專利名稱：臭曲霉表達系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明領域本發(fā)明涉及在重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)中有用的宿主細胞。具體地說，本發(fā)明涉及曲霉屬的真菌宿主細胞，可以用其高水平表達重組蛋白質(zhì)，特別是酶。
本發(fā)明背景近年來，重組宿主細胞在異源蛋白質(zhì)表達中的使用已經(jīng)大大簡化了有商業(yè)價值蛋白質(zhì)的大量生產(chǎn)，當然，從其天然來源僅僅通過純化也是可以得到的。最近，選擇了許多表達系統(tǒng)用于從中生產(chǎn)任何給定的蛋白質(zhì)，其中包括原核和真核宿主。適宜表達系統(tǒng)的選擇常常不僅取決于宿主細胞以活性狀態(tài)生產(chǎn)相當產(chǎn)率的蛋白質(zhì)的能力，而且在大程度上受蛋白質(zhì)的最終用途所支配。
盡管常常用哺乳動物和酵母細胞作為真核宿主，但是已現(xiàn)在開始認識到用絲狀真菌作為重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的宿主細胞是非常有用的。目前用于或建議用于所述目的的絲狀真菌是粗糙鏈孢霉，Acremonium chrysogenum，Tolypocladium geodes，卷枝毛霉和Trichoderma reesei。另外，已經(jīng)特別有效地用曲霉屬的某些種作為重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的宿主細胞。曲霉屬是半知菌類真菌，其特征在于aspergillum由終止于泡囊的分生孢子菌柄組成，每個菌柄依次帶有一或兩層同時形成的特化細胞，稱為小?；蚱抗＃约盁o性形成的孢子，稱為分生孢子。已經(jīng)報道了用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化構巢曲霉(Ballance et al.Biochem.Biophys.Res.Comm.112284-289，1983)，但發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的的頻率相當?shù)?。已?jīng)描述了將黑曲霉和米曲霉用于重組生產(chǎn)蛋白質(zhì)。但是，尚未表明將曲霉屬的其他種可用于蛋白質(zhì)的重組生產(chǎn)，而且事實上，由于蛋白酶或真菌毒素的低表達和/或過量生產(chǎn)，并不是曲霉屬的所有種均適于作為宿主細胞用于該目的，而且從一個種的這種能力也不能推測到另一個種。已經(jīng)用臭曲霉表達乙型肝炎抗原(Hongdi，et al ActaMicrobiologica Sinica 3098-104，1990)，但是還沒有報道將其用于表達任何其他類型的蛋白質(zhì)，而且也沒有報道說它可以以高產(chǎn)率生產(chǎn)蛋白質(zhì)。一種理想的表達系統(tǒng)是基本上沒有蛋白酶和真菌毒素產(chǎn)生且無大量內(nèi)生分泌的蛋白質(zhì)，但是比已知宿主細胞的表達水平高。現(xiàn)在本發(fā)明提供符合這些要求的新的曲霉表達系統(tǒng)。
本發(fā)明綜述本發(fā)明提供含有編碼異源酶的核酸序列的臭曲霉宿主細胞?！爱愒疵浮敝覆皇撬拗骷毎刑烊淮嬖诘?，或已經(jīng)對其進行了修飾從而改變了天然序列的天然蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，所述蛋白質(zhì)是異源真菌酶。所述核酸序列與一適宜的啟動子可操作相連，所述啟動子能夠指導核酸序列在所選宿主細胞中的轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明涉及重組生產(chǎn)酶的方法，所述方法包括在導致表達所述酶的條件下，培養(yǎng)含有編碼異源酶的核酸序列的臭曲霉，然后從培養(yǎng)物中回收所述酶。在優(yōu)選的實施方案中，所述酶是真菌酶。
本發(fā)明的宿主細胞和方法在各種真菌酶的重組生產(chǎn)中與其他已知的曲霉種例如黑曲霉或米曲霉相比，有意想不到的效果。本發(fā)明的詳細描述臭曲霉屬于曲霉屬的Nigri組。Nigri組的成員，例如黑曲霉是特征在于有輻射狀的分生孢子頭和呈黑色的分生孢子群；球形泡囊；菌柄光滑透明，或在泡囊下有色素；有或沒有?；页３Ｖ?“The Genus Aspergillus”，by K.B.Raper and D.I.Fennel，TheWilliams and Wikins Company，Baltimore，1965)。這些菌株的突變體在孢子顏色和紋飾上不同，或在該組內(nèi)也包括其他微生物學特征。在曲霉屬的Nigri組內(nèi)，分類單位的界定經(jīng)過了多論，這是因為主要分類目錄所主要依賴的菌落顏色和產(chǎn)分生孢子結(jié)構有變異(即，Raper and Fennel，同上文)。Raper和Fennel鑒定的臭曲霉-相關的分類單位是臭曲霉和臭曲霉acidus變種和臭曲霉pallidus變種。
臭曲霉的一般特征為有兩列小梗；分生孢子頭保持灰暗的棕色或橄欖棕色；分生孢子為球形或在成熟時接近球形，不規(guī)則但細致地粗糙。更具體地說，該種的特征為在室溫(24-26℃)Czapek’s溶液瓊脂上菌落生長相當緩慢，在10到2星期內(nèi)，直徑為3.5-4.5cm，營養(yǎng)菌絲為白色或黃色，生長浸沒程度較大或形成相當致密且相對粗糙的表面，平坦或呈放射狀環(huán)溝的無環(huán)溝或淺環(huán)溝，在一些菌株中有豐富的橄欖棕色到棕黑色分生孢子頭，除正在生長的邊緣外，在其他菌株中，孢子形成整齊但不豐富；沒有滲出物或不顯著；菌落背面為黃色到橙色，在衰老時變?yōu)榧t棕色，而且氣味很強烈，有刺激性，放線菌狀。分生孢子頭開始小，球形到放射狀，在擁擠的菌落中心區(qū)域一直保持這樣，其他靠近菌落邊緣逐漸變得不規(guī)則，裂成數(shù)個很規(guī)則的柱，總直徑常常為200-300μ，但在有些菌株得到500μ；大部分分生孢子直徑為25-35μ，但有些菌株得到40-50μ，在較大頭的整個表面或較小泡囊的四分之三上可育；有兩列小梗，在棕色陰影中著色，初生的有點可變，大多數(shù)為7-12μ×3.0-5.0μ，偶爾較長，二級大多數(shù)為7-8μ×2.5-3.0μ；分生孢子球形或接近球形，有棕色的壁，常?？雌饋砗芄饣墒鞎r不規(guī)則而且很粗糙，大多數(shù)直徑為4.0-4.5μ，帶有沒有明顯孢間。
菌落在麥芽提取物瓊脂上菌株生長稍迅速，在兩星期內(nèi)直徑達5-6cm，平坦，被茸毛的，營養(yǎng)菌絲體浸沒，無色或只是稍微有點黃色，始終有很多孢子形成，黑棕色陰影，無環(huán)溝或有不顯著的環(huán)溝，背面有淡黃色陰影到幾乎無色；氣味不顯著。分生孢子頭通常裂成許多顯著分叉的且致密的柱，在大多數(shù)菌株中直徑達到300-350μ，但在其他的菌株中達到600-800μ；分生孢子頭比在Czapek瓊脂上的有更均勻的小刺。分生孢子頭的詳細描述見上文。首先由Thom和Raper(A Manual of the Aspergilli 219-220，F(xiàn)ig.61C，1945)描述了這些種。
臭曲霉pallidus變種(Nakazawz，Simo，and Watanabe，J.agr.Chem.Xoc.Japan 12961-962，F(xiàn)ig.10，1936)的特征在于在Czapek溶液瓊脂上的生長相當受限制，在室溫(24-26℃)10天內(nèi)直徑為2.0-2.5cm，平面或很淺的環(huán)溝，有致密的基菌絲體，無孢子形成，在邊緣為白色或黃色，但是在暗灰色到橄欖-棕色并接近暗橄欖到Chactura或橄欖黑的陰影中帶有擁擠的分生孢子頭；背面開始無色，然后變黃，在衰老時變成暗黃棕色；在種中屬于氣味不顯著的，不可辨別。分生孢子頭呈球形放射狀，直徑通常為500-600μ，通常裂成很少的且不清晰的柱；分生孢子光滑，無色或淡棕色，通常長為1×寬為8-16μ，偶爾有更長的；泡囊球形或接近球形，在最大的頭上直徑50-60μ，在整個表面上均是可育的；有兩列小梗，棕色，一級的在年輕時通常為10-15μ×3.5-5.0μ，在衰老的頭上達30-40μ，二級大多數(shù)為7-10μ×3.0-4.0μ；分生孢子從橢圓形到卵圓形而且光滑或近似光滑，逐漸變成球形或亞球形，直徑為3.5-4.5且較粗糙，附著在液體載片上，但連續(xù)而不顯著。
菌落在麥芽上生長要更迅速些，平坦通常被茸毛的而且有很多孢子形成，在暗橄欖黑陰影中。分生孢子結(jié)構直徑達700-800μ，基本上與在Czapek瓊脂上的情況相同，但是成熟的分生孢子為3.0-3.5μ，球形有小刺，有縱向的表面標記。這種不同區(qū)別于所述種的主要方面在于在Czapek瓊脂上生長受到更多的限制，有較大的二維結(jié)構，其分生孢子結(jié)構橄欖色更深，在麥芽瓊脂上的成熟頭上沒有明顯的分生孢子分叉柱。
臭曲霉acidus(Nakazawa，Simo and Watanabe，J.Agr.Chem.Soc.Japan 12960-961，fig.8，1936)的特征在于菌落在Czapek液體瓊脂上生長相當緩慢，室溫(24-26℃)10-14天為4.0-5.0cm，最初為絮狀且接近白色到淡黃色，孢子形成較少，后期產(chǎn)生相對較少的球形放射狀，在邊緣和次邊緣區(qū)有棕黑色分生孢子頭；背面黃色陰影在衰老時逐漸變成暗黃棕色；氣味不顯著；分生孢子頭相對較大，直徑為350-400μ，不裂成明晰的柱；分生孢子相對短且寬，通常為600-800μ×20-30μ，罕見1mm長的，泡囊球形或接近球形，直徑達80-85μ在整個表面上均可育；雙列小梗，棕色，一級為20-40μ×4.6μ，二級為6-10μ×2.5-3.5μ；分生孢子球形到有些扁平，棕色，直徑為4.0-4.5μ，相對厚的壁，看起來光滑或表面有點不規(guī)則，但沒有小刺或微皺。
菌落在麥芽上生長更迅速在10天內(nèi)孢子形成不規(guī)則，寬環(huán)溝，平坦或很密的褶皺，營養(yǎng)菌絲體生長浸沒程度大，明亮的金黃色；如上，在短分生孢子上帶分生孢子頭但比在Czapek上的大，直徑達到500-600μ，而且有很多清晰的分生孢子柱。這種變化不同于所述種的方面在于菌落在Czapek和麥芽瓊脂上孢子形成程度更低，其分生孢子頭和結(jié)構部分較大，有相當短和較寬的分生孢子，特別是在麥芽瓊脂上有明亮的黃色菌絲體。
應當理解在說明書和權利要求中所用的術語臭曲霉不僅包括在上述三個種中所含的生物，而且包括在改變的分類目錄中已經(jīng)或現(xiàn)在被分為其他類的那些，但是，它們應具有與上述相同的形態(tài)學或培養(yǎng)特征，而且可以是臭曲霉及其變種異名。例如異名包括(但不限于)A.aureus Nakazawa，A.aureus var.pallidusnakazawa，Simo and Watanabe。還可能的異名是A.citricusMosseray(A.Musallam Revision of the Black Aspergiilusspecies，Ph.D.thesis，Universitu of Utrecht)。
通過評價由曲霉屬不同分類組中15個以上種的各種分離物產(chǎn)生的蛋白酶水平來開始確定候選宿主細胞。在酸，中性和堿性pH通過在酪蛋白清除平皿上檢測來達到上述目的。令人驚奇的是，發(fā)現(xiàn)Nigri組的幾個成員完成的最好，即它們生產(chǎn)的蛋白酶量最小，所述蛋白酶會降解所生產(chǎn)的任何重組蛋白質(zhì)。以這一標準為基礎，選擇了數(shù)個種以進行進一步的研究，包括臭曲霉，日本曲霉，日本曲霉棘孢變種，棘孢曲霉，塔里木氏曲霉，碳黑曲霉和海棗曲霉。
然后進行轉(zhuǎn)化所選的種的嘗試。開始的努力集中在標準米曲霉轉(zhuǎn)化技術(Christensen et al.，Bio/Technology 61419-1422，1988；歐洲申請87 103806.3)的使用?？傊?，用有關形成原生質(zhì)體的米曲霉方法，轉(zhuǎn)化和amdS或潮霉素B(hygB)標記基因的篩選得到了共轉(zhuǎn)化體。表達載體含有米曲霉TAKA-淀粉酶基因和來自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的轉(zhuǎn)錄終止信號，此外，還有異源編碼序列。轉(zhuǎn)化頻率從1/μg DNA到10/μg DNA不等。在下列實施例中詳細描述用表達載體的共轉(zhuǎn)化試驗中，共轉(zhuǎn)化的頻率為0-60％。
然后觀察轉(zhuǎn)化的種以確定各種異源酶的表達水平。所試驗的異源酶包括Humicola lanuginosa脂酶(HLL)，Humicola insolens木聚糖酶(木聚糖酶)，Humicola insolens纖維素酶(纖維素酶)，Coprinus cinereus過氧化物酶(CiP)，和Candidaantarctica脂酶A。令人驚奇的是，臭曲霉對于一種或多種酶而言，均有最好的表達結(jié)果，但在某些情況下，均比對照米曲霉菌株的酶產(chǎn)率高。具體地說，在振蕩燒瓶培養(yǎng)中，一個臭曲霉菌株生產(chǎn)很高水平的HLL(每升約1克)。這些試驗結(jié)果的總結(jié)見表2。
正如結(jié)果清楚地表明的，該種的數(shù)個分離物都能表達異源蛋白。因此，這種能力并不限于單個分離物或菌株，而是這個種整個的特征。本領域?qū)I(yè)人員應認識到這些種的其他菌株或分離物也可以用于表達異源蛋白質(zhì)。在美國典型培養(yǎng)物收集中心(ATCC，12301 Parklawn Drive，Rockille Maryland 200852)；Agricultural Research Service Culture Collection(NRRL，1815North University Street，Peoria，Illinois 61604)；Fungal GeneticsStock Center (FGSC，Kansas)；Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkuturen(DSM，Mascheroder Weg1B，D-3300 Braunschweig，Germany)；Institute of Applied Microbiology(IAM，TodyoUniversity 1-1，1-Chome，Yayoi，Bunkyo-ku，Tokyo113，Japan)；Institute for Fermentation(IFO，17-85 uso-Honmachi 2-chome，Yodogawa-ku，Osaka 532，Japan)；和Centraal Bureau voor Schimmelcultures(CBS，Oosterstraat 1，3740 AG Baarn，Netherlands)所述各個種的許多菌株均是公眾可以得到的。
本領域?qū)I(yè)人員也會理解成功地轉(zhuǎn)化本文所述的宿主種并不限于使用具體舉證的載體，啟動子和選擇性標記。通常來說，在轉(zhuǎn)化米曲霉，黑曲霉和構巢曲霉中有用的那些技術也適用于本發(fā)明的宿主細胞。例如，盡管amdS和hygB選擇性標記是優(yōu)選的，但是其他有用的選擇性標記包括argB(構巢曲霉和黑曲霉)，trpC(黑曲霉或構巢曲霉)或pyrG(黑曲霉或構巢曲霉)標記。啟動子可以是在這些種中表現(xiàn)出強轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，而且可以得自編碼細胞外和細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，如淀粉酶，葡糖淀粉酶，蛋白酶，脂酶，纖維素酶和糖酵解酶的基因。所述適宜的啟動子可以得自米曲霉TAKA淀粉酶，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸穩(wěn)定的α-淀粉酶和Rhizomucor miehei脂酶的基因。糖酵解酶基因啟動子的實例是TPI，ADH和PGK。啟動子也可以是同源啟動子，即天然臭曲霉基因的啟動子。本發(fā)明優(yōu)選的啟動子是米曲霉TAKA淀粉酶啟動子。TAKA淀粉酶是熟知的α-淀粉酶(Todaet al.，Proc.Japam Acad.58 Ser.B.208-212，1992)。啟動子序列也可以有連接子以便導入特異性限制位點，從而有利于將啟動子序列與所選的基因或與所選的信號肽或前區(qū)相連。終止子和多聚腺苷酸序列可以從與啟動子相同的來源得到。也可以將增強子序列插入構建體。
為了避免因得到表達產(chǎn)物而不得不破碎細胞，并使細胞內(nèi)表達產(chǎn)物可能的降解量最小，優(yōu)選的是將產(chǎn)物分泌到細胞外。為了達到此目的，在優(yōu)選的實施方案中，將所需的基因與可使表達產(chǎn)物進入細胞分泌途徑的信號或前導肽相連。前區(qū)可以得自來自任何生物的分泌蛋白的基因或可以是天然的前區(qū)。所述前區(qū)的有用的來源是曲霉屬的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因，桿菌屬的淀粉酶基因，Rhizomucor miehei的脂酶或蛋白酶基因，啤酒酵母α-因子的基因或牛凝乳酶原基因。最佳的前區(qū)得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸性α-淀粉酶、地衣形牙孢桿菌α-淀粉酶、Bacillus NCIB 11837產(chǎn)麥芽(maltogenic)淀粉酶或地衣形牙孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的基因。一種有效的信號序列是米曲霉TAKA淀粉酶信號，Rhizomucor miehei脂酶信號。另外，也可以使用所表達蛋白的天然前區(qū)。
可將與啟動子和終止子序列功能相連的所需產(chǎn)物的基因摻入含有選擇性標記的載體中或可以將其放在能夠被整合到宿主菌株基因組中的單獨載體或質(zhì)粒中。所述載體系統(tǒng)可以是單個載體或質(zhì)?；蛘咭黄鸷斜徽系交蚪M中的整個DNA的兩個或多個載體或質(zhì)粒。載體或質(zhì)?？梢允蔷€性的或閉合的環(huán)狀分子。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，用兩個載體轉(zhuǎn)化宿主，其中一個含有選擇性標記，另一個含有剩下的待導入的異源DNA，包括啟動子，編碼所需蛋白質(zhì)的基因和轉(zhuǎn)錄終止子及多聚腺苷酸序列。
可以使用本發(fā)明的宿主細胞以表達所需的原核或真核異源酶，而且優(yōu)選的是用于表達真核酶。所述種是特別有用的，即已經(jīng)同意將它們用于食品工業(yè)。所述種還特別適于表達異源真菌酶(Regulatory Aspects of Microbial Food Enzymes Third Edition，The Association of Microbiaa Food Enzyme Producers，Brussels，Belgium)。可以用新的表達系統(tǒng)表達酶，如過氧化氫酶，漆酶，酚氧化酶，氧化酶，氧化還原酶，纖維素酶，木聚糖酶，過氧化物酶，脂酶，水解酶，酯酶，角質(zhì)酶(cutinase)，蛋白酶和其他蛋白水解酶，氨肽酶，羧肽酶，肌醇六磷酸酶(植酸酶)，裂解酶，果膠酶和其他果膠水解(pectinolytic)酶，淀粉酶，葡糖淀粉酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，甘露糖苷酶，異構酶，蔗糖酶，轉(zhuǎn)移酶，核糖核酸酶，幾丁質(zhì)酶和脫氧核糖核酸酶。本領域?qū)I(yè)人員應該理解術語“真菌酶”不僅包括天然真菌酶，而且也包括已經(jīng)通過氨基酸取代，缺失，加入或其他可以提高活性，熱穩(wěn)定性，pH耐受性等的改變而修飾的真菌酶。
也可以用本發(fā)明的宿主細胞重組生產(chǎn)所述宿主細胞的天然蛋白質(zhì)。所述應用的實例包括但不限于將臭曲霉天然蛋白質(zhì)置于不同啟動子的控制下以提高所述蛋白質(zhì)的表達，利用信號序列將所需的天然蛋白質(zhì)迅速運輸?shù)郊毎猓蛟黾佑芍黧w宿主細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)。因此，本發(fā)明還包括同源蛋白質(zhì)的重組生產(chǎn)，從而所述的表達包括使用宿主細胞中天然不存在的遺傳元件，或使用已經(jīng)經(jīng)過加工不以在所述宿主細胞中常見的方式發(fā)揮功能的天然元件。
將利用下列非限制性實施例進一步說明本發(fā)明。I蛋白酶檢測檢測來自至少15個不同種的50個以上的菌株以確定由各分離物生產(chǎn)的蛋白酶的量，同時觀察其細胞外蛋白酶圖譜。為了制備培養(yǎng)接種物，將10ml滅菌水加到一在9cm平皿中的7-10天的各菌株的老培養(yǎng)物中，從菌絲體上輕輕刮下孢子制成稠密的懸浮液。用2.5ml懸浮液接種100mlASPO4培養(yǎng)基[ASPO4培養(yǎng)基含有1g/lCaCl2，2g/l酵母提取物，1g/lMgSO4，5g/l KH2PO4，2g/l檸檬酸，0.5mlTrace Metal溶液(含有14.3g/lZnSO4·7H2O，CuSO4·5H2O，0.5g/lNiCl2·6H2O，13.8g/lFeSO4·7H2O，8.5g/lMnSO4·H2O，和3g/l檸檬酸)，1g/l脲，2g/l(NH4)2SO4，在自來水中的20g/l麥芽糖糊精(8ml25％的原液，滅菌后加入)，滅菌前將pH調(diào)到4.5或6.5，滅菌后用8ml0.1M/100ml檸檬酸將pH調(diào)到4.5]。將燒瓶在30和/或37℃培養(yǎng)，在旋轉(zhuǎn)的振蕩儀上以200rpm振蕩培養(yǎng)5天，在連續(xù)光照下。將各培養(yǎng)液的上清液以2500rpm離心5分鐘，然后用于酪氨酸澄清平皿檢測，確定作為重組蛋白質(zhì)表達潛在候選菌的各真菌種生產(chǎn)的蛋白酶水平。
按如下完成酪蛋白平皿澄清實驗。平皿培養(yǎng)基由20g/l脫脂牛奶，29g/l瓊脂糖和用于在pH5和pH7跑樣試驗的0.2M檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液，以及用于在pH9跑樣試驗的苷氨酸NaOH緩沖液組成。將奶粉與100ml緩沖液混合并于60℃保持。將瓊脂糖與400ml緩沖液混合，然后高溫滅菌5分鐘。稍微冷卻后，加入熱牛奶混合物，將混合物輕輕地倒置2-3次以便混合。將培養(yǎng)基倒入150mm平皿中，每平皿使用50-70ml，然后在5℃貯存直到使用。
即將使用前，在每平皿的瓊脂上做12個小孔。將25μl各菌株發(fā)酵上清液在不同的pH加到不同的平皿中，然后在37℃培養(yǎng)過夜。對于pH9的平板，加入0.5M冰乙酸以使酪氨酸沉淀，然后對任何澄清的區(qū)進行肉眼觀察。接著測量各平皿澄清區(qū)的大小(即，直徑從沒有區(qū)到＞2cm)和區(qū)類型(澄清，模糊或介于兩者之間)。
再用各培養(yǎng)物的上清液評估這些菌株的細胞外蛋白質(zhì)生產(chǎn)。用按制造商的說明制備的Novex(San Diego，California)8-16％梯度凝膠估計蛋白質(zhì)圖譜。將75μl(3和5天)培養(yǎng)上清液樣品與20μl5X解離緩沖液(解離緩沖液＝4mlTris-HCl，pH6.8，1gSDS，617mg二硫蘇糖醇，和至10ml蒸餾水)和甘油/溴酚藍(10-20mg加到約10ml80-90％甘油中，然后在沸水中放1-2小時以溶解)混合，煮5分鐘，冷卻，上樣，在60-200V跑樣直到溴酚藍示蹤染料到達凝膠底部。用Biorad Silver Stain Plus Protocol(BioradLaboratories，Hercules，CA)將凝膠銀染。認為有大量帶的那些分離物不太適宜作為潛在的新宿主，而認為圖譜相對澄清并只有1-4個主要帶的那些可用于進行進一步的實驗。
縱觀蛋白酶檢測和蛋白質(zhì)圖譜的綜合結(jié)果，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)適宜的潛在候選菌株均是Nigri組的成員?；谶@些結(jié)果，選用下列分離物進行轉(zhuǎn)化研究臭曲霉E46，臭曲霉CBS 103.14，臭曲霉pallidus變種(NRRL356)，臭曲霉N0953(NRRL337；ATCC1-254)，日本曲霉A1438(CBS 568.65)，棘孢曲霉N1136(CBS 101.43)，棘孢曲霉N1454(CBS 172.66)，棘孢曲霉N1455(CBS 186.67)，日本曲霉棘孢變種N0956(IAM13871)，海棗曲霉A528(CBS 139.48)，海棗曲霉A530(CBS137.52)，海棗曲霉E419(CBS 137.52)，炭黑曲霉A3993(IBT4977)，炭黑曲霉ATCC1025，塔木里氏曲霉E112(ATCC 10836)，塔木里氏曲霉N2266(IFO 4358)和塔木里氏曲霉N2267(IFO 4142)，還將這些培養(yǎng)物保藏在Novo NordiskBiotech Culture Collection，Davis Califonia。II載體構建A選擇性標記載體在轉(zhuǎn)化帶有潮霉素B抗性選擇性標記的宿主細胞時，使用載體pJaL77和pJaL154。該選擇性標記是以E.coli潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因為基礎，所述基因在pJaL77中位于TAKA啟動子的控制下，在pJaL154中位于amdS啟動子的控制下。簡而言之，按如下構建這些載體。從Boehringer Mannheim購買作為質(zhì)粒pHph-1賦予潮霉素B抗性的基因。所述基因配有ATG密碼子和經(jīng)PCR在氨基和羧基末端的適宜的限制位點，使用的引物為5’-GCT CAG AAGCTT CCATCC TAC ACC TCA GCAATG TCG CCT GAA CTC ACC GCG ACG TCT-3’(N-末端)和3’-CGT CCG AGG GCA AAG GAA TAG CTCCAGAGATCT CAT GCT-5’(C-末端)。用限制酶BamHI和XhoI切割PCR片段，然后克隆到曲霉表達載體pToC68(參見WO91/17243)中的相應位點以得到pJaL77。
按如下構建質(zhì)粒pJaL154。用下列引物(劃線區(qū)表示與amdS啟動子同源)CCT GGA TCC TCT GTG TTA GCT TAT AG和CCT GCA TGC CGC CAG GAC CGA CGA GCA AG.經(jīng)PCR從質(zhì)粒pCaHj406中克隆amdS啟動子突變體I9+I666(Hynes et al.Mol.Cell.Biol.3(8)1430-1439，1983 and Katz et al.MolGenGenet.220373-376，1990)。用BamHI和SphI切割含有amdS啟動子的694bp的PCR片段，然后克隆到pJaL77的相應位點，以便將pJaL77中的TAKA啟動子換成amdS啟動子。
通過將p3SR2(Hynes et al.，同上文)的2.7kb片段克隆到XbaI切割并去磷酸化的pUC19質(zhì)粒中而構建含有amds標記的質(zhì)粒pToC90。稱為pToC186的衍生物除啟動子區(qū)含有已知可提高amdS基因表達(Hynes et al.同上文；Corrick et al.，Gene 5363-91，1987)的兩個突變(I9和I66)外，與pToC90相同。B表達載體1 Humicola insolens木聚糖酶。載體pHD414是質(zhì)粒p775(EP238 023)的衍生物。與該質(zhì)粒相反，pHD414在TAKA啟動子和AMG終止子之間有一個特有的限制位點區(qū)。通過除去終止子3’末端約200bp長的片段(含有不必要的RE位點)，然后除去啟動子5’末端約250bp長的片段(也含有不必要的位點)而構建所述質(zhì)粒。通過用NarI(位于pUC載體)和XbaI(3’到終止子)裂解，隨后用Klenow DNA聚合酶+dNTP補平成熟的末端，在凝膠上純化載體片段并將載體片段再連連而除去20bp的片段。該質(zhì)粒稱為pHD413。用StuI(啟動子的位于5’末端)和PvuII(在pUC載體中)切割pHD413，在凝膠上分離繽紛再連接，得到pHD414。將含有在pYES中的約1100bp木聚糖酶HindII/XbaI cDNA片段的E.coli菌株以DSM6995保藏在DSM。通過用HindII/XbaI裂解而從一個克隆中分離木聚糖酶cDNA片段。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，電洗脫純化所述片段，然后準備進行連接反應。將cDNA片段連接到pHD414中以得到pAXX40-1-1。木聚糖酶基因和蛋白質(zhì)的序列示于SEQ ID NO 1和2，且所述基因以DSM(Deutsche SammlungVon Mikrooroganismen und Zellkulturen GmbH)6995保藏。
2 Humicola insolens纖維素酶。在WO 91/17243中可找到Humicola insolens纖維素酶的詳細特征。用限制酶BamHI和SalI裂解，從pCaHj201中切去926bp的纖維素酶編碼區(qū)片段而構建用于纖維素酶表達的表達載體從pCaHj418。用標準技術經(jīng)制備性凝膠電泳純化所述片段，然后與已經(jīng)BamHI和XhoI處理的pHD414(見上述)相連。所得的表達載體pCaHj418含有在米曲霉TAKA淀粉酶啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的纖維素酶基因和黑曲霉葡糖淀粉酶終止子區(qū)。
3 Humicola langinosa脂酶。在EP305和美國系列申請No.07/236,605中報告了H.langinosa脂酶基因的分離和表達，所有內(nèi)容引入本文作為參考?？傊?，用如Bodl等人(EMBO J 31097-1102，1984)和Chirgwin等人(Biochenistry 185294-5299，1979)描述的方法從H.langinosa菌絲體中抽提總RNA。按Aviv和Leder(PNAS USA 691408-1412，1972)所述，在寡(dT)-纖維素中進行兩個循環(huán)的親和層析而得到含Poly(A)的RNA。用Okayama和Berg(Molec.Cell.Biol.2161-170，1982)描述的方法，和Noma等人(Nature 319640-646，1986)描述的載體pSP62-K2和pCDVI-PL合成cDNA。將合成的cDNA轉(zhuǎn)化到E.coli MC1000的hsdR-，M+衍生物(Casadaban and Cohen，J.Mol.Bol.138179-207，1980)中以得到重組克隆。
在Applied Biosystems，Inc.DNA合成儀上合成32個十五聚物寡脫氧核糖核苷酸混合物A A A A Ad( TT AA TG TT AA)，G G G G G其中之一與Phe-Asn-Gln-Phe-Asn編碼區(qū)中的H.langinosa脂酶mRNA互補然后經(jīng)PAGE純化。將H.langinosacDNA文庫中的約10000個E.coli重組體轉(zhuǎn)到Whatman540濾紙上。按Gergen等人所述(Nucleic Acids Res.72115-2135，1979)溶解菌落，然后固定。將濾紙與Boel等人(EMBO J31097-1102，1984)所述的32P-標記的H.langinosa脂酶特異性十五聚物混合物雜交。分別在37℃和43℃完成濾紙雜交和洗滌，然后然后用放大屏放射自顯影24小時。從兩個雜交的菌落pHLL702.3和pHLL702.4用標準方法(Birnboim andDoly，Nucleic Acids Res.71513-1523，1979)分離少量制備的質(zhì)粒DNA，用Maxam和Gilbert(Methods Enzymol.65499-560，1980)的方法確定DNA插入片段的DNA序列。
為了有利于用cDNA進行進一步的構建，按如下將含有特定限制位點的DNA序列加到cDNA的5’和3’末端。用消化3’非翻譯區(qū)cDNA的Sau961消化pHLL702.3，然后，用大腸桿菌DNA聚合酶(Klenow片段)和四種dNTP填平所得的末端。隨后用切割3’到起始甲硫氨酸密碼子cDNA的SacI消化所述DNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化所得的0.9kb cDNA片段；電洗脫，然后制備進行連接反應。合成927和928bp的作為5’銜接物的兩個寡核苷酸。設計所述銜接物以便將HindIII和BamHI位點加到cDNA 5’到起始Met密碼子前。用ATP和T4多聚核苷酸激酶激活所述兩個寡聚物，彼此退火，然后與用HindIII和HincII消化的pUC19載體中純化的0.9kbcDNA序列相連，在0.7％瓊脂糖凝膠上純化。所得的質(zhì)粒攜帶了為0.9kb BamHI可攜帶片段的H.langinosa脂酶cDNA。BamHI消化并在瓊脂糖凝膠上純化0.9kbcDNA片段后，將其與BamHI和磷酸酶化的p775相連，以得到p960，其中脂酶cDNA位于米曲霉TAKA啟動子和黑曲霉AMG終止子的轉(zhuǎn)錄控制下。
為了制備pMHan37，通過用來自構巢曲霉tpiA基因(McKnightet al，Cell 46143-147，1986)對應區(qū)代替在H.langinosa脂酶基因上游的米曲霉TAKA啟動子5’非翻譯區(qū)的60個堿基對而修飾p960。在PCR反應中使用合成的寡核苷酸和另一個引物，前者含有來自構巢曲霉tpiA兩側(cè)的5’非翻譯區(qū)，在該區(qū)的每個末端均有20個堿基與正好在非翻譯區(qū)外的p9609序列同源，后者含有TAKA啟動子區(qū)中的BssHII位點。由于誘變引物含有靠近ATG起始密碼子的BamHI位點，所以用BamHI和BssHII消化所述PCR片段，然后再克隆到用BssHII和用BamHI部分消化的p960中。用DNA序列分析確定MHan37中ATG上游的200個堿基。p960和pMHan37之間的序列差異如下所示pMHan37CATGCTTGGAGTTTCCAACTCAATTTACCTCTATCCACACTTCTCTTp960 CATGCTTGGAG...GATAGCAACCGACAACATCACATCAAGCTCTCCpMHan37CCTTCCTCAACAATAAACCCCACAGGGG..GGATCCp960 CTTCTCTGAATCCTCTATATACACAACTGGGGATCC含有BamHI位點的引物的序列5’GCTCCTCATGGTGGATCCCCAGTTGTGTATATAGACCATTGAGGAAGGAAGAGAAGTGTGGATAGAGGTAAATTGAGTTGGAAACTCCAAGCATGGCATCCCTTGC 35 Coprinus cinereus過氧化物酶。Coprinus cinereus過氧化物酶的分離和克隆參見WO 92/16634?？傊瑥膭驖{的Coprinuscinereus(IFO 8371)菌絲體抽提，按Boel等人(EMBO J，31097-1102)和Chrigwin等人(Biochemistry 185294-5299)所述，在最大過氧化物酶活性時收集總RNA。按Aviv和Leder(PNASUSA 691408-1412，1972)所述，在寡(dT)-纖維素中進行兩個循環(huán)的親和層析而得到含Poly(A)的RNA。按制造商的說明，用Invitrogen的cDNA合成試劑盒合成cDNA。將來自CoprinuscinereuscDNA文庫的約50000個大腸桿菌重組體轉(zhuǎn)移到Whatman540濾紙上。按Gergen等人所述(Nucleic Acids Res.72115-2135，1979)溶解菌落，然后固定。將濾紙在0.2X SSC，0.1％SDS中與32P-標記的430個堿基對的過氧化物酶特異性探針雜交。在65℃完成濾紙的雜交和洗滌，然后用放大屏放射自顯影24小時，在逐漸增加的溫度洗滌濾紙，然后用放大屏放射自顯影24小時。用這種方法，鑒定了50多個陽性克隆。用標準方法(Birnboimand Doly，Nucleic Acids Res.71513-1523，1979)從雜交的菌落中分離小制備的質(zhì)粒DNA，然后用Sanger雙脫氧方法(Sanger et al.，PNAS USA 745463-5467，1977)確定cDNA插入片段的DNA序列。用HindIII/XhoI從載體中切出過氧化物酶CDNA片段，用瓊脂糖凝膠對應純化，電洗脫，準備進行連接反應。將cDNA片段與HindIII/XhoI消化的HD414相連，以得到pCip，其中，cDNA位于米曲霉TAKA啟動子和黑曲霉AMG終止子的轉(zhuǎn)錄控制下。從pCip準備pJVi9，即缺失正好在過氧化物酶起始密碼子之前的SacI，KpnI，HindIII，PstI，SalI和BamHI限制位點。
編碼Coprinus cinereus過氧化物酶的cDNA序列示于SEQ IDNO 3和4。
6茄病鐮孢角質(zhì)酶。角質(zhì)酶表達載體pCaHj427含有位于米曲霉TAKA-淀粉酶啟動子和黑曲霉葡糖淀粉酶終止子區(qū)(Christiansenet al.，

圖1，同上文)控制下的Fusarium solani f.pisi角質(zhì)酶編碼區(qū)(Soliday et al.，J.Bacteriol.1711942-1951，1989)。按上述用其與pToC90一起共轉(zhuǎn)化臭曲霉菌株NRRL341，NRRL357和CBS103.14。
7 Candida antarctica脂酶B。表達載體pMT1335含有位于米曲霉TAKA-淀粉酶啟動子和黑曲霉葡糖淀粉酶終止子區(qū)(Christiansen et al.，圖1，同上文)控制下的Candida antarctica脂酶B基因。按上述用該載體和pToC90轉(zhuǎn)化臭曲霉菌株CBS103.14，NRRL356，NRRL357和NRRL341。
表1中列出了制備的表達載體的總結(jié)。
表1用于共轉(zhuǎn)化新宿主候選菌株的表達載體
III轉(zhuǎn)化曲霉宿主用下列一般方法轉(zhuǎn)化所有待實驗菌株，除特別說明的例外用被轉(zhuǎn)化菌株的孢子接種100ml YDP(Sherman et al.Methodsin Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，1981)，于34℃振蕩培養(yǎng)1-2天。通過miracloth過濾收集菌絲體，然后用200ml 0.6M MgSO4洗滌。將菌絲體懸浮在15ml1.2M MgSO4，10mM NaH2PO4，pH＝5.8中。將懸浮液在冰上冷卻，加入1ml含120mg BSA(Sigma型H25)的緩沖液中，于37℃緩慢攪拌繼續(xù)培養(yǎng)1.5-2.5小時，直到在顯微鏡下，在樣品中可以觀察到大量的原生質(zhì)體。
通過miracloth過濾懸浮液，將濾液轉(zhuǎn)移到無菌試管中，用5ml0.6 M山梨醇，100mM Tris-HCl，pH＝7.0覆蓋。以2500rpm離心15分鐘，從MgSO4層的頂部收集原生質(zhì)體。將兩體積的STC(1.2M山梨醇，10mM Tris-HCl，pH＝7.5，10mMCaCl2)加到原生質(zhì)體懸浮液中，，然后以1000Xg將混合物離心5分鐘。將原生質(zhì)體顆粒重懸于3mlSTC中，然后再沉淀。重復該過程，然后將原生質(zhì)體重懸于0.2-1mlSTC中。
將100μl原生質(zhì)體懸浮液與5-25μg在10μlSTC中的適宜DNA混合。用含有所需結(jié)構基因(見表1)的表達載體和含有選擇性標記的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化各菌株。質(zhì)粒pToC90和pToC186含有構巢曲霉amdS基因，用其進行轉(zhuǎn)化，然后在以乙酰胺為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長篩選。用質(zhì)粒pJaL77和pJaL154轉(zhuǎn)化，然后篩選潮霉素B抗性。
將混合物在室溫放置25分鐘。加入0.2ml 60％PEG4000(BDH29576)，10mM CaCl2和10mM Tris-HCl pH＝7.5，仔細混合兩次，最后加入0.85ml相同的溶液并仔細混合。將混合物在室溫放置25分鐘，以2500Xg離心15分鐘，然后將顆粒重懸于2ml1.2M山梨醇中。在沉淀一次以上后，將原生質(zhì)體鋪在適宜的平皿上。將原生質(zhì)體鋪在含有1.0M蔗糖，pH＝7.0 10mM乙酰胺為氮源(若amdS為選擇性標記)和20mM CsCl的基本培養(yǎng)基(Cove，Biochem.Biophys.Acta 11351-56，1966)中以抑制背景生長。若hygB為選擇性標記，則使用10mM硝酸鈉為氮源，并存在150μg/ml潮霉素B。作為最終離心，重懸和鋪展步驟的另一種方案，可以加入8mlSTC并與原生質(zhì)體混合，，然后向3個選擇平皿中的每一個中加入3ml，然后旋轉(zhuǎn)以覆蓋平皿。于37℃培養(yǎng)4-7天后，撿出帶有分生孢子的菌落，將其懸浮在無菌水中并鋪開以分離單個菌落。重復所述過程，在第二次再分離后，單個菌落的孢子作為確定的轉(zhuǎn)化體貯存。IV評估重組蛋白質(zhì)的表達在上述過程后，用表1中的表達載體之一和在上述實施例中提到的含有選擇性標記的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化所選菌株的單個分離物。然后用適宜的檢測方法檢測各共轉(zhuǎn)化體以確定是否表達了所需的基因。
A脂酶在含50g/l麥芽糊精，2g/lMgSO4·7H2O2g/l，KH2PO4，3g/lK2SO4，4g/l檸檬酸，8g/l酵母提取物，3g/l(NH4)2SO4，0.5ml痕量金屬溶液，4ml50％脲溶液(單獨高壓滅菌)，1l蒸餾水，pH6.0的M400Da培養(yǎng)基中培養(yǎng)有關脂酶活性的共轉(zhuǎn)化體，用tap水將5g/l酵母提取物制成800ml。在高壓滅菌前將pH調(diào)到4.5。滅菌后，加入166ml過濾滅菌的1M脲(以得到10/l的終濃度)和35.3ml過濾滅菌的1M NaNO3(以得到0.3％的終濃度)。
以對-硝基苯基丁酸酯(pNB)為底物檢測培養(yǎng)過濾物中的脂酶活性。通過將104.6μlpNB加到5mlDMSO中而制備pNB原液。將90μl50mM Tris，pH7.加到微滴定板的各孔中。向各孔加入10μl樣品，將微滴定板振蕩約1分鐘而混合。在正要檢測前，將20μlpNB原液與970μl50mMTris緩沖液(pH7)合在一起，然后混合。在將要用市售的平皿閱讀器檢測脂酶活性前，將100μlpNB-Tris混合物加到各樣品孔中，3分鐘后于405nm測量吸收值。檢測是溫度敏感型的，因此各樣品組均使用內(nèi)標。各樣品確定的斜率直接與脂酶活性相關；檢測的線性范圍為約0.005-5μg/ml。在這種類型的檢測中，確定了H.lanuginosa脂酶的比活性為約4000LU/mg，而假絲酵母脂酶A的比活性為約400LU/mg。
B木聚糖酶在含有下列組分的培養(yǎng)基中生長所有的木聚糖酶轉(zhuǎn)化體，以g/l計麥芽糊精50；MgSO4·7H2O，2.0；KH2PO4，10.0；K2SO4，2.0；檸檬酸2.0；酵母提取物，10.0；AMG痕量金屬溶液，0.5ml；脲，2.0；pH6.0。所有轉(zhuǎn)化體均在34℃作為浸沒的攪拌培養(yǎng)物長長。
用在檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液，pH6.5中懸浮的0.2％AZCL-木聚糖(Megazyme Co.Australia)確定在培養(yǎng)液中的木聚糖酶活性。將培養(yǎng)液通常稀釋100倍，然后將10μl稀釋的培養(yǎng)液與1mlo.2％AZCL-木聚糖底物混合。于42℃將混合物保溫30分鐘。每膈5分鐘將反應混合物混勻。在保溫結(jié)束時，以10000rpm離心5分鐘沉淀未消化的底物。用在595nm的吸收值定量分析從該底物釋放的藍色染料，然后從已知活性的酶制劑制成的標準計算在培養(yǎng)液中的酶活性的量。根據(jù)在相同條件下制備的酶標準確定內(nèi)木聚糖酶單位(EXU)。
C纖維素酶在MY50培養(yǎng)基(50g/l麥芽糊精，2g/lMgSO4·7H2O，10g/lKH2PO4，2g/lK2SO4，2g/l檸檬酸，10g/l酵母提取物，0.5ml痕量金屬，2.0g脲)中，于34℃時纖維素酶轉(zhuǎn)化體生長為浸沒的培養(yǎng)物。
用懸浮在0.1M檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH6.5)中的0.2％AZCL-HE-纖維素(Megazyme)為底物，測量纖維素酶活性。用0.1M檸檬酸鹽緩沖液，pH6.5稀釋培養(yǎng)物，將10μl稀釋的培養(yǎng)液與1ml0.2％AZCL-HE-纖維素混合。在42℃將混合物保溫30分鐘，同時每膈5分鐘振蕩。保溫后，以10000rpm離心5分鐘沉淀未消化的底物。在595nm分光光度計定量測量上清液中的藍色，然后從用已知纖維素酶標準制作的標準曲線確定酶活性的量。根據(jù)在相同條件下制成的酶標準確定內(nèi)纖維素酶單位(ECU)。
D過氧化物酶在含有50g/l麥芽糊精，2g/lMgSO4·7H2O2g/lKH2PO4，3g/lK2SO4，4g/l檸檬酸，8g/l酵母提取物，3g/l(NH4)2SO4，0.5ml痕量金屬溶液，4ml50％脲溶液(分別高溫滅菌)，在1l蒸餾水，pH6.0的M400Da培養(yǎng)基中培養(yǎng)CiP共轉(zhuǎn)化體。
用ABTS為底物或用與已知濃度標準相比的火箭免疫電泳監(jiān)測過氧化物酶表達。對于免疫擴散，在TM緩沖液(1.3g/lTrisbase，0.6g/l馬來酸，pH7)中融解1％瓊脂糖，然后冷卻到55℃。將400μl抗CiP的兔抗血清與15ml瓊脂糖混合，鋪展，固化在10cm×10cm的平皿上。將于37℃，在CDM中生長了7天的CiP轉(zhuǎn)化體的CDM瓊脂(1g/l K2SO4，30g/l蔗糖，0.3g/l NaNO3，0.05g/lKCl，0.05g/lMgSO4·7H2O，0.001g/l FeSO4·7H2O，0.001g/lZnSO47H2O，0.0005g/l CuSO4·5H2O，20g/l麥芽糊精，15g/l瓊脂糖)培養(yǎng)樣品用于在瓊脂平皿中制成的5 mm孔中。使蛋白質(zhì)擴散48小時。用考馬斯藍R將平皿染色，一般肉眼觀察蛋白質(zhì)-抗體沉淀區(qū)。作為標準溶液，在濃度為500，1000，和2000過氧化物酶單位(PODU)/ml使用純化的；1PODU是在標準條件下每分鐘催化1μmol過氧化氫的酶量。
為了用ABTS(2，2’-連氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯)方法確定過氧化物酶，將2ml2mM ABTS[0.110gABTS，Boehringer Mannheim No.102946在0.1 M磷酸鹽緩沖液(10.63g Na2HPO4·2H2O p.a.M6580，5.49KH2PO4p.a.M4873，加軟化水至1l)在30℃預熱10分鐘。在玻璃試管中，向其中加入10.6mMH2O2溶液(1.0g Perhydrol Suprapur 30％H2O2 Merck7298在達25ml的軟化水中)，和0.2ml樣品或標準(標準＝5.0mgKem-En-Tec，1級，No.4140A在達25ml的磷酸鹽緩沖液中，稀釋400倍)。于30℃反應3分鐘。在418nm對milli Q軟化水測量樣品的吸收值，測量3分鐘。通過吸收值的差異給出過氧化物酶活性的最佳反映ΔA＝A(75秒)-A(15秒)。吸收值的差異對應于樣品中的0.05-0.1 PODU/ml應在0.15-0.30之間。
E角質(zhì)酶。在三丁酸甘油酯瓊脂(13％麥芽糊精，0.3％MgSO4·7H2O，0.5％KH2PO4，0.4％檸檬酸，0.6％K2SO4，0.5％酵母提取物，1％三丁酸甘油酯，1％脲，0.3％NaNO30.5ml痕量金屬，2％瓊脂，pH4.5)篩選所選的轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)細胞外角質(zhì)酶的能力，通過三丁酸甘油酯的澄清來檢測。
在37℃用M400Da培養(yǎng)基(見上文所述)在振蕩燒瓶培養(yǎng)中評估產(chǎn)生最大澄清區(qū)的菌株。按如上所述，用對硝基苯基丁酸酯確定細胞外角質(zhì)酶活性。在所有的轉(zhuǎn)化體中，產(chǎn)量最高的角質(zhì)酶生產(chǎn)菌株是稱為CBS 103.14/CaHj427.1的臭曲霉CBS103.14轉(zhuǎn)化體。在振蕩燒瓶培養(yǎng)的3天中，所述轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)的細胞為角質(zhì)酶的水平大約等于由米曲霉對照轉(zhuǎn)化體Qu-1-1生產(chǎn)的量。在小規(guī)模(2升)培養(yǎng)中，所述轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)約1克/升的細胞外角質(zhì)酶。VI結(jié)果和討論表2總結(jié)了由本發(fā)明不同宿主生產(chǎn)的各種異源真菌酶的表達水平。從表中可以看出，所有菌株均成功地表達了至少一種所需的基因。在幾種情況下，新宿主菌株產(chǎn)生了意想不到的高水平的酶。例如，至少有一個臭曲霉菌株在振蕩燒瓶培養(yǎng)液(約1g/l)中，產(chǎn)生了令人驚奇的高水平的HLL，表明這些種能夠表達大量的異源蛋白質(zhì)。事實上，由這些轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)的HLL的生產(chǎn)水平看起來與最佳初級米曲霉轉(zhuǎn)化體，例如HL-23的一樣高或比其高。相似的，兩個菌株以相似高水平表達脂酶B。
與米曲霉，臭曲霉也是一種優(yōu)秀的木聚糖酶生產(chǎn)宿主。這種酶的振蕩燒瓶產(chǎn)率大約是最佳米曲霉轉(zhuǎn)化體中所見到的水平的2倍。
表2在臭曲霉中表達真菌酶<
<p>正如從所列的數(shù)據(jù)中可以看到的，許多臭曲霉菌株均可以生產(chǎn)顯著量的各種異源蛋白質(zhì)，因此確定作為標準黑曲霉和米曲霉宿主系統(tǒng)的替代物是有用的，而且在一些情況下，與使用這些已知的宿主相比，可能更好。
生物材料的保藏下列生物材料已保藏在Agricultural ResearchService Culture Collection(NRRL)1815North UniversityStreet，Peoria，Illinois 61604。細胞系 登記號含有pJVi9的E.coli DH5αNRRL B-21161含有pCaHJ418的E.coli DH5α NRRL B-21162含有pMT1229的E.coli DH5αNRRL B-21163含有pAXX40-1-1的E.coli DH5α NRRL B-21164含有pMHan37的E.coli DH5αNRRL B-21165臭曲霉E46 NRRL B-21167
序列表(1)一般資料(i)申請人(A)名爾Novo Nordisk Biotech，Inc.
(B)街道1445 Drew Avenue(C)城市Davis，california(D)國家United states of America(E)郵政編碼(ZIP)95616-4880(F)電話(916)757-8100(G)電傳(916)757-0317(ii)發(fā)明題目臭曲霉表達系統(tǒng)(iii)序列數(shù)目4(iv)相應地址(A)收件人Novo Nordisk of North America，Inc.
(B)街道405 Lexington Avenue，Suite 6400(C)城市New York(D)洲New York(E)國家USA(F)郵政編碼1017 4-62 01(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBN PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS
(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.25(vi)當前申請資料(A)申請?zhí)朥S(B)申請日29-NOV-1994(C)分類號(viii)代理人/代理資料(A)姓名(B)注冊號31,274(C)參考/文檔號4119.204-WO(ix)通訊資料(A)電話212-867-0123(B)電傳212-867-0298(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度1123個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部(vi)來源(A)生物Humicola insolens(C)個體分離物DSM 6995(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置126..806(xi)序列描述SEQ ID NO1AATACGACTC ACTATAGGGA ATATTAAGCT TGGTACCGAG CTCGGATCCA CTAGTAACGG 60CCGCCAGTGT GCTCTAAAGC GCCGCTTCTT CAGTTGTGTA CGATCATCCA GCAACTCGCA 120GCACC ATG GTC TCG CTC AAG TCT GTC CTC GCG GCC GCC ACG GCT GTG 167Met Val Ser Leu Lys Ser Val Leu Ala Ala Ala Thr Ala Val1 5 10AGC TCT GCC ATT GCT GCC CCT TTT GAC TTC GTT CCT CGG GAC AAC TCG215Ser Ser Ala Ile Ala Ala Pro Phe Asp Phe Val Pro Arg Asp Asn Ser15 20 25 30ACG GCC CTT CAG GCT CGA CAG GTG ACC CCC AAC GGC GAG GGC TGG CAC263Thr Ala Leu Gln Ala Arg Gln Val Thr Pro Asn Gly Glu Gly Trp His35 40 45AAC GGC TAC TTC TAC TCG TGG TGG TCC GAC GGC GGA GGC CAG GTT CAG311Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser Trp Trp Ser Asp Gly Gly Gly Gln Val Gln50 55 60TAC ACC AAC CTC GAG GGC AGC CGC TAC CAG GTC AGA TGG CGT AAC ACC359Tyr Thr Ash Leu Glu Gly Ser Arg Tyr Gln Val Arg Trp Arg Asn Thr65 70 75GGC AAC TTC GTC GGT GGT AAG GGT TGG AAC CCG GGA ACC GGC CGC ACG407Gly Asn Phe Val Gly Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Thr Gly Arg Thr80 85 90ATC AAC TAC GGC GGC TAC TTC AAC CCC CAG GGC AAC GGC TAC CTG GCC455Ile Asn Tyr Gly Gly Tyr Phe Asn Pro Gln Gly Asn Gly Tyr Leu Ala95 100 105 110GTC TAC GGC TGG ACC CGC AAC CCG CTC GTC GAG TAC TAT GTC ATC GAG503Val Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Val Ile Glu115 120 125TCG TAC GGC ACG TAC AAT CCC GGC AGC CAG GCT CAG TAC AAG GGC ACA551Ser Tyr Gly Thr Tyr Asn Pro Gly Ser Gln Ala Gln Tyr Lys Gly Thr130 135 140TTC TAT ACC GAC GGC GAT CAG TAT GAC ATC TTT GTG AGC ACC CGC TAC 599Phe Tyr Thr Asp Gly Asp Gln Tyr Asp Ile Phe Val Ser Thr Arg Tyr145 150 155AAC CAG CCC AGC ATC GAC GGC ACC CGG ACG TTC CAG CAG TAC TGG TCT 647Asn Gln Pro Ser Ile Asp Gly Thr Arg 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Thr His225(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度1307個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設無(iv)反義無(vi)來源(A)生物Coprinus cinereus(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置5...1096(xi)序列描述SEQ ID NO3TACT ATG AAG CTC TCG CTT TTG TCC ACC TTC GCT GCT GTC ATC ATC GGT 49Met Lys Leu Ser Leu Leu Ser Thr Phe Ala Ala Val Ile Ile Gly1 5 10 15GCC CTC GCT CTA CCC CAG GGT CCT GGA GGA GGC GGG TCA GTC ACT TGC97Ala Leu Ala Leu Pro Gln Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Cys20 25 30CCC GGT GGA CAG TCC ACT TCG AAC AGC CAG TGC TGC GTC TGG TTC GAC 145Pro Gly Gly Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gln Cys Cys Val Trp Phe Asp35 40 45GTT CTA GAC GAT CTT CAG ACC AAC TTC TAC CAA GGG TCC AAG TGT GAG 193Val Leu Asp Asp Leu Gln Thr Asn Phe Tyr Gln Gly Ser Lys Cys Glu50 55 60AGC CCT GTT CGC AAG ATT CTT AGA ATT GTT TTC CAT GAC GCG ATC GGA 241Ser Pro Val Arg Lys Ile Leu Arg Ile Val Phe His Asp Ala Ile Gly65 70 75TTT TCG CCG GCG TTG ACT GCT GCT GGT CAA TTC GGT GGT GGA GGA GCT 289Phe Ser Pro Ala Leu Thr Ala Ala Gly Gln Phe Gly Gly Gly Gly Ala80 85 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(A)長度363個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Lys Leu Ser Leu Leu Ser Thr Phe Ala Ala Val Ile Ile Gly Ala1 5 10 15Leu Ala Leu Pro Gln Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Cys Pro20 25 30Gly Gly Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gln Cys Cys Val Trp Phe Asp Val35 40 45Leu Asp Asp Leu Gln Thr Asn Phe Tyr Gln Gly Ser Lys Cys Glu Ser50 55 60Pro Val Arg Lys Ile Leu Arg Ile Val Phe His Asp Ala Ile Gly Phe65 70 75 80Ser Pro Ala Leu Thr Ala Ala Gly Gln Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp85 90 95Gly Ser Ile Ile Ala Mis Ser Asn Ile Glu Leu Ala Phe Pro Ala Asn100 105 110Gly Gly Leu Thr Asp Thr Val Glu Ala Leu Arg Ala Val Gly Ile Asn115 120 125His Gly Val Ser Phe Gly Asp Leu Ile Gln Phe Ala Thr Ala Val Gly130 135 140Met Ser Asn Cys Pro Gly Ser Pro Arg Leu Glu Phe Leu Thr Gly Arg145 150 155 160Ser Asn Ser Ser Gln Pro Ser Pro Pro Ser Leu Ile Pro Gly Pro Gly165 170 175Asn Thr Val Thr Ala Ile Leu Asp Arg Met Gly Asp Ala Gly Phe Ser180 185 190Pro Asp Glu Val Val Asp Leu Leu Ala Ala His Ser Leu Ala Ser Gln195 200 205Glu Gly Leu Asn Ser Ala Ile Phe Arg Ser Pro Leu Asp Ser Thr Pro210 215 220Gln Val Phe Asp Thr Gln Phe Tyr Ile Glu Thr Leu Leu Lys Gly Thr225 230 235 240Thr Gln Pro Gly Pro Ser Leu Gly Phe Ala Glu Glu Leu Ser Pro Phe245 250 255Pro Gly Glu Phe Arg Met Arg Ser Asp Ala Leu Leu Ala Arg Asp Ser260 265 270Arg Thr Ala Cys Arg Trp Gln Ser Met Thr Ser Ser Asn Glu Val Met275 280 285Gly Gln Arg Tyr Xaa Xaa Xaa Met Ala Lys Met Ser Val Leu Gly Phe290 295 300Asp Arg Asn Ala Leu Thr Asp Cys Ser Asp Val Ile Pro Ser Ala Val305 310 315 320Ser Asn Asn Ala Ala Pro Val Ile Pro Gly Gly Leu Thr Val Asp Asp325 330 335Ile Glu Val Ser Cys Pro Ser Glu Pro Phe Pro Glu Ile Ala Thr Ala340 345 350Ser Gly Pro Leu Pro Ser Leu Ala Pro Ala Pro355 360
權利要求
1含有與啟動子可操作相連的編碼異源酶的核酸序列的臭曲霉宿主細胞。
2權利要求1的宿主細胞，其中所述酶選自過氧化氫酶，漆酶，酚氧化酶，氧化酶，氧化還原酶，纖維素酶，木聚糖酶，過氧化物酶，脂酶，水解酶，酯酶，角質(zhì)酶，蛋白酶和其他蛋白水解酶，氨肽酶，羧肽酶，植酸酶，裂解酶，果膠酶和其他果膠水解酶，淀粉酶，葡糖淀粉酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，甘露糖苷酶，異構酶，蔗糖酶，轉(zhuǎn)移酶，核糖核酸酶，幾丁質(zhì)酶和脫氧核糖核酸酶。
3權利要求1的宿主細胞，其中所述啟動子是真菌啟動子。
4權利要求1的宿主細胞，其中所述蛋白質(zhì)是真菌酶。
5權利要求1的宿主細胞，還含有選擇性標記。
6權利要求5的宿主細胞，其中所述標記選自argB，trpC，pyrG，amdS和hygB。
7權利要求3的宿主細胞，其中所述啟動子選自米曲霉TAKA淀粉酶，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸穩(wěn)定α-淀粉酶和Rhizomucor miehei脂酶。
8臭曲霉宿主細胞，含有編碼與真菌啟動子和選擇性標記可操作相連的異源真菌酶的核酸序列。
9權利要求8的細胞，其中所述酶選自過氧化氫酶，漆酶，酚氧化酶，氧化酶，氧化還原酶，纖維素酶，木聚糖酶，過氧化物酶，脂酶，水解酶，酯酶，角質(zhì)酶，蛋白酶和其他蛋白水解酶，氨肽酶，羧肽酶，植酸酶，裂解酶，果膠酶和其他果膠水解酶，淀粉酶，葡糖淀粉酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，甘露糖苷酶，異構酶，蔗糖酶，轉(zhuǎn)移酶，核糖核酸酶，幾丁質(zhì)酶和脫氧核糖核酸酶。
10權利要求9的宿主細胞，含有選自脂酶，木聚糖酶和纖維素酶的真菌酶。
11權利要求8的宿主細胞，其中所述啟動子選自來自米曲霉TAKA淀粉酶，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸穩(wěn)定α-淀粉酶和Rhizomucor miehei脂酶的啟動子。
12權利要求8的宿主細胞，其中所述選擇性標記選自argB，trpC，pyrG，amdS和hygB。
13權利要求8的宿主細胞含有與TAKA-淀粉酶啟動子可操作相連的編碼真菌脂酶的核酸序列，而且還含有amdS標記。
14權利要求8的宿主細胞，含有編碼與TAKA淀粉酶啟動子或AMG啟動子可操作相連的真菌木聚糖酶的核酸序列，而且還含有amdS或hygB標記。
15生產(chǎn)所需的蛋白質(zhì)的方法，包括在可以表達所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)含有編碼與啟動子可操作相連的異源蛋白質(zhì)的核酸序列的臭曲霉宿主細胞，然后從培養(yǎng)液中回收所述蛋白質(zhì)。
16權利要求15的方法，其中所述蛋白質(zhì)是真核酶。
17權利要求15的方法，其中所述啟動子是真菌啟動子。
18權利要求16的方法，其中所述蛋白質(zhì)是真菌酶。
19權利要求16的方法，其中所述酶選自過氧化氫酶，漆酶，酚氧化酶，氧化酶，氧化還原酶，纖維素酶，木聚糖酶，過氧化物酶，脂酶，水解酶，酯酶，角質(zhì)酶，蛋白酶和其他蛋白水解酶，氨肽酶，羧肽酶，植酸酶，裂解酶，果膠酶和其他果膠水解酶，淀粉酶，葡糖淀粉酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，甘露糖苷酶，異構酶，蔗糖酶，轉(zhuǎn)移酶，核糖核酸酶，幾丁質(zhì)酶和脫氧核糖核酸酶。
20權利要求15的方法，還包括一選擇性標記。
21權利要求20的方法，其中所述標記選自argB，trpC，pyrG，amdS和hygB。
22權利要求15的方法，其中所述啟動子選自來自米曲霉TAKA淀粉酶，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸穩(wěn)定α-淀粉酶和Rhizomucor miehei脂酶的啟動子。
23含有與啟動子可操作相連的編碼同源酶的核酸序列的臭曲霉宿主細胞。
24生產(chǎn)所需蛋白質(zhì)的方法，包括在可以表達所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)含有編碼與啟動子可操作相連的同源蛋白質(zhì)的重組核酸序列的臭曲霉宿主細胞，然后從培養(yǎng)液中回收所述蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的表達系統(tǒng)，其中用臭曲霉為宿主細胞表達異源酶。
文檔編號C12N9/30GK1139456SQ94194682
公開日1997年1月1日 申請日期1994年11月29日 優(yōu)先權日1993年12月1日
發(fā)明者R.M.伯卡, W.猶德, S.塔卡吉, K.C.博密納桑 申請人:諾沃諾爾迪斯克生物技術有限公司