三時間長度可能至少相差1小時，第三時間長度和第四時間長度至少相差1小時，第二時間長度和第四時間長度至少相差大約2小時。
按上所述，調(diào)整過的樣品熒光值可以通過從樣品熒光值中減去相應(yīng)的對照熒光值來獲得。校正過的樣品熒光值還可以經(jīng)從調(diào)整過的樣品熒光值中減去校正因子得到。
提供啟動培養(yǎng)基的上述兩種方法中，啟動培養(yǎng)基可進一步限定為含水，4-甲基-傘形酮-β-D-半乳糖苷，大約.46％到.54％重量的胨，約.26％到.34％重量的酵母提取物，大約.4％到.6％重量的酶誘導(dǎo)物，約.73％到.77％重量的鹽，大約.48％到.52％重量的丙酮酸，大約.01％到.03％重量的表面活性劑，大約.009％到.011％重量的膽汁鹽。
酶誘導(dǎo)物可以是乳糖，表面活性劑十二烷基硫酸鈉，和NaCl。啟動培養(yǎng)基還可以包括大約.004％到.006％重量的4-甲基傘形酮β-D-葡糖苷酸。
按上面詳細描述的本發(fā)明的另一種方法，第二樣品容器和第二對照容器培養(yǎng)時間長度為大約20到30分鐘。當(dāng)校正的第二樣品熒光值為正的時，得出的結(jié)論是每100毫升原始樣品中至少含1個糞便大腸桿菌類細胞(即證實“存在”)。在本方法中還可得出的結(jié)論是每100毫升原始樣品中含至少25個糞便大腸桿菌類細胞。在本方法中，短的第一時期可以不超過5分鐘，它可以從大約2到大約5分鐘。
按上面詳細描述的本發(fā)明的另一種方法，第二樣品容器和第二對照容器可培養(yǎng)一段大約為1小時的第二時間長度。當(dāng)校正的第二樣品熒光值相應(yīng)于第二樣品中4-甲基傘形酮的體積摩爾濃度至少約0.01μM時，可得出的結(jié)論是每100毫升原始樣品含至少一個糞便大腸桿菌類細胞。
在本發(fā)明的各種方法中，用于鑒定每100毫升原始液體或液化樣品中是否含有至少一個糞便大腸桿菌類細胞的物質(zhì)組合物可以包含一種含水混合物，4-甲基-傘形酮-β-D-半乳糖苷和一種干燥培養(yǎng)基。含水混合物還可以包括大約.46％到.54％重量的胨，大約.26％到.34％重量的酵母提取物，大約.4％到.6％重量的酶誘導(dǎo)物，大約.73％到.77％重量的鹽，大約.48％到.52％重量的丙酮酸，大約.01％到.03％重量的去污劑，大約.009％到.011％重量的膽汁鹽。
胨可以是胨蛋白的胨No.3，酶誘導(dǎo)物可以是乳糖，鹽可以是NaCl，去污劑可以是十二烷基硫酸鈉，加入混合物的培養(yǎng)基還可以包含4-甲基傘形酮β-D-葡糖苷酸作為第二種熒光源底物?；旌衔镞€可以包含大約.004％到.006％重量的4-甲基傘形酮-β-D-葡糖苷酸。
與水和與一定量的4-甲基傘形酮β-D-半乳糖苷混合的所述組合物可以含有以干燥的形式的約17％到21％重量的胨，大約10％到14％重量的酵母提取物，大約15％到24％重量的酶誘導(dǎo)物，大約28％到30％重量的鹽，大約18％到21％重量的丙酮酸，大約0.3％到.12％重量的去污劑，大約0.3％到0.5％重量的膽汁鹽。胨可以是胨蛋白的胨No.3，酶誘導(dǎo)的可以是乳糖，鹽可以是NaCl，去污劑可以是十二烷基硫酸鈉。培養(yǎng)基還可以包含4-甲基傘形酮β-D-葡糖苷酸作為第二熒光源底物，4-甲基傘形酮-β-D-葡糖苷酸可以含有大約.1％到.3％重量的培養(yǎng)基。
實施例圖1代表了本發(fā)明的一種圖解形式，其中1000ml原始液體樣品被分成10個近似相等的部分。各個100ml部分通過一種微孔濾膜(如.45μm的微孔濾膜)。兩個濾膜可放入含有本文所公開的啟動培養(yǎng)基的營養(yǎng)瓊脂糖培養(yǎng)基。其它8個濾膜放入含有大約5-10ml液體啟動培養(yǎng)基的容器中。8個樣品容器(和培養(yǎng)板，如果使用的話)放入一個大約為44.5℃±.2℃的培養(yǎng)箱(如水浴)中。含有啟動培養(yǎng)基和反應(yīng)試劑的對照同時進行培養(yǎng)。同時，對空白容器(僅含有空白培養(yǎng)基)和校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)(含空的培養(yǎng)基4-甲基傘形酮)進行培養(yǎng)。
在培養(yǎng)期間，成對的樣品容器按預(yù)定間隔或時期取出。第一培養(yǎng)時間長度較短，一般為大約2到5分鐘。它也可稱為“零樣品”。這一短時間長度允許已存在于濾膜或在樣品細胞中的外來熒光物質(zhì)溶解到培養(yǎng)基中，但這一時期太短以致于培養(yǎng)基中的糞便大腸桿菌類細胞不能開始明顯產(chǎn)生4-甲基傘形酮。其他重復(fù)的各對在經(jīng)歷預(yù)定間隔(如2、4和6小時)的培養(yǎng)后取出。培養(yǎng)后，加入堿性溶液(如NaOH)到樣品中以增加4-甲基傘形酮檢測的靈敏性。然后照射樣品，分析熒光的發(fā)射。對空的容器，校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)和試劑對照在每個時間間隔時也進行處理和照射以用于比較。
所有樣品進行培養(yǎng)，照射和進行熒光檢測后，分析數(shù)據(jù)。在每一步用空的容器和校準(zhǔn)容器重新校準(zhǔn)熒光計。
經(jīng)平均兩個重復(fù)樣品檢測每個間隔或時期的樣品熒光值。從樣品熒光值中減去從培養(yǎng)了特定時期的試劑對照中得到的熒光值以獲得一個調(diào)整后的樣品熒光值。當(dāng)對“零樣品”使用這一算法時，調(diào)整后的熒光值是“校正因子”，它隨后運用于培養(yǎng)了更長期間的樣品。每個調(diào)整后的樣品熒光值通過從該值中減去校正因子來校正，以獲得一個校正后的樣品或“凈”熒光值。
在本發(fā)明的這種方法中，如果2小時的校正熒光(凈)值為正的，而且如果4小時校正熒光值是正的且比2小時值要大，可推斷糞便大腸桿菌類細胞存在于原始樣品中(即≥1個糞便大腸桿菌類細胞/100ml)。
如果4小時校正熒光值是正的，而且如果6小時校正熒光值是正的且比4小時值更大，可推斷糞便大腸桿菌類細胞存在于原始樣品中(即≥1個糞便大腸桿菌類細胞/100ml)。
如果在任一校正樣品中校正的樣品熒光值相應(yīng)于樣品中的至少大約0.01μM的4-甲基傘形酮的體積摩爾濃度，可推斷糞便大腸桿菌類細胞存在于原始樣品中(即≥1個糞便大腸桿菌細胞/100ml)。圖3顯示了4-甲基傘形酮體積摩爾濃度對標(biāo)準(zhǔn)的校準(zhǔn)熒光強度的關(guān)系曲線。
如果不存在兩個連續(xù)增長的校正熒光值，或如果校正值在6小時后不與至少為大約0.01μM的4-甲基傘形酮體積摩爾濃度相對應(yīng)，可推斷在原始樣品中不存在糞便大腸桿菌類細胞，(即糞便細胞濃度＜1個糞便大腸桿菌類細胞/100ml)。
培養(yǎng)板樣品在經(jīng)歷一段7小時的培養(yǎng)期后可進行分析以證實所說結(jié)論。
方法過濾提供用于試驗的液體樣品，如用于飲用的水資源。樣品按照美國公眾衛(wèi)生協(xié)會出版的檢查水和廢水的標(biāo)準(zhǔn)方法，第17版，9222D部分的膜過濾方法進行過濾。本文引用此方法作為參考。甄別或判斷存在-不存在的方法為進行甄別步驟或判斷存在-不存在步驟，將濾膜置入含有啟動培養(yǎng)基的樣品容器中。啟動培養(yǎng)基含有乳糖，和一種去污劑，這里出現(xiàn)的是十二烷基硫酸鈉，用以增強4-甲基傘形酮的熒光(圖4)。濾膜沿培養(yǎng)管的管壁放入使其被培養(yǎng)基浸沒。
管在培養(yǎng)箱(如水浴)中在大約44.5℃±0.2℃下培養(yǎng)，在即將照射和熒光測量之前取出，使用調(diào)到預(yù)定波長的紫外光源照射含有樣品的管。以預(yù)定的時間間隔如每小時一次或在啟動培養(yǎng)后的1、2、4和6小時測量樣品以判定存在-不存在所述細胞。用于甄別的樣品在照射和熒光測量前先培養(yǎng)大約20到30分鐘。為了在標(biāo)準(zhǔn)熒光計中進行測量，將3-10ml樣品與約33μl 10MNaOH/ml試劑混合。
在第一次讀數(shù)前，準(zhǔn)備熒光計并經(jīng)首先將空的和內(nèi)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)的(工作液)預(yù)熱到44.5℃來校準(zhǔn)。先用3ml空白培養(yǎng)基(無MUGal)與100μl 10M NaOH混合將儀器調(diào)到零(零旋鈕)，再用3ml內(nèi)標(biāo)物(0.27μm MU)與100μL 10M NaOH混合調(diào)到500(量程旋鈕)。放大調(diào)到1000。使用來自Sequoia Turner，Model450-003的標(biāo)準(zhǔn)熒光計。
在優(yōu)選的實施例中，培養(yǎng)箱是一種水浴。然而，培養(yǎng)箱可以是能維持穩(wěn)定的培養(yǎng)溫度的任一裝置，該裝置有一種熱傳遞介質(zhì)，該介質(zhì)與容器表面保持密切的物理接觸，包括具有液體介質(zhì)如水或油的增產(chǎn)箱，具有固體或金屬熱傳遞介質(zhì)的塊狀或坑狀培養(yǎng)箱。直接計數(shù)方法在直接計數(shù)方法中，濾膜放到直接計數(shù)板的直接計數(shù)培養(yǎng)基表面。制備的培養(yǎng)板放入防水塑料袋中，浸沒在水浴中，44.5℃±0.2℃下培養(yǎng)約7小時±15分鐘。重要的是確保培養(yǎng)板浸沒以維持所需的恒定溫度。
培養(yǎng)期后，培養(yǎng)板移出培養(yǎng)箱，用紫外光(如以商品形式從UVP.Inc(Model No.UVL-21)買到的)以預(yù)定波長照射。然后觀察板上具熒光的微生物菌落。優(yōu)選一種堿性形成劑如NaOH噴灑到濾膜上，計數(shù)藍色熒光菌落的數(shù)目。在加入堿性形成劑前，需要試驗進行證實的任何菌落必須移去。儀器和設(shè)備用于7小時直接計數(shù)方法的儀器和設(shè)備包括膜過濾裝置(如從Sartorius可購得的)，能維持大約44.5℃±0.2℃恒溫的水浴培養(yǎng)箱(如可從Haake-Model SWB 20得到的)，長波紫外線手控?zé)?例如，可從UVP.Inc.得到的，UVL-21)，啟動培養(yǎng)基，堿性形成劑溶液，稀釋水(例如，0.1％無菌胨)，塑料培養(yǎng)皿，濾膜(例如，網(wǎng)的微孔為0.45μm)，4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷(MUGal)，95％乙醇，十二烷基硫酸鈉。
用于甄別或判斷存在-不存在試驗的儀器和設(shè)備包括膜過濾裝置，能維持大約44.5℃恒溫的水浴培養(yǎng)箱，長波紫外線手控?zé)?，啟動培養(yǎng)基，稀釋水(例如，0.1％的無菌胨)，濾膜(例如，0.45μm網(wǎng)孔)，4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷(MUGal)，95％乙醇，十二烷基硫酸鈉，熒光劑，空白培養(yǎng)基，10m NaOH溶液，無菌培養(yǎng)管，和4-甲基傘形酮(4-MU)。0.02％十二烷基硫酸鈉(SLS)溶液的制備0.1g十二烷基硫酸鈉溶于500ml蒸餾水中，120℃高壓滅菌15分鐘。4-MU-β-D-半乳糖苷底物溶液的制備加入1.5ml 95％乙醇到0.0375g MUGal中，劇烈搖動2分鐘，然后加入28.5ml 0.02％無菌SLS(十二烷基硫酸鈉)充分混合。加熱含底物溶液的管到60℃-80℃直到溶解。優(yōu)選地，每次試驗制備新鮮的該溶液。直接計數(shù)板的制備溶解12.925g啟動培養(yǎng)基于500ml無菌水中，20℃下調(diào)pH到7.3，加入5.0g瓊脂到培養(yǎng)基中，加熱到接近沸騰以溶化瓊脂。移走熱源，冷卻到大約70℃并加入20ml MUGal溶液到培養(yǎng)基中。冷卻培養(yǎng)基到45-50℃。分配5到7ml到塑料培養(yǎng)器中以產(chǎn)生直接計數(shù)板。優(yōu)選地4℃貯存配好的培養(yǎng)基，14天后棄去未用的培養(yǎng)基。液態(tài)啟動培養(yǎng)基的制備溶解12.925g啟動培養(yǎng)基(優(yōu)選表1所示的組合物)于500ml無菌蒸餾水中，20℃下調(diào)pH至7.3。加熱培養(yǎng)基至接近沸騰，移去熱源。冷卻到大約70℃并加入20ml MUGal溶液到培養(yǎng)基中，冷卻培養(yǎng)基到45℃以下。吸取大約15ml培養(yǎng)基到無菌管中以制成樣品容器。
表1啟動培養(yǎng)基組合物<

>空白培養(yǎng)基的制備溶解25.80g空白培養(yǎng)基(優(yōu)選表2所示的組合物)于1000ml無菌蒸餾水中，20℃調(diào)pH至7.3并過濾滅菌培養(yǎng)基。表2空白培養(yǎng)基組合物

內(nèi)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物的制備先溶解6mg 4-MU于500ml空白培養(yǎng)基(無MUGal)中以制備68.1μm MU貯液。每第二周制備新鮮的貯液。用空白培養(yǎng)基將1ml貯液稀釋到250ml以制備工作液(0.27μm MU)。將它用作校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物。新鮮工作液優(yōu)選每周制備一次。
根據(jù)試驗者所需的資料，甄別判斷存在-不存在和直接計數(shù)方法可分別、同時或連續(xù)完成。例如，甄別方法可單獨用于甄別大量水樣品的高度污染。判斷存在-不存在的方法用于進一步鑒別水樣品可疑的大腸桿菌類水平。直接計數(shù)方法用于分別證實特定水樣品中糞便大腸桿菌類的存在。這些方法也可結(jié)合使用。例如，水樣品的試驗可同時使用甄別方法和判斷存在-不存在的方法，使用甄別方法和直接計數(shù)方法，或使用判斷存在-不存在的方法和直接計數(shù)方法。最后，樣品可同時用甄別方法，判斷存在-不存在的方法，和直接計數(shù)法來檢驗。
本發(fā)明的結(jié)果用下面資料例來證實。
資料例1使用本發(fā)明的一種方法和使用標(biāo)準(zhǔn)方法mFC 24h方法評價在美國表層水中自然形成的糞便大腸桿菌類種群。1992年3月26日從美國馬里蘭州Monocacy河收集水樣并用本發(fā)明的方法分析糞便大腸桿菌類微生物。方法描述如上。以一式兩份試驗了3種稀釋度。樣品按上所述方法培養(yǎng)。在24小時計數(shù)mFC樣品。使用Turner Model 450-003熒光計在“零時”，2、4和6小時測量在快速檢測方法樣品中的熒光。激發(fā)和發(fā)射波長分別為365和465nm。結(jié)果和討論結(jié)果如圖5所示。與1、3和34FC/100ml相應(yīng)的所有稀釋度產(chǎn)生正的(+)結(jié)果，表明存在糞便細菌。最低值，1FC/100ml在6小時時檢測為正的，3FC/100ml在2小時時檢測為負(fù)的，34FC/100ml在≤2小時時檢測為正的(第一次測量時)。因此，在本實施例中，對于最低計數(shù)，在6小時證實了其存在，對于次低值(3FC/100ml)在2小時證實了其存在，對于最高值(34FC/100ml)在2小時證實了其存在，如果在20分鐘時進行測量，很可能在如此短的時間內(nèi)就證實。
資料例2在本實施例中使用本發(fā)明的一種形式和標(biāo)準(zhǔn)m-FC24小時方法分析了有或無污水污染的挪威表層水中自然糞便大腸桿菌類種群。1992年4月3日從挪威oslo的Aker河收集水樣，使用本發(fā)明的方法分析糞便大腸桿菌類微生物。試驗了3種樣品河水，含兩種不同劑量的未處理的家庭污水的河水。按上述方法制備的樣品在44.5℃水溶中培養(yǎng)。在24小時計數(shù)m-FC樣品。使用Turner Model 450-003熒光計在“零時”，2、4和6小時測量快速檢測方法樣品中的熒光。激發(fā)和發(fā)射波長分別是365和465nm。結(jié)果如圖6所示。相應(yīng)于11、90和TNTC的所有3種樣品產(chǎn)生正的(+)結(jié)果，證實了糞便大腸桿菌類的存在。所有結(jié)果在≤2小時內(nèi)為正的。如果在1小時的培養(yǎng)間隔后進行測量，TNTC細胞/100ml和90細胞/100ml樣品很可能被證實為正的。11細胞樣品可能在培養(yǎng)1.5小時后證實為正的。
資料例3在本實施例中，使用本發(fā)明的一種方法和標(biāo)準(zhǔn)m-FC 24小時方法分析了在幾種表層水中自然形成的糞便大腸桿菌類的種群。從Monocacy河，Aker河和Loysa河收集新鮮樣品并當(dāng)天進行分析。也根據(jù)EPA指南，檢測微生物學(xué)水純度的標(biāo)準(zhǔn)和方案(1987)制備了一種“最劣例”水樣品。樣品的物理參數(shù)和組成如表3所示。表3試驗樣品的成份

<p>所有樣品以一式兩份進行試驗。樣品在44.5℃的水溶中培養(yǎng)并按上面所述方法制備。m-FC樣品在24小時計數(shù)。使用Turner Model 450-003熒光計在“零時”，2、4和6小時測量快速檢測方法樣品的熒光值。激發(fā)和發(fā)射波長分別為365和465nm。
結(jié)果總結(jié)在表4中。使用本發(fā)明的方法進行的糞便大腸桿菌類存在/不存在檢測用+/-表示。報道了校正熒光值(量程為0至500)和最早正的“存在”檢測時間(2到6小時)。表4


全部具有＞10FC/100ml的樣品的正的結(jié)果在≤2小時測量出(樣品1、4、7、10、11、12和15)。含1-10FC/100ml的樣品在2-6小時內(nèi)檢測為正的(樣品2、5、6、8、13和14)。所有例子的7h直接計數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)m-FC 24h計數(shù)顯示出密切的一致性。本文所用的TNTC意思是“數(shù)量太大無法計數(shù)”。
本文引用的全部專利或文獻編入本文以供參考。
對本文所述的本發(fā)明實施例或本文所述實施例的部分要素或步驟或本文所述方法的步驟之順序可進行改變而不偏離在下面權(quán)利要求書中所限定的本發(fā)明的實質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1.一種當(dāng)每100毫升原始液體或液化樣品中含有至少一個糞便大腸桿菌類細胞時用于快速檢測所述細胞有無的方法，包括(a)在第一濾器上過濾原始樣品的第一部分，在第二濾器上過濾原始樣品的第二部分以濃縮活的糞便大腸桿菌類細胞；(b)提供具有熒光源底物的啟動培養(yǎng)基，以產(chǎn)生熒光產(chǎn)物；(c)提供第一樣品容器和第二樣品容器，每個中都含有預(yù)定量的啟動培養(yǎng)基；(d)將第一濾器放入第一樣品容器所含的啟動培養(yǎng)基中，第二濾器放入第二樣品容器所含的啟動培養(yǎng)基中；(e)提供培養(yǎng)設(shè)備，它具有熱傳遞介質(zhì)，可保持與所放置的每個容器緊密的物理接觸；(f)以第一時間長度培養(yǎng)第一樣品容器，以第二時間長度培養(yǎng)第二樣品容器，其中第一時間長度處于約1至5小時的范圍，而第二時間長度處于約2至6小時的范圍，前提條件是第三時間長度至少應(yīng)比第一時間長度長約1小時；(g)第一時間長度后將第一樣品容器中內(nèi)容物的pH調(diào)節(jié)至堿性pH；(h)調(diào)節(jié)pH后，用預(yù)定激發(fā)波長的光照射第一樣品容器和第一對照容器；(i)第二時間長度后將第二樣品容器中內(nèi)容物的pH調(diào)節(jié)至堿性pH；(j)調(diào)節(jié)pH后，用預(yù)定激發(fā)波長的光照射第二樣品容器；(k)每次照射步驟后，測量第一樣品容器中第一樣品的熒光值以及第二樣品容器中的第二樣品的熒光值；(l)得到校正因子；(m)調(diào)節(jié)第一樣品的熒光值以得到經(jīng)調(diào)節(jié)的第一樣品熒光值；(n)調(diào)節(jié)第二樣品的熒光值以得到經(jīng)調(diào)節(jié)的第二樣品熒光值；(o)使用校正因子以校正經(jīng)調(diào)整的第一樣品熒光值，可得到經(jīng)校正的第一樣品熒光值；(p)使用校正因子以校正經(jīng)調(diào)整的第二樣品熒光值，得到經(jīng)校正的第二樣品熒光值；和(q)當(dāng)經(jīng)校正的第一樣品熒光值是正的，經(jīng)校正的第二樣品熒光值也是正的并超出經(jīng)校正的第一樣品熒光值時，可推斷每100毫升原始樣品中至少含有一個糞便大腸桿菌類細胞。
2.如權(quán)利要求1的方法，進一步包括在含有啟動培養(yǎng)基的瓊脂培養(yǎng)基上至少培養(yǎng)原始樣品的第三部分，在培養(yǎng)裝置中用約7小時培養(yǎng)此培養(yǎng)基，培養(yǎng)期過后，用預(yù)定激發(fā)波長照射培養(yǎng)基，并對培養(yǎng)基上可見的微菌落計數(shù)。
3.如權(quán)利要求2的方法，進一步包括在對微菌落計數(shù)前，對徽菌落施用堿性溶液以加強熒光。
4.如權(quán)利要求1的方法，其中的啟動培養(yǎng)基進一步包括(1)維持活的糞便大腸桿菌類細胞代謝的營養(yǎng)成分，(2)能誘導(dǎo)產(chǎn)生可有效地與熒光源底物反應(yīng)以產(chǎn)生發(fā)熒光產(chǎn)物的酶的誘導(dǎo)劑，和(3)能有效加強熒光的表面活性劑。
5.如權(quán)利要求4的方法，其中的誘導(dǎo)劑是乳糖，能有效加強熒光的表面活性劑是十二烷基硫酸鈉，酶是β-D-半乳糖苷酶，熒光源底物是4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷，熒光部分是4-甲基傘形酮。
6.如權(quán)利要求5的方法，其中的培養(yǎng)基進一步包括作為第二熒光源底物的4-甲基傘形酮-β-D-葡糖苷酸。
7.如權(quán)利要求1的方法，其中照射步驟使用的激發(fā)波長約為365nm，它可導(dǎo)致約465nm的發(fā)射波長。
8.如權(quán)利要求1的方法，其中培養(yǎng)裝置中的液體熱傳遞介質(zhì)是液體。
9.如權(quán)利要求8的方法，其中液體熱傳遞介質(zhì)是水。
10.如權(quán)利要求8的方法，其中液體熱傳遞介質(zhì)是油。
11.如權(quán)利要求1的方法，其中培養(yǎng)裝置中熱傳遞介質(zhì)是固體。
12.如權(quán)利要求11的方法，其中培養(yǎng)工具中的固體熱傳遞介質(zhì)是金屬。
13.如權(quán)利要求1的方法，其中堿性pH大于11。
14.如權(quán)利要求13的方法，其中堿性pH大于13。
15.一種當(dāng)每100毫升原始液體或液化樣品中至少含有一個糞便大腸桿菌類細胞時用于快速檢測所述細胞有無的方法，包括(a)在第一濾器上過濾原始樣品的第一部分，在第二濾器上過濾原始樣品的第二部分，在第三濾器上過濾原始樣品的第三部分以濃縮活的糞便大腸桿菌類細胞；(b)提供具有熒光源底物的啟動培養(yǎng)基以產(chǎn)生熒光產(chǎn)物；(c)提供第一樣品容器、第二樣品容器、第三樣品容器、第一對照容器、第二對照容器、第三對照容器，每個中都含有預(yù)定量的啟動培養(yǎng)基；(d)將第一濾器放入第一樣品容器所含的啟動培養(yǎng)基中，第二濾器放入第二樣品容器所含的啟動培養(yǎng)基中，第三濾器放入第三樣品容器所含的啟動培養(yǎng)基中；(e)提供培養(yǎng)工具，它具有熱傳遞介質(zhì)，可保持與所放置的每個容器緊密的物理接觸(f)在短的第一時間長度培養(yǎng)第一樣品容器和第一對照容器；(g)短的第一時間長度后，將第一樣品容器中的內(nèi)容物和第一對照容器中內(nèi)容物的pH調(diào)節(jié)至堿性pH；(h)調(diào)節(jié)pH后，用預(yù)定激發(fā)波長的光照射第一樣品容器和第一對照容器；(i)以第二時間長度培養(yǎng)第二樣品容器和第二對照容器；(j)第二時間期限后，將第二樣品容器中的內(nèi)容物的pH和第二對照容器中內(nèi)容物的pH調(diào)節(jié)至堿性pH；(k)調(diào)節(jié)pH后，用預(yù)定激發(fā)波長的光照射第二樣品容器和第二對照容器；(l)以第三時間長度培養(yǎng)第三樣品容器和第三對照容器；(m)第三時間長度后將第三樣品容器中內(nèi)容物的pH和第三對照容器中內(nèi)容物的pH調(diào)節(jié)至堿性pH；(n)調(diào)節(jié)pH后，用預(yù)定激發(fā)波長的光照射第三樣品容器和第三對照容器；(o)每次照射步驟后，測量第一樣品容器中第一樣品的熒光值，第一對照容器的第一對照熒光值，第二樣品容器中的第二樣品的熒光值，第二對照容器中的第二對照熒光值，第三樣品容器中的第三樣品熒光值以及第三對照容器中的第三對照熒光值；(p)使用第一對照熒光值和第一樣品熒光值以得到校正因子；(q)用第二對照熒光值調(diào)整第二樣品熒光值以得到經(jīng)調(diào)整的第二樣品熒光值；(r)用第三對照熒光值調(diào)整第三樣品熒光值以得到經(jīng)調(diào)整的第三樣品熒光值；(s)用校正因子校正經(jīng)調(diào)整的第二樣品熒光值以得到經(jīng)校正的第二樣品熒光值；(t)用校正因子校正經(jīng)調(diào)整的第三樣品熒光值以得到經(jīng)校正的第三樣品熒光值；和(u)得出結(jié)論，當(dāng)經(jīng)校正的第二樣品熒光值是正的，經(jīng)校正的第三樣品熒光值也是正的并超出經(jīng)校正的第二樣品熒光值時，可推斷每100毫升原始樣品中至少含有一個糞便大腸桿菌類細胞。
16.如權(quán)利要求15的方法，進一步包括在含有啟動培養(yǎng)基的瓊脂培養(yǎng)基上至少培養(yǎng)原始樣品的第四部分，在培養(yǎng)裝置中用約7小時培養(yǎng)此培養(yǎng)基，培養(yǎng)期過后，用預(yù)定激發(fā)波長照射培養(yǎng)基，并對培養(yǎng)基上可見的微菌落計數(shù)。
17.如權(quán)利要求16的方法，進一步包括在對微菌落計數(shù)前，對微菌落施用堿性溶液以加強熒光。
18.如權(quán)利要求15的方法，其中短的時間長度少于約5分鐘。
19.如權(quán)利要求18的方法，其中第一時間長度約為2至5分鐘。
20.如權(quán)利要求15的方法，其中第二時間長度約為1至5小時。
21.如權(quán)利要求15的方法，其中第三時間長度約為2至6小時，前提條件是第三時間長度比第二時間長度長約1小時或更長時間。
22.如權(quán)利要求15的方法，其中第一時間長度在約2分鐘至5分鐘的范圍內(nèi)，第二時間長度約為1小時，第三時間長度約為2小時。
23.如權(quán)利要求15的方法，其中第一時間長度少于約5分鐘，第二時間長度約為1小時，第三時間長度在約為2小時至約6小時的范圍內(nèi)。
24.如權(quán)利要求15的方法，其中第一時間長度少于約5分鐘，第二時間長度約為2小時，第三時間長度約為4小時。
25.如權(quán)利要求15的方法，其中第一時間長度少于約5分鐘，第二時間長度約為4小時，第三時間長度約為6小時。
26.如權(quán)利要求15的方法，其中第二時間長度和第三時間長度至少相差約1小時。
27.如權(quán)利要求15的方法，其中得到校正因子的步驟進一步包括從第一樣品熒光值中減去第一對照熒光值。
28.如權(quán)利要求15的方法，其中得到經(jīng)調(diào)整的第二樣品熒光值的步驟進一步包括從第二樣品熒光值中減去第二對照熒光值。
29.如權(quán)利要求15的方法，其中得到經(jīng)校正的第二樣品熒光值的步驟進一步包括從經(jīng)調(diào)整的第二樣品熒光值中減去校正因子。
30.如權(quán)利要求15的方法，其中的啟動培養(yǎng)基進一步包括(1)維持活的糞便大腸桿菌類細胞代謝的營養(yǎng)成分，(2)能誘導(dǎo)產(chǎn)生可有效地與熒光源底物反應(yīng)以產(chǎn)生發(fā)熒光產(chǎn)物的酶的誘導(dǎo)劑，和(3)能有效加強熒光的表面活性劑。
31.如權(quán)利要求30的方法，其中的誘導(dǎo)劑是乳糖，能有效加強熒光的表面活性劑是十二烷基硫酸鈉，酶是β-D-半乳糖苷酶，熒光源底物是4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷，熒光部分是4-甲基傘形酮。
32.如權(quán)利要求31的方法，其中培養(yǎng)基進一步包括作為第二熒光源底物的4-甲基傘形酮-β-D-葡糖苷酸。
33.一種當(dāng)每100毫升原始液體或液化樣品中至少含有一個糞便大腸桿菌類細胞時用于快速檢測所述細胞有無的方法，包括(a)在第一濾器上過濾原始樣品的第一部分，在第二濾器上過濾原始樣品的第二部分，在第三濾器上過濾原始樣品的第三部分，在第四濾器上過濾原始樣品的第四部分以濃縮活的糞便大腸桿菌類細胞；(b)提供具有熒光源底物的啟動培養(yǎng)基，以產(chǎn)生熒光產(chǎn)物；(c)提供第一樣品容器、第二樣品容器、第三樣品容器、第四樣品容器、第一對照容器、第二對照容器、第三對照容器和第四對照容器，每個中都含有預(yù)定量的啟動培養(yǎng)基；(d)將第一濾器放入第一樣品容器所含的啟動培養(yǎng)基中，第二濾器放入第二樣品容器所含的啟動培養(yǎng)基中，第三濾器放入第三樣品容器所含的啟動培養(yǎng)基中，第四濾器放入第四樣品容器所含的啟動培養(yǎng)基中；(e)提供培養(yǎng)裝置，它具有熱傳遞介質(zhì)，可保持與所放置的每個容器緊密的物理接觸；(f)以短的第一時間長度，培養(yǎng)第一樣品容器和第一對照容器；(g)第一時間長度后，將第一樣品容器內(nèi)容物和第一對照容器內(nèi)容物的pH調(diào)節(jié)至堿性pH；(h)調(diào)節(jié)pH后，用預(yù)定激發(fā)波長的光照射第一樣品容器和第一對照容器；(i)以第二時間長度培養(yǎng)第二樣品容器和第二對照容器；(j)第二時間長度后，將第二樣品容器內(nèi)容物和第二對照容器中內(nèi)容物的pH調(diào)節(jié)至堿性pH；(k)調(diào)節(jié)pH后，用預(yù)定激發(fā)波長的光照射第二樣品容器和第二對照容器；(l)以第三時間長度培養(yǎng)第三樣品容器和第三對照容器；(m)第三時間長度后，將第三樣品容器內(nèi)容物和第三對照容器中內(nèi)容物的pH調(diào)節(jié)至堿性pH；(n)調(diào)節(jié)pH后，用預(yù)定激發(fā)波長的光照射第三樣品容器和第三對照容器；(o)以第四時間長度培養(yǎng)第四樣品容器和第四對照容器；(p)第四時間長度后，將第四樣品容器內(nèi)容物和第四對照容器內(nèi)容物的pH調(diào)節(jié)至堿性pH；(q)調(diào)節(jié)pH后，用預(yù)定激發(fā)波長的光照射第四樣品容器和第四對照容器；(r)每次照射步驟后，測量第一樣品容器中第一樣品的熒光值，第一對照容器的第一對照熒光值，第二樣品容器中的第二樣品熒光值，第二對照容器中的第二對照熒光值，第三樣品容器中的第三樣品熒光值，第三對照容器中的第三對照熒光值，第四樣品容器中的第四樣品熒光值，第四對照容器中的第四對照熒光值；(s)使用第一對照熒光值和第一樣品熒光值以得到校正因子；(t)用第二對照熒光值調(diào)整第二樣品熒光值以得到經(jīng)調(diào)整的第二樣品熒光值；(u)用第三對照熒光值調(diào)整第三樣品熒光值以得到經(jīng)調(diào)整的第三樣品熒光值；(v)用第四對照熒光值調(diào)整第四樣品熒光值以得到經(jīng)調(diào)整的第四樣品熒光值；(w)用校正因子校正經(jīng)調(diào)整的第二樣品熒光值以得到經(jīng)校正的第二樣品熒光值；(x)用校正因子校正經(jīng)調(diào)整的第三樣品熒光值以得到經(jīng)校正的第三樣品熒光值；(y)用校正因子校正經(jīng)調(diào)整的第四樣品熒光值以得到經(jīng)校正的第四樣品熒光值；和(z)得出結(jié)論，在下列情況下時每100毫升原始樣品中含有至少一個糞便大腸桿菌類細胞(1)經(jīng)校正的第二樣品熒光值是正的，經(jīng)校正的第三樣品熒光值超出經(jīng)校正的第二樣品熒光值，或者(2)經(jīng)校正的第三樣品熒光值是正的，經(jīng)校正的第四樣品熒光值超出經(jīng)校正的第三樣品熒光值。
34.如權(quán)利要求33的方法，其中短的時間長度少于約5分鐘。
35.如權(quán)利要求34的方法，其中第一時間長度約為2至5分鐘。
36.如權(quán)利要求33的方法，其中第二時間長度約為1小時至4小時。
37.如權(quán)利要求33的方法，其中第三時間長度約為2小時至5小時，前提條件是第三時間長度比第二時間長度要長約1小時或更長。
38.如權(quán)利要求33的方法，其中第四時間長度約為3小時至5小時，前提條件是第四時間長度比第三時間長度要長約1小時或更長。
39.如權(quán)利要求33的方法，其中第一時間長度在從約2分鐘至5分鐘的范圍內(nèi)，第二時間長度約為2小時，第三時間長度約為4小時，第四時間長度約為6小時。
40.如權(quán)利要求33的方法，其中第一時間長度少于約5分鐘，第二時間長度約為1至2小時，第三時間長度在從約3小時至5小時的范圍內(nèi)，第四時間長度在約4小時至6小時的范圍內(nèi)，前提條件是第三時間長度至少約比第二時間長度長1小時，第四時間長度至少約比第三時間長度長1小時。
41.如權(quán)利要求33的方法，其中第二時間長度和第三時間長度至少相差約1小時，第三時間長度和第四時間長度至少相差約1小時，第二時間長度和第四時間長度至少相差約2小時。
42.如權(quán)利要求33的方法，其中得到校正因子的步驟進一步包含從第一樣品熒光值中減去第一對照熒光值。
43.如權(quán)利要求33的方法，其中得到經(jīng)調(diào)整的樣品熒光值的步驟進一步包括從樣品熒光值中減去相應(yīng)的對照熒光值。
44.如權(quán)利要求33的方法，其中得到經(jīng)校正的樣品熒光值的步驟進一步包括從經(jīng)調(diào)整的樣品熒光值中減去校正因子。
45.如權(quán)利要求33的方法，進一步包括在含有啟動培養(yǎng)基的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)原始樣品的第二部分，在培養(yǎng)裝置中培養(yǎng)此培養(yǎng)基約7小時，培養(yǎng)期過后，用預(yù)定激發(fā)波長照射培養(yǎng)基，并對培養(yǎng)基上可見的微菌落計數(shù)。
46.如權(quán)利要求45的方法，進一步包括對微菌落計數(shù)前，對微菌落施用堿性溶液以加強熒光。
47.一種當(dāng)每100毫升原始液體或液化樣品中至少含有一個糞便大腸桿菌類細胞時用于快速檢測所述細胞有無的方法，包括(a)在第一濾器上過濾原始樣品的第一部分，在第二濾器上過濾原始樣品的第二部分，在第三濾器上過濾原始樣品的第三部分以濃縮活的糞便大腸桿菌類細胞；(b)提供啟動培養(yǎng)基，它含有水、4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷以及約占重量.46％至.54％的蛋白胨，約占重量.26％至.34％的酵母浸出汁，約占重量.4％至.6％的酶誘導(dǎo)物，約占重量.73％至.77％的鹽，約占重量.48％至.52％的丙酮酸鹽，約占重量.01％至.03％的表面活性劑，以及約占重量.009％至.011％的膽汁鹽；(c)提供第一樣品容器、第二樣品容器、第三樣品容器、第一對照容器、第二對照容器、第三對照容器，每個中都含有預(yù)定量的啟動培養(yǎng)基；(d)將第一濾器放入第一樣品容器所含的啟動培養(yǎng)基中，第二濾器放入第二樣品容器所含的啟動培養(yǎng)基中，第三濾器放入第三樣品容器所含的啟動培養(yǎng)基中；(e)提供培養(yǎng)裝置，它具有熱傳遞介質(zhì)，可保持與所放置的每個容器緊密的物理接觸；(f)以短的第一時間長度培養(yǎng)第一樣品容器和第一對照容器；(g)第一時間長度后將第一樣品容器中的內(nèi)容物和第一對照容器中內(nèi)容物的pH調(diào)節(jié)至堿性pH；(h)調(diào)節(jié)pH后，用預(yù)定激發(fā)波長的光照射第一樣品容器和第一對照容器；(i)以第二時間長度培養(yǎng)第二樣品容器和第二對照容器；(j)第二時間長度后將第二樣品容器內(nèi)容物和第二對照容器中內(nèi)容物的pH調(diào)節(jié)至堿性pH；(k)調(diào)節(jié)pH后，用預(yù)定激發(fā)波長的光照射第二樣品容器和第二對照容器；(l)以第三時間長度培養(yǎng)第三樣品容器和第三對照容器；(m)第三時間長度后，將第三樣品容器內(nèi)容物和第三對照容器內(nèi)容物的pH調(diào)節(jié)至堿性pH；(n)調(diào)節(jié)pH后，用預(yù)定激發(fā)波長的光照射第三樣品容器和第三對照容器；(o)每次照射步驟后，測量第一樣品容器中的第一樣品熒光值，第一對照容器的第一對照熒光值，第二樣品容器中的第二樣品熒光值，第二對照容器中的第二對照熒光值，第三樣品容器中的第三樣品熒光值和第三對照容器中的第三對照熒光值；(p)使用第一對照熒光值和第一樣品熒光值以得到校正因子；(q)用第二對照熒光值調(diào)整第二樣品熒光值以得到經(jīng)調(diào)整的第二樣品熒光值；(r)用第三對照熒光值調(diào)整第三樣品熒光值以得到經(jīng)調(diào)整的第三樣品熒光值；(s)用校正因子校正經(jīng)調(diào)整的第二樣品熒光值以得到經(jīng)校正的第二樣品熒光值；(t)用校正因子校正經(jīng)調(diào)整的第三樣品熒光值可得到經(jīng)校正的第三樣品熒光值；和(u)得出結(jié)論，當(dāng)經(jīng)校正的第二樣品熒光值是正的，經(jīng)校正的第三樣品熒光值超出經(jīng)校正的第二樣品熒光值時，可推斷每100毫升原始樣品中至少含有一個糞便大腸桿菌類細胞。
48.如權(quán)利要求47的方法，進一步包括在含有啟動培養(yǎng)基的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)原始樣品的第二部分，在培養(yǎng)裝置中培養(yǎng)此培養(yǎng)基約7小時，培養(yǎng)期過后，用預(yù)定激發(fā)波長照射培養(yǎng)基，并對培養(yǎng)基上可見的微菌落計數(shù)。
49.如權(quán)利要求48的方法，進一步包括在對微菌落計數(shù)前，對微菌落施用堿性溶液以加強熒光。
50.如權(quán)利要求47的方法，其中酶誘導(dǎo)物是乳糖，表面活性劑是十二烷基硫酸鈉，由誘導(dǎo)物誘導(dǎo)的酶是β-D-半乳糖苷酶，鹽是NaCl。
51.如權(quán)利要求47的方法，其中啟動培養(yǎng)基進一步包括約占重量.004％至.006％的4-甲基傘形酮-β-D-葡糖苷酸。
52.一種當(dāng)每100毫升原始液體或液化樣品中至少含有一個糞便大腸桿菌類細胞時用于快速檢測所述細胞有無的方法，包括(a)在第一濾器上過濾原始樣品的第一部分，在第二濾器上過濾原始樣品的第二部分以濃縮活的糞便大腸桿菌類細胞；(b)提供具有熒光源底物的啟動培養(yǎng)基以產(chǎn)生熒光產(chǎn)物；(c)提供第一樣品容器、第二樣品容器、第一對照容器和第二對照容器，每個中都含有預(yù)定量的啟動培養(yǎng)基；(d)將第一濾器放入第一樣品容器所含的啟動培養(yǎng)基中，第二濾器放入第二樣品容器所含的啟動培養(yǎng)基中；(e)提供培養(yǎng)裝置，它具有熱傳遞介質(zhì)，可保持與置入培養(yǎng)裝置中的每個容器緊密的物理接觸；(f)以短的第一時間長度培養(yǎng)第一樣品容器和第一對照容器；(g)第一時間長度后，將第一樣品容器中的內(nèi)容物和第一對照容器中內(nèi)容物的pH調(diào)節(jié)至堿性pH；(h)調(diào)節(jié)pH后，用預(yù)定激發(fā)波長的光照射第一樣品容器和第一對照容器；(i)以約為20至30分鐘的第二時間長度培養(yǎng)第二樣品容器和第二對照容器；(j)第二時間長度后，將第二樣品容器中內(nèi)容物和第二對照容器中的內(nèi)容物的pH調(diào)節(jié)至堿性pH；(k)調(diào)節(jié)pH后，用預(yù)定激發(fā)波長的光照射第二樣品容器和第二對照容器；(l)每次照射步驟后，測量第一樣品容器中的第一樣品熒光值，第一對照容器中的第一對照熒光值，第二樣品容器中的第二樣品熒光值，第二對照容器中的第二對照熒光值；(m)使用第一對照熒光值和第一樣品熒光值得到校正因子；(n)用第二對照熒光值來調(diào)整第二樣品熒光值得到經(jīng)調(diào)整的第二樣品熒光值；(o)用校正因子校正經(jīng)調(diào)整的第二樣品熒光值得到經(jīng)校正的第二樣品熒光值；和(p)得出結(jié)論，當(dāng)經(jīng)校正的第二樣品熒光值是正的時，每100毫升原始樣品中至少含有一個糞便大腸桿菌類細胞。
53.如權(quán)利要求52的方法，其中推斷的步驟進一步包括可推斷出每100毫升原始樣品中至少含有25個糞便大腸桿菌類細胞。
54.如權(quán)利要求52的方法，其中短的期間約低于5分鐘。
55.如權(quán)利要求54的方法，其中短的第一期間約為2至5分鐘。
56.如權(quán)利要求52的方法，進一步包括在含有啟動培養(yǎng)基的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)原始樣品的第二部分，在培養(yǎng)裝置中培養(yǎng)此培養(yǎng)基約7小時，培養(yǎng)期過后，用預(yù)定激發(fā)波長照射培養(yǎng)基，并對培養(yǎng)基上可見的微菌落計數(shù)。
57.如權(quán)利要求56的方法，進一步包括在對微菌落計數(shù)前，對微菌落施用堿性溶液以加強熒光。
58.如權(quán)利要求52的方法，其中培養(yǎng)基中進一步包括作為第二發(fā)熒光底物的4-甲基傘形酮-β-D-葡糖苷酸。
59.當(dāng)每100毫升原始液體或液化樣品中至少含有一個糞便大腸桿菌類細胞時的快速檢測該細胞有無的方法，包括(a)在第一濾器上過濾原始樣品的第一部分，在第二濾器上過濾原始樣品的第二部分以濃縮活的糞例大腸桿菌類細胞；(b)提供具有發(fā)熒光底物的啟動培養(yǎng)基以產(chǎn)生熒光產(chǎn)物；(c)提供第一樣品容器、第二樣品容器、第一對照容器和第二對照容器，每個中都含有預(yù)定量的啟動培養(yǎng)基；(d)將第一濾器放入第一樣品容器所含的啟動培養(yǎng)基中，第二濾器放入第二樣品容器所含的啟動培養(yǎng)基中；(e)提供培養(yǎng)裝置，它具有熱傳遞介質(zhì)，可保持與所放置的每個容器緊密的物理接觸；(f)在短的第一期間內(nèi)，培養(yǎng)第一樣品容器和第一對照容器；(g)第一期間后，將第一樣品容器中的內(nèi)容物和第一對照容器中內(nèi)容物的pH調(diào)節(jié)至堿性pH；(h)調(diào)節(jié)pH后，用預(yù)定激發(fā)波長的光照射第一樣品容器和第一對照容器；(i)在約為1小時的第二期間內(nèi)，培養(yǎng)第二樣品容器和第二對照容器；(j)第二期間后，將第二樣品容器中內(nèi)容物和第二對照容器中內(nèi)容物的pH調(diào)節(jié)至堿性pH；(k)調(diào)節(jié)pH后，用預(yù)定激發(fā)波長的光照射第二樣品容器和第二對照容器；(l)每次照射步驟后，測量第一樣品容器中的第一樣品熒光值，第一對照容器中的第一對照熒光值，第二樣品容器中的第二樣品熒光值，第二對照容器中的第二對照熒光值；(m)使用第一對照熒光值和第一樣品熒光值以得到校正因子；(n)用第二對照熒光值來調(diào)整第二樣品熒光值可得到經(jīng)調(diào)整的第二樣品熒光值；(o)用校正因子校正經(jīng)調(diào)整的第二樣品熒光值可得到經(jīng)校正的第二樣品熒光值；和(p)當(dāng)經(jīng)校正的第二樣品熒光值相應(yīng)于第二樣品中4-甲基傘形酮的至少約為0.01μmolar的體積克分子濃度時，可推斷每100毫升原始樣品至少含有一個糞便大腸桿菌類細胞。
60.如權(quán)利要求59的方法，其中短的期間約低于5分鐘。
61.如權(quán)利要求60的方法，其中第一期間約為2至5分鐘。
62.如權(quán)利要求59的方法，進一步包括在含有啟動培養(yǎng)基的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)原始樣品的第二部分，在培養(yǎng)裝置中培養(yǎng)此培養(yǎng)基約7小時，培養(yǎng)期過后，用預(yù)定激發(fā)波長照射培養(yǎng)基，并對培養(yǎng)基上可見的微菌落計數(shù)。
63.如權(quán)利要求62的方法，進一步包括在對微菌落計數(shù)前，對微菌落施用堿性溶液以加強熒光。
64.如權(quán)利要求59的方法，其中培養(yǎng)基進一步包括作為第二發(fā)熒光底物的4-甲基傘形酮-β-D-葡糖苷酸。
65.一種物質(zhì)組合物，包括水、4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷和培養(yǎng)基，此組合物是用于測定每100毫升原始液體或液化樣品中是否含有至少一個糞便大腸桿菌類細胞的試驗，此培養(yǎng)基進一步包括約占重量.46％至.54％的蛋白胨，約占重量.26％至.34％的酵母浸出汁，約占重量.4％至.6％的酶誘導(dǎo)物，約占重量.73％至.77％的鹽，約占重量.48％至.52％的丙酮酸鹽，約占重量.01％至.03％的表面活性劑，和約占重量.009％至.011％的膽汁鹽。
66.如權(quán)利要求65的方法，其中蛋白胨是3號胨蛋白胨，酶誘導(dǎo)物是乳糖，鹽是NaCl，去污劑是十二烷基硫酸鈉。
67.如權(quán)利要求65的方法，其中培養(yǎng)基進一步包括作為第二發(fā)熒光底物的4-甲基傘形酮-β-D-葡糖苷酸。
68.如權(quán)利要求67的方法，其中啟動培養(yǎng)基進一步包括約占重量.004％至.006％的4-甲基傘形酮-β-D-葡糖苷酸。
69.一種物質(zhì)組合物，當(dāng)它與水混合并聯(lián)合大量4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷時可提供培養(yǎng)基，以用于測定每100毫升原始液體或液化樣品中是否含有至少一個糞便大腸桿菌類細胞的試驗，此組合物包括約占重量17％至21％的蛋白胨；約占重量10％至14％的酵母浸出汁；約占重量15％至24％的酶誘導(dǎo)物；約占重量28％至30％的鹽；約占重量18％至21％的丙酮酸鹽；約占重量0.3％至1.2％的去污劑；和約占重量O.3％至0.5％的膽汁鹽。
70.如權(quán)利要求69的方法，其中蛋白胨是3號胨蛋白胨，酶誘導(dǎo)物是乳糖，鹽是NaCl，去污劑是十二烷基硫酸鈉。
71.如權(quán)利要求70的方法，其中培養(yǎng)基進一步包括作為第二發(fā)熒光底物的4-甲基傘形酮-β-D-葡糖苷酸。
72.如權(quán)利要求71的方法，其中活性培養(yǎng)基進一步包括約占重量.1％至.3％的4-甲基傘形酮-β-D-葡糖苷酸。
73.測定每100毫升原始液體或液化樣品中至少含有1個糞便大腸桿菌類細胞時的快速直接計數(shù)法，包括(a)在濾器中過濾原始樣品部分以濃縮活的糞便大腸桿菌類細胞；(b)提供含有啟動培養(yǎng)基的培養(yǎng)基，包括約占重量.46％至.54％的蛋白胨，約占重量.26％至.34％的酵母浸出汁，約占重量.4％至.6％的酶誘導(dǎo)物，約占重量.73％至.77％的鹽，約占重量.48％至.52％的丙酮酸鹽，約占重量.01％至.03％的去污性劑，約占重量.009％至.011％的膽汁鹽，和進一步包括一定量的4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷以產(chǎn)生作為熒光產(chǎn)物的4-甲基傘形酮；(c)將濾器放在培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基包含在容器中；(d)提供培養(yǎng)裝置，它具有熱傳遞介質(zhì)，可保持與所放置的每個容器緊密的物理接觸；(e)在約為7小時的期間內(nèi)培養(yǎng)培養(yǎng)容器；(f)培養(yǎng)期間后，用預(yù)定激發(fā)波長的光照射培養(yǎng)容器；(g)對培養(yǎng)基上的可見微菌落計數(shù)；和(h)當(dāng)至少可見一個熒光微菌落時，可推斷每100毫升原始樣品中至少含有一個糞便大腸桿菌類細胞。
74.如權(quán)利要求73的方法，其中蛋白胨是3號胨蛋白胨，酶誘導(dǎo)物是乳糖，鹽是NaCl，去污劑是十二烷基硫酸鈉。
75.如權(quán)利要求73的方法，其中啟動培養(yǎng)基進一步包括占重量.004％至.006％的4-甲基傘形酮-β-D-葡糖苷酸。
76.如權(quán)利要求73的方法，進一步包括在對微菌落計數(shù)前，對微菌落施用堿性溶液以加強熒光。
全文摘要
一種快速測定樣品中是否存在糞便大腸桿菌類細胞的方法。將原始樣品部分過濾并保留在微孔濾器上，在具有含熒光源底物的啟動培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中放入微孔濾器。按約20分鐘至6小時預(yù)定的時間長度培養(yǎng)樣品。將pH值調(diào)至堿性水平，照射容器并測量所發(fā)射的熒光。用背景熒光值調(diào)整測量的熒光值，并用外源熒光值校正，當(dāng)經(jīng)校正的熒光值是正的且達到某一預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)時，可得出結(jié)論；在原始樣品中存在糞便大腸桿菌類細胞(即，每100毫升樣品中至少有一個糞便大腸桿菌類細胞)。
文檔編號C12Q1/10GK1122147SQ94191972
公開日1996年5月8日 申請日期1994年3月11日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月12日
發(fā)明者詹姆斯·D·堡格 申請人:詹姆斯·D·堡格