專(zhuān)利名稱(chēng)：糖組分的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖組分，如寡糖、多糖、糖脂和糖蛋白的制備方法。
背景技術(shù)：
“碳水化合物”一詞包括通式為(CH2O)n的一大批化學(xué)物質(zhì)，如單糖、二糖、寡糖和多糖。寡糖是由糖單位組成的鏈，即通常所知的糖類(lèi)。這些糖單位可以任何順序排列，二個(gè)糖單位之間大約有10種連接方式。因此，各種可能的寡糖立體異構(gòu)體鏈的數(shù)目是龐大的。
在所有生物聚合物家族中，對(duì)寡糖和多糖研究得最不充分，這部分原因是由于對(duì)其常常復(fù)合糖鏈的測(cè)序與合成均十分困難。盡管合成寡核苷酸和多肽的技術(shù)已發(fā)展得很完善，但迄今仍沒(méi)有一種通用的合成寡糖的技術(shù)。
理論上已形成了大量的合成碳水化合物的傳統(tǒng)技術(shù)，但這些技術(shù)均存在需要選擇性保護(hù)與去保護(hù)的困難，迄今只獲得了非常有限的結(jié)果。寡糖的有機(jī)合成因許多糖苷鍵的不穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)區(qū)域選擇性糖偶聯(lián)的困難，以及通常合成產(chǎn)率低而進(jìn)一步受阻。加之分離、純化碳水化合物以及分析它們的結(jié)構(gòu)等的困難，使寡糖的有機(jī)合成成為一個(gè)極為苛刻的化學(xué)領(lǐng)域。
對(duì)于碳水化合物以及包含碳水化合物片段的分子如糖脂和糖蛋白已進(jìn)行了深入的研究。研究興趣集中在這些組成成分主要是由于認(rèn)識(shí)到蛋白質(zhì)與碳水化合物互作是一系列生物識(shí)別過(guò)程，包括受精、分子標(biāo)記、細(xì)胞間識(shí)別以及病毒、細(xì)菌、真菌的致病原因。目前普遍認(rèn)識(shí)到糖蛋白和糖脂的寡糖部分介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與配體、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)、及細(xì)胞與病原體之間的識(shí)別。
這些識(shí)別現(xiàn)象可能會(huì)受到寡糖的抑制，這些寡糖同參與細(xì)胞識(shí)別的糖蛋白或糖脂的活性部位具有相同的糖順序和立體化學(xué)結(jié)構(gòu)。它們可能與糖蛋白及糖脂競(jìng)爭(zhēng)受體蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)。例如，二糖半乳糖苷β1-4N-乙酰葡糖胺是糖蛋白的組成成分之一。這種糖蛋白與肝細(xì)胞的原生質(zhì)體膜中的受體互作。由于寡糖和其它的糖組分同那些對(duì)細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)有潛在危害的組成成分競(jìng)爭(zhēng)，所以它們?cè)谠\斷醫(yī)學(xué)、藥理學(xué)以及治療方面具有開(kāi)辟新的領(lǐng)域的潛力。
如上所述，由于尚未找到合成寡糖的方法，在測(cè)試作為人類(lèi)或動(dòng)物疾病治療劑的寡糖方面的努力一直相對(duì)較少。少數(shù)小片段寡糖類(lèi)型可用有機(jī)化學(xué)方法委托合成，但這類(lèi)化合物的成本極高。此外，寡糖的立體有擇合成很困難，有些糖如唾液酸和巖藻糖等由于其化學(xué)鍵極為不穩(wěn)定而尚未完成其加成。因此，需要改良的，普遍適用的寡糖合成方法以便生產(chǎn)大量的不同類(lèi)型的具有治療用途的寡糖。
對(duì)于某些應(yīng)用場(chǎng)合，酶法已經(jīng)作為眾多傳統(tǒng)技術(shù)中一種可供選擇的方法用于有機(jī)合成。例如，酶在有機(jī)合成中作為催化劑，此處酶促合成反應(yīng)在加快反應(yīng)速度和立體選擇性方面的作用已得到證實(shí)。另外，目前已獲得了低成本生產(chǎn)一些酶和改變其特性的技術(shù)。
糖基轉(zhuǎn)移酶以分步方式催化活化糖(供體NDP-糖)加到蛋白、糖蛋白、脂類(lèi)、糖脂或延伸的寡糖的非還原性末端上的加成反應(yīng)。氮連接的糖蛋白經(jīng)由轉(zhuǎn)移酶和脂連接的寡糖供體[Dol-PP-NAG2Glc3Man9]全體轉(zhuǎn)移進(jìn)而修飾核心來(lái)合成。在這種情況下，核心糖的屬性同隨后的連接部分稍有不同。碳水化合物合成中需要大量的糖基轉(zhuǎn)移酶。每種供體NDP-糖殘基需要一類(lèi)截然不同的糖基轉(zhuǎn)移酶，到目前為止所鑒定的每100種以上的糖基轉(zhuǎn)移酶催化一個(gè)特定的糖苷鍵的形成。迄今，關(guān)于糖基轉(zhuǎn)移酶特異性的細(xì)節(jié)尚不清楚，如還不知道大多數(shù)糖基轉(zhuǎn)移酶識(shí)別碳水化合物的什么序列。
糖基轉(zhuǎn)移酶在許多脊椎動(dòng)物體液中以可溶性形式存在，但它們?cè)诩?xì)胞中通常以膜結(jié)合形式存在。迄今為止許多關(guān)于膜結(jié)合酶的研究認(rèn)為其為內(nèi)在蛋白；即，它們不能經(jīng)聲處理從膜中釋放出來(lái)，而需要用去污劑溶解。1971年以前，由于在大鼠的肝臟中發(fā)現(xiàn)了糖基轉(zhuǎn)移酶活性，所以一般認(rèn)為它們位于細(xì)胞內(nèi)高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。從那時(shí)起，人們認(rèn)為表面糖基轉(zhuǎn)移酶位于脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的表面，還認(rèn)識(shí)到這些表面轉(zhuǎn)移酶在生理?xiàng)l件下保持催化活性。但細(xì)胞表面糖基轉(zhuǎn)移酶的識(shí)別功能是細(xì)胞間識(shí)別。(Roth，Molecular Ap-proaches to Supracellular Phenomena，1990)。
表達(dá)細(xì)胞表面糖基轉(zhuǎn)移酶活性的細(xì)胞已得到鑒定。Cerven曾報(bào)道，作為唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性源，進(jìn)入瑞士小白鼠的完整艾氏腹水癌細(xì)胞的表面具有這種活性。Bernacki也曾測(cè)定了完整白血病L-1210細(xì)胞的內(nèi)源唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性。關(guān)于細(xì)胞表面糖基轉(zhuǎn)移酶活性的進(jìn)展，詳見(jiàn)Pierce等人的文章International Review of Cytology，651-44，1980)。
在其它情況下已經(jīng)認(rèn)識(shí)到有些糖基轉(zhuǎn)移酶，特別是那些與膜結(jié)合者，需要有附加蛋白的存在才能表達(dá)轉(zhuǎn)移酶活性(Kelleher，D.J.等人，細(xì)胞，6955-65，1992)。
此外，已經(jīng)建立了改變細(xì)胞表達(dá)的糖基轉(zhuǎn)移酶的方法。Larson等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，868227-8231(1989))報(bào)道了一種分離克隆的cDNA序列的遺傳方法，這種cDNA序列能決定細(xì)胞表面寡糖結(jié)構(gòu)及其相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。從已知表達(dá)UDP-半乳糖β-D-半乳糖苷-1，4-N-乙酰-D-氨基葡糖苷α-1，3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的小鼠細(xì)胞系中分離mRNA生成cDNA文庫(kù)，將后者轉(zhuǎn)染到CDS-1細(xì)胞中。然后培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并測(cè)定其1-3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性。
Paulson等人(美國(guó)專(zhuān)利5,032,519)公開(kāi)了一種生產(chǎn)分泌性糖基轉(zhuǎn)移酶的方法。按照這一方法，真核細(xì)胞除表達(dá)內(nèi)源高爾基體結(jié)合體形式的酶以外，還表達(dá)經(jīng)遺傳改變的可溶形式的糖基轉(zhuǎn)移酶。但這一方法僅限于真核細(xì)胞系統(tǒng)。
Francisco等人在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，892713-2717(1992)著文中公開(kāi)了β-內(nèi)酰胺酶固著于大腸桿菌外表面的方法。產(chǎn)生一種由(i)外膜蛋白信號(hào)序列，(ii)外膜蛋白的跨膜區(qū)和(iii)完整成熟的β-內(nèi)酰胺酶序列組成的三元融合體，由此得到活性表面結(jié)合的β-內(nèi)酰胺酶分子。但Francisco的方法僅限于原核細(xì)胞系統(tǒng)，并且作者認(rèn)識(shí)到只有當(dāng)融合體的三個(gè)組成成分完整時(shí)才具有適宜的功能。這種細(xì)菌三元融合體由于細(xì)胞產(chǎn)生長(zhǎng)融合蛋白的極其沉重負(fù)擔(dān)而降低了細(xì)胞效率并減緩了細(xì)胞生長(zhǎng)，因而不適于工業(yè)化生產(chǎn)。融合蛋白構(gòu)建的生產(chǎn)是反方向生產(chǎn)的。
盡管在修飾結(jié)合與非結(jié)合糖基轉(zhuǎn)移酶方面取得了一些進(jìn)展，但如此修飾的微生物的應(yīng)用一直是極為有限的。事實(shí)上，這些轉(zhuǎn)化細(xì)胞僅用于糖基化蛋白的轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)，在此之前僅得到非糖基化蛋白。
由于細(xì)胞外糖基轉(zhuǎn)移酶出現(xiàn)在細(xì)胞表面上，因此將這些糖基轉(zhuǎn)移酶活性用于人工合成方法是可行的。
本發(fā)明的公開(kāi)如上所述，本發(fā)明的目的之一是提供一種新的利用細(xì)胞表面結(jié)合的糖基轉(zhuǎn)移酶合成糖組分，包括寡糖的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種適合于合成本發(fā)明所說(shuō)的糖組分的生物反應(yīng)器，該反應(yīng)器包括至少一種細(xì)胞培養(yǎng)物(如果多于一種，則各自表達(dá)不同的糖基轉(zhuǎn)移酶)和分離糖組分的裝置。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種適合于合成本發(fā)明所說(shuō)的糖組分的生物反應(yīng)器，該反應(yīng)器包括至少一種細(xì)胞培養(yǎng)物，同結(jié)合的供體糖類(lèi)一起表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶。
發(fā)明者現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的及可從下文對(duì)本發(fā)明的描述中明顯看出的其它目的均由糖基轉(zhuǎn)移酶催化制備糖組分的方法得以實(shí)現(xiàn)，該方法是使預(yù)選的糖單位連續(xù)地結(jié)合到受體部分上，其中受體部分在至少一種細(xì)胞表面結(jié)合糖基轉(zhuǎn)移酶存在的條件下同至少一種供體糖接觸，細(xì)胞表面結(jié)合糖基轉(zhuǎn)移酶可特異地催化受體部分與供體糖的偶聯(lián)。受體部分是碳水化合物、糖蛋白或糖脂。當(dāng)受體部分是蛋白質(zhì)或脂時(shí)，最終產(chǎn)物是氧連接的糖蛋白或氧連接的糖脂。這一糖組分產(chǎn)物隨后可被分離并被選擇性地進(jìn)一步純化。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本文所用的“糖組分”一詞包括任何其結(jié)構(gòu)中含有糖單位的化學(xué)成份。糖、碳水化合物、糖類(lèi)、單糖、寡糖、多糖、糖蛋白和糖脂均為糖組分的實(shí)例。上述成份的混合物及溶液亦均為糖組分。
按照本發(fā)明，可提供一個(gè)能同預(yù)選的糖單位共價(jià)結(jié)合的受體部分。典型的受體部分包括蛋白質(zhì)，糖蛋白、脂類(lèi)、糖脂及碳水化合物如單糖、二糖、寡糖和/或多糖。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到優(yōu)選的受體部分作為相關(guān)糖組分的結(jié)構(gòu)成份存在。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和脂類(lèi)為受體時(shí)，將產(chǎn)生氧連接的糖蛋白或氧連接的糖脂。為了形成氮連接的糖蛋白，必須首先連接核心糖單位。例如在制備象N-乙酰神經(jīng)氨酸α2-3半乳糖苷β1-4N-乙酰葡萄糖胺的糖組分時(shí)，受體部分是N-乙酰葡萄糖胺和半乳糖苷β1-4N-乙酰葡萄糖胺。同樣可以看到，受體部分被糖單位封端時(shí)，隨后的糖單位一般共價(jià)結(jié)合于末端糖的非還原性末端上。
供體糖以核苷單磷酸或二磷酸糖的形式出現(xiàn)。在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中，下述8種單糖以這種形式被活化，產(chǎn)生大多數(shù)寡糖的結(jié)構(gòu)單元UDP-Glc，UDP-GlcUA，UDP-GlcNAc，UDP-Gal，UDP-GalNAc，GDP-Man，GDP-Fuc和CMP-NeuAc。
以其最簡(jiǎn)單的形式，本發(fā)明的方法用于在至少一種細(xì)胞培養(yǎng)物存在的條件下使受體和至少一種供體糖連在一起。當(dāng)使用一種以上的細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，每種細(xì)胞培養(yǎng)物可優(yōu)選帶有不同的細(xì)胞表面結(jié)合糖基轉(zhuǎn)移酶，后者能夠催化受體和一種供體糖的偶聯(lián)以及受體-供體糖復(fù)合體與第二種供體糖的偶聯(lián)。可以使用單一的供體糖，此時(shí)三糖是受體與兩個(gè)相同的供體糖單位結(jié)合的結(jié)果?？墒辜?xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)并不斷產(chǎn)生帶有膜結(jié)合的糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞。在有受體和兩種供體糖存在的情況下，可提供一種生產(chǎn)三糖的生物反應(yīng)器。
根據(jù)本方法所使用的細(xì)胞是在細(xì)胞表面表達(dá)能催化受體與供體部分反應(yīng)的相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞培養(yǎng)物。盡管細(xì)胞表面糖基轉(zhuǎn)移酶天然存在，但用基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞以表達(dá)相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶也是可能的。
轉(zhuǎn)染細(xì)胞可用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的方法獲得。例如，為了獲得轉(zhuǎn)染細(xì)胞，將含有天然的或修飾的編碼糖基轉(zhuǎn)移酶催化和跨膜區(qū)的序列的DNA，包括cDNA轉(zhuǎn)入自然條件下沒(méi)有相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的細(xì)胞中。那些已有相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶細(xì)胞表面表達(dá)的細(xì)胞也能用所需cDNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，從而獲得表面具有更高特異性的轉(zhuǎn)移酶活性的細(xì)胞。
在許多情況下已對(duì)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶基因的DNA(包括cDNA)進(jìn)行了分離與測(cè)序。已有關(guān)于牛酶和人類(lèi)酶中的編碼乳糖合成酶的基因的報(bào)道(Narimatsu et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，834720-24(1986)；Shaper et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，831573-77(1986)和Appert et al，Biochem.Biophys.Res.Comm.，139163-68(1986))。已報(bào)道的其它糖基轉(zhuǎn)移酶基因是兩種唾液酸轉(zhuǎn)移酶(Weinstein et al，J.Biol.Chem.，26217735-43(1987)；Wenet al.，J.Biol.Chem.，26721011-19(1992))，大鼠肝臟葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(Jackzon and Burcheli，Nuc.Acids Res.，14779-95(1986)；Mackonzie，J.Biol.Chem.，26114112-17(1986)，小鼠葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(Kimura and Owens，Eur.J.Biochem.，168515-21(1987))，人類(lèi)葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(Jackzon，Biochem.J.，242581-88(1987))，人類(lèi)N-乙酰氨基半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(Nagataet al.，J.Biol.Chem.，26712082-89(1992))，小鼠半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(Iarson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，868227-31(1989)，兔子N-乙酰氨基糖基轉(zhuǎn)移酶I(Sarkar et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88234-38(1991))，大鼠N-乙酰氨基糖基轉(zhuǎn)移酶III(Nishikawa et al.，J.Biol.Chem.，26718199-204(1992))；一些人類(lèi)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(Larsen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，876674-78(1990)Kukowska-Latallo et al.，Genesand Development 41288-303(1990)；Weston et al.，J.Biol.Chem.，2674152-60(1992))，人類(lèi)N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(Berhuizen and Fukuda，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，899326-30(1992))和牛N-乙酰氨基糖基轉(zhuǎn)移酶(Homa et al.，J.Biol.Chem.，26812609-16(1993))。
對(duì)于那些不易得到其基因(DNA or cDNA)的糖基轉(zhuǎn)移酶，如下方法可用于獲得編碼所需糖基轉(zhuǎn)移酶的基因。通常，在按照本發(fā)明合成糖組分的過(guò)程中，預(yù)選的糖單位首先要在酶促條件下連接到初始受體部分，即蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂類(lèi)、糖脂或碳水化合物起始物上。然后，預(yù)選的糖單位在酶促條件下連續(xù)不斷地連接到所得產(chǎn)物上，由此形成糖組分。
連接每個(gè)預(yù)選糖單位時(shí)會(huì)得到中間產(chǎn)物。正如本發(fā)明者待審申請(qǐng)07/683,810中所詳細(xì)描述的，合成起始物(即，蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂類(lèi)、糖脂或碳水化合物)和合成中形成的每個(gè)中間產(chǎn)物。對(duì)于每個(gè)相應(yīng)的合成步驟，可被有利地用于獲得對(duì)催化在合成目的糖組分中連接下一個(gè)中間產(chǎn)物特異的糖基轉(zhuǎn)移酶。
因此，任何給定步驟所需的糖基轉(zhuǎn)移酶同中間產(chǎn)物(受體部分)分離且用于連接到受體部分，即構(gòu)建目的碳水化合物分子所需的下一個(gè)糖單位上。這個(gè)過(guò)程可重復(fù)進(jìn)行，隨著每次分離使下一個(gè)糖單位連接到伸長(zhǎng)的分子上所需的特定的糖基轉(zhuǎn)移酶，直至得到目的碳水化合物分子為止。按照這種方式，可分離對(duì)特定的受體部分特異且能將預(yù)選糖單位轉(zhuǎn)移到受體部分的糖基轉(zhuǎn)移酶并且據(jù)此可得到用于給定的合成反應(yīng)的所有酶。
另外，肽序列也能從糖基轉(zhuǎn)移酶獲得，這種糖基轉(zhuǎn)移酶已用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的傳統(tǒng)方法純化。從肽序列獲得的合成的簡(jiǎn)并寡核苷酸可用于篩選λ噬菌體，柯斯質(zhì)?；験AC庫(kù)，從而分離各種糖基轉(zhuǎn)移酶的cDNA或基因組克隆。使用上述合成的寡核苷酸探針，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法同樣可克隆糖基轉(zhuǎn)移酶。最后，已成功地用于分離大量糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)克隆(Larsen et al.，Pror.Natl Acad.Sci.U.S.A.，876674-78(1990)；Nagata et al.，J.Biol.Chem.，26712082-89(1992))也可被用于獲得編碼其它糖基轉(zhuǎn)移酶的cDNA。
每個(gè)對(duì)合成一個(gè)目的寡糖所必需的酶均能在受體部分同對(duì)受體部分特異的糖基轉(zhuǎn)移酶有效結(jié)合的條件下，通過(guò)使受體部分與可能含有眾多的糖基轉(zhuǎn)移酶的混合物接觸可以鑒定和獲得合成目的寡糖所必需的每種必不可少的酶，包括所需的糖基轉(zhuǎn)移酶?？赡芎兴杼腔D(zhuǎn)移酶的混合物可用下述方法鑒定。對(duì)于最普通的糖苷鍵，很多文獻(xiàn)報(bào)道了糖基轉(zhuǎn)移酶活性。象牛奶寡糖這樣的化合物，或典型的(即，普通的)糖蛋白、糖脂的碳水化合物部分大多如此。對(duì)于描述不太充分的連接鍵，可以首先注意食料微生物上的組織和器官，其中可發(fā)現(xiàn)連接鍵。通常，如果該連接鍵是在某個(gè)特殊來(lái)源中發(fā)現(xiàn)的，則產(chǎn)生該連接鍵的酶也存在于該來(lái)源中。
如果一個(gè)連接鍵僅存在于某個(gè)糖結(jié)構(gòu)上而不是存在于某一來(lái)源中，則可以使用目前最為敏感的篩選方法對(duì)可能包含這一糖結(jié)構(gòu)的微生物進(jìn)行測(cè)試(借助于相關(guān)結(jié)構(gòu)的文獻(xiàn)報(bào)道)。例如，如果目的化合物含有艾杜糖醛酸，N-乙酰氨基半乳糖或N-乙酰氨基葡糖，則可測(cè)試脊椎動(dòng)物的結(jié)締組織。如果目的化合物含有阿比可糖，則可以測(cè)試細(xì)菌和植物是否存在適當(dāng)?shù)奶腔D(zhuǎn)移酶。
大量可按照本發(fā)明測(cè)試糖基轉(zhuǎn)移酶的方法已經(jīng)發(fā)表。以下可作例證。Furukawa等人(Biochem.J.，227573-582(1985))描述了一種由本發(fā)明者發(fā)展的硼酸浸漬紙電泳方法和熒光測(cè)定方法。Roth等人(Exp′l Cell Research 143217-225(1983)描述了硼酸測(cè)試葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用，此前是用顯色法測(cè)定的。Benau等人(J.Histochem.Cytochem.，38(1)23-20(1990)介紹了一種依賴(lài)由NADH還原重氮鹽的組織化學(xué)測(cè)試法。
一個(gè)有關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶的來(lái)源一但被發(fā)現(xiàn)，需將該來(lái)源均質(zhì)化。通過(guò)將受體部分作為親和配體的親和色譜，可將這種酶從均化物中純化出來(lái)。也就是說(shuō)，在能使糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合到受體部分上的條件下，使均化物通過(guò)一個(gè)其上已固定有受體部分的固體基質(zhì)。
對(duì)受體結(jié)合酶的監(jiān)測(cè)可如下進(jìn)行。使細(xì)胞均化物通過(guò)固定的受體部分。例如，使細(xì)胞均化物通過(guò)一個(gè)有固定的受體部分的柱可使上述過(guò)程得以實(shí)現(xiàn)。此后，洗脫該柱并監(jiān)測(cè)通過(guò)有固定受體柱的蛋白質(zhì)的量。當(dāng)檢測(cè)不到蛋白質(zhì)時(shí)，使一種鹽水溶液或適宜糖供體洗脫物的溶液通過(guò)柱子洗脫這種酶。然后測(cè)定所得的洗脫物中是否存在糖基轉(zhuǎn)移酶。可使用的檢測(cè)方法如上所述，即Furukawa等人，Roth等人和Benau等人所述的方法。
如果沒(méi)有發(fā)生酶與受體部分的結(jié)合(即洗脫物檢測(cè)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶存在)，那么可以得出結(jié)論，混合物中不含對(duì)特定受體特異的酶。其它混合物，如動(dòng)物和/或植物細(xì)胞勻漿保持與受體部分接觸，直至觀察到酶結(jié)合。
當(dāng)受體部分被酶結(jié)合后，將這部分分離出來(lái)。例如可以洗脫結(jié)合有糖基轉(zhuǎn)移酶的固體支持基質(zhì)。進(jìn)而經(jīng)一個(gè)洗脫步驟使糖基轉(zhuǎn)移酶從固體支持基質(zhì)上釋放出來(lái)，并收集之。已知吸附的糖基轉(zhuǎn)移酶可洗脫下來(lái)，例如使鹽水溶液(如NaCl)通過(guò)固體支持基質(zhì)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，受體與待選的酶再次接觸，此時(shí)有供體部分存在，該供體部分包含欲轉(zhuǎn)移至受體部分上所需的糖單位。如果這種接觸導(dǎo)致糖單位轉(zhuǎn)移到受體上，則該酶是可用于實(shí)施本發(fā)明的糖基轉(zhuǎn)移酶。
應(yīng)該認(rèn)識(shí)到一旦糖基轉(zhuǎn)移酶被識(shí)別并分離出來(lái)，可對(duì)其測(cè)序，用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)獲得和/或復(fù)制編碼該酶的DNA序列。例如，可借助于包括分離為糖基轉(zhuǎn)移酶編碼的遺傳物質(zhì)和制備能擴(kuò)增大量編碼該糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA的不滅細(xì)胞系的技術(shù)，獲得編碼這個(gè)酶的DNA序列。使用DNA或RNA探針，最好是簡(jiǎn)并探針，測(cè)定糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸順序(使用已知技術(shù))，從而能分離得到編碼這個(gè)酶的DNA序列。
按照本發(fā)明，編碼糖基轉(zhuǎn)移酶基因的DNA(包括cDNA)可使用下述已知技術(shù)以天然或人工形式引入真核或原核的宿主細(xì)胞內(nèi)。
在原核細(xì)胞情況下，糖基轉(zhuǎn)移酶的信號(hào)序列和跨膜序列被能實(shí)現(xiàn)融合蛋白在外膜上的定位的細(xì)菌信號(hào)序列取代。適宜的信號(hào)序列包括但并不僅限于大腸桿菌主要的脂蛋白Lpp和LamB。此外，om-pA，ompC，ompF或phoE形成的跨模區(qū)可以三元融合蛋白形式用于引導(dǎo)融合蛋白適當(dāng)插入外膜。任何原核細(xì)胞，包括但不限于大腸桿菌，芽孢桿菌菌種和假單胞菌菌種等典型實(shí)例均可按照本發(fā)明使用。
在另一實(shí)施方案中，糖基轉(zhuǎn)移酶的天然跨膜區(qū)被細(xì)菌外膜蛋白的跨膜區(qū)取代。在這一實(shí)施方案中，糖基轉(zhuǎn)移酶信號(hào)序列和細(xì)菌跨膜區(qū)共同作用使糖基轉(zhuǎn)移酶固著于細(xì)菌的細(xì)胞外膜上。任何外膜結(jié)合蛋白均適用于此。包括但不限于ompA、ompC和ompF、Lpp，及LamB，只要跨膜結(jié)構(gòu)是已知的，即人們能確定其在線性序列中的位置，該蛋白質(zhì)中存在細(xì)胞外環(huán)。糖基轉(zhuǎn)移酶的催化部分應(yīng)與細(xì)菌跨膜區(qū)中的細(xì)胞外環(huán)融合以便保證融合蛋白結(jié)合在外膜表面上而非細(xì)胞原生質(zhì)或周質(zhì)中的適當(dāng)取向。關(guān)于融合蛋白插入這種環(huán)區(qū)而沒(méi)有適當(dāng)?shù)目缒ふ郫B的描述以前曾報(bào)道過(guò)(Charbit et al.，J.Bacteriology.173262-275(1991)；Francisco，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，892713-2717(1992))。
本發(fā)明也適用于能導(dǎo)致在已知的可培養(yǎng)的真核細(xì)胞中糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞表面表達(dá)的真核細(xì)胞，包括但并不限于酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)、小鼠L細(xì)胞、小鼠A9細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞、C127細(xì)胞、和PC8細(xì)胞。
Paulson等人(美國(guó)專(zhuān)利5,032,519，在此引用作為參考)描述了一種使糖基轉(zhuǎn)移酶分泌可溶形式的酶的方法。本專(zhuān)利權(quán)人描述了導(dǎo)致以可溶形式分泌蛋白質(zhì)的糖基轉(zhuǎn)移酶疏水跨膜固著區(qū)域的去除。在本發(fā)明中糖基轉(zhuǎn)移酶的天然跨膜區(qū)被修飾使重組蛋白能定位于細(xì)胞原生質(zhì)膜的細(xì)胞外表面上。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，糖基轉(zhuǎn)移酶跨膜區(qū)被質(zhì)膜蛋白的跨膜區(qū)取代。任何固定的質(zhì)膜蛋白的跨膜區(qū)均適于此目的。M6P/IGF-II受體，LDL受體或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的跨膜部分均為典型例子。進(jìn)而，除了跨膜部分以外的短的細(xì)胞質(zhì)肽將使在質(zhì)膜上的固著得到改善。如果前述三種受體蛋白任一種的細(xì)胞質(zhì)尾部的內(nèi)在化信號(hào)經(jīng)過(guò)位點(diǎn)特異性誘變而失活，則這種細(xì)胞質(zhì)尾部就夠了(Johozon eta1.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，8710010-10014(1990)；Canfield et al.，J.Biol.Chem.，2665682-5688(1991))。內(nèi)在化信號(hào)的失活可以由修飾4個(gè)氨基酸的序列tyr-X-X-Y來(lái)達(dá)到，此處X是任何氨基酸，Y是亮氨酸，異亮氨酸或纈氨酸。內(nèi)在化信號(hào)失活是由于酪氨酸變成丙氨酸和Y變成丙氨酸。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，糖基轉(zhuǎn)移酶的高爾基保留位點(diǎn)被位點(diǎn)特異性誘變所破壞。這種方法誘變少數(shù)使糖基轉(zhuǎn)移酶集中到高爾基區(qū)的氨基酸。生成的糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜上，在此經(jīng)由其修飾的跨膜序列得以固著。β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶跨膜區(qū)的異亮氨酸殘基取代天然氨基酸表明酶優(yōu)先定域在質(zhì)膜上而不是高爾基體上(Mazibay et al.，J.Biol.Chem.，2689908-9916(1993))。盡管不希望受任何特定的理論束縛，但認(rèn)為異亮氨酸殘基的取代作用增加了跨膜序列的疏水性，從而導(dǎo)致酶優(yōu)先定域在質(zhì)膜上。
對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，任何將外源DNA序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞的已知方法都可用于本發(fā)明。將外源DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的適宜載體包括但并不限于質(zhì)粒載體、病毒載體和將克隆的基因組DNA、cDNA、合成DNA、半合成DNA和任何的其它外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入宿主細(xì)胞的任何其它的已知方法。
適宜的原核載體包括但不限于pBR322，pMB9、pUC、λ噬菌體、M13噬菌體和Blue script。
適宜的真核載體包括但不限于pMSG，pAV009/A+、PMT010/A+，pMAM neo-5，棒狀病毒、pDSVE，YIP5，YRP17，YEP。
依所使用的宿主細(xì)胞的細(xì)胞類(lèi)型應(yīng)使用哪種載體或啟動(dòng)子系統(tǒng)對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是清楚的。
優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)物只表達(dá)所需的細(xì)胞表面的糖基轉(zhuǎn)移酶。
通過(guò)與適當(dāng)?shù)氖荏w和放射性標(biāo)記的供體糖部分一起溫育認(rèn)為能表達(dá)所需的細(xì)胞表面糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞，可鑒定適宜的細(xì)胞。溫育期結(jié)束后，從未消耗的放射性底物中分離糖基化產(chǎn)物。適宜的受體—供體縮合物的合成是細(xì)胞表面上所需糖基轉(zhuǎn)移酶活性存在的證據(jù)。
以這種方式，可鑒定一個(gè)完整的細(xì)胞培養(yǎng)物庫(kù)，在其細(xì)胞表面上表達(dá)特異的糖基轉(zhuǎn)移酶。例如，可以鑒定和貯存在細(xì)胞表面上表達(dá)N-乙酰氨基糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞培養(yǎng)物。同樣也可鑒定和貯存表達(dá)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞培養(yǎng)物。
一但鑒定出一個(gè)適宜的糖基轉(zhuǎn)移酶庫(kù)，就可以選擇合成目的寡糖所需的特異性糖基轉(zhuǎn)移酶。
例如為了合成乳-N-新四糖，一種發(fā)現(xiàn)于人乳中的結(jié)構(gòu)為β-D-Gal 1-4β-D-Glc NAc 1-3β-D-Gal 1-4 D-Glc的寡糖，必須有兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物，其產(chǎn)生兩種形成β-Gal 1-4 GlcNAC鍵和β-GlcNAc 1-3Gal鍵所需的糖基轉(zhuǎn)移酶。在這兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物及UPD-GlcNAc和UDP-Gal存在下，β-D-Gal 1-4 D-Glc(即乳糖)轉(zhuǎn)變?yōu)槿?N-新四糖。
通過(guò)裝配該細(xì)胞培養(yǎng)物，受體和供體糖源，有可能設(shè)計(jì)一個(gè)合成包含天然存在的糖苷鍵的任何寡糖組分的生物反應(yīng)器。這個(gè)生物反應(yīng)器酷似傳統(tǒng)生物反應(yīng)器的結(jié)果，其中培養(yǎng)細(xì)胞將產(chǎn)生所需的生物學(xué)產(chǎn)物，但在本方法中，目的產(chǎn)物可由人決定。依據(jù)制備目的寡糖所需的糖基轉(zhuǎn)移酶的數(shù)量，生物反應(yīng)器可包含任意數(shù)量不同的細(xì)胞培養(yǎng)物。特別是生物反應(yīng)器可包含1、2、3或4個(gè)不同的細(xì)胞培養(yǎng)物，每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物在細(xì)胞表面上表達(dá)不同的糖基轉(zhuǎn)移酶。單獨(dú)的細(xì)胞培養(yǎng)物將提供與單個(gè)細(xì)胞相同的功能，但由于可對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物和供體糖進(jìn)行選擇，可預(yù)先確定最終產(chǎn)物。
表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶活性的適宜細(xì)胞可以是轉(zhuǎn)染的原核或真核細(xì)胞。優(yōu)選的是使用表達(dá)所需糖基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)染的酵母細(xì)胞。
本發(fā)明也可按上述同樣方法用表達(dá)不同糖基轉(zhuǎn)移酶的多樣性細(xì)胞來(lái)實(shí)施，即，使細(xì)胞表面糖基轉(zhuǎn)移酶和結(jié)合的供體糖與適宜的受體接觸以形成寡糖。
以這種方式，任何所需的寡糖均可簡(jiǎn)單地通過(guò)使表達(dá)所需細(xì)胞表面糖基轉(zhuǎn)移酶的適宜細(xì)胞和必需的受體及供體糖連在一起而形成。因此，可以通過(guò)選擇細(xì)胞培養(yǎng)物和供體糖單位生成一個(gè)“設(shè)計(jì)的”生物反應(yīng)器。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含表達(dá)給定的結(jié)合的糖核苷酸供體的細(xì)胞培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器，由于編碼對(duì)糖供體的合成反應(yīng)是必需的酶的cDNAs的轉(zhuǎn)染，可以同另一個(gè)包含適宜細(xì)胞培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器互作，該細(xì)胞培養(yǎng)物具有對(duì)于結(jié)合的糖核苷酸適宜的糖基轉(zhuǎn)移酶的表面表達(dá)。在培養(yǎng)基中包含適當(dāng)?shù)姆派湫詷?biāo)記的受體部分可以鑒定適宜的細(xì)胞。在溫育期結(jié)束時(shí)，使糖基化產(chǎn)物與未消耗的放射性受體分離。形成放射標(biāo)記產(chǎn)物表明表達(dá)結(jié)合的糖供體的細(xì)胞培養(yǎng)物和在其表面上表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶的培養(yǎng)細(xì)胞同時(shí)存在。也有可能是具有適宜糖基轉(zhuǎn)移酶表面表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)物和表達(dá)給定的結(jié)合的糖核苷酸供體的細(xì)胞培養(yǎng)物在一個(gè)單一生物反應(yīng)器中互作。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，同樣的細(xì)胞培養(yǎng)物既有糖基轉(zhuǎn)移酶的表面表達(dá)又表達(dá)結(jié)合的供體糖。通過(guò)溫育認(rèn)為能表達(dá)細(xì)胞表面糖基轉(zhuǎn)移酶和結(jié)合部分的細(xì)胞鑒定適宜的細(xì)胞。在溫育期結(jié)束時(shí)，使葡糖基化產(chǎn)物與未消耗的放射性受體分離。放射性受體反應(yīng)表明在相同的細(xì)胞培養(yǎng)物中存在表面糖基轉(zhuǎn)移酶和結(jié)合的供體糖。然后通過(guò)表征受體—供體糖組分鑒定糖基轉(zhuǎn)移酶活性。
通過(guò)鑒定同時(shí)表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶和結(jié)合的供體糖的細(xì)胞培養(yǎng)物，包含這種細(xì)胞培養(yǎng)物的任何生物反應(yīng)器的效率由于排除了單獨(dú)提供供體糖的需要而大大提高。
按照本發(fā)明的生物反應(yīng)器可以是任何常用的細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器。適宜的反應(yīng)器應(yīng)設(shè)置有維持穩(wěn)定的適宜溫度的裝置，提供必要的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)素的裝置和混合反應(yīng)器內(nèi)容物的裝置。
按照本方法，可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)連續(xù)或分批培養(yǎng)細(xì)胞。
可通過(guò)不斷調(diào)整營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，以改良的批量法培養(yǎng)細(xì)胞(U.S.3，419，703)。
按照本發(fā)明可以制備出的糖組分在診斷、治療和藥理學(xué)應(yīng)用方面具有廣泛用途。一但所需的目的糖組分的糖序列由傳統(tǒng)方法確定，便可進(jìn)行反向合成分析以確定可行的糖組分的合成方案。這種合成方案很適宜鑒定獲得糖組分所需的特定的供體部分、受體部分和糖基轉(zhuǎn)移酶。
在如下敘述的典型實(shí)施方案中可見(jiàn)本發(fā)明的這些和其它特征，這些實(shí)施方案是用于說(shuō)明本發(fā)明的，但本發(fā)明并不限于此。
實(shí)施例1乳-N-新四糖(lacto-N-neotetraoee)的合成在包含適宜的反應(yīng)培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)器中加入兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物，兩者分別表達(dá)不同的糖基轉(zhuǎn)移酶。一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)產(chǎn)生Gal1-4GlcNAc鍵所需的糖基轉(zhuǎn)移酶。第二個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物提供形成Glc-NAc1-3Gal鍵所需的糖基轉(zhuǎn)移酶。反應(yīng)介質(zhì)中含有水及供細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)所需的適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)素。在這個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)器中還含有1當(dāng)量的UDP-GlcNAc和1當(dāng)量的UDP-Gal。然后將1摩爾當(dāng)量的乳糖加入反應(yīng)介質(zhì)中。將反應(yīng)器置于35℃，反應(yīng)28小時(shí)。此后，細(xì)胞培養(yǎng)物通過(guò)過(guò)濾而分離，上清液經(jīng)層析純化，得到乳-N-新四糖。
顯然，依據(jù)以上教導(dǎo)對(duì)本發(fā)明的多種改進(jìn)和改變都是可能的。因此可以理解在本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)，本發(fā)明可以不同于此處具體描述的方法來(lái)實(shí)踐。
權(quán)利要求
1.通過(guò)將預(yù)選的糖單位連續(xù)結(jié)合到受體部分上，在糖基轉(zhuǎn)移酶催化條件下制備糖組分的方法，包括(i)在至少一種特異地催化受體部分與所說(shuō)的供體糖偶聯(lián)的細(xì)胞表面結(jié)合糖基轉(zhuǎn)移酶存在條件下，使受體部分同至少一種供體糖接觸，其中所說(shuō)的受體部分是碳水化合物、蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂類(lèi)或糖脂；(ii)分離所述糖組分。
2.權(quán)利要求1的方法，其中使用至少兩種不同的細(xì)胞表面結(jié)合糖基轉(zhuǎn)移酶和兩種供體糖。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述細(xì)胞是原核生物。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的受體部分是碳水化合物。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所說(shuō)的碳水化合物是單糖。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所說(shuō)的碳水化合物是二糖。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所說(shuō)的碳水化合物是寡糖。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所說(shuō)的碳水化合物是多糖。
9.權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的受體部分是蛋白質(zhì)。
10.權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的受體部分是糖蛋白。
11.權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的受體部位是脂類(lèi)。
12.權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的受體部分是糖脂。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的細(xì)胞是真核生物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所說(shuō)的受體部分是碳水化合物。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所說(shuō)的碳水化合物是單糖。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所說(shuō)的碳水化合物是二糖。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所說(shuō)的碳水化合物是寡糖。
18.權(quán)利要求14的方法，其中所說(shuō)的碳水化合物是多糖。
19.權(quán)利要求13的方法，其中所說(shuō)的受體部分是蛋白質(zhì)。
20.權(quán)利要求13的方法，其中所說(shuō)的受體部分是糖蛋白。
21.權(quán)利要求13的方法，其中所說(shuō)的受體部分是脂類(lèi)。
22.權(quán)利要求13的方法，其中所說(shuō)的受體部分是糖脂。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的細(xì)胞是一種表達(dá)β1-4糖基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
24.權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的細(xì)胞一種表達(dá)β1-3糖基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
25.權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
26.權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的細(xì)胞被包含編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的cDNA的DNA載體所轉(zhuǎn)染。
27.權(quán)利要求26的方法，其中cDNA天然信號(hào)序列已被細(xì)菌信號(hào)序列所取代。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所說(shuō)的信號(hào)序列包含一個(gè)缺損的信號(hào)肽切割位點(diǎn)。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所說(shuō)的細(xì)菌信號(hào)序列是從包含OmpA，Lpp和LamB組中選擇出的蛋白。
30.權(quán)利要求26的方法，其中所說(shuō)的cDNA附加地包含一個(gè)編碼疏水蛋白區(qū)域的DNA部分，其中所說(shuō)的DNA片段被插入所說(shuō)cDNA中的天然信號(hào)序列之后。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所說(shuō)的DNA或序列編碼跨膜蛋白的疏水區(qū)域。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所說(shuō)的跨膜蛋白的疏水區(qū)域是從OmpA，Lpp和LamB組中選擇出來(lái)的。
33.權(quán)利要求13的方法，其中所說(shuō)的細(xì)胞被含有包括天然信號(hào)序列的DNA載體，和編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA區(qū)域的cDNA所轉(zhuǎn)染其中編碼疏水膜區(qū)域的DNA已被刪除。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所說(shuō)的信號(hào)序列包含缺損的信號(hào)肽切割位點(diǎn)。
35.權(quán)利要求33的方法，其中所說(shuō)的cDNA進(jìn)而包括編碼一段跨膜蛋白的DNA片段。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所說(shuō)的DNA片段編碼從包含OmpA，Lpp和LamB的組中選擇出來(lái)的跨膜蛋白。
37.權(quán)利要求1的方法，其中糖基轉(zhuǎn)移酶羧基末端是結(jié)合到細(xì)胞表面上的C末端。
40.適合于通過(guò)將預(yù)選的糖單位連續(xù)結(jié)合到受體部分上，由糖基轉(zhuǎn)移酶催化制備糖組分的生物反應(yīng)器，包括一個(gè)包括至少一種表達(dá)細(xì)胞表面膜結(jié)合糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞培養(yǎng)物和一個(gè)對(duì)所說(shuō)的膜結(jié)合糖基轉(zhuǎn)移酶特異的供體糖部分源的反應(yīng)裝置，和分離所說(shuō)的糖組分的裝置。
41.適宜通過(guò)將預(yù)選的糖單位連續(xù)結(jié)合到受體部分上，由糖基轉(zhuǎn)移酶催化制備糖組分的生物反應(yīng)器，包括一個(gè)包括至少兩種細(xì)胞培養(yǎng)物，每種表達(dá)不同的細(xì)胞表面膜結(jié)合的糖基轉(zhuǎn)移酶和結(jié)合的供體糖的反應(yīng)裝置，和分離所說(shuō)的糖組分的裝置。
42.權(quán)利要求40的生物反應(yīng)器，其中所說(shuō)的細(xì)胞培養(yǎng)物是轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，經(jīng)轉(zhuǎn)染可表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶。
43.權(quán)利要求40的生物反應(yīng)器，其中所說(shuō)的細(xì)胞培養(yǎng)物之一是表達(dá)β1-4糖基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)物。
44.權(quán)利要求40的生物反應(yīng)器，其中所說(shuō)的細(xì)胞培養(yǎng)物之一是表達(dá)β1-3糖基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)物。
45.權(quán)利要求40的生物反應(yīng)器，其中所說(shuō)的細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
46.權(quán)利要求40的生物反應(yīng)器，其中所說(shuō)的細(xì)胞是原核細(xì)胞。
47.權(quán)利要求46的生物反應(yīng)器，其中所說(shuō)的細(xì)胞被包含編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的cDNA的DNA載體轉(zhuǎn)染。
48.權(quán)利要求46的生物反應(yīng)器，其中所說(shuō)的cDNA的天然信號(hào)序列被細(xì)菌信號(hào)序列取代。
49.權(quán)利要求40的生物反應(yīng)器，其中所說(shuō)的信號(hào)序列包括缺損的信號(hào)肽切割位點(diǎn)。
50.權(quán)利要求48的生物反應(yīng)器，其中所說(shuō)的細(xì)菌信號(hào)序列是從包含OmpA，Lpp和LamB組中選擇出的蛋白。
51.權(quán)利要求46的生物反應(yīng)器，其中所說(shuō)的cDNA附加地包括編碼疏水蛋白區(qū)的DNA片段，其中所說(shuō)的DNA片段被插入到所說(shuō)cDNA的天然信號(hào)序列后面。
52.權(quán)利要求51的生物反應(yīng)器，其中所說(shuō)的DNA或序列編碼跨膜蛋白的疏水區(qū)域。
53.權(quán)利要求51的生物反應(yīng)器，其中所說(shuō)的跨膜蛋白的疏水區(qū)是從包含OmpA，Lpp和LamB組中選擇出來(lái)的。
54.權(quán)利要求40的生物反應(yīng)器，其中所說(shuō)的細(xì)胞是真核細(xì)胞。
55.權(quán)利要求54的生物反應(yīng)器，其中所說(shuō)的細(xì)胞被含有包括天然信號(hào)序列的DNA載體，和編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA區(qū)域的cDNA所轉(zhuǎn)染，其中編碼疏水膜區(qū)的DNA已被刪除。
56.權(quán)利要求55的生物反應(yīng)器，其中所說(shuō)的信號(hào)序列包含一個(gè)缺損的信號(hào)肽切割位點(diǎn)。
57.權(quán)利要求55的生物反應(yīng)器，其中所說(shuō)的cDNA進(jìn)而包含編碼跨膜蛋白的DNA片段。
58.權(quán)利要求57的生物反應(yīng)器，其中所說(shuō)的編碼跨膜蛋白的DNA片段是從OmpA，Lpp和LamB組中選擇出來(lái)的。
59.權(quán)利要求40的生物反應(yīng)器，其中糖基轉(zhuǎn)移酶的羧基末端是結(jié)合到所述細(xì)胞表面上的C末端。
60.權(quán)利要求49的生物反應(yīng)器，其中所說(shuō)的信號(hào)肽切割位點(diǎn)已被編碼所述信號(hào)序列的DNA的位點(diǎn)特異性突變所破壞。
61.權(quán)利要求56的生物反應(yīng)器，其中所說(shuō)的糖基轉(zhuǎn)移酶的羧基末端是同所說(shuō)細(xì)胞表面結(jié)合的C末端。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種合成糖組分的方法。在這種方法中，受體部分在至少一種細(xì)胞表面結(jié)合糖基轉(zhuǎn)移酶存在下與至少一種供體糖接觸，該細(xì)胞表面結(jié)合糖基轉(zhuǎn)移酶可特異地催化受體部分與供體糖的偶聯(lián)。所用的受體部分是碳水化合物，蛋白質(zhì)，糖蛋白，脂類(lèi)，或糖脂。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1129953SQ94193208
公開(kāi)日1996年8月28日 申請(qǐng)日期1994年7月15日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月15日
發(fā)明者S·羅思 申請(qǐng)人:尼奧斯藥品公司