專利名稱：具有乙酰酯酶活性的酶的制作方法
發(fā)明的所屬領域本發(fā)明涉及具有乙酰酯酶活性的酶，生產(chǎn)該酶的方法，以及含有一種或多種所說酶的酶制劑。
發(fā)明的背景各種生物學植物材料中，(主要在木聚糖、甘露聚糖和果膠聚合物中)，許多多糖均可以乙?；问酱嬖凇?〕。乙酰基團的生物學意義尚不完全明了。已經(jīng)知道，乙?；鶊F常?？煞乐苟嗵潜凰饷附到狻Ｒ虼?，為了實現(xiàn)部分或完全地酶促破壞乙酰化的多糖，使這些多糖去乙酰化是必要的〔2—4〕。
因此，有人預料〔2，3〕乙酰酯酶對于食品工業(yè)，主要在水果和蔬菜加工中如果汁生產(chǎn)、造酒或果膠提取中是一種重要的酶，其中可以利用它們的修飾乙?；嗵浅蔀橐捉到庑问降哪芰?。
已知許多真菌都含有能夠使乙?；亩嗵侨ヒ阴；拿?，這些酶通常被稱為乙酰酯酶。已純化了某些真菌乙酰酯酶〔5—9〕。然而，由于缺少充分鑒定特性的均一底物，以及檢測乙酚釋放的方法困難且耗時而阻礙了對這些酶的研究。迄今尚沒有描述這些酶的工業(yè)應用。
WO92/19728描述了從真菌菌種棘孢曲霉(Aspergillumaculeatus)中分離的半乳糖醛酸—鼠李聚糖(rhamnogalacturonan)乙酰酯酶。該酶對果膠發(fā)狀區(qū)域中的乙?；肴樘侨┧釟埢翘禺惖?。EP507369描述了編碼分離自黑曲霉(Aspergillusniger)之乙酰木聚糖酯酶的DNA序列。
為了許多目的，期望提供基本上沒有其他成分的乙酰酯酶。以這種方式，有可能產(chǎn)生適于特殊目的的酶制劑，這些制劑可含有單一乙酰酯酶或其隨意組合，并可含有或不含其他多糖降群酶。為此目的，方便的辦法是使用重組DNA技術制取單一成分的乙酰酯酶。
發(fā)明的概要現(xiàn)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，除上述半乳糖醛酸鼠李聚糖乙酰酯酶外，真菌菌種棘孢曲霉還產(chǎn)生許多具有有用酶促活性的新的乙酰酯酶。盡管這些酶只是以很低的量(占總的酶產(chǎn)生量的0.1％以下)產(chǎn)生的，但本發(fā)明人已成功地純化并從性質上鑒定了這些新的酶。
因此，本發(fā)明涉及具有乙酰酯酶活性的新的酶，特別是涉及單一成分的乙酰酯酶。
更具體地說，本發(fā)明的第一個方面涉及具有乙酰酯酶活性的酶，該酶包含序列表SEQ ID NO.1中所示的氨基酸序列，其中X代表任何一種氨基酸殘基。
本文所使用的術語“具有乙酰酯酶活性”是指一組酶，其成員具有能夠按下文材料和方法部分中給出的程序裂解乙酰酯酶底物—對位硝基苯酚乙酸酯(PNP—乙酸酯)這一共有特征。再者，在某些情況下它們也可能作用于其他乙酰化非糖底物。這些酶統(tǒng)稱為乙酰酯酶?？梢岳斫獾剑疚墓_的各種乙酰酯酶的天然底物在不同的乙?；嗵牵缫阴；事毒厶?、乙?；揪厶恰⒁阴；肴樘侨┧帷罄罹厶羌耙阴；z間可能有所變化。
在進行導致本發(fā)明的研究工作中，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，由棘孢曲霉中分離的不同的乙酰酯酶包含SEQ ID NO.1中所示的部分氨基酸序列。該序列的存在可能是乙酰酯酶，特別是由棘孢曲霉或其他相關生物產(chǎn)生的乙酰酯酶的特征。如上所述，X可以是任何氨基酸殘基，其在本文中可被理解為包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰按、天冬氨酸、半脘氨酸、容氨酰胺、容氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、鹵氨酸、酪氨酸和纈氨酸。
第二個方面，本發(fā)明涉及具有乙酰酯酶活性的酶，該酶是對乙酰化木聚糖及乙?；事毒厶怯谢钚缘?。據(jù)本發(fā)明人所知，以前尚沒有公開過對這兩種底物都有活性的酶。因此，已知乙酰酯酶是很特異的，因為它們只使一種類型的乙?；妓衔锶ヒ阴；?。根據(jù)本發(fā)明的這一個方面的乙酰酯酶的優(yōu)點是，它可用于一種以上類型的底物。
本文使用的術語“對乙?；哪揪厶堑幕钚浴焙汀皩σ阴；母事毒厶堑幕钚浴?，意思是指該酶能夠分別水解見于乙?；鶊F與木聚糖之間和乙酰基團與甘露聚糖之間的酯鍵。
本發(fā)明的再一個方面涉及具有乙酰酯酶活性的酶，該酶與對抗衍生于棘孢曲霉，CBS101.43純化的乙酰酯酶的抗體發(fā)生免疫學反應并具有約44或35DKa的分子量。
本文限定的是分子量約44KDa或35KDa的棘孢曲霉乙酰酯酶。如眾所周知，測得的給定酶的分子量的確切數(shù)值取決于其檢測中使用的方法。因此，即使所使用的分子量檢測法只稍有不同，和/或由產(chǎn)生不同的人進行分子量檢測時，都可能出現(xiàn)所測得的真實數(shù)值的變化。因此，應在這一基礎上估計本文給出的酶的分子量，并最好解釋為一個接近所述真實數(shù)值的范圍，而不是其準確數(shù)值。如果用本領域已知的其他適當?shù)姆椒?如質譜法、凝膠過濾或沉淀法)而不是實際用于本發(fā)明的方法檢測酶的分子量(詳見下文材料和方法部分所述)，則可望得到與本申請實際給出者有所不同的分子量。
本文中使用的術語“衍生于”不僅是指由CBS101.43菌株產(chǎn)生的乙酰酯酶，而且還包括由分離自CBS101.43菌株的DNA序列編碼的和在用所說的DNA序列轉化的宿主生物體中產(chǎn)生的乙酰酯酶。
本發(fā)明的再一個方面涉及具有乙酰酯酶活性的酶，該酶是由包含SEQ IDNO.4中所示之DNA序列的DNA序列編碼的。
應明確的是，由包含SEQ ID NO.4中所示DNA序列之類似物的DNA序列編碼的酶也被看作是本發(fā)明范圍之內(nèi)的。本文中使用的術語“類似物”被理解為包括編碼具有乙酰酯酶活性之酶的任何DNA序列，并且其與SEQ ID NO.4中所示的DNA序列至少70％同源，包括SEQ ID NO.4中所示DNA序列的部分序列。類似DNA序列可以是在下述條件下編碼乙酰酯酶之DNA相同的探針雜文的DNA序列于大約40℃在5×SSC中預浸漬并在5×SSC、5XDenharat氏溶液、50mM磷酸鈉(pH6、8)，以及50mg變性的超聲處理的小牛胸腺DNA的溶液中預雜交1小時，然后在添加有50μCi32P—dCTP標記之探針的相同溶液中，于大約40℃下雜交18小時，再于2×SSC、0.2％SDS中于40℃洗三次共30分鐘。類似DNA序列與SEQ ID NO.4中所示的序列至少80％，如至少90％同源，且最好與所說的序列至少95％同源。
可以從例如另一種生物體中分離或基于SEQ ID NO.1—3中所示的氨基酸序列制備類似DNA序列，例如可以導入并不產(chǎn)生另一個乙酰酯酶的氨基酸序列，但相當于在其中導入3DNA物建體之宿主生物體的密碼于用法的核苷酸取代，或者導入將產(chǎn)生不同的氨基酸序列并因此有可能產(chǎn)生不同的蛋白質結構后者會產(chǎn)生與天然酶有不同性質的乙酰酯酶突變體的核苷酸取代?？赡艿男揎椀钠渌邮窃谛蛄兄胁迦胍粋€或多個核苷酸，在序列的每個末端加入一個或多個核苷酸，或者在序列的任一末端或在序列內(nèi)刪除一個或多個核苷酸。
本發(fā)明的再一個方面涉及用于降解植物細胞壁成分的酶制劑，所說的制劑富含具有如上所述的乙酰酯酶活性的酶，還涉及酶或酶制劑的各種應用。
發(fā)明的詳細描述根據(jù)一個實施方案，包含SEQ ID NO.1中所示共有氨基酸序列的本發(fā)明的酶是包含SEQ ID NO.2中所示N末端氨基酸序列的酶。該酶在下文中被稱為乙酰酯酶I。
本文中術語“N末端氨基酸序列”在其常規(guī)含義上應被理解為成熟(被分泌或經(jīng)過加工的)酶的N末端氨基酸序列，即在信號序列或前序列已被切掉后所保留的N末端序列。
本發(fā)明的乙酰酯酶I較好是由包含SEQ ID NO.4中所示DNA序列的DNA序列或所說DNA序列的類似物編碼的，所說的類似物與所說的DNA序列至少有80％，較好至少有90％同源。
乙酰酯酶I較好有大約44KDa的分子量，pI范圍為4.5—5.1，和/或最適pH范圍為大約6.0—9.0，例如在本文所述條件下測得最適pH范圍約為7.0—7.5。
已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的乙酰酯酶I，當用下文材料和方法部分中所述的檢測法檢測時，基本上對乙?；揪厶?、乙酰化甘露聚糖和/或乙酰化半乳糖醛酸—鼠李聚糖沒有活性。此外，已發(fā)現(xiàn)乙酰酯酶I是沒有脂肪酶活性的。
本發(fā)明的另一種酶是包含SEQIDNO.3中所示N末端氨基酸序列的酶，其中可以是任何氨基酸殘基。在下文中該酶被稱為乙酰酯酶II。
已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的乙酰酯酶II是對乙?；揪厶腔蛞阴；事短怯谢钚缘模鴮σ阴；樘侨┧帷罄罹厶莿t基本上沒有活性。事實上，據(jù)信本發(fā)明的乙酰酯酶II是首次公開的對乙?；揪厶呛鸵阴；事毒厶嵌加谢钚缘拿?。
目前，本發(fā)明的乙酰酯酶II較好是如上所示氨基酸序列中的X為蘇氨酸殘基的酶。
本發(fā)明的乙酰酯酶II較好有范圍為4～5，如大約4.5的pI，和/或大約35KDa的分子量。
應明確的是，上文鑒定的酶的同系物應看作是本發(fā)明的范圍內(nèi)的。術語“同系物”是指N末端氨基酸序列的一個或多個氨基酸殘基分別不同于SEQ ID NO.2或3中所示序列的有乙酰酯酶活性，而基本上不損傷酶之特征性乙酰酯酶活性的酶。例如，同系物可以是經(jīng)適當?shù)匦揎椌幋a該氨基酸序列的DNA序列，如果導致向序列的N和C末端之一或兩者加入一個或多個氨基酸殘基、在氨基酸序列的一個或多個不同位點取代一個或多個氨基酸殘基、在氨基酸序列的一個或多個位點的一個或兩個末端刪除一個或多個氨基酸殘基，或在氨基酸序列的一個或多個位點處插入一個或多個氨基酸殘基的適當修飾而制備本發(fā)明乙酰酯酶I或II的天然存在的或遺傳工程改造的變異體。
優(yōu)選的是同源性酶的N末端氨基酸序列為至少70％同源，如分別與SEQ IDNO.2或3中所示之N末端氨基酸序列至少80％、90％或95％同源。
借助本發(fā)明，有可能提供高度純化形式的乙酰酯酶，即，用本文材料與方法部分中所述的SDS凝膠電泳法測定其純度大于80％，且最好大于90％或95％。
雖然可從包括植物和動物在內(nèi)的任何來源得到具有乙酰酯酶活性的本發(fā)明的酶，但目前優(yōu)選的是微生物來源的酶。
本文中，術語“微生物來源”意欲包括細菌和真菌(如絲狀真菌或酵母)。術語“可得到的”意欲包括可從上述任何來源回收的酶，或者可由分離自上述來源的DNA或基于這些來源的DNA制備的DNA序列編碼并表達的酶。
特別是，本發(fā)明的確可以得自真菌更具體地說是曲霉屬特別是棘孢曲霉或黑曲霉菌株木霉(Trichoderma)的菌株，特別是T.harzianum，T.reesie，或鐮孢霉屬(Fusarium)的菌株，特別是尖鐮孢(F.oxysporum)，可得自酵母屬的菌株，特別是釀酒酵母。
作為一個例子可用本領域已知的純化方法，包括超濾、柱層析、凝膠過濾等，以及這些方法的適當組合，從任何適當?shù)纳矬w如棘孢曲霉的培養(yǎng)物中回收有乙酰酯酶活性的本發(fā)明的酶。繼后可以檢測從這些方法制得的含蛋白質部分的乙酰酯酶活性。下文實施例1中給出了整個純化方案的更詳細的描述。
雖然可用上述方法生產(chǎn)本發(fā)明的酶，但目前優(yōu)選的是利用適于這一目的的重組DNA技術。因此，本發(fā)明的酶最好經(jīng)過表達從編碼該酶的DNA序列而產(chǎn)生的，所說的DNA序列則是從上述適當生物體的DNA或基因組文庫分離的。適當?shù)纳矬w的優(yōu)選例子是棘孢曲霉CBS101.43，公眾可從Centeraalbureall voorSchimmelcultures，Delft，NL得到該菌株。
例如可經(jīng)篩選適當生物體如棘孢曲霉的cDNA文庫，并選擇與基于所說酶之氨基酸序列而制備的DNA探針雜交的克隆，以分離編碼該酶的DNA序列(如上述序列)。雜交可在本領域已知的條件下，例如上述與類似DNA相關聯(lián)的條件下完成。
另外，也可以經(jīng)篩選上述任何生物體，特別是棘孢曲霉之菌株的cDNA或基因組文庫，并按上述方法分離表達乙酰酯酶活性的克隆，以分離DNA序列。然而，當在其本身表達乙酰酯酶活性的細胞中制備cDNA或基因組文庫時，該后一種方法可能受到限制，并因此而產(chǎn)生假陽性篩選結果。特別是，當使用PNP—乙酸酯作為底物時，如期望由真核細胞表達乙酰酯酶活性，則會出現(xiàn)假陽性結果。
然后可用標準程序從克隆中分離以上述任一方法選擇的適當?shù)腄NA序列。
繼而可將DNA序列插入重組表達載體中。所用載體可以是常規(guī)用于重組DNA操作的任何一種載體，對載體的選擇常常取決于它將要導入的宿主細胞。因此，載體可以是一種自動復制載體，即作為染色體外整體存在的載體，其復制是不依賴于染色體復制的，如質粒。另外，載體也可以是當被導入宿主細胞內(nèi)時，可整合到宿主細胞基因組中，并與它已整合進的宿主細胞的染色體一起復制的載體。
在載體中，應將編碼乙酰酯酶的DNA序列可操作地連接到適當后動子和終止子序列上。后動子可以是在選擇的宿細胞中顯示有轉錄活性，并且可以衍生于編碼同源或異源于宿主細胞之蛋白質的基因的任何DNA序列。用于連接乙酰酯酶之DNA序列、后動子和終止子的方法，以及將它們插入適當載體中的方法是本領域技術人員熟知的(例如參見Sambrook et al，1989)。
用編碼本發(fā)明的酶的DNA序列轉化的宿主細胞較好是真核細胞，特別是如酵母或絲狀真菌細胞等真菌細胞。具體地說，細胞可屬于曲霉屬的菌種，最好是米曲霉(A oryzae)或黑曲霉(A.niger)?？梢杂蒙婕霸|體形成的原生質體轉化的方法轉化真菌細胞，然后以已知的方式再生細胞壁。EP238023(Novo NordiskA/S)中描述了作為宿主微生物的曲霉菌的使用，該文獻的內(nèi)容列入本文作為參考。宿主細胞還可以是酵母細胞，如酵母屬的菌株，特別是釀酒酵母。
在另一個方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)本發(fā)明的酶的方法，其中在允許產(chǎn)生該酶的條件下培養(yǎng)用編碼該酶的DNA序列轉化的適當?shù)乃拗骷毎?，并從培養(yǎng)物中回收所產(chǎn)生的酶。
用于碚養(yǎng)被轉化的宿主細胞的培養(yǎng)基可以是適于生長所說的宿主細胞的任何常規(guī)培養(yǎng)基。所表達的乙酰酯酶可方便地分泌到培養(yǎng)基中并可用已知的方法從中回收之，這些方法包括經(jīng)離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細胞、借助鹽如硫酸銨沉淀培養(yǎng)基的蛋白質成分，然后進行層析如離子交換層析，親和層析等。
除了用于制備本發(fā)明的乙酰酯酶外，還可用編碼此乙酰酯酶的DNA序列失活或破壞編碼乙酰酯酶的基因。因此，為了某些應用，存在于所使用的多糖底物上的乙?；蚩赡苁侵匾模唤?jīng)乙酰酯酶的作用除去之。在某些將使和樹膠作為底物的應用中即可能是這種情況。因此，乙酰酯酶對這些底物的作用可能是不期望有的。
因此預期可以使用編碼本發(fā)明的乙酰酯酶的DNA序列(如SEQ ID NO.4所示的DNA序列)或其部分來避免為這些應用所使用的多糖降解酶制劑中乙酰酯酶活性的存在，其中底物上乙酰基因的存在是合乎要求的。更具體地說，預期可以使用編碼本發(fā)明的乙酰酯酶的DNA序列，以破壞將或失活將用作基本上沒有或只包含小量乙酰酯酶的多糖降解生產(chǎn)菌的生物體中存在并有活性的乙酰酯酶基因。
可經(jīng)制備乙酰酯酶基因的反義序列并按照已知的反義技術使用該反義序列失活所研究的乙酰酯酶基因，以方便地完成失活作用。因而，可以產(chǎn)生能夠生產(chǎn)只有小量(或基本上沒有)不需要之乙酰酯酶活性的多糖降解酶的新的產(chǎn)生酶的生物體，如微生物。
再一個方面，本發(fā)明涉及用于降解或修飾植物細胞壁成分的酶制劑，所說的制劑富含有上述乙酰酯酶活性的酶。
已富集了本發(fā)明的酶的酶制劑例如可以是包含多種酶促活性的酶制劑。特別是該酶制劑包含多種植物細胞壁降解酶，如Pulpzyme、Gamanase、Pectinexr、Pectinex Ultre SPr、Celluclaet或Celluzyme(所有這些酶制劑都得自Novo Hordisk A/S)。
本文中，術語“富含”意指已增加了酶制劑的乙酰酯酶活性，如富集因子至少為1.1，而這種增加一般是由于加入按上述方法制備的本發(fā)明的酶。
另外，富含有乙酰酯酶活性之酶的酶制劑可以是包含本發(fā)明的酶作為主要酶促成分的酶制劑，即單成分酶制劑。
可以按照本領域已知的方法，并可以液體或干燥制劑的形式制備酶制劑。例如，酶制劑可以是顆粒或微顆粒形式的?？梢园凑毡绢I域已知的方法穩(wěn)定將包含于制劑中的酶。
除了本發(fā)明的乙酰酯酶外，本發(fā)明的酶制劑可含有一種或多種其他植物細胞壁降解酶，例如有纖維素水解、木聚糖水解、甘露聚糖水解或果膠水解活性的酶，如2—阿拉伯糖苯酶、木聚糖酶、2—萄聚糖苯酶、β—木糖苷酶、甘露聚糖酶、β—甘露糖苷酶、2—半乳糖苷酶、阿拉伯聚糖酶、半乳糖醛酸鼠李聚糖酶、半乳聚糖酶、多聚半乳糖醛酸酶、果膠溶解酶、果膠酸鹽溶解酶、萄聚糖酶、2—半乳糖醛酸苷酶或果膠甲基酯酶。
可借助屬于曲霉屬的微生物，較好是黑風霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉(A.awamori)或米曲霉、或木霉屬的微生物產(chǎn)生其他的酶。
較好使用根據(jù)本發(fā)明的酶制劑作為降解或修飾植物細胞壁材料，以及來源于植物細胞壁之含木聚糖或苷露聚糖材料的試劑。
下面給出的是優(yōu)選使用的本發(fā)明的酶制劑?？苫诒绢I域已知的方法來確定本發(fā)明酶制劑的劑量及使用該制劑的其他條件。
已知許多多糖都是乙?；模缬材?、軟木或谷物中的乙?；揪厶?、軟水中的乙?；肴楦事毒厶呛桶肴樘迅事毒厶?、糖甜菜中的乙?；z、雙子葉植物的乙?；肴樘侨┧帷罄罹厶呛鸵阴；暇厶牵约耙阴；瘶淠z如梧桐樹膠(得自蘋婆樹)和黃原膠(細菌樹膠)。
因此，使用本發(fā)明的乙酰酯酶與沒有其他木聚糖水解酶(特別是β—木糖苷酶)或者有有限的其他木聚糖水解酶活性的木聚糖酶結合，以將木聚糖降解為聚寡糖是十分有利的。這樣的寡糖可用作填充劑。
經(jīng)完全或部分地除去木聚糖的側支鏈將有利于由本發(fā)明的乙酰酯酶連同含木聚糖酶的酶制劑降解木聚糖?？捎脺睾偷乃崽幚砘蛴?—阿拉伯糖苷酶除去阿拉伯糖側鏈基因，并可用2—萄糖醛酸苷酶除去萄糖醛酸側鏈。
經(jīng)乙酰酯酶和木聚糖酶，或乙酰酯酶、木聚糖酶及上述側鏈水解酶的聯(lián)合作用釋放的寡聚體可進一步經(jīng)β—木糖苷酶的作用被降解或游離的木糖(及其他單糖)。所釋放的木糖可被轉化成其他化合物如呋喃硐香味劑。
可使用本發(fā)明的乙酰酯酶并合用沒有其他甘露聚糖水解酶或只有有限的其他甘露聚糖水解酶活性的甘露聚糖酶，降解甘露聚糖(包括半乳甘露聚糖、萄甘露聚糖及半乳萄甘露聚糖)以生產(chǎn)寡糖。寡糖可用作填充劑。
經(jīng)全部或部分除去甘露聚糖側支鏈，可有利于用本發(fā)明的乙酰酯酶和含甘露聚糖的酶制劑降解甘露聚糖。例如，甘露聚糖的半乳糖側支鏈可經(jīng)β—半乳糖苷酶的作用而除去。
可使用β—甘露糖苷酶(及用于葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的β—葡糖苷酶)進一步降解經(jīng)乙酰酯酶和甘露聚糖酶，或如上所述合用乙酰酯酶、甘露聚糖酶及2—半乳糖苷酶處理所釋放的寡聚體，以產(chǎn)生游離甘露糖。
可將本發(fā)明的乙酰酯酶與木聚糖水解酶合用，用于改良動物飼料，并可發(fā)揮其體外(經(jīng)改良飼料成分)或體內(nèi)作用。乙酰酯酶特別適于加到含有較高量乙?；揪厶堑膭游镲暳辖M合物，例如含牧草、容物或玉米葉的飼料中。
本發(fā)明的乙酰酯酶可與木聚糖和/或甘露聚糖酶合用，用于造紙或紙漿工業(yè)，例如用發(fā)改善木素纖維素紙漿的漂白性能或濾水性能。
用本發(fā)明的乙酰酯酶并合用其他酶處理植物材料，以改善不同類型的加工，有利于純化或提取不同的成分如碳水化合物，改善飼養(yǎng)質量、降低水結合能力、改善廢水處理廠中的降解性、改善牧草和玉米向青貯飼料的轉化率、或者水解各種植物細胞壁衍生的材料或廢物材料，如造低廢物材料，或農(nóng)業(yè)殘留物如麥秸、玉米棒、整個玉米植物株、果仁殼、雜草、植物外殼、豆莢、廢棄容物、糖甜菜漿等。
可使用本發(fā)明的乙酰酯酶制劑使碳水化合物去乙?；愿淖兤湫再|。如碳水化合物的流變性、穩(wěn)定能力或疏水性。例子是對木聚糖和甘露聚糖的去乙?；饔?。用于上述目的的碳水化合物乙酰酯酶制劑較好是基本上沒有可使所說的碳水化合物解聚活性的。
此外，在有低水活度的系統(tǒng)中，可用本發(fā)明的乙酰酯酶酯化如乙?；?通過酯合成或轉酯化作用)木聚糖和甘露聚糖等碳水化合物。由此形成的乙?；奶妓衔锟杀忍烊淮嬖诘奶妓衔镉懈蟮囊阴；潭龋⒕哂性黾恿耸杷缘刃碌男再|，并進而改善了乳化和/或穩(wěn)定含脂肪乳液的能力。
可在食口工業(yè)中使用本發(fā)明的酶制劑降解植物細胞壁多糖。其中主要是用在水果和蔬菜加工如果汁生產(chǎn)或果酒釀造中，并且可用于造紙和紙漿工業(yè)中。此外，該酶制劑可用于修飾或降解例如用于食品中的樹膠。這些樹膠的例子是梧桐樹膠(得自蘋婆樹)、阿拉伯樹膠、特別是刺槐豆樹膠(角豆樹)、瓜耳樹膠及黃原膠(細菌膠)。
下列附圖進一步說明本發(fā)明，其中

圖1是用于分離本發(fā)明的酶的純化方法的流程圖；圖2是從上述棘孢曲霉上清液中分離的純化的乙酰酯酶的銀染色SDS—PAGE凝膠。在12％TSDS—PAGE凝膠上分離并按材料和方法部所述銀染色蛋白質。泳道1分子量標記(磷酸化酶β94KDa，βSA67KDa，卵清蛋白43KDa，磷酸酐酶39KDa，STI20.1KDa)。泳道210μg棘孢曲霉上清液。泳道320μg集合物I。泳道420μg從陰離子交換層析純化得到的副部分。泳道50.8μg集合物1.1。泳道60.07μg集合物I.II。泳道71.2μg純化的半乳糖醛酸—鼠李聚糖乙酰酯酶(WO92/19728)；圖3圖解顯示按下文材料和方法部分所述測得的從集合物I.I回收的乙酰酯酶的最適pH；圖4顯示對PNP乙酸酯、乙酰化甘露聚糖及乙?；揪厶菧y得的從集合物I.Ⅱ中回收的乙酰酯酶的最適pH。
圖5顯示用等電聚焦法測得的本發(fā)明酶的等電點。泳道1標記物淀粉萄糖苷酶(pI3.5)、以及胰蛋白酶抑制劑(pI4.55)、牛清碳酸酐酶(pI5，85)、人碳酸酐酶(pI6.55)的等電點。泳道210μg棘孢曲霉培養(yǎng)物上清液。泳道31μg集合物I.I。泳道41μg集合物I.II。
下列實施例進一步詳細描述本發(fā)明，這些實施例不以任何方式限制本發(fā)明權利要求的范圍。
材料和方法供體生物體和發(fā)酵使棘孢曲霉，菌株CBS101.43在40m3通氣的連續(xù)攪拌的以酵罐內(nèi)生長于含有12％(W/W)大豆餅和1.5％磷酸鉀pH低于5.0的培養(yǎng)基中。發(fā)酵期間使用pH保持在大約4.2，并在發(fā)酵期間連續(xù)加入馬鈴薯淀粉。過濾所得培養(yǎng)物上清液離心并在20KDaUF濾器中濃縮得到約150mg/ml蛋白質。
PNP—乙酰酯酶活性在500μl的1.6mMPNP—乙酸酯(Sigma，ST.Louis，USA)、20mM檸酸酸鹽(pH5.5)中保溫純化酶的樣品，并在加入100μlIMTris(pH7.0)后檢測活性OD450定量所釋放之PNP的量，以檢測活性。1單位定義為于40℃釋放1μmolePNP/分鐘的活性。
乙酰酯酶檢測法(Boehringer Mannheim檢測法)按照制造商提供的使用手冊完成檢測。
將乙?；亩嗵堑孜锶芙庠谠噭┘壦械玫?％溶液/懸浮液，以制得將用于檢測的底物溶液。
將65μl底物溶液加到30μl的0.3M有適當pH的緩沖液(即用于集合物I.I和I.II乙酰酯酶的Tris緩沖液pH6.5)中。最后加入5μl酶溶液(以及加入5μl水作為空白對照)。
在振蕩臺上將樣品于37℃保溫1小時，然后加熱至95℃約15分鐘，以失活酶。
用Boehringer Manheim檢測法檢測10μl該溶液的乙酯酯含量。
乙?；牡孜镆阴；肴樘侨ァ罄罹厶?經(jīng)修飾的發(fā)狀區(qū)域)該底物得自用果膠酶制劑(Pectinex AR，Novo—Nordisk)部分果膠水解的Golden Delicious蘋果，然后對其進行離心香味反率取(aromawtripping)及在MW60,000Da截留BX3聚砜膜(PatersonCandy Ltd.)上進行引超濾。將保留物對水透析并凍干。將代表1.7％蘋果固體和大約4％糖的MHR部分乙?；?。
乙?；母事毒厶窃摰孜镉蒍iirgen Puls(Hamburg，F(xiàn)RG)提供。它是按照常規(guī)方法用亞氯酸鹽使鋸木去木質化，然后用DMSO提取半纖維素后從Norwegian Bruce(Picia abes)中分離的。在DEAE瓊脂糖凝膠柱上經(jīng)陰離子交換層析分離所提取的多糖，并收集含甘露聚糖的部分。
乙?；哪揪厶前凑諈⒖嘉墨I6(Kormelink ＆Vorageh)中所述方法經(jīng)蒸汽提取樺木產(chǎn)生水溶性多糖，得到作為其不可透析部分的乙?；揪厶?。其中含有70.6％總糖和10.6％乙酰基(基于干燥物質)。
按照改進的Laemli方法〔16〕，在Mini—LeaK4電泳。按照廠商提供的說明書用Multiphor電泳單元在屬性電解質PAG平板(pH3.5～9.5)(Pharmacia，Sweden)上進行等電聚膠?；旧习次墨I〔11〕中所述方法進行銀染色或考馬斯蘭染色。
pI的測定按照廠商提供的說明書在pharmacia兩性電解質PAG平板(pH3.5～9.5)上電泳檢測等遇點。電泳后按下述方法對凝膠進行銀染色。
蛋白質檢測法使用BioRad蛋白質檢測法。
最適pH的檢測用PNP—乙酸酯將純化的酶(2～5μg)與2mMPNP—乙酸酯在有不同pH的50mM檸檬酸鹽—磷酸鹽緩沖液中保溫。保溫25分鐘后，在0.2MTris(pH7.0)中檢測OD405nm以定量PNP釋放。對照樣品含有PNP—乙酸酯的緩沖液，但不含酶，從含酶樣品中減去在這些樣品中測得的吸光率。
用乙?；嗵菫榱藱z測酶對乙?；嗵堑幕钚裕瑢悠放c1％底物溶液在0.1M有不同pH的檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液中保溫，保溫30分鐘用Boehriger Nannheim檢測法檢測所釋放的乙酸酯。保溫沒有酶的對照樣品，并從含酶樣品測得的數(shù)值中減去對照樣品數(shù)值。
氨基酸序列測定按上述方法在SDS—PAGE中對純化的酶進行電泳分離并使用標準方法電轉印到PVDF膜(Immobillon，Milipore，USA)上。按照制造廠商的說明書在AppliedBiosystms473A測序儀上對電轉印之蛋白質的N末端氨基酸進行序列測定。
MRNA制備從按上述方法生長的CBS101.43中分離的RNA；其中所說的菌株經(jīng)培養(yǎng)3—5天后收獲菌緣體，直接在液氮中冷凍并保存于-80℃。
在大腸桿菌中構建棘孢曲霉cDNA文庫基本上按WO92/19728中所述方法進行，該文獻的內(nèi)容摻入本文作為參考。更具體地說，使用Boel等人(EMBO J，31097—1102，1984)和Chirgwin等人(Biochemistry(Wash)，185294—5299，1979)所述方法，從勻漿化的棘孢曲霉菌緣體中提取總RNA。在Oligo(dT)纖維素柱中按Aviv和Leder(PNAS，USA691408—1412，1972)所述方法經(jīng)兩次親和層析循環(huán)得到含poly(A)的RNA。使用Invitrogen的cDNA合成藥盒，按廠商所述方法合成cDNA。
棘孢曲霉乙酰酯酶特異性cDNA重組體的鑒定使用基于已確定的乙酰酯酶的氨基酸序列而制備的合成的寡脫氧核苷酸；或使用免疫學篩選方法進行鑒定。這些方法已在WO92/19728中詳述。
曲霉屬表達載體的構建可將按上述方法制得的DNA序列插入WO92/19728中所述的表達載體pHD414中完成這一構建?？砂凑找阎椒ㄔ诖竽c桿菌中擴增所得表達質粒，然后按照下述一般方法轉化到米曲霉或黑曲霉中。
米曲霉或黑曲霉的轉化(一般方法)用米曲霉或黑曲霉的孢子接種100mlYPD(Sherman et al，Metgods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，1981)，并于37℃振蕩約2天。通過纖細濾布過濾以收獲菌絲體并用200ml 0.6M Mg洗。將菌絲體懸浮在15ml 1.2M MgSO4，10mMNaH2PO4(pH＝5.8)中。在冰上冷卻懸液并加入1ml含有120mg NovozymR234(批號1687)的緩沖液中。5分鐘后加入1ml12mg/mlBSA(Sigma type H25)并在37℃和輕輕攪拌下持續(xù)保溫1.5～2.5小時，直到在顯微鏡下觀察到樣品中的大量原生質體。
通過纖細濾布過濾懸浮液，將濾液轉移到無菌管中并在其上覆蓋5ml 0.6M山梨醇，100mM Tris—HCI(pH7.0)。100g離心15分鐘并從MgSO4墊層的頂部收集原生質體。向原生質體懸液中加入2體積STC(1.2M山梨醇、10mM Tris—HCI，pH7.5，10mMCaCl2)并將混合物以1000g離心5分鐘。將原生物體沉淀物重新懸浮在3mlSTC中并再次離心沉降之。重復這一處理過程。最后將原生質體重新懸浮在0.2—1mlSTC中。
將100μl原生質體懸液與5—25mg適當?shù)腄NA在10μSTC中混合。將原生質體與p3SR2(攜帶構巢曲霉amds基因的質粒)混合。將混合物于室溫下放置25分鐘。加入0.2ml 60％PEC 4000(BDH29576)、10mM CaCl2和10mM Tris—HCI(pH7.5)并小心混合之(兩次)，最后加入0.85ml同樣溶液并小心混合之。將混合物于室溫放置25分鐘，以2500g離心15分鐘并將沉淀物重新懸浮在2ml 1.2mM山梨醇中。再一次沉降后將原生質體散布在適當?shù)钠桨迳?。將原生質體散布在含有1.0M蔗糖(pH7.0)、10mM乙酰胺(作為氮源)及20mMCsCl的基本平板(Cove Biochem，Biophys.Acta 113 51—56(1966))上，以抑制本底生長。37℃保溫2—7天后挑取孢子并散布單個菌落的孢子。重復該程序并在第二次再分離后儲存單個菌落的孢子作為限定的轉化體。
免疫學交叉反應性可以使用純化的乙酰酯酶制備用于檢測免疫學交叉反應性的抗體。更具體地說，可按照N.Axelsen等人(A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis，BlackwellSeieutific Publications，1973，Chapter23)或A.Johnstone和R.Thorpe(Immunochencistry in Practice，Blackwell ScientificPublicationw，1982，具體參見PP.27—31)所述的方法產(chǎn)生抗本發(fā)明的酶的抗血清。例如可經(jīng)鹽沉淀((NH4)2SO4)，然后透析并進行離子交換層析(例如使用DEAE—Sephadex柱)從抗血清中制得純化的免疫球蛋白?？捎肙utcherlony雙擴散分析法(O.Ouchterlony，Handbook of Exparimental Immunology(D.M.Weir，Ed)，Blackwell Scientific Publications，1967，PP.655—706)、交叉免疫電泳法(N.Axelsen et al，文獻同上，chapter3and4)，或火箭免疫電泳法(N.Axelsen et al，chapter2)對該蛋白質進行免疫化學性質鑒定。
實施例1純化按圖1中所示程序純化乙酰酯酶。
初步純化在帶有10KDa濾膜的200ml Amicon池中超濾100ml按上述方法制得的棘孢曲霉上清液。用調(diào)到終體積50ml的20mM TrispH7.8將保留物稀釋10倍，并以4ml/分鐘的流速加樣到于20mM Tris(pH7.0)中的250mlDEAE柱(50mm內(nèi)徑)上。用0.1至0.4MNacl的線性梯度徑200分鐘洗脫結合的蛋白質，收集10ml洗脫部分并檢測PNP—乙酰酯酶活性。洗脫一個如圖1中所表明的PNP—乙酰酯酶活性的峰(集合物I)。
向集合物I中加入硫酸銨(AMS)至終濃度2M，并將所得混合物以2ml/分鐘的流速加樣到在50mM tris(pH6.5)；2MAMS中的60ml苯基瓊脂糖柱(26mm內(nèi)徑)上。用降低AMS濃度的步驟梯度(第步驟降低0.5MAMS)洗脫結合的蛋白質，并將DEAE集合物分離成兩個不同的活性峰(集合物I.I和集合物I.II)。
在加于0.25M乙酸銨(pH5.5)中的500mlSuperdex 6.75柱(26mm內(nèi)徑)上，以1ml/分鐘的流速經(jīng)凝膠過濾純化從苯基瓊脂糖(Phenyl Sepharose)柱上得到的集合物。收集10ml部分并使用上述方法檢測PNP—乙酰酯酶活性。
最終純化合部分純化之乙酰酯酶的部分集合物I.I(乙酰酯酶I)將該活性集合物超濾到10mM磷酸鈉(pH6.8)中，并以1ml/分鐘的恒定流速加于8mlBiorad HTP羥基磷灰石柱(10mm內(nèi)徑)上。在30分鐘內(nèi)用線性漸增到0.5M的磷酸鹽濃度洗脫結合的蛋白質。收集每管5ml，并檢測PNP—乙酰酯酶活性和蛋白質含量(使用SDS—PAGE和蛋白質檢測法)。如用上述SDS—PAGE法測得的，純化的酶具有44KDa的分子量。純化的酶沒有顯示出對乙?；哪揪厶?、甘露聚糖或半乳糖醛酸—鼠李聚糖的任何活性。
集合物I.II(乙酰酯酶II)凝膠過濾后，得到對乙?；事毒厶呛湍揪厶嵌加谢钚缘牟糠帧⒃摬糠殖瑸V到10mM磷酸鈉(pH6.8)中并以1ml/分鐘的恒定流速加到8mlBiopad HTP羥基磷灰石柱(10mm內(nèi)徑)上。在30分鐘內(nèi)用線性漸增到0.5M濃度的磷酸鹽洗脫結合的蛋白質。收集5ml一管并檢測PNP—乙?！ッ富钚约暗鞍踪|含量(SDS—PAGE和蛋白質檢測法)?；厥諆蓚€部分中的活性，兩者均含有42KDa蛋白質和35KDa蛋白質。推測42KDa蛋白質是PCT/DK93/00445中所述的多聚半乳糖醛酸酶I將最后洗脫的部分超濾到25mM Tris(pH8.0)中并以1ml/分鐘的流速加于1mlmono—P柱上。在60分鐘期間內(nèi)以220至0.5M Nacl的漸增的線性Nacl梯度洗脫結合的蛋白質。第管收集2ml并檢測PNP—乙酰酯酶活性和蛋白質含量(SDS—PAGE和蛋白質檢測法)。有活性的部分含有對乙?；事逗湍揪厶蔷谢钚缘囊环N35KDa蛋白質。
在下表中，列出了上述純化程序中得到的棘孢曲霉乙酰酯酶的純度系數(shù)和活性。顯示出了從純化過程中選擇的部分，以及最終純化的酶部分。PNP—乙酰酯酶活性的回收率為0.8％。用上文給出的方法檢測乙酰酯酶活性。
實施例2本發(fā)明的純化的乙酰酯酶的特征鑒定使用上文材料和方法部分中所述程序確定按實施例1中所述方法制得的純化的乙酰酯酶的最適pH。
當使用PNP—乙酸酯作為底物進行檢測時，發(fā)現(xiàn)從集合物I.I分離的(并具有44KDa表現(xiàn)分子量)的乙酰酯酶的最適pH為7.0—7.5。發(fā)現(xiàn)該酶在從pH5.0到pH9.0的條件下均是有活性的。pH曲線示于圖3中。
使用PNP—乙酸酯作為底物，發(fā)現(xiàn)從集合物I.II中分離的乙酰酯酶有6.0的小的最適pH和7—8的大的最適pH。但這種在堿性pH時的高活性可能是因為在中性pH以上底物的不穩(wěn)定性而人為造成的。使用乙?；事毒厶呛湍揪厶亲鳛榈孜飼r，測得一個寬的最適pH，且峰值在6.0。pH曲線示于圖4中。
使用上文材料和方法部分所述程序測定兩種酶的等電點。結果示于圖5中。
使用上文材料和方法部分中所述步驟測定兩種酶的N末端氨基酸序列。
實施例3經(jīng)聚合酶鏈反應產(chǎn)生cDNA探針為了得到用于棘孢曲霉之乙酰酯酶的cDNA探針，經(jīng)在多義位置摻入脫氧肌苷而合成相應于純化的乙酰酯酶I之NH2末端序列中某一區(qū)域的簡并寡核苷酸(引物AE1.1/P3；p3r—5′—TTYGAYTGGGAYWSIAC—3′)。使用有同向(引物#22，5′—CTGTAATACGACTCACTA—3′)和反向(引物#172，5′—GGGCGTGAATGTAAGCGTGAC—3′)pYES2.0引物配對的引物，利用聚合酶鏈反應技術(Ohara et ai，1989)從含有7000個克隆的擴增的cDNA文庫集合物擴增靶乙酰酯酶cDNA。使用DNA熱循環(huán)和2.5單位Tag聚合酶(Perkin—Elmer，Cetus)，在含有550pmol有意義引物(AE1.1/P3)和各100pmol反義引物(見上文)，1Mg模板DNA(Qiagen純化的質粒DNA)和各200μMdNTP的100μlPCR緩沖液(10mM Tris—HCl，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01％，Perkin—Elmer，Cetus)中進行PCR反應。使用在94℃變性1分鐘、55℃退火2分鐘，和72℃延伸3分鐘的循環(huán)方式進行30次PCR循環(huán)。
在1％瓊脂糖凝膠上電泳分析10μl等分的擴增產(chǎn)物，用一個引物對(AE1.1/P3；PYES反向引物#172)揭示出1.5Kb和1.0Kb產(chǎn)物。從凝膠上切下感興趣的DNA片段，使用D—0405型不封口透析管(Sigma)經(jīng)電洗脫(Sambrook et al，1989)回收，然后用苯酚提取并于-20℃下用乙醇沉淀12小時。在含有各50μmdNTP和3單位T4DNA聚合酶(New England Biolabs)的20μl緩沖液(20mMKAC，1mMDTT)中，于370℃將PCR產(chǎn)物處理10分鐘以將其末端填平。于70℃保溫5分鐘以終止反應，在冰上冷卻5分鐘并稀釋在50μl激酶緩沖液(70mM Tris—HCI，pH7.6，10mMMgCL2，5mMDTT)中，然后用T4多核等酸激酶(10V，New England Bioabs)和1mMATPpH7.0(Pharmacia)于37℃磷酸化30分鐘，用苯酚提取，乙醇沉淀，并于16℃處理12小時連接到Smai切割的，去磷酸化pUC18載體上(每次連接50ng，Pharmacia)。
使用5μl連接混合物轉化大腸桿菌DH52成為氨芐青霉素抗性菌株(Hanahan，1985)，經(jīng)分離質粒極微制劑DNA(Sambrooket al.1989)并用ECORI/HindIII酶切質粒亞克隆，然后用通用的pUC引物測定來自一個亞克隆(pAE8.1.1)的1.5Kb插入段之末端的序列(Sanger et ai，1977)分析10個克隆。對pCIAEI亞克隆的核苷酸序列分析揭示出一個獨特的開放讀碼，其除了引物編碼的氨基酸外，還含有與純化的乙酰酯酶I的可利用的NH2末端序列并存的附加殘基。
編碼棘孢曲霉之乙酰酯酶的全長cDNA的分離和特性鑒定為了分離乙酰酯酶的全長度cDNA克隆，將cDNA文庫集合物#22的集落鋪敷在含有氨芐青霉素(100μg/ml)的LB瓊脂平板(24×24cm平板，Nunc)上，并復制到用尼龍濾膜(Hybond—N，Amersham)包被動的LB＋amp一平板上。按上述隨機引導對純化的1.5Kb乙酰酯酶PCR片段進行32P標記，并用作以集落雜交法(Sambrook et al，1989)篩選文庫集合物的探針。雜交在含2.5ng/ml探針的2×SSC(Sambrook et al，1989)，5XDenhardt氏溶液(Sambrook et al，1989)，1％SDS和100μg/ml變性的鮭精子DNA中于65℃進行16小時，然后在2×SSC(2×15分鐘)，0.2×SSC、1％SDS(2×30分鐘)，及2×SSC(2×15分鐘)中進行并于-80℃放射自顯影12小時。篩選集合物22中的10,000個集落得到10個推測可能的乙酰酯酶IcDNA克隆，經(jīng)兩次以上的雜交循環(huán)對其進行集落純化。經(jīng)用HindIII和XbaI消化質粒并用正向和反向pYES2.0多接頭引物測定1.4KbcDNA插入段的末端序列鑒定出其中一個克隆(定名為pCIAE)。
PCIAE1中的1.4Kb插入段含有以核等酸位置33處的ATG密碼子超始，并以TGA終止密碼子終止的1019bp開放讀碼(OPF)(SEQ ID NO.4)。SEQ ID NO.4顯示乙酰酯酶cDNA之3′末端的核苷酸序列，且SEQ ID NO.5顯示推測的預期與乙酰酯酶I高度同源的棘孢曲霉之乙酰酯酶的一級結構。ORF前面是39bp5′非編碼區(qū)，而后面則是132bp3′非編碼區(qū)和poly(A)尾部。將推測的蛋白質序列與純化之成熟乙酰酯酶I的NH2末端序列相比較，揭示出該cDNA編碼含27殘基信號肽和可能的前肽的前體蛋白質。
實施例4為了在曲霉屬中表達該酶，經(jīng)用HindIII/XbaI或其他適當?shù)南拗泼赶?，在凝膠上按大小分級分離并純化而分離出各家族的一個或多個有代表性的cDNA，然后連接到pHD414上。在大腸桿菌中擴增后，按上述的一般程序將質粒轉化到米曲霉或黑曲霉中。
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序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱NOVO NORDISK A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)國家DENMARK(F)郵編(ZIP)DK-2880(G)電話+45 44448888(H)傳真+45 4449 3256(I)電傳37304(ii)發(fā)明名稱有乙酰酯酶活性的酶(iii)序列數(shù)目5(iv)計算機可讀形式(A)媒介類型Floppy disk(B)計算機IBM PC compatible(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息
(i)序列特征(A)長度9氨基酸(B)類型氨基酸(C)股型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iii)反意義無(v)片段類型內(nèi)部(vi)最初來源(A)生物體Aspergillus aculeatus(xi)序列描述SEQ ID NO1Ile Xaa Phe Gly Asp Xaa Tyr Tyr Thrl 5(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度21氨基酸(B)類型氨基酸(C)股型單股
(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(v)片段類型內(nèi)部(vi)初始來源(A)生物體Aspergillus aculeatus(xi)序列描述SEQ ID NO2Phe Asp Trp Asp Ser Thr Lys Tyr Leu Leu Ile Ala Phe Gly Asp Ser1 5 10 15Tyr Tyr Thr Val Gln20(2)SEQ ID NO3的特征(i)序列特征(A)長度17氨基酸(B)類型氨基酸(C)股型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iii)反意義無
(v)片段類型內(nèi)部(vi)初始來源(A)生物體Aspergillus aculeatus(xi)序列描述SEQ ID NO3Thr Thr Lys Tyr Val Ile Ser Phe Gly Asp Asp Tyr Tyr Thr Thr Xaa1 5 10 15Phe(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度1315堿基對(B)類型核酸(C)股型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬無(iii)反意義無(v)片段類型內(nèi)部(vi)初始來源
(A)生物體Aspergillus aculeatus(xi)序列描述SEQ ID NO4GAATTCCAGG GACTTCCATT CGAGCCATAG CCATGCTCGC TCTCTGGCAG TGCCTAGCCC 60TCGCGGCCAT CCCTACAGTA TCAGCATTCC CCTCCGGTTC GTCTCAGAAG GCGTTCGACT 120GGGACTCGAC GAAATACCTA ATAGCGTTCG GTGATTCCTA TACGTACGTG CAGGGCACTC 180ACGGACACCA AAACTATAGC TTCATTGGGG ATCTGCAGAA CTTCGCATAT GATGCTCAGA 240CCCTGTTAAC GGATAAGATC GTTCAGAACC AGACAGCAAC GGCAGAAGGG GGCCCCAACT 300GGGTTGAATA CCTCACCGGG TGCGGGGTAG AAGATGGAAT CATCTCACCC TTGGACTGCG 360AGAGACAACT CTGGGACTTC GCGTTCGCGG GATCTGATAT CTCCGTTGCA TACACCCCCC 420TCCACCACAA CTACACCGTC TCCCTCGTCA ACCAGGTCAN CCAATTCACG ACCTACGGGC 480AGCCGGTCCT CTCGCGGCAC ATCTCCGCGC CGCAGACCCT TGTCGCCATC TGGATCGGGA 540TCAACGACAT CGGCGACAGC GCCAAATACG CCGTCGATTT TCCGGCCTTC TACGAAACCC 600TCATCACCAC CCTCTTCGCC TCCGTCCAGG AGATCTACGC CCAGGGCTAT CGCTCCTACC 660TGTTCGTCAA CCTGCCGCCC CTCGACCGCA CCCCGGNCAA CCAGGCCCTG AGCCAGCCCT 720ACCCGAACGC CACGCAGGTC GCCTGGTACA ACGACGCGCT GGCCCGGAAC GCCGCCGCCT 780TCCACCGCAA CCACACGGAC ACGGCCGTGC ACCTGTTNGA CGCGCACCGG ACGCTCAGCG 840AGGTCATGGA CCACCCCGCG GCGTACGGCA TCGTCAACAC CACCAACTTC TGCCCCGGGT 900ACGACCAGCC CGATATCGCG TGGAACTACC GGGCGTACGG GTGTCCGACC CCGCTGGAGG 960AGTACTTCTG GTTCAACTCG GGGCATCTGA CGAGCCATGT GCATCAGATT CTTGCGGGTG1020TGTTGGAGGG GGAGCTGAGA GAGTGGTCGA AGTGAGGGTG GTCTGTCGTT GATTGGAGGC1080GTGGTGGGGG GAACTCATTG ATGATCCAGT GGGAATACGT CAGCTCCAAA CTATGCTTTG1140TACGCTTCAG TTTAGACTGA CGCAGGTAAG ACTCCGTAGC ATGATTCATC ACAACAATCC1200CGGACCTGCA TGCATTTAAG TTGGGTGTAT ACCACTGGTA TCTGCTTGTT ACTCCTCGTA1260TATGTCAACC ATATGAGAAG TCAAATATGC CATCGCGTGA AAAAAAAAAA AAAAA 1315(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度240氨基酸(B)類型氨基酸(C)股型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假擬無(iii)反意義無(v)片段類型N豐端(vi)最初來源(A)生物體Aspergillus aculeatus(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Leu Ala Leu Trp Gln Cys Leu Ala Leu Ala Ala Ile Pro Thr Val1 5 10 15Ser Ala Phe Pro Ser Gly Ser Ser Gln Lys Ala Phe Asp Trp Asp Ser20 25 30Thr Lys Tyr Leu Ile Ala Phe Gly Asp Ser Tyr Thr Tyr Val Gln Gly35 40 45Thr His Gly His Gln Asn Tyr Ser Phe Ile Gly Asp Leu Gln Asn Phe50 55 60Ala Tyr Asp Ala Gln Thr Leu Leu Thr Asp Lys Ile Val Gln Asn Gln65 70 75 80Thr Ala Thr Ala Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Glu Tyr Leu Thr Gly85 90 95Cys Gly Val Glu Asp Gly Ile Ile Ser Pro Leu Asp Cys Glu Arg Gln100 105 110Leu Trp Asp Phe Ala Phe Ala Gly Ser Asp Ile Ser Val Ala Tyr Thr115 120 125Pro Leu His His Asn Tyr Thr Val Ser Leu Val Asn Gln Val Xaa Gln130 135 140Phe Thr Thr Tyr Gly Gln Pro Val Leu Ser Arg His Ile Ser Ala Pro145 150 155 160Gln Thr Leu Val Ala Ile Trp Ile Gly Ile Asn Asp Ile Gly Asp Ser165 170 175Ala Lys Tyr Ala Val Asp Phe Pro Ala Phe Tyr Glu Thr Leu Ile Thr180 185 190Thr Leu Phe Ala Ser Val Gln Glu Ile Tyr Ala Gln Gly Tyr Arg Ser195 200 205Tyr Leu Phe Val Asn Leu Pro Pro Leu Asp Arg Thr Pro Xaa Asn Gln210 215 220Ala Leu Ser Gln Pro Tyr Pro Asn Ala Thr Gln Val Ala Trp Tyr Asn225 230 235 240Asp Ala Leu Ala Arg Asn Ala Ala Ala Phe His Arg Asn His Thr Asp245 250 255Thr Ala Val His Leu Xaa Asp Ala His Arg Thr Leu Ser Glu Val Met260 265 270Asp His Pro Ala Ala Tyr Gly Ile Val Asn Thr Thr Asn Phe Cys Pro275 280 285Gly Tyr Asp Gln Pro Asp Ile Ala Trp Ash Tyr Arg Ala Tyr Gly Cys290 295 300Pro Thr Pro Leu Glu Glu Tyr Phe Trp Phe Asn Ser Gly His Leu Thr305 310 315 320Ser His Val His Gln Ile Leu Ala Gly Val Leu Glu Gly Glu Leu Arg325 330 335Glu Trp Ser Lys340
權利要求
1.具有乙酰酯酶活性的酶，該酶包含SEQ ID NO.1中所示的氨基酸序列，式中X代表任何氨基酸殘基。
2.具有乙酰酯酶活性的酶，該酶對乙?；哪揪厶呛鸵阴；母事毒厶潜憩F(xiàn)有活性。
3.具有乙酰酯酶活性的酶，該酶是由包含SEQ ID NO.4中所示的DNA序列的DNA構建體編碼的。
4.具有乙酰酯酶活性的酶，該酶與抗衍生于棘孢曲霉CBS101，43之純化的乙酰酯酶的抗體有免疫反應性，并且有大約44或35KDa的分子量。
5.根據(jù)權利要求1、3或4中任一項的酶，該酶包含SEQ IDNO.2中所示的N末端氨基酸序列。
6.根據(jù)權利要求5的酶，其具有大約44KDa的分子量，6.0—9.0范圍內(nèi)的最適pH，和/或4.4—5.1范圍內(nèi)的pI。
7.根據(jù)權利要求1、2或4中任一項的酶，該酶包含SEQ IDNO.3中所示的N末端氨基酸序列，式中X代表任何氨基酸殘基。
8.根據(jù)權利要求7的酶，其中N末端氨基酸序列的X是T。
9.根據(jù)權利要求1—8中任一項的酶，其可從曲霉屬的菌株，特別是棘孢曲霉或黑曲霉，木霉屬的菌株，特別是T.harzianum，鐮孢霉屬的菌株，特別是尖鐮孢或酵母屬的菌株，特別是釀酒酵母。
10.根據(jù)權利要求9的酶，其為由分離自棘孢曲霉CBS101，43之DNA文庫的DNA序列編碼。
11.包含編碼根據(jù)權利要求1—10中任一項之酶的DNA序列的重組表達載體。
12.包含根據(jù)權利要求11之重組表達載體的細胞。
13.根據(jù)權利要求12的細胞，其為真核細胞，特別是真菌細胞，如酵母細胞或絲狀真菌細胞。
14.根據(jù)權利要求13的細胞，其中細胞屬于曲霉屬的菌株，特別是黑曲霉或米曲霉的菌株。
15.生產(chǎn)具有乙酰酯酶活性之酶的方法，該方法包括在允許產(chǎn)生酶的條件下培養(yǎng)根據(jù)權利要求12—14中任一項的細胞，并從培養(yǎng)物中回收酶。
16.用于處理植物細胞壁成分的酶制劑，所說的制劑富含根據(jù)權利要求1—10之任一項的有乙酰酯酶活性的酶。
17.根據(jù)權利要求16的制劑，其另外包含木聚糖酶、甘露聚糖酶、果膠溶解酶、半乳糖醛酸—鼠李聚糖酶、多聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、藥聚糖酶、果膠甲基酯酶或這些酶的任何組合。
18.根據(jù)權利要求1—10中任一項的酶或根據(jù)權利要求17的酶制劑用于降解或修飾植物材料。
19.根據(jù)權利要求18的應用，用于降解或修飾乙?；哪揪厶呛?或乙?；母事毒厶?。
20.根據(jù)權利要求18或19的應用，用于制備紙和紙漿、飼料或食品。
全文摘要
具有乙酰酯酶活性的酶，該酶包括氨基酸序列IxFGDxYYT，其中x代表任何氨基酸殘基。該酶對乙?；哪揪厶呛鸵阴；母事毒厶潜憩F(xiàn)有活性，并可用于修飾或降解含植物材料。
文檔編號C12N15/55GK1127012SQ9419276
公開日1996年7月17日 申請日期1994年7月13日 優(yōu)先權日1993年7月13日
發(fā)明者S·克里斯戈, T·桑德爾, M·S·考平恩, T·霍凱爾, H·達爾博格 申請人:諾沃挪第克公司