專利名稱：前尿激酶突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在溶解血栓治療中使用的新型前尿激酶。
前尿激酶(pro-UK)是一種單鏈型的絲氨酸蛋白酶前體，該前體受纖維蛋白溶酶(plasmin)的激活而形成雙鏈尿激酶(UK)。前尿激酶和尿激酶都可將纖維蛋白溶酶酶原活化或轉(zhuǎn)化為活性纖維蛋白溶酶，它降解存在于纖維蛋白凝塊中的一系列血漿蛋白。因此，前尿激酶和尿激酶已用于血栓栓塞的治療。
這種治療方式可產(chǎn)生一些不良的副作用。前尿激酶和尿激酶都能引起非特異性的纖維蛋白溶酶酶原活化，從而導(dǎo)致纖維蛋白、纖維蛋白原降解(纖維蛋白原溶解作用)，以及血小板和血管壁的部分溶解，和出血素質(zhì)的降低。在以低劑量使用時(shí)，前尿激酶比尿激酶更具有選擇性，即特異性地使纖維蛋白溶酶原激活，這是因?yàn)榍澳蚣っ竷H激活結(jié)合了纖維蛋白的纖維蛋白溶酶原，而尿激酶激活任何纖維蛋白溶酶原。但是，為了確保血栓溶解的效果需要使用高劑量時(shí)，前尿激酶就喪失了其低劑量時(shí)的特異性。
前尿激酶具有一些特性，使它既類似“非活性”酶原也類似“活性”酶。一方面，前尿激酶的酶原特征包括在血漿中的惰性行為，不能形成十二烷基硫酸鈉-穩(wěn)定抑制劑復(fù)合物，以及相對(duì)抵抗二異丙基氟磷酸(DFP)或Glu-Gly-Arg氯甲基酮的抑制作用，這些都是尿激酶的有效抑制劑。前尿激酶具有的激活纖維蛋白溶酶原活性也比尿激酶低200倍。
另一方面，前尿激酶的酶活性包括其作用于合成底物和纖維蛋白溶酶酶原的可測(cè)量的內(nèi)在活性(intrinsic activity)，其活性比其他絲氨酸蛋白酶酶原(如胰蛋白酶原或糜蛋白酶)高出104.0-4.3倍。在作用于纖維蛋白溶酶酶原時(shí)前尿激酶的米氏常數(shù)(Km)也比尿激酶低，并且在纖維蛋白片段E2存在下，已證明前尿激酶不必激活為尿激酶形式而有作用于纖維蛋白酶原的完全活性。
盡管其具有用作血栓溶解劑的潛力，但當(dāng)以治療劑量給藥時(shí)，前尿激酶的高的內(nèi)在酶活性可引起如上所述的不希望出現(xiàn)的非特異性全身纖維蛋白溶酶酶原激活。因此用前尿激酶進(jìn)行血栓溶解治療仍伴有有害的副作用。
發(fā)明概述本發(fā)明是基于下列發(fā)現(xiàn)可以設(shè)計(jì)突變型前尿激酶，使天然前尿激酶中存在的不合需要的、內(nèi)在的、非特異的酶活性降低，但在受纖維蛋白(片段Y或E2)啟動(dòng)(激活)的能力方面至少與天然前尿激酶具有同樣的效果，并可將纖維蛋白溶酶酶原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白溶酶，以及在轉(zhuǎn)化為雙鏈尿激酶之后，保留溶解血栓的活性。因此，當(dāng)給患者施用時(shí)，這些突變型前尿激酶比天然前尿激酶能產(chǎn)生更低的非特異性纖維蛋白溶酶酶原激活作用以及出血并發(fā)癥。
與天然前尿激酶相比，這些突變型前尿激酶是優(yōu)良的血栓溶解藥劑，因?yàn)樗鼈兪芾w維蛋白激活的程度與天然前尿激酶相同。因此具有相同的纖維蛋白溶解效率，但比天然前尿激酶具有大得多的對(duì)于結(jié)合纖維蛋白的纖維蛋白溶酶酶原的特異性，因?yàn)樗鼈冊(cè)谘獫{中確實(shí)是惰性的。由于其惰性行為，結(jié)果在給患者施用這些突變型前尿激酶時(shí)，可比天然前尿激酶使用更高，更有效驗(yàn)的劑量。
因此，本發(fā)明的特征在于一種有溶解血栓活性的前尿激酶突變體，它具有天然前尿激酶的氨基酸序列，其中該序列有一個(gè)突變位點(diǎn)。當(dāng)給患者施用時(shí)，該突變促使前尿激酶突變體比天然前尿激酶誘導(dǎo)出更低的纖維蛋白原溶解作用和非特異性纖維蛋白溶酶酶原激活作用。該突變優(yōu)選是由一個(gè)新的氨基酸替代在天然前尿激酶的氨基酸序列中存在的一個(gè)常規(guī)天然氨基酸，這種替代發(fā)生后導(dǎo)致突變型前尿激酶具有的內(nèi)在活性比天然前尿激酶至少低10倍，并且在給患者施用時(shí)，與天然前尿激酶相比，在纖維蛋白溶酶激活后基本上具有相同的纖維蛋白激活作用以及血栓溶解活性。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“天然”是指一種天然存在或野生型形式的蛋白質(zhì)，或者是指在天然存在的蛋白質(zhì)中的一種天然存在或野生型形式的氨基酸。一種“新”氨基酸是指天然蛋白質(zhì)內(nèi)通常不定位于給定位點(diǎn)上的氨基酸。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“突變”包括用單一新氨基酸替代一個(gè)天然氨基酸，或者是兩個(gè)或多個(gè)新氨基酸替代兩個(gè)或多個(gè)天然氨基酸。
具體地說(shuō)，突變可以是一個(gè)新氨基酸替代天然前尿激酶的可塑性環(huán)(第297位氨基酸至313位氨基酸)中的一個(gè)天然氨基酸。例如，可用新氨基酸(如丙氨酸或組氨酸)替代Lys300，Gly299和/或Glu301。另外，可用新氨基酸(如丙氨酸或組氨酸)替代Lys313，或用如甘氨酸替代Tyr306。
另外，突變可以是用一個(gè)新氨基酸替代Ala175，并用第二個(gè)新氨基酸替代Tyr187，從而在突變型前尿激酶中形成一個(gè)酶原三聯(lián)體(Zymogen triad)。例如，該新氨基酸可以是絲氨酸，而第二個(gè)新氨基酸可以是組氨酸。本發(fā)明的特征還在于組合突變，例如導(dǎo)入兩個(gè)突變而形成酶原三聯(lián)體，還包括用第三個(gè)新氨基酸替代Lys300，以及用第四個(gè)新氨基酸替代Glu301。這樣一種突變型具有諸如以絲氨酸作為新氨基酸，組氨酸作為第二個(gè)新氨基酸，丙氨酸或組氨酸作為第三個(gè)新氨基酸，以及丙氨酸作為第四個(gè)新氨基酸的突變。
本發(fā)明的特征還在于一種DNA分子，例如，一種重組DNA分子，該分子編碼本文中描述的任何突變型前尿激酶。這些突變可以包括單個(gè)或雙個(gè)或多個(gè)替代。本發(fā)明還包括一種用上述的DNA分子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，例如一種哺乳動(dòng)物、細(xì)菌或酵母細(xì)胞。本發(fā)明的特征還在于一種制備本文中描述的突變型前尿激酶的方法，該方法包括用編碼一種突變型前尿激酶的DNA分子轉(zhuǎn)化一種細(xì)胞，培養(yǎng)該細(xì)胞，以及表達(dá)該突變體，并分離該突變體。
另外，本發(fā)明描述了治療患者的血栓栓塞的方法，該方法包括給患者施用使血栓溶解的量的本文描述的任何前尿激酶突變體。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“使血栓溶解的量”是指裂解患者的纖維蛋白凝塊而不會(huì)誘導(dǎo)全身出血的所需的前尿激酶突變體的量。
從下文的中詳細(xì)描述以及從權(quán)利要求可容易地看到本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明詳述首先簡(jiǎn)要地描述附1圖解表示前尿激酶的氨基酸結(jié)構(gòu)，顯示可塑性環(huán)和各種特定氨基酸。
圖2a是用計(jì)算機(jī)繪制的“非活性”構(gòu)型的前尿激酶的三維空間結(jié)構(gòu)(3-D)模型，該模型顯示了活性位點(diǎn)(Ser356，His204和Asp255，紅色 )，以及不與Asp355(綠色 )發(fā)生相互作用的所謂“可塑性環(huán)”(藍(lán)色 )的Lys300和Lys313(黃色 )。
圖2b是用計(jì)算機(jī)繪制的“活性”構(gòu)型的前尿激酶的3-D模型。該模型顯示了活性位點(diǎn)(Ser356，(His204以及Asp255，紅色 )，以及與Asp355(綠色 )發(fā)生相互作用的所謂“可塑性環(huán)”(藍(lán)色 )。的Lys300和Lys313(黃色 )。
圖2c是用計(jì)算機(jī)繪制的雙鏈尿激酶的3-D模型，該模型顯示了活性位點(diǎn)(Ser356，His204和Asp255，紅色 )，Asp355(綠色 )，以及被切割的新氨基末端殘基Ile159(紫色 )。
圖3顯示了所謂的包括Ser356，His204和Asp255的“電荷傳遞系統(tǒng)(charge relay system)”和位于Asp355和Ile159之間一個(gè)“鹽橋”。
圖4描述了適用于制造本發(fā)明的前尿激酶突變體的寡核苷酸定位誘變的方式。
圖5是雙順?lè)醋觤RNA表達(dá)載體pED的概要圖，該載體適用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)前尿激酶突變體。
突變型前尿激酶的研制至今還未測(cè)出尿激酶和前尿激酶的三維空間(“3-D”)結(jié)構(gòu)。但是，已知前尿激酶/尿激酶的B鏈(它是蛋白酶區(qū))分別與胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶及其前體胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原具有顯著的同源性，它們的3-D結(jié)構(gòu)都是采用X-射線晶體照相方法而得知的。由于這些分子的同源性大于30％，因而前尿激酶/尿激酶與這些分子進(jìn)行主鏈排列時(shí)核心殘基的距離約在1.0?；蚋》秶鷥?nèi)。因此，預(yù)測(cè)得的前尿激酶/尿激酶結(jié)構(gòu)是可靠的。
氨基酸序列“同源性”是指兩個(gè)或多個(gè)氨基酸序列之間的相似性或百分等同率。可以采用例如序列分析軟件(例如，WI，Madison，威斯康星大學(xué)，遺傳計(jì)算機(jī)組的序列分析軟件包)測(cè)出兩個(gè)給定蛋白質(zhì)的同源性。同源性百分值是由完全匹配或者含有保守的氨基酸替代的序列(例如由另一個(gè)類似的氨基酸替代一個(gè)氨基酸，結(jié)果導(dǎo)致得到的蛋白質(zhì)的特性和活性發(fā)生很少或幾乎不發(fā)生變化)來(lái)確定的。
基于前尿激酶/尿激酶與胰蛋白酶(原)和胰凝乳蛋白酶(原)結(jié)構(gòu)同源性，以及前尿激酶的纖維蛋白特異性是由纖維蛋白E2片段的選擇性啟動(dòng)介導(dǎo)的這一發(fā)現(xiàn)(Liu & Gurewich，Biochemistry，316311-6317(1992)，該E2片段誘導(dǎo)Glu-血纖維蛋白溶酶原上特定構(gòu)型變化)而設(shè)計(jì)前尿激酶突變體。為了設(shè)計(jì)前尿激酶突變體，申請(qǐng)人根據(jù)分別以胰凝乳蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶的多肽主鏈的空間坐標(biāo)，以及彈性蛋白酶和胰蛋白酶(原)的結(jié)構(gòu)，研究出前尿激酶/尿激酶的蛋白酶區(qū)(B-鏈)的3-D結(jié)構(gòu)計(jì)算機(jī)模型。申請(qǐng)人還使用了兩個(gè)制作分子模型的程序，一個(gè)是CHARMM，這是一個(gè)將大分子的能量最低化以及進(jìn)行動(dòng)力學(xué)計(jì)算的程序，該程序是由哈佛大學(xué)化學(xué)系研制的，并描述于Brooks等人，J.Comp.Chem.，4187-217(1983)。另一個(gè)程序是QUANTAR，它是由Silicon Graphics，Inc.(San Francisco，CA，USA)研制的。
如

圖1、2a和2b所示，該模型清楚地顯示了前尿激酶B鏈(蛋白酶鏈)的三維空間結(jié)構(gòu)。該模型是由兩個(gè)亞區(qū)組建而成，這兩個(gè)亞區(qū)是與胰凝乳蛋白酶(原)的結(jié)構(gòu)相似的β-管形結(jié)構(gòu)，并且該模型具有下列特征。該B鏈上每個(gè)原子的空間坐標(biāo)已被明確限定。位于分子表面的Ile159共價(jià)連接到其A鏈的130-158肽上。前尿激酶的“活化區(qū)”含有三個(gè)序列(氨基酸位點(diǎn)297-313，344-353以及376-383)。序列297-313形成其可塑性比胰凝乳蛋白酶原或胰蛋白酶的類似環(huán)更小但更不穩(wěn)定的“可塑性環(huán)”(圖2a和2b中的藍(lán) 。當(dāng)該可塑性環(huán)處于某一種構(gòu)型時(shí)，該環(huán)中Lys300(黃色 )的帶ε-正電氨基團(tuán)與Asp355(綠色 )的帶負(fù)電荷羧基團(tuán)發(fā)生作用。這一相互作用把活性位點(diǎn)Ser356幾乎推入到理想位置，在這里Ser356的羥基所處位置最有利于在電荷傳遞系統(tǒng)(charge relay system)內(nèi)發(fā)生相互作用，該電荷傳遞系統(tǒng)包含另外兩個(gè)重要的活性位點(diǎn)殘基一個(gè)組氨酸和一個(gè)天冬氨酸(圖2a和2b中紅色)。Lys313(黃色 )也從另一方向與Asp355發(fā)生作用。因此，這時(shí)主要形成了前尿激酶蛋白酶區(qū)的活性位點(diǎn)和底物結(jié)合袋，沒(méi)有轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈形式。但是，由于這種“活性構(gòu)型”出現(xiàn)的概率僅為0.5％，因而未切割的單鏈尿激酶的活性僅為活性雙鏈形式活性的約0.5％。
如圖2c和3所示，在雙鏈形式中，被切割的Ile159新的氨基基團(tuán)(圖2c中紫色 與Asp355(綠色 圖2c)一起形成穩(wěn)定的“鹽橋(salt bridge)”，它可使活化區(qū)穩(wěn)定，并使整個(gè)分子活化。另一種可選情況，如果有外來(lái)力量作用，如來(lái)自于結(jié)合E2片段的血纖維蛋白溶酶酶原的作用，使“可塑性”環(huán)的活性構(gòu)型(圖2c中黃色 )穩(wěn)定，則未切割的前尿激酶單鏈形式也可以完全活化。
另外，前尿激酶模型并不包括胰凝乳蛋白酶原中的所謂“酶原三聯(lián)體(zymogen triad)”(由Asp194，His40以及Ser32形成的氫鍵網(wǎng))，因?yàn)樵撊?lián)體并不存在于天然前尿激酶中。在前尿激酶中，胰凝乳蛋白酶原三聯(lián)體的His40和Ser32分別由Tyr187和Ala175替代。該“酶原三聯(lián)體”對(duì)于使胰凝乳蛋白酶原的一個(gè)活性位點(diǎn)區(qū)的非活性構(gòu)型(含氧陰離子孔)是重要的。
利用該模型，中請(qǐng)人在前尿激酶和尿激酶的蛋白酶區(qū)域內(nèi)選擇和制作了特異的氨基酸替代模型，從而設(shè)計(jì)出特定的前尿激酶突變體，然后構(gòu)建、表達(dá)并定性這些突變體。下文中描述了四種類型的突變，這些突變方式可以達(dá)到使非特異性血纖維蛋白溶酶酶原激活降低并完全保留血栓溶解活性的預(yù)期目的。
前尿激酶的Lys300的定點(diǎn)突變利用X-射線晶體學(xué)技術(shù)進(jìn)行研究曾幫助人們解釋了為什么大多數(shù)蛋白酶的單鏈酶原形式“沒(méi)有”活性，并且怎樣裂解一個(gè)單鍵會(huì)誘導(dǎo)出具全部活性的酶的形成。但是前尿激酶比其他大多數(shù)酶原具有更大的內(nèi)在活性，但是它比單鏈組織血纖維蛋白溶酶原激活因子(SC-t-PA)活性要低。具體來(lái)說(shuō)，胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原僅為其相應(yīng)的活化雙鏈酶形式活性的約10-6。SC-t-PA具有雙鏈t-PA活性的約10-1.5。前尿激酶具有其雙鏈衍生物UK活性的約10-2.3。
絲氨酸蛋白酶原激活為活性酶的一個(gè)主要方面是該酶原的新氨基末端α-氨基基團(tuán)移動(dòng)進(jìn)該酶原的表面小袋，在其中該基團(tuán)與一個(gè)天冬氨酸形成一個(gè)所謂的“鹽橋”，該天冬氨酸在該蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)中在氨基酸序列上與絲氨酸相毗鄰。圖3用圖解方法顯示了發(fā)生的這一系列事件。該鹽橋是在雙鏈尿激酶的新氨基末端(Ile159的正電荷α-氨基，或前尿激酶中的相應(yīng)基團(tuán)，與天冬氨酸殘基(Asp355)的側(cè)鏈的負(fù)電荷羧基基團(tuán)之間形成的離子鍵或靜電作用。
該鹽橋的形成導(dǎo)致絲氨酸羥基旋轉(zhuǎn)至一個(gè)新位置，該位置上最有利于在電荷傳遞或質(zhì)子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)內(nèi)發(fā)生相互作用(這是催化反應(yīng)的關(guān)鍵)，并由三個(gè)主要活性位點(diǎn)殘基形成His，Asp和Ser(圖2a-2c(紅色 和3)。該鹽橋的形成也使含有三個(gè)序列(297-313，344-353和376-383)的、被稱為前尿激酶的“活化區(qū)”的區(qū)域穩(wěn)定。
在非活性的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原中，X-射線晶體衍射圖沒(méi)有反映出這些活化區(qū)域，這歸因于這些區(qū)域空間位置不固定，容易搖擺不定。這些區(qū)域圍繞著底物結(jié)合袋，這就可以解釋為什么酶原不與底物結(jié)合。在激活的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶中，正如Huber等人，在Acct，Chem，Res.，11114-122(1978)描述的，這些區(qū)域是固定的并且在X-射線晶體衍射圖中可明顯地看到。
正如Heckel等人，J.Comp.Aided Mol.Des.，27-14(1988)和Peterson等人，Biochem.，293451-57(1990)描述，在SC-t-PA中，帶正電荷的Lys416的ε-氨基(編號(hào)按t-PA)通過(guò)Asp477(編號(hào)按t-PA)而顯示出代用鹽橋的作用，將活性位點(diǎn)Ser478(編號(hào)按t-PA)幾乎推入到理想位置。在前尿激酶中，在相同于SC-t-PA中的Lys416位置上有一個(gè)Lys300(編號(hào)按前尿激酶)。前尿激酶Lys300的帶正電荷的ε-氨基被假定是尿激酶的新末端Ile159α-氨基的代用物。但是，有一個(gè)鄰接的Glu301，看來(lái)它可以降低其影響。在Asn302殘基上有一個(gè)糖基化位點(diǎn)，在鄰近的Ser303殘基上有一個(gè)磷酸化位點(diǎn)。這種排列可以解釋前尿激酶高的(相對(duì)于胰凝乳蛋白酶原)內(nèi)在活性的部分(相對(duì)于SC-t-PA)來(lái)源。
基于這些考慮，申請(qǐng)人已對(duì)一組突變進(jìn)行分類，其中，Lys300和/或其周圍殘基突變?yōu)閹追N不同類型的氨基酸殘基，以便調(diào)節(jié)該位點(diǎn)和Asp355(編號(hào)按前尿激酶)之間的電子作用，從而盡可能多地降低天然前尿激酶的內(nèi)在活性，但保留其纖維蛋白啟動(dòng)能力和天然前尿激酶的雙鏈形式活性。下列編號(hào)為1-5的前尿激酶突變體描述了該組突變體。這些突變體是采用下文中描述的定點(diǎn)誘導(dǎo)技術(shù)和基因表達(dá)技術(shù)制備的。
突變體1Lys300→Ala用中性氨基酸丙氨酸(Ala)替代前尿激酶中的Lys300，這種替代不會(huì)影響該分子的折疊，但被設(shè)計(jì)用來(lái)消除300位和Asp355之間的鹽橋而降低內(nèi)在活性。一旦設(shè)計(jì)完成計(jì)算機(jī)模型，就按下文描述制備和檢測(cè)該突變體。結(jié)果顯示，該突變體沒(méi)有可檢測(cè)到的內(nèi)在活性，因此它在血漿中是非常穩(wěn)定的。在以大于10mg/ml的濃度保溫24小時(shí)以上時(shí)沒(méi)有誘導(dǎo)血纖維蛋白原降解。這一穩(wěn)定性比天然前尿激酶在體外誘導(dǎo)血漿血纖維蛋白原降解50％時(shí)使用的濃度至少高出10倍。
這種突變體的雙鏈形式時(shí)的活性(在血纖維蛋白溶酶激活之后)被降低(為尿激酶活性的33％)，其受血纖維蛋白E2片段啟動(dòng)后活性也降低(為前尿激酶活性的40％)。
突變體2Lys300→His作為第二種可選擇方案，用組氨酸(His)替代前尿激酶模型中的Lys300。組氨酸能夠在pH低于6.5時(shí)獲得一個(gè)氫離子變成帶正電荷，但沒(méi)有象賴氨酸中的ε-氨基電荷一樣強(qiáng)。在前尿激酶模型中，His300的咪唑基團(tuán)被包裹在分子內(nèi)部，處于比在外面時(shí)更低的能量狀態(tài)，因?yàn)檫溥蚧喈?dāng)疏水。由于它面向Asp355，這使咪唑基帶有正電荷，這就使局部環(huán)境呈酸性。因此，在Asp355和His300之間存在一個(gè)弱鹽橋，使His300的行為類似于弱Lys300。由于His的靜電荷依據(jù)局部環(huán)境而定，并且如下文中描述的該His300定位于可塑性環(huán)區(qū)域(297-313)，因而該調(diào)制子(E2片段)仍調(diào)節(jié)前尿激酶的內(nèi)在活性。基于Lys300→Ala的資料以及His相對(duì)于Lys的特性，突變體2的內(nèi)在活性也應(yīng)該比天然前尿激酶的相應(yīng)活性低10倍，但比突變體1的活性要高。但是，應(yīng)該保留雙鏈型活性以及纖維蛋白激活能力，并應(yīng)該比突變體1高，但比天然前尿激酶低。
突變體3Gly299→His/Lys300→Ala在前尿激酶模型中，在前尿激酶的主鏈上的Gly299羰基基團(tuán)的氧與Asp355形成一個(gè)氫鍵。在胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原中也存在上述鍵結(jié)構(gòu)。當(dāng)在模型中用His替代Gly299時(shí)，在His299和Asp355之間形成了一個(gè)強(qiáng)鹽橋，其強(qiáng)度大于His300和Asp355之間形成的橋，因此，阻止了該鹽橋的形成。His299的局部環(huán)境受活性位點(diǎn)、底物結(jié)合袋或其他內(nèi)部區(qū)域變化的影響大于受前尿激酶的可塑性環(huán)構(gòu)象變化的影響。相反，His300突變體(突變體2)應(yīng)該有相反的行為，即它應(yīng)該更多地受環(huán)區(qū)域構(gòu)象變化的調(diào)節(jié)?；贖is相對(duì)于Gly的特性，突變體3的內(nèi)在活性和雙鏈型活性應(yīng)該比突變體2高2倍。但是，其纖維蛋白激活能力應(yīng)比突變體2降低20％以上，但要比突變體1高。
突變體4Lys300→Ala/Glu301→Ala如果以一個(gè)中性丙氨酸替代帶正電荷的Lys300，則Glu301的負(fù)電荷變得太強(qiáng)以致于不能吸引Ile159的α-氨基從而避免它與Asp355發(fā)生相互作用。這導(dǎo)致活化的突變體1雙鏈型(UK)溶解血栓能力降低。因此，通過(guò)用中性丙氨酸替代Lys300和Glu301而設(shè)計(jì)成雙重突變來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。根據(jù)模型，以及相對(duì)于Lys和Glu的中性Ala的特性，突變體4應(yīng)該具有幾乎相同于突變體1的特性，但是它的雙鏈型活性應(yīng)比突變體1高出2倍。
突變體5Lys300→His/Glu301→Ala該突變體是突變體2和突變體4的結(jié)合物?；贏la300前尿激酶突變體1的特性，帶正電荷殘基(300)對(duì)于激發(fā)單鏈的內(nèi)在活性和雙鏈型活性是重要的。因此，該雙重突變體，突變體5在內(nèi)在活性和纖維蛋白激發(fā)能力方面應(yīng)該相似于突變體2，但其雙鏈型活性應(yīng)該更高。
突變體1—5顯示了怎樣可將內(nèi)在活性，雙鏈型活性，以及纖維蛋白激發(fā)能力相對(duì)于天然前尿激酶進(jìn)行調(diào)整。這些調(diào)整可采用定點(diǎn)誘變和結(jié)構(gòu)模型技術(shù)在真正的前尿激酶突變體上完成。這些突變體基本上達(dá)到三個(gè)目的(1)降低了血纖維蛋白原的降解(低內(nèi)在活性)，(2)未改變纖維蛋白啟動(dòng)能力(保留了纖維蛋白啟動(dòng)能力)以及(3)在血纖維蛋白溶酶激活之后具有相當(dāng)于天然前尿激酶的活性(雙鏈型活性)。因此，這些突變體具有較高的治療用途。
前尿激酶的可塑性環(huán)的定點(diǎn)誘變對(duì)內(nèi)在活性起著關(guān)鍵作用的前尿激酶的另一結(jié)構(gòu)就是由297—313位氨基酸形成的所謂的“可塑性環(huán)”(圖1，圖2a和2b(藍(lán) ))，在所有絲氨酸蛋白酶和它們的酶原中該環(huán)是最混亂或搖擺不定的區(qū)域。該區(qū)域提供了酶/酶原功能調(diào)節(jié)的機(jī)制。
該環(huán)在胰凝乳蛋白酶中被裂解，但在t-PA和前尿激酶中，一種Lys416/300突變體涉及內(nèi)在活性。基于前尿激酶/尿激酶模型，鑒別出了該環(huán)的一個(gè)明確的“活性”構(gòu)型(圖2b中的藍(lán) )，在天然前尿激酶中，該“活性”構(gòu)型與其他各種“非活性”構(gòu)型處于動(dòng)力學(xué)平衡中。在“活性”構(gòu)型中，該環(huán)上僅有的帶正電殘基Lys300被定位于面朝該分子的里面，從而與Asp355(綠色 一起形成鹽橋，結(jié)果導(dǎo)致產(chǎn)生一個(gè)全活性催化位點(diǎn)。與之相比，在“非活性”構(gòu)型中，該環(huán)(圖2a的藍(lán)色 被向上翻轉(zhuǎn)使Lys300正電荷不與Asp355(綠色 )排成一直線，從而使酶原失活。
所觀察到的前尿激酶的活性表明了該平衡偏向于非活性構(gòu)型，僅0.5％處于活性構(gòu)型，這與前尿激酶的內(nèi)在活性相對(duì)于其活性雙鏈形式(UK)的百分?jǐn)?shù)相一致。
起初的研究證明，在可塑性環(huán)中，三個(gè)帶負(fù)電殘基(Glu301，Asp305和Glu310)的側(cè)鏈總是定位于環(huán)上與Lys300相反的一邊。當(dāng)帶負(fù)電的殘基的側(cè)鏈被約束在該分子的外面時(shí)，則極有可能Lys300的ε-氨基將與Asp355形成鹽橋。換句話說(shuō)，當(dāng)三個(gè)帶負(fù)電殘基被約束在該分子的外面時(shí)，有利于活性構(gòu)型形成。
當(dāng)前尿激酶與結(jié)合了E2片段的Glu-血纖維蛋白溶酶原發(fā)生相互作用時(shí)，來(lái)自于E2片段-Glu-血纖維蛋白溶酶原復(fù)合體的外部靜電作用力，通過(guò)吸引該分子外的三個(gè)帶負(fù)電側(cè)鏈(Glu301，Asp305和Glu310)而使活性構(gòu)型穩(wěn)定。因此，Lys300被定位于面對(duì)該分子里面的位置上并且與Asp355形成鹽橋。結(jié)果，前尿激酶在沒(méi)有轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的情況下被完全活化。
可以進(jìn)一步提高該環(huán)的可塑性的使可塑性環(huán)定位誘變方法將使產(chǎn)生“活性”構(gòu)型的可能性降低至低于0.5％。如果該突變體在轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈形式之后保留相似的雙鏈型活性，并且與天然前尿激酶相比保留相似的纖維蛋白激活能力，則它將是一種能達(dá)到三種預(yù)期目的的優(yōu)良的激活子。這樣一種突變體在血漿中具有較低的內(nèi)在活性但在纖維蛋白(E2片段)存在下以及在雙鏈形式時(shí)是完全活化的。
基于這些考慮，申請(qǐng)人劃分出了第二組突變體，這組突變體降低了“活化”構(gòu)型存在的概率，但保留了可被E2片段-Glu-血纖維蛋白溶酶原復(fù)合體誘導(dǎo)“活性”構(gòu)型的特性，以及雙鏈型活性。這組突變體可用下面編號(hào)為6的前尿激酶突變體來(lái)描述。
突變體6Tyr306→Gly基于前尿激酶的內(nèi)在活性是“活性”和“非活性”構(gòu)型之間平衡的函數(shù)這一概念，則環(huán)可塑性的提高應(yīng)可降低內(nèi)在活性。因此，設(shè)計(jì)了一種Tyr306→Gly突變體，其中該環(huán)的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)被打破從而提高了它的可塑性。因此，該突變體應(yīng)具有降低了的內(nèi)在活性，但應(yīng)仍保存E2片段激發(fā)作用、雙鏈活性和血纖維蛋白激活作用。因此，突變體6會(huì)有較好的治療作用。
前尿激酶的Lys303定點(diǎn)突變前尿激酶的Lys313是尿激酶的新末端α-氨基基團(tuán)的另一個(gè)替代物。如圖1和2b所示，Lys313(黃色 的行為可以象Lys300，與Asp355(綠色 )一起形成一個(gè)鹽橋，這樣能導(dǎo)致前尿激酶的內(nèi)在活性提高。Lys313與Asp355的相互作用是受可塑性環(huán)的運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)的。因此，這種相互作用的消除將進(jìn)一步降低前尿激酶的內(nèi)在活性。基于這些考慮，申請(qǐng)人已設(shè)計(jì)了下列突變體7和8。
突變體7Lys313→Ala如圖1和2b所示，Lys313(圖2b的黃色 )定位于可塑性環(huán)(圖1的297-313，圖2b的藍(lán)色 )的末端以及靠近于Asp355(綠色 )處。與Lys300相似，Lys313的ε-氨基正電荷具有作為尿激酶的新末端α-氨基的替代物的作用并與Asp355形成一個(gè)鹽橋，該鹽橋方向與Lys300形成的鹽橋方向相反。有利的是，該突變體沒(méi)有影響雙鏈尿激酶的活性，因?yàn)楫?dāng)新的末端氨基(Ile159)被產(chǎn)生而通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)與雙鏈尿激酶中的Asp355形成另一個(gè)鹽橋時(shí)就打破了該鹽橋。
與之相反，由于在雙鏈型中存在Lys300和Asp355之間的電荷作用并且這種電荷作用對(duì)雙鏈型的活性起作用，因而Lys300確實(shí)影響雙鏈型的活性。類似地，在SC-t-PA的相應(yīng)的氨基酸位置上也有一個(gè)Lys殘基，已證明該殘基與其高內(nèi)在活性相關(guān)。
突變體8Lys313→His在該突變體中，用His替代Lys313，該His比Lys具有更低的正電荷。基于類似于上文中描述的有關(guān)突變體2的基本原理，設(shè)計(jì)該突變體用于校正突變體7。
突變體7和8應(yīng)比天然前尿激酶具有更低的內(nèi)在活性，因?yàn)樗鼈冏柚沽伺cLys313形成鹽橋，但其內(nèi)在活性應(yīng)高于突變體1和2。它們的雙鏈型活性應(yīng)基本上相同于天然UK(雙鏈型)。它們的纖維蛋白激活能力也被保留了，并近似于天然前尿激酶。因此，這些突變體在臨床上也有用途。
在前尿激酶中定點(diǎn)突變形成一個(gè)“酶原三聯(lián)體”胰凝乳蛋白酶和胰凝乳蛋白酶原的X-射線結(jié)構(gòu)證明，由“酶原三聯(lián)體”(由Asp194，His40和Ser32組成，編號(hào)是用胰凝乳蛋白酶編號(hào))氫鍵網(wǎng)的形成對(duì)于胰凝乳蛋白酶原活性位點(diǎn)區(qū)域(含氧陰離子裂口)非活性構(gòu)型的穩(wěn)定是重要的。但是，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)在前尿激酶或t-PA中未出現(xiàn)酶原三聯(lián)體。在前尿激酶中，胰凝乳蛋白酶原三聯(lián)體的His40和Ser32是分別由Tyr187和Ala175代表的。該缺失的三聯(lián)體也對(duì)前尿激酶或t-PA的更高的內(nèi)在活性起作用。
作為設(shè)計(jì)具有所需特性的前尿激酶突變體的另一種可選擇的方法，在天然前尿激酶中制造“酶原三聯(lián)體”可降低它的內(nèi)在活性，而不會(huì)影響其溶解血栓活性所需的其他功能。
突變體9Ala175→Ser/Tyr187→His設(shè)計(jì)這種雙重突變體，以便在前尿激酶中導(dǎo)入類似于在胰凝乳蛋白酶原中存在的“酶原三聯(lián)體”。這種突變應(yīng)降低前尿激酶的內(nèi)在活性，但并不影響E2片段的激活作用，以及雙鏈型的活性。因此，這種突變體也應(yīng)達(dá)到上述的三個(gè)目標(biāo)，并可用作為血栓溶解劑。
聯(lián)合突變申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，前尿激酶的內(nèi)在活性依賴于幾個(gè)不同的分子內(nèi)相互作用，這些相互作用包括(1)在單鏈型中作為尿激酶的新末端α氨基的替代物的Lys300或Lys313；2)缺乏“酶原三聯(lián)體”；以及3)可塑性環(huán)(297—313)活性構(gòu)型的較低可塑性和較高出現(xiàn)概率。因此，僅基于一方面的突變不能最大程度地消除內(nèi)在活性，這種突變正在損傷而沒(méi)有消除雙鏈型活性以及纖維蛋白激活能力，而這是血栓溶解活性所需要的。但是，影響兩種或多種這些分子相互作用的多重突變可以獲得一種最合適的前尿激酶突變體。基于這些考慮，申請(qǐng)人已經(jīng)設(shè)計(jì)一組聯(lián)合突變體，由下列突變體10—17進(jìn)行描述。
突變體10—17的所有突變體都有一個(gè)人工酶原三聯(lián)體，這可以減少內(nèi)在活性，并且大多數(shù)將Lys313中和或使其最小程度地帶有正電荷，以便阻止或減弱鹽橋的形成，這也可以減少內(nèi)在活性。同樣，這些聯(lián)合突變體中有幾種也使Lys300中和或使之帶有較少正電荷。Tyr306→Gly的突變通過(guò)提供更多的可塑性而降低了可塑性環(huán)活性構(gòu)型出現(xiàn)的概率，并且Glu301→Ala的突變阻礙了Ile159和Asp355之間的相互作用，于是保留了雙鏈型活性。突變體10Ala175→Ser/Tyr187→His/Lys313→Ala突變體11Ala175→Ser/Tyr187→His/Tyr306→Gly突變體12Ala175→Ser/Tyr187→His/Lys313→His突變體13Ala175→Ser/Tyr187→His/Tyr306→Gly/Lys313→Ala突變體14Ala175→Ser/Tyr187→His/Lys300→Ala/Glu301→Ala/Lys313→Ala突變體15Ala175→Ser/Tyr187→His/Lys300→His/Glu301→Ala/Lys313→Ala突變體16Ala175→Ser/Tyr187→His/Lys300→Ala/Glu301→Ala/Lys313→His突變體17Ala175→Ser/Tyr187→His/Lys300→His/Glu301→Ala/Lys313→His所有這些突變體最令人滿意的是應(yīng)該完成三個(gè)計(jì)劃目標(biāo)(1)在血漿中具有低內(nèi)在活性和高穩(wěn)定性，(2)不改變其纖維蛋白激發(fā)能力以及顯著高的纖維蛋白特異性，以及(3)在血纖維蛋白溶酶激活之后與天然前尿激酶相比具有相等的雙鏈型活性。因此，這些突變體應(yīng)該在比天然前尿激酶更高的劑量時(shí)高效地溶解血栓栓塞塊而沒(méi)有誘導(dǎo)出血并發(fā)癥。而且，它們應(yīng)該可用作為藥物以阻止閉合的纖維蛋白栓塞形成。因?yàn)樗鼈冊(cè)跊](méi)有纖維蛋白的血漿中是非常惰性的，因而是十分安全的。因此，這些突變體有高的治療功效。
前尿激酶突變體的制備針對(duì)寡聚核苷酸的誘變適用于制備本文中描述的前尿激酶突變體的定點(diǎn)誘變的一種類型是寡聚核苷酸定點(diǎn)誘變，這種方法可使現(xiàn)有DNA序列，即天然前尿激酶，發(fā)生特異性變化。編碼天然前尿激酶的基因已被完全定性并可從例如Dr.David Dichek(NIH)和Dr.Paolo Sarmientos(Primm，Milano，Italy)處得到。在ATCC的保藏號(hào)為DNA 57329或細(xì)菌/噬菌體57328。還可從NIH計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)Protein IdentityResource中以UKHU名稱得到。前尿激酶的氨基酸序列顯示于圖1中。
通過(guò)合成序列中含有所需突變的一個(gè)寡核苷酸引物，將該引物與含有天然序列的模板進(jìn)行雜交，并用T4 DNA聚合酶延伸之，可以完成寡核苷酸定點(diǎn)誘變。由于在寡核苷酸中存在突變，得到的產(chǎn)物因而是一個(gè)含有一個(gè)錯(cuò)配的異質(zhì)雙鏈分子。在例如大腸桿菌細(xì)胞中修復(fù)該錯(cuò)配后該突變就被固定下來(lái)。該方法的詳細(xì)描述參見(jiàn)例如Ausubel等人(eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 8.1(Greene Pubishing Associates 1989，Supp.13)，引入本文作為參考。
這種定點(diǎn)誘變方法的基礎(chǔ)是使用一種DNA模板，該模板含有少量替代胸腺嘧啶的尿嘧啶殘基(圖4)。該含有尿嘧啶的DNA是在大腸桿菌dut-ung-菌株中產(chǎn)生的。在該dut-ung-組合突變體中，脫氧尿苷摻入到DNA中替代胸苷并且沒(méi)有被除去。于是，可將含有待改變的序列的載體在dut-ung-宿主中生長(zhǎng)以便制備含有尿嘧啶的DNA模板用于定點(diǎn)誘變。如圖4所示，將經(jīng)突變的寡核苷酸引物與該DNA模板退火，并用T4 DNA聚合酶和T4 DNA連接酶處理以便產(chǎn)生雙鏈環(huán)狀分子。
該寡核苷酸引物應(yīng)該是高質(zhì)量的，即是從不完整DNA合成中產(chǎn)生的低分子量雜質(zhì)中純化出來(lái)的。在某些情況下，尤其是對(duì)于大于40個(gè)核苷酸的寡核苷酸，用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純化是必要的。
在以體外反應(yīng)為特點(diǎn)的定點(diǎn)誘變方法中，無(wú)法將含有尿嘧啶的DNA模板與正常模板分開(kāi)。由于在該模板中dUMP與TMP具有相同的編碼潛力，因而尿嘧啶不是誘變性的。此外，在該模板中尿嘧啶的存在不是DNA體外合成的抑制因素。因而，該DNA可用作產(chǎn)生互補(bǔ)鏈的模板，該互補(bǔ)鏈含有所需的DNA序列變化，但是僅含有TMP而不含有dUMP殘基。
在完成體外反應(yīng)之后，通過(guò)尿嘧啶N-糖基化酶的作用，或者通過(guò)將體外反應(yīng)的未進(jìn)行分離的產(chǎn)物導(dǎo)入到野生型(dut+ung+)大腸桿菌細(xì)胞中而從該模板鏈中除去尿嘧啶。用糖基化酶處理釋放尿嘧啶，在該模板鏈中產(chǎn)生致死的脫嘧啶(AP)位點(diǎn)。于是該模板鏈的生物學(xué)活性喪失，并且其子代大多數(shù)是從感染性互補(bǔ)鏈產(chǎn)生的，該互補(bǔ)鏈含有所需的變化。這導(dǎo)致高效率地產(chǎn)生突變DNA(通常為50％)，并由此可采用DNA序列分析法篩選出突變DNA。
如Smith，Ann.Rev.Genet.，19423-463(1986)的描述，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出采用引物延伸高效率地產(chǎn)生突變體而進(jìn)行體外誘變的幾種方案。本文描述的方案是一種簡(jiǎn)單的定點(diǎn)誘變方案，適用于一種特定的含尿嘧啶的模板，用該方案可快速和高效地回收突變DNA，原始方法可參見(jiàn)Kunkel，Proc，Natl，Acad，Sci，U.S.A.，82488-492(1985)，和Kunkel等人，Meth.Enzymol.，154367382(1987)的描述，所有這些都引入本文作為參考。原則上，這樣的模板可應(yīng)用到大多數(shù)其他方案中。
將前尿激酶基因連接到質(zhì)粒M13mp18的HindIII/XbaI位點(diǎn)，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，分離單鏈DNA，并完成如上所述的寡核苷酸定點(diǎn)誘變，即可以產(chǎn)生突變體1。
前尿激酶突變體DNA的表達(dá)一旦獲得了帶有所需突變的前尿激酶，則必須將其克隆到合適的表達(dá)載體中。然后必須將該載體導(dǎo)入到一個(gè)細(xì)胞系(例如細(xì)菌，哺乳動(dòng)物細(xì)胞或酵母)中，以便表達(dá)前尿激酶突變體。該突變體可從培養(yǎng)基或從酵母細(xì)胞中回收，然后純化。這些技術(shù)都是分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員熟知的，并在，例如Ausubel等人(eds.)，Current Protcols in Molecular Biology，Chapters 9和16，見(jiàn)上文；以及Sambrook，F(xiàn)ritsch，和Maniatis，Molecular Cloning(2nd ed.)，Chapter 16(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中有詳細(xì)描述，所有這些都引入本文作為參考。
有幾種方法可將前尿激酶突變體基因?qū)氲讲溉閯?dòng)物細(xì)胞中。一種方法包括將一種載體轉(zhuǎn)染到中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(“CHO”)細(xì)胞中。在該方案中，用一種選擇性標(biāo)記與該突變型前尿激酶一起共轉(zhuǎn)染，使該基團(tuán)穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞染色體中，并且隨后被擴(kuò)增。CHO細(xì)胞系統(tǒng)是優(yōu)選的，這是因?yàn)樗茉陂L(zhǎng)時(shí)期內(nèi)產(chǎn)生大量突變型前尿激酶。例如CHO DXB11或CHO DG44細(xì)胞系可從Columbia大學(xué)的Lawr-ence Chasin處獲得。細(xì)胞系CHO GRA可從Genetics Institute Ran-dall Koufman處獲得。
另一種表達(dá)方法包括將含有突變DNA的載體轉(zhuǎn)染到PET-19B大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(Novagen，Madison，WI)中。例如，在定點(diǎn)誘變之后，將編碼突變體1(Lys300→Ala)的DNA進(jìn)行測(cè)序以確保發(fā)生突變，然后連接到一種高效大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng)PET-19B(Novagen，Madison，WI)的NdeI/XhaI位點(diǎn)上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)，并在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入誘導(dǎo)劑IPTG而誘導(dǎo)前尿激酶突變體的表達(dá)。
將載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞系時(shí)，也需通過(guò)選擇出宿主染色體內(nèi)的高拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)染DNA而增加所需蛋白質(zhì)(例如突變型前尿激酶)的表達(dá)。使被轉(zhuǎn)染的DNA進(jìn)行共擴(kuò)增可導(dǎo)致由該轉(zhuǎn)染DNA編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)提高100-1000倍。在文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了20個(gè)以上可選擇和可擴(kuò)增的基因，但用轉(zhuǎn)染的二氫葉酸還原酶基因進(jìn)行氨甲喋呤選擇和擴(kuò)增已獲得很多經(jīng)驗(yàn)和最大成功。例如采用共擴(kuò)增方法通過(guò)氨甲喋呤抗性選擇，可用二氫葉酸還原酶缺陷型CHO細(xì)胞獲得突變型前尿激酶基因的高水平表達(dá)。
利用CHO細(xì)胞表達(dá)載體進(jìn)行擴(kuò)增用pED系列的雙順?lè)醋虞d體可使一種靶基因在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中進(jìn)行高水平表達(dá)(圖5)。這些載體攜帶一個(gè)克隆序列以便于一個(gè)靶基因(例如突變型前尿激酶基因)插入，其后跟隨著可選擇和可擴(kuò)增的標(biāo)記基因，即二氫葉酸還原酶(“DHFR”)。根據(jù)其在無(wú)核苷培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)能力，可選擇出用合適載體轉(zhuǎn)化的DHFR缺陷型CHO細(xì)胞。隨后在逐漸增加濃度的作為DHFR功能的一種強(qiáng)抑制劑的氨甲喋呤存在下進(jìn)行周期性選擇，結(jié)果導(dǎo)致被整合的DNA擴(kuò)增并使所需基因產(chǎn)物的表達(dá)提高。圖5中顯示的pED載體描述于Kaufman等人，Nucl.Acids.Res.，194485-4490(1991)中，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
可以利用電穿孔，磷酸鈣，或脂質(zhì)體介導(dǎo)的技術(shù)(詳細(xì)內(nèi)容參見(jiàn)Current Protocols in Molecular Biology)，將合適載體(例如pED)中的突變型前尿激酶和DHFR基因轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中。對(duì)于CHODXB11細(xì)胞，優(yōu)選的是用磷酸鈣處理之后接著用甘油休克。然后將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞置于選擇性培養(yǎng)基中，并在生長(zhǎng)幾天之后，挑取含大約500個(gè)細(xì)胞的大的健康集落進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增之前將選擇出的集落在分開(kāi)的平板上生長(zhǎng)。
在擴(kuò)增穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子之前，應(yīng)該用Southern分析法分析細(xì)胞DNA，或用突變型前尿激酶的功能檢測(cè)方法分析RNA，以確保細(xì)胞中已整合入所需的突變型前尿激酶基因。然后將選出的細(xì)胞置于氨甲喋呤溶液中，這一步提高了選擇水平，因?yàn)榘奔奏┻适荄HFR的一種強(qiáng)抑制劑。通過(guò)將細(xì)胞平分到該培養(yǎng)基中，選出能制造高水平DHFR的細(xì)胞。一般來(lái)說(shuō)這一步是通過(guò)提高轉(zhuǎn)染的DHFR基因的拷貝數(shù)來(lái)完成的。與此同時(shí)，與DHFR基因共轉(zhuǎn)染的突變型前尿激酶基因的拷貝數(shù)也提高。用越來(lái)越高水平的氨甲喋呤選擇出有最高拷貝數(shù)的DHFR基因的細(xì)胞，并因此有最高拷貝數(shù)的所需突變型前尿激酶基因的細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞在20-80μM氨甲喋呤中生長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞應(yīng)含有500-2000拷貝的轉(zhuǎn)染的突變型前尿激酶基因。前尿激酶突變體的提取和純化在突變型前尿激酶由諸如哺乳動(dòng)物或細(xì)菌細(xì)胞系表達(dá)之后，必須從培養(yǎng)基中提取并純化。對(duì)于酵母細(xì)胞培養(yǎng)物的情況，首先必須用例如加玻璃珠的機(jī)械破碎法打碎酵母細(xì)胞，以便產(chǎn)生含有突變型前尿激酶的細(xì)胞提取物。從細(xì)胞培養(yǎng)基或細(xì)胞提取物中純化活性突變型前尿激酶的操作一般包括步驟1)液/液相萃取或起始過(guò)濾步驟，2)疏水親和層析，3)抗體親和層析，以及4)凝膠過(guò)濾層析。這些步驟是分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員熟知的，詳見(jiàn)Current Proto-cols in Molecular Biology，Chapter 10。
用超聲處理法裂解含有前尿激酶突變體1的大腸桿菌細(xì)胞，由于在帶有一個(gè)腸激酶切割位點(diǎn)(DDDDK)的前尿激酶的N-末端的前頭插入了聚-His，因而可將裂解液加到Nickel親和層析柱上。將純化的前尿激酶突變體與固定化的腸激酶一起保溫，在Nickel親和柱上進(jìn)行重復(fù)層析而移去N-末端聚-His。按照Winkler & Blaber，Biochemistry，254041-4045(1986)，以及Orsini等人，Eur.J.Biochem.，195691-697(1991)描述，將樣品進(jìn)一步通過(guò)S-Seph-arose，羥磷灰石，Sephacryl S-200以及在折疊之后苯甲酸脒層析而進(jìn)一步純化。用二異丙基氟磷酸(DFP)處理除去少量雜質(zhì)UK。
前尿激酶突變型分析如在突變型1中所做的，將前尿激酶突變體的特性與大腸桿菌產(chǎn)生的rec-pro-UK(重組前尿激酶)進(jìn)行比較。檢測(cè)內(nèi)在活性，在早期時(shí)E2片段激發(fā)的Glu-血纖維蛋白溶酶原激活作用以及在血漿環(huán)境中對(duì)血纖維蛋白溶酶激活以及凝塊裂解的敏感性，以便測(cè)定出可用少量前尿激酶突變體獲得的分析概況，這種概況可預(yù)測(cè)該突變體在體內(nèi)作為血栓溶解劑時(shí)怎樣起作用。內(nèi)在活性檢測(cè)這些檢測(cè)法是基于S2444，尿激酶的一種合成底物，的水解和Glu-血纖維蛋白溶酶原的活化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)分析。
S2444水解在室溫以及0.05M磷酸鈉，0.15M NaCl，0.2％BSA以及0.01％吐溫80(PH 7.8)中，將4.0nM的尿激酶或1.0μM的前尿激酶突變體1與一定濃度范圍(0.03，0.06，0.12，0.18，0.24，0.3，0.6，1.2，1.8和2.4mM)和S2444一起保溫。在一個(gè)微滴板讀數(shù)器中以490nm作參照波長(zhǎng)在410nm(410/490nm)時(shí)測(cè)出線性O(shè)D值隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而測(cè)出反應(yīng)速率。突變體1顯示幾乎沒(méi)有S2444水解活性。
Glu-血纖維蛋白溶酶原激活在一個(gè)微滴板讀數(shù)器(DynatechMR5000)中，在選定的波長(zhǎng)410nm以及參照波長(zhǎng)490nm(410/490nm)處測(cè)出反應(yīng)混合物的OD隨時(shí)間的增長(zhǎng)值而獲得Glu-血纖維蛋白溶酶原激活的時(shí)間-光吸收值曲線。該反應(yīng)混合物含有S2251(1.5mM)，Glu-血纖維蛋白溶酶原(1.0，1.5，2.5，3.5，4.5，5.5，7.5和10.0μM)以及尿激酶(0.2nM)或前尿激酶突變體1(5.0nM)。反應(yīng)物被配制于0.05M磷酸鈉，0.15M NaCl，0.2％BSA，0.01％吐溫-80，pH7.8溶液中，并在室溫下保溫。突變體1顯示約4IU/mg的血纖維蛋白溶酶原激活活性，該活性僅為天然前尿激酶活性1％，天然前尿激酶的活性為約400IU/mg。由纖維蛋白E2片段激活血纖維蛋白溶酶原的分析用微滴板讀數(shù)器，以490nm作參照波長(zhǎng)，在410nm(410/490nm)測(cè)出反應(yīng)混合物的OD值隨時(shí)間增長(zhǎng)值，即可決定在E-2片段存在下前尿激酶突變體1對(duì)Glu-血纖維蛋白溶酶原的激活。該反應(yīng)混合物含有1.5mM S2251(一種血纖維蛋白溶酶的合成底物)，Glu-血纖維蛋白溶酶原(1.0，2.0，4.0&8.0μM)，5.0μM的E-2片段，以及1.0nm的前尿激酶突變體1，0.05M磷酸鈉，0.15M NaCl，0.2％BSA，0.01％吐溫80，室溫下pH7.8。在纖維蛋白E-2片段存在下由突變體1對(duì)血纖維蛋白溶酶原的激活僅為天然前尿激酶的40％。天然前尿激酶血纖維蛋白溶酶原激活在纖維蛋白E2片段存在時(shí)比沒(méi)有纖維蛋白激發(fā)時(shí)高出250倍。血纖維蛋白溶酶敏感性檢測(cè)血纖維蛋白溶酶敏感性檢測(cè)是由Lys-血纖維蛋白溶酶激活前尿激酶突變體的動(dòng)力學(xué)研究。在1.2mM S2444存在下，在0.05MTris·HCl，0.15M NaCl，0.01M CaCl2和0.01％吐溫80，pH7.4于室溫下將一定范圍內(nèi)濃度(0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，2.5，3.5&5.0μM)的前尿激酶突變體1與Lys-血纖維蛋白溶酶(0.1nM)保溫足夠長(zhǎng)時(shí)間。將同樣范圍濃度的前尿激酶突變體在沒(méi)有血纖維蛋白溶酶時(shí)與S2444一起保溫作為對(duì)照。在對(duì)照條件下0.1nm血纖維蛋白溶酶對(duì)S2444的水解沒(méi)有直接的影響。用一個(gè)微滴板讀數(shù)器(MR 5000；Dynatech Laboratories，Inc.，Al-exandria，VA)以490nm作為參照波長(zhǎng)，在410nm時(shí)檢測(cè)OD值隨時(shí)間的增長(zhǎng)(410/490nm)而測(cè)出從前尿激酶突變體1產(chǎn)生的尿激酶的量。發(fā)現(xiàn)，突變體1具有類似于天然前尿激酶的血纖維蛋白溶酶敏感性，它具有2.44μM的KM以及3.04 nanoM/分鐘的Kcat。血漿血纖維蛋白原溶解活性檢測(cè)在37℃時(shí)將前尿激酶突變體1(0-100μg/ml)或前尿激酶(0-10μg/ml)在1.0ml的貯存血漿中保溫6、16或24小時(shí)，其后加入0.2ml的抑蛋白酶肽(10,000 KIU/ml)，采用凝血酶-凝塊方法測(cè)出在給定時(shí)間之后留下的血漿血纖維蛋白原。突變體1具有比天然前尿激酶低約100倍的血漿血纖維蛋白原溶解活性，即1.0μg/ml的天然前尿激酶在6小時(shí)之內(nèi)將裂解50％的9.0μg/ml的血纖維蛋白原，而突變體1需達(dá)到100μg/ml才能獲得同樣效果。血纖維蛋白凝塊溶解分析按照Gurewich等人，Clin.Invest.，731731(1980)的描述，從0.25ml血漿中制備125I-標(biāo)記的凝塊。在3ml血漿中用一定范圍濃度的前尿激酶突變體1(10，20，30，40，70和80μg/ml)或t-PA(5，10，30，50，75，100和150ng/ml)以及t-PA和前尿激酶突變體的組合物進(jìn)行凝塊溶解試驗(yàn)。根據(jù)釋放的放射性活性對(duì)溶解反應(yīng)進(jìn)行定量，并以相對(duì)于時(shí)間的占完全溶解時(shí)值的百分?jǐn)?shù)表示。突變體1纖維蛋白凝塊溶解活性是天然前尿激酶的50％，即200U/ml天然前尿激酶在6小時(shí)內(nèi)將溶解一個(gè)凝塊(1cm3)，而同樣量的突變體1在12小時(shí)內(nèi)才能獲得同樣效果。前尿激酶突變體的治療用途以相同于前尿激酶和尿激酶的方式，將前尿激酶突變體作為血栓溶解劑給藥。將突變型前尿激酶與藥物學(xué)上可接受的載體(例如鹽水)進(jìn)行混合，并通過(guò)血管內(nèi)(例如，靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi))或皮下注射而給藥。注射的前尿激酶突變體為約20-60mg的一丸團(tuán)，或以40-80mg/小時(shí)的速率進(jìn)行靜脈注射。由于前尿激酶突變體比天然前尿激酶具有大得多的血漿穩(wěn)定性，以及低得多的誘導(dǎo)非特異性血纖維蛋白溶酶原激活的可能性，可以使用更高的劑量，例如高至200mg/小時(shí)進(jìn)行輸注。
序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人Liu，Jian-NingGurewich，Victor(ii)發(fā)明名稱前尿激酶突變體(iii)序列數(shù)1(iv)通信地址(A)收件人Fish & Richardson(B)街道225 Frankin Street(C)城市Boston(D)州Massachusetts(E)國(guó)家U.S.A.
(F)郵編02110-2804(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型3.5″Diskette，1.44Mb(B)計(jì)算機(jī)IBM PS/2 Model 50Z或55SX(C)操作系統(tǒng)MS-DOS(Version 5.0)(D)軟件Word Perfect(Version 5.1)(vi)現(xiàn)在的申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類(vii)以前的申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?8/087,163(B)申請(qǐng)日1993年7月2日(Viii)代理人/代理機(jī)構(gòu)資料(A)名稱Fasse，J.Peter(B)登記號(hào)32，983(C)參考/檔案號(hào)04353/003WO1(ix)電信號(hào)碼(A)電話(617)542-5070(B)傳真(617)542-8907(C)電傳200154(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度411(B)類型氨基酸
(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO1Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Asn Cys Asp Cys Leu Asn Gly5 10 15Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile His Trp Cys Asn20 25 30Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gln His Cys Glu Ile Asp Lys Ser Lys35 40 45Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly Lys Ala Ser Thr50 55 60Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser Ala Thr Val Leu65 70 75 80Gln Gln Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu Gln Leu Gly Leu85 90 95Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg Arg Arg Pro Trp100 105 110Cys Tyr Val Gln Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gln Glu Cys Met Val115 120 125His Asp Cys Ala Asp Gly Lys Lys Pro Ser Ser Pro Pro Glu Glu Leu130 135 140Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg Phe Lys Ile Ile145 150 155 160Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Ash Gln Pro Trp Phe Ala Ala Ile165 170 175Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys Gly Gly Ser180 185 190Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys Phe Ile Asp195 200 205Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg Ser Arg Leu210 215 220Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu Ash Leu Ile225 230 235 240Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His Asn Asp Ile245 250 255Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gln Pro Ser260 265 270Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro Gln275 280 285Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Asn Ser Thr290 295 300Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val Lys Leu Ile305 310 315 320Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu Val Thr325 330 335Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys Thr Asp Ser Cys340 345 350Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gln Gly Arg Met355 360 365Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Leu Lys Asp370 375 380Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro Trp Ile Arg385 390 395 400Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu405 410其他實(shí)施方式其他實(shí)施方式包含于下列權(quán)利要求書(shū)內(nèi)
權(quán)利要求
1.一種具血栓溶解活性的前尿激酶(Pro-UK)突變體，它基本上是由天然前尿激酶的氨基酸序列組成的，其中，所說(shuō)序列含有突變，當(dāng)給患者施用時(shí)，該突變促使所說(shuō)前尿激酶突變體誘導(dǎo)出比天然前尿激酶更低的血纖維蛋白原溶解活性以及非特異性血纖維蛋白溶酶原激活作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的前尿激酶突變體，其中，所述突變是用一種新的氨基酸替代在天然前尿激酶的氨基酸序列中常規(guī)存在的天然氨基酸，這種替代促使所述前尿激酶突變體比天然前尿激酶有至少低10倍的內(nèi)在活性，并且當(dāng)給患者施用時(shí)，與天然前尿激酶相比，在血纖維蛋白溶酶激活之后，基本上具有相同的纖維蛋白激發(fā)以及血栓溶解活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的前尿激酶突變體，其中，天然前尿激酶的氨基酸序列包括一個(gè)可塑性環(huán)(氨基酸297至313)，并且所述突變是由一個(gè)新的氨基酸替代所述可塑性環(huán)中常規(guī)存在的一個(gè)氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的前尿激酶突變體，其中，所述新氨基酸用于替代Lys300。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的前尿激酶突變體，其中，所述新氨基酸是丙氨酸或組氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的前尿激酶突變體，其中，用第二個(gè)新氨基酸替代Gly299。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的前尿激酶突變體，其中，所述新氨基酸是丙氨酸或組氨酸，所述第二個(gè)新氨基酸是組氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的前尿激酶突變體，其中，第二個(gè)新氨基酸是用于替代Glu301。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的前尿激酶突變體，其中，所述新氨基酸是丙氨酸或組氨酸，所述第二個(gè)新氨基酸是丙氨酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的前尿激酶突變體，其中，所述新氨基酸用于替代Lys313。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的前尿激酶突變體，其中，所述新氨基酸是丙氨酸或組氨酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求3所述的前尿激酶突變體，其中，所述新氨基酸用于替代Tyr306。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的前尿激酶突變體，其中，所述新氨基酸是甘氨酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求2所述的前尿激酶突變體，其中，所述突變是用一個(gè)新氨基酸替代Ala175以及第二個(gè)新氨基酸替代Tyr187，以便在所述前尿激酶突變體中形成一個(gè)酶原三聯(lián)體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的前尿激酶突變體，其中，所述新氨基酸是絲氨酸，并且所述第二個(gè)新氨基酸是組氨酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的前尿激酶突變體，其中，所述突變進(jìn)一步包括用第三個(gè)新氨基酸替代Lys300，以及第四個(gè)新氨基酸替代Glu301。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的前尿激酶突變體，其中，所述新氨基酸是絲氨酸，所述第二個(gè)新氨基酸是組氨酸，所述第三個(gè)新氨基酸是丙氨酸或組氨酸，以及所述第四個(gè)新氨基酸是丙氨酸。
18.一種編碼權(quán)利要求2所述的前尿激酶突變體的DNA分子。
19.用權(quán)利要求18所述的重組DNA分子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及具血栓溶解活性的前尿激酶突變體；它由天然前尿激酶的氨基酸序列組成，但包括一個(gè)突變，該突變促使前尿激酶突變體誘導(dǎo)出比天然前尿激酶更低的血纖維蛋白原溶解活性以及非特異性血纖維蛋白溶酶原激活作用，具有的內(nèi)在活性比天然前尿激酶至少低10倍，并且當(dāng)給患者施用時(shí)，與天然前尿激酶相比基本上具有相同的纖維蛋白激發(fā)以及在血纖維蛋白溶酶激活之后具相同的血栓溶解活性。
文檔編號(hào)C12N15/57GK1130402SQ94193246
公開(kāi)日1996年9月4日 申請(qǐng)日期1994年6月28日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月2日
發(fā)明者劉建寧, 維克托·格里維克 申請(qǐng)人:新英格蘭迪科尼斯·豪斯皮托公司