專利名稱：物質(zhì)的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用微生物來生產(chǎn)目的物質(zhì)的方法。本發(fā)明的典型微生物包括屬于埃希氏桿菌屬(Escherichia)的微生物和棒狀桿菌，它們被傳統(tǒng)用于多種物質(zhì)生產(chǎn)中。所生產(chǎn)的目的物質(zhì)，包括L-氨基酸、抗生素、維生素、生長因子、生理活性物質(zhì)，以及其他傳統(tǒng)由微生物生產(chǎn)的物質(zhì)。本發(fā)明公開了在利用微生物的物質(zhì)生產(chǎn)方法中，提高最終目的產(chǎn)物產(chǎn)率所使用的方法。
背景技術(shù)：
L-氨基酸發(fā)酵是使用微生物生產(chǎn)目的產(chǎn)物的公知方法的典型例證。L-氨基酸不僅被用于調(diào)味品和食品，也用于作各種的醫(yī)藥營養(yǎng)混合物組分，用作動物飼料添加劑，制藥業(yè)及化學(xué)工業(yè)中的藥劑，以及作為利用微生物產(chǎn)生L-氨基酸如L-賴氨酸和L-高絲氨酸等的生長因子。作為用于發(fā)酵法生產(chǎn)L-氨基酸的微生物，眾所周知的有棒狀桿菌屬于埃希氏桿菌屬、棒狀桿菌屬(Bacillus)、及沙雷氏菌屬(Serratia)的微生物。
野生型微生物(野生型株)、由野生株誘導(dǎo)而得的營養(yǎng)缺陷株、作為多種耐藥性突變株的、由野生株誘導(dǎo)而得的代謝調(diào)節(jié)變異株以及既有營養(yǎng)缺陷株和代謝調(diào)節(jié)變異株兩方面性質(zhì)的株都可用于發(fā)酵法生產(chǎn)L-氨基酸。營養(yǎng)缺陷株所需物質(zhì)隨不同的株而不同，并且，對于同種物質(zhì)，不同的營養(yǎng)缺陷株要求程度亦不同。同樣，對于作為耐藥性變異株的代謝調(diào)節(jié)變異株亦有多樣性。
近年來，使用了重組DNA技術(shù)進(jìn)行L-氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)。此技術(shù)的原理是在宿主微生物中，富集L-氨基酸生物合成酶(系)，強(qiáng)化宿主微生物的L-氨基酸生物合成系統(tǒng)。參見「氨基酸發(fā)酵學(xué)會出版中心1986」。
但是，傳統(tǒng)用于發(fā)酵法生產(chǎn)L-氨基酸的微生物，其L-氨基酸生物合成途徑、以及輔酶的生物合成途徑等，與野生型微生物的生物合成途徑?jīng)]有什么不同。即，L-氨基酸生產(chǎn)微生物的育種，對于在L-氨基酸生物合成途徑中存在的最終產(chǎn)物或類似物是脫敏的。為了如此育種，對微生物細(xì)胞提供營養(yǎng)要求性及耐藥性，用重組DNA技術(shù)，進(jìn)行生物合成酶(系)基因的擴(kuò)增。
另外，除L-氨基酸以外，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的物質(zhì)有很多。例如抗生素和維生素。抗生素有各種各樣的種類，有多種物質(zhì)作為其生物合成的前體。如糖、氨基酸、醋酸、丙酸、甲羥戊酸等。通過前體之外的多種代謝物的轉(zhuǎn)換過程，從這種前體中產(chǎn)生目的抗生素。對于維生素和其他生物產(chǎn)生物質(zhì)也有同樣的機(jī)制。
在利用微生物生產(chǎn)上述各種物質(zhì)的時(shí)候，每種物質(zhì)都是由微生物細(xì)胞內(nèi)的生物合成途徑來生產(chǎn)的。有一種重要的輔酶是生物合成體系中相應(yīng)酶充分起作用所必需的，它就是還原型煙酰胺腺苷二核苷酸磷酸(以下稱作NADPH)，但是，對于NADPH和利用微生物生產(chǎn)物質(zhì)的關(guān)系，尚未報(bào)導(dǎo)。
與NADPH的產(chǎn)生有關(guān)的酶之一是煙酰胺二核苷酸轉(zhuǎn)氫酶(以下稱作轉(zhuǎn)氫酶)。該酶被公認(rèn)存在于包括埃希氏桿菌屬微生物的各種生物中。大腸桿菌是埃希氏桿菌屬的典型微生物，其轉(zhuǎn)氫酶的純化(David M.Clarke and Philip D.Bragg，Eur.J.Biochem.，149，517-523(1985))，其編碼基因的克隆(David M.Clarke and Philip D.Bragg，J.Bacteriology，162，367-373(1985))，基因的核苷酸序列的測定(David M.Clarke，Tip W.Loo，Shirley Gillam，and PhilipD.Bragg，Eur.J.Biochem.158，647-653(1986))已進(jìn)行，也明確了該酶的存在。然而，該酶的生理活性幾乎未知。這一點(diǎn)被該酶缺陷株沒有表現(xiàn)型表達(dá)的事實(shí)所證明。
發(fā)明公開內(nèi)容本發(fā)明的主題是，提高微生物產(chǎn)生目的物質(zhì)的產(chǎn)率，包括步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，使目的物質(zhì)在該培養(yǎng)基中生成并蓄積，收集該目的物質(zhì)。
傳統(tǒng)的提高目的物質(zhì)的方法是對于目的物質(zhì)的生物合成途徑產(chǎn)生的終產(chǎn)物或其他物質(zhì)引起的合成調(diào)節(jié)的失敏，或?qū)τ诖嬖谟谖⑸锛?xì)胞中的目的物質(zhì)合成所必需的輔酶的失敏。本發(fā)明是根據(jù)提及以外的全新的原理，給出一種提高目的物質(zhì)產(chǎn)率的方法。
對于在生物體內(nèi)進(jìn)行的物質(zhì)如L-氨基酸的生物合成，要起多種還原反應(yīng)。輔酶NADPH被生理性用作生活期內(nèi)還原物質(zhì)。例如，對于L-谷氨酸的生物合成途徑，谷氨酸脫氫酶要求NADPH作為輔酶。對于L-賴氨酸的生物合成途徑中，天冬氨酸半醛脫氫酶、二氫吡啶二羧酸還原酶也要求NADPH作為輔酶。
對于其他L-氨基酸的生物合成途徑也是同樣，NADPH作為輔酶起到了重要的作用。并且，對于多數(shù)L-氨基酸的生物合成途徑，L-谷氨酸作為氨基的供給源是必要的，因此，在L-氨基酸生物合成中NADPH是供給氨基必不可少的。
NADPH大部分是由在含有葡萄糖-6-磷酸鹽脫氫酶和磷酸葡萄糖脫氫酶的磷酸戊糖循環(huán)中，葡萄糖被代謝而生成的。由于磷酸戊糖循環(huán)，可以釋放出二氧化碳，因此，NADPH的產(chǎn)率，可以按每一個葡萄糖分子，相對于12個NADPH分子來計(jì)算。
另一方面，雖然還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下簡稱為NADH)與NADPH是極為相似的分子，但在許多情況下則不能作為L-氨基酸生物合成的輔酶。NADH在TCA循環(huán)中被生物合成，通常大量存在于細(xì)胞內(nèi)。
對于L-氨基酸的生物合成途徑，由葡萄糖生物合成所需L-氨基酸過程中，在很多情況下，產(chǎn)生了不能夠有效地被利用的生物體內(nèi)的成份。通常這樣的成份在TCA循環(huán)中被氧化，結(jié)果產(chǎn)生很多NADH。
本發(fā)明提出了一種假說，對于利用微生物生產(chǎn)目的物質(zhì)的方法，在生產(chǎn)目的物質(zhì)時(shí)，需要大量的NADPH，為提供這種NADPH，就要不可避免地消耗葡萄糖，結(jié)果引起每消耗糖量的目的物質(zhì)產(chǎn)率的降低(假說1)。
并且，發(fā)明者提出了一種假說，對于利用微生物生產(chǎn)目的物質(zhì)的方法，在生產(chǎn)目的物質(zhì)時(shí)，不能被有效地利用的生物體內(nèi)成份會不可避免地蓄積起來，在TCA循環(huán)中被代謝，結(jié)果引起的細(xì)胞內(nèi)NADH濃度上升(假說2)。
基于上述假說1和假說2，如果細(xì)胞內(nèi)的NADH能夠充分地轉(zhuǎn)變成NADPH，就可以節(jié)約NADPH的生物合成所需要的糖，微生物就可以以更高的產(chǎn)率生產(chǎn)目的物質(zhì)。同時(shí)假定，作為在TCA循環(huán)中所生成的NADH轉(zhuǎn)變成NADPH的這種方法，也可以考慮利用轉(zhuǎn)氫酶。
發(fā)明者，以上述概念為基礎(chǔ)進(jìn)行了研究。深入研究的結(jié)果，從埃希氏桿菌中獲得含有轉(zhuǎn)氫酶基因的DNA片段，使用此DNA片段，能夠成功地使微生物的還原型煙酰胺腺苷二核苷酸磷酸的生產(chǎn)能力上升。因此，上述具有提高的還原型煙酰胺腺苷二核苷酸磷酸的生產(chǎn)能力的微生物能夠提高目的物質(zhì)的產(chǎn)率。
即，本發(fā)明具有以下特征(1)一種使用微生物生產(chǎn)目的物質(zhì)的方法，包括步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，在該培養(yǎng)基中，使目的物質(zhì)生成并蓄積，以及從培養(yǎng)基中收集目的物質(zhì)這個利用微生物生產(chǎn)還原型煙酰胺腺苷二核苷酸磷酸的產(chǎn)率得到提高。
(2)(1)的方法其中目的物質(zhì)是L-氨基酸(3)(2)的方法其中L-氨基酸選自L-蘇基酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸或是L-苯丙氨酸；(4)(1)或(2)的方法其中微生物屬于埃希氏桿菌；(5)(1)或(2)的方法其中微生物屬于棒狀桿菌；(6)(1)或(5)的方法其中通過提高微生物細(xì)胞內(nèi)煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的酶活性而提高微生物還原型煙酰胺腺苷二核苷酸磷酸的產(chǎn)率。
(7)(6)的方法通過增加微生物細(xì)胞內(nèi)編碼煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶基因的表達(dá)數(shù)量，而提高微生物的還原型煙酰胺腺苷二核苷酸磷酸的產(chǎn)率。
(8)(7)的方法通過增加微生物細(xì)胞內(nèi)的煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶基因拷貝數(shù)，從而提高微生物的還原型煙酰胺腺苷二核苷酸磷酸的產(chǎn)率。
本發(fā)明利用微生物所產(chǎn)生的目的物質(zhì)是如L-蘇基酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-苯丙氨酸等的各種L-氨基酸。除此之外，任何下面提及的微生物產(chǎn)生的，在其生物合成途徑中必需NADPH的物質(zhì)，如鳥苷酸、次黃苷酸等的核酸類、維生素類、抗生素、生長因子、生理活性物質(zhì)等都是可應(yīng)用的。另外，即使是不是利用微生物生產(chǎn)的物質(zhì)，假如對于它的生物合成，NADPH是必要的物質(zhì)，則一定可以使用本發(fā)明。
例如，生物合成鏈霉素，在從dTDP-葡萄酸到dTDP-4-氧-4，6-雙脫氧-D-葡萄糖的合成中，要使用NADPH。另外，對于肽抗生素，由于氨基酸成為前體，對于它的生物合成，NADPH是必要的。青霉素是一種β-內(nèi)酰胺抗生素其前體是L-纈氨酸、L-半胱基酸以及L-α-氨基已二酸，對于它的生物合成，NADPH也是必要的。
試圖知道任何物質(zhì)的生物合成需要NADPH時(shí)，假如生物合成途徑被揭示，從其生物合成途徑可以顯而易見。
本發(fā)明所用的微生物，假如它屬于那些用于生產(chǎn)的埃希氏桿菌屬、棒狀桿菌、芽孢桿菌屬(Bacillus)、沙雷氏菌屬等，并沒有被特殊地限定。優(yōu)選微生物，其DNA片段含有從微生物中分離得的質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，轉(zhuǎn)氫酶基因機(jī)能，以及增高的轉(zhuǎn)氫酶基因的拷貝數(shù)。另一方面，具有起始的目的物質(zhì)的高生產(chǎn)能力的株，根據(jù)本發(fā)明，最優(yōu)選為應(yīng)用提高產(chǎn)率的菌株。因?yàn)楦弋a(chǎn)率的菌株引起的上述假說1，假說2的現(xiàn)象更強(qiáng)，因此，利用本方法，產(chǎn)率的改良的效果應(yīng)該表現(xiàn)得更為明顯。例如，目的物質(zhì)是L-蘇基酸時(shí)，例舉大腸桿菌B-3996(VKPM B-3996)(RIA 1867)(參照美國專利第5,175,170號)、棒狀桿菌。乙酰嗜酸菌AJ12318(FERM BP-1172)(參照美國專利第5,188,949號)等，L-賴氨酸時(shí)，例舉大腸桿菌AJ11442(NRRL B-12185，F(xiàn)ERM BP-1543)(參照美國專利第4,346,170號)、乳糖發(fā)酵短桿菌。AJ 3990(ATCC 31269)(參照美國專利第4,066,501號)等，L-谷氨酸時(shí)，例舉大腸桿菌AJ12624(FERM BP-3853)(參照法國專利公開申請第2,680,178號)、乳糖發(fā)酵短桿菌，AJ12475(FERM BP-2922)(參照美國專利第5,272,067號)等，L-亮氨酸時(shí)，例舉大腸桿菌AJ11478(FERM P-5274)(參見特公昭62-34397號)、乳糖發(fā)酵短桿菌AJ 3718(FERM P-2516)(參照美國專利第3,970,519號)等，L-異亮氨酸時(shí)，是大腸桿菌KX141(BKTTM B-4781(VKPM B-4781)(參照歐洲專利公開申請第519,113號)、乳糖發(fā)酵短桿菌AJ12419(FERM BP-759)(參照美國專利第4,656,135號)等，L-纈氨酸時(shí)，是大腸桿菌VL1970(BKTTM B-4411(VKPM B-4411)(參照歐洲專利公開申請第519,113號)、乳糖發(fā)酵短桿菌AJ12341(FERM BP-1763)(參照美國專利第5,188,948號)等，L-苯丙氨酸時(shí)，是大腸桿菌AJ12604(FERM BP-3579)(參照歐洲專利公開申請第488,424號)、乳糖發(fā)酵短桿菌AJ12637(FERM BP-4160)(參照法國專利公開申請第2,686,898號)。
本發(fā)明使用的生產(chǎn)目的物質(zhì)的培養(yǎng)基，可以使用對應(yīng)于所采用的微生物，傳統(tǒng)使用的眾所周知的培養(yǎng)基。即含有碳源、氮源、無機(jī)離子以及優(yōu)選其他有機(jī)成份的普通培養(yǎng)基。實(shí)施本發(fā)明無需特別的培養(yǎng)基。
作為碳源，可以使用例如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉水解物等糖類、甘油和山梨醇等的醇類、富馬酸、檸檬酸、琥珀酸等有機(jī)酸類。
作為氮源，可以使用硫酸銨、氧化胺、磷酸銨等的無機(jī)銨鹽、大豆水解物等的有機(jī)氮、氨氣、氨水等。
作為微量有機(jī)營養(yǎng)源，例如維生素B1、L-高絲氨酸、L-酪氨酸、酵母提取物等的必需物質(zhì)，并且優(yōu)選適量的含有。除此之外，少量添加磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等也是任選的。
對應(yīng)于所采用的微生物，可以在傳統(tǒng)使用的公知的條件下進(jìn)行。例如，在有氧條件下可以培養(yǎng)16-120個小時(shí)，培養(yǎng)溫度為25℃-45℃，培養(yǎng)中的pH值控制在5-8。另外，可以使用無機(jī)或有機(jī)的酸或堿物質(zhì)以及氨氣等調(diào)節(jié)pH值。
從培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)基中收集代謝產(chǎn)物，本發(fā)明無須特別的方法。也就是說，本發(fā)明將傳統(tǒng)的眾所周知的離子交換樹脂片，沉淀法及其他方法組合起來實(shí)施的。
作為使微生物的NADPH的生產(chǎn)能力上升的方法，可以例舉微生物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氫酶的酶活性上升。
作為使轉(zhuǎn)氫酶的酶活性上升的方法之一，可以例舉提高轉(zhuǎn)氫酶的基因的表達(dá)量。另一種提高轉(zhuǎn)氫酶酶活性的方法是修飾轉(zhuǎn)氫酶基因以產(chǎn)生具有的升高活性的轉(zhuǎn)氫酶。
微生物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氫酶基因的表達(dá)數(shù)量上升的方法，可例舉微生物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氫酶的拷貝數(shù)提高。
為了提高轉(zhuǎn)氫酶基因的拷貝數(shù)，含有上述基因的DNA片段是必要的。轉(zhuǎn)氫酶基因已被克隆到埃希氏桿菌屬的大腸桿菌K-12中，其核酸序列已被確定(D.M.Clarke et al.，Eur.J.Biochem.，158，647-653(1986)。制備上述基因的DNA片段，可以使用D.M.Clarke et al.所揭示的方法。另外，使用參照D.M.Clarkeet al.所揭示的堿基序列制成的合成DNA探針進(jìn)行雜交法，或使用按照上述堿基序列制成的合成DNA為引物的PCR法，用以上兩種方法能夠得到所期望的DNA片段。將能夠在目的微生物內(nèi)自主復(fù)制的質(zhì)粒-DNA，與含有轉(zhuǎn)氫酶基因的DNA片段相連，將其導(dǎo)入上述微生物，能夠使轉(zhuǎn)氫酶基因的拷貝數(shù)上升。
在使用PCR法從埃希氏桿菌屬細(xì)菌中克隆轉(zhuǎn)氫酶基因時(shí)，所使用的DNA引物，對于大腸桿菌，可以基于合適的已知的序列(D.M.Clarke et al.，Eur.J.Biochem.，158，647-653(1986)制成。由于轉(zhuǎn)氫酶是兩個亞基組成的，因此必須把它們各自的基因pntA pntB的擴(kuò)增。能夠擴(kuò)增pntA，pntB兩個基因的3Kb的區(qū)的兩個引物、5′-CTGATTTTTGGATCCAGATCACAG-3′(SEQ ID NO1)，5′-CGTTCTGTTAAGCTTTCTCAATAA-3′(SEQ ID NO2)是適合的。這些引物與D.M.Clarke et al.，所報(bào)告的序列略有不同，然而由于其序列的變化，可以在pntA，pntB兩個基因的上游導(dǎo)入BamHI酶切位點(diǎn)，在其下游導(dǎo)入HindIII酶切位點(diǎn)，BamHI和HindIII位點(diǎn)在兩基因內(nèi)以及它們附近都不存在。所以，當(dāng)使用這些限制酶進(jìn)行克隆擴(kuò)增的DNA片段，以及轉(zhuǎn)運(yùn)到其他載體-DNA時(shí)，是很方便的。引物-DNA的合成，可以使用Applied Biosystems公司制造的DNA合成儀model 380 B，用phosphoamidite法(Tetrahedron letters，22，1859(19817)按常規(guī)進(jìn)行。PCR反應(yīng)，可用寶酒造有限公司制造的DNAサ-マルサイクゥ-PJ2000型，使用Taq DNA聚合酶，依照廠家指定的方法進(jìn)行。
含轉(zhuǎn)氫酶基因的DNA片段，可以從埃希氏桿菌屬細(xì)菌以外的微生物中取得，取得方法是參考D.M.Clarke et al.，公開的堿基序列，制備DNA探針進(jìn)行雜交，或按照上述堿基序列合成DNA引物進(jìn)行PCR，就可以得到所希望的DNA片段。
在雜交法中使用的DNA探針，或用PCR法克隆基因時(shí)使用的DNA引物，可以基于已知的序列，例如大腸桿菌的序列(D.M.Clarke et al.，Eur.J.Biochem.，158，647-653(1986)適當(dāng)?shù)刂瞥?。預(yù)計(jì)對各種微生物，基因的堿基序列是不同的，主張制備的合成DNA應(yīng)匹配于那些在來源于各種微生物轉(zhuǎn)氫酶之間的保守的部分。
用PCR法擴(kuò)增的轉(zhuǎn)氫酶基因，在導(dǎo)入埃希氏桿菌屬細(xì)菌時(shí)，連接到能夠在埃希氏桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞中自主復(fù)制的載體DNA上，導(dǎo)入埃希氏桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞。
對于將得到的含有轉(zhuǎn)氫酶基因的DNA片段，導(dǎo)入埃希氏桿菌屬細(xì)菌以外的微生物時(shí)，將上述DNA片段連接到能夠在待導(dǎo)入上述DNA片段的微生物細(xì)胞中自主復(fù)制的載體DNA上，導(dǎo)入上述細(xì)胞。
本發(fā)明使用的載體-DNA，優(yōu)選質(zhì)粒載體DNA?？衫epUC19、pUC 18、pBR 322、pHSG 299、pHSG 399、RSF 1010等。另外也可以使用噬菌體DNA載體。為有效地表達(dá)轉(zhuǎn)氫酶，也可以使用微生物內(nèi)起作用的啟動子，如lac、trp和PL。另外，為使轉(zhuǎn)氫酶基因拷貝數(shù)上升，可采用轉(zhuǎn)座子(Berg，D.E.and Berg，C.M.，Bio/Technol.，1，417(1983))Mu噬菌體(專利申請平成2-109985)或同源性重組(Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Lab.1972))的方法，將含有上述基因的DNA(Berg，D.E.and Berg，C.M.，Bio/Technol.，1，417(1983))整合入染色體。
在導(dǎo)入基因的是微生物是棒狀桿菌時(shí)，本發(fā)明能夠使用的載體-DNA是棒狀桿菌中能夠自主復(fù)制的質(zhì)粒載體、如pAM 330(參照專利申請平成1-11280公報(bào))和pHM 519(參照專利申請昭和58-77895號公報(bào))等。
從具有提高的轉(zhuǎn)氫酶活性的可能性的待選株中，為了選擇在實(shí)際上具有提高的轉(zhuǎn)氫酶活性的株，可使用已知的方法(David M.Clarkeand Philip D.Bragg，Journal of Bacteriolony，162，367-373(1985))來確認(rèn)轉(zhuǎn)氫酶活性的增強(qiáng)。
附圖簡述

圖1、表示質(zhì)粒pMW∷THY的制備。
圖2、表示質(zhì)粒pHSG∷THYB的制備。
圖3、表示質(zhì)粒pSU∷THY的制備。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式通過列舉以下實(shí)施例，更加具體地說明本發(fā)明。
實(shí)施例1轉(zhuǎn)氫酶基因的克隆編碼大腸桿菌的轉(zhuǎn)氫酶的pntA，pntB基因的堿基序列已經(jīng)報(bào)導(dǎo)過(D.M.Clarke et al.，Eur.J.Biochem.，158，647-653(1986)、pntA編碼502氨基酸殘基的蛋白質(zhì)、pntB編碼462氨基酸的蛋白質(zhì)。另外，這兩種蛋白質(zhì)對于轉(zhuǎn)氫酶活性的表達(dá)都是必要的，兩個基因在染色體DNA上連續(xù)排列因而兩基因可作為1個DNA片段得以克隆。
本發(fā)明者，為以后的操作的方便，不僅克隆兩個基因，并同時(shí)對于已知的存在于這些基因的上游的有啟動子活性的區(qū)域，進(jìn)行克隆。具體說就是用PCR法，放大含有基因和啟動子區(qū)的DNA片段，進(jìn)行克隆。
用常規(guī)法制備5′-CTGATTTTTGGATCCAGATCACAG-3′(SEQ ID NO1)，5′-CGTTCTGTTAAGCTTTCTCAATAA-3′(SEQ ID NO2)的二種合成DNA，作為PCR反應(yīng)用的引物。對于PCR反應(yīng)DNA模板，用齋藤、三浦的方法(Biochem.Biophys.Acta.，72，619(1963))制備大腸桿菌K-12 MC 1061株的總?cè)旧w組DNA。使用兩種引物-DNA和模板染色體DNA，根據(jù)Erlich等人的方法(PCR Technology，Stockton press(1989))進(jìn)行PCR反應(yīng)，進(jìn)行最終DNA片段的擴(kuò)增。另外，作為引物使用的兩個合成DNA的堿基序列與D.M.Clarkeet al.報(bào)告的序列，在其合成DNA片段中央部分有若干不同。這是由于在設(shè)計(jì)合成寡核苷酸時(shí)，它們各自分別導(dǎo)入BamHI酶切位點(diǎn)和HindIII酶切位點(diǎn)。這兩個限制酶切位點(diǎn)，在將擴(kuò)增的DNA片段插入載體時(shí)是必要的。在PCR反應(yīng)時(shí)兩限制酶切位點(diǎn)的導(dǎo)入，引起引物和染色體DNA之間失配，但由于這些限制酶切位點(diǎn)被限定在合成DNA片段的中央部位，PCR反應(yīng)的DNA的擴(kuò)增可以不受失配影響進(jìn)行?？梢杂铆傊悄z電泳，確認(rèn)3.0KbDNA片段的擴(kuò)增。
用BamHI和HindIII消化擴(kuò)增的3.0Kb DNA片段。另和具有氨芐抗性標(biāo)記的質(zhì)粒載體-pMW 118(從Nippon Gene公司購入)。用DNA連結(jié)酶連結(jié)兩片段。由此得到的重組DNA命名為pMW∷THY質(zhì)粒(圖1)用pMW∷THY質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(從寶酒造(株)公司購入)，得到轉(zhuǎn)化子大腸桿菌JM109(pMW∷THY)。使用已知的方法(David M.Clarke and Philip D.Bragg，Journal ofBacteriolony，162，367-373(1985))，測定大腸桿菌JM109和大腸桿菌JM109(pMW∷THY)的細(xì)胞提取液中存在的轉(zhuǎn)氫酶的活性，結(jié)果用表1表示。
表1菌株名JM109 JM109 pMW∷THY轉(zhuǎn)氫酶比活(u/mg proteion)1.01.7根據(jù)表1所示，將大腸桿菌JM109(pMW∷THY)株與大腸桿菌JM109株比較，可以看到前者的轉(zhuǎn)氫酶的酶活性被提高了。其結(jié)果，證明在THY質(zhì)粒中插入的DNA片段被確認(rèn)含有轉(zhuǎn)氫酶基因。具有pMW∷THY質(zhì)粒的大腸桿菌起名為AJ12929株。此菌株在平成5年10月4日(1993年10月4日)，在通產(chǎn)省工業(yè)技術(shù)院生命工業(yè)技術(shù)研究所(郵政編號305，日本國茨城縣つくば市未一街第一排3號)，以保藏號為FERM P-13890保藏，平成6年9月14日(1994年9月14日)，根據(jù)布達(dá)佩斯條約由原保藏單位轉(zhuǎn)移為國際保藏單位，保藏號為FERM BP-4798。
用常規(guī)方法制備pMW∷THY質(zhì)粒的DNA，用BamHI和HindIII切斷，以分離含有轉(zhuǎn)氫酶基因的3.0Kb DNA片段。另外，用BamHI和HindIII切斷具有氯霉素抗性標(biāo)記的質(zhì)粒載體pHSG 399(從寶酒造購入)，并分離大片段。使用DNA-連結(jié)酶連結(jié)轉(zhuǎn)氫酶基因的片段和pHSG 399的BamHI和HindIII大片段，以獲得pHSG∷THY質(zhì)粒。
雖然pHSG∷THY質(zhì)粒，在埃希氏桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，能夠自主復(fù)制，但不能穩(wěn)定地存在于棒狀桿菌細(xì)胞內(nèi)，因此，從棒狀桿菌衍生的自主復(fù)制質(zhì)粒中獲得復(fù)制起點(diǎn)，并將其引入質(zhì)粒pHSG∷THY。
用BamHI酶切在棒狀桿菌細(xì)胞內(nèi)能自主復(fù)制的質(zhì)粒pHM 1519(參照專利申請昭和58-77895號公報(bào))，得到含有復(fù)制起點(diǎn)的3.0Kb DNA片段。另一方面，得到用BamHI酶切pHSG∷THY質(zhì)粒而成的DNA片段。用DNA-連結(jié)酶，連結(jié)兩DNA片段，制成質(zhì)粒pHSG∷THYB(圖2)，含有此pHSG∷THYB的大腸桿菌，命名為AJ12872株。此菌株，于平成5年10月4日(1993年10月4日)，在通產(chǎn)省工業(yè)技術(shù)院生命工業(yè)技術(shù)研究所(日本國茨城縣筑波市未一街第一排3號)保藏，保藏號為FERM P-13889，平成6年9月14日(1994年9月14日)，根據(jù)布達(dá)佩斯條約，從原保藏單位移到國際保藏單位，保藏號為FERM BP-4797。
并且，將在埃希氏桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)能夠自主復(fù)制的質(zhì)粒pSU 18，用限制酶BamHI和HindIII酶切(Borja，Bartolome et al.，Gene，102，75-78(1991))，得到大片段。用DNA連結(jié)酶，將此大片段與上述的含轉(zhuǎn)氫酶基因的3.0Kb DNA片段連結(jié)，制成質(zhì)粒pSU∷THY(圖3)。含有此pSU∷THY的大腸桿菌，命名為AJ12930株。此菌株，平成5年10月4日(1993年10月4日)，在通產(chǎn)省工業(yè)技術(shù)院生命工業(yè)技術(shù)研究所保藏，保藏號為FERM P-13891，平成6年9月14日(1994年9月14日)，根據(jù)布達(dá)佩斯條約，從原保藏單位移至國際保藏單位，保藏號為FERM BP-4799。
已證明通過增加細(xì)菌中的轉(zhuǎn)氫酶活性，在埃希氏桿菌屬和棒狀桿菌的細(xì)菌細(xì)胞中對多種氨基酸的產(chǎn)率有何種影響。
實(shí)施例2 具有導(dǎo)入轉(zhuǎn)氫酶的菌株的L-蘇氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)作為L-蘇氨酸大腸桿菌生產(chǎn)菌，到現(xiàn)在所知，B-3996(參照日本專利公開N0.3-501682(PCT))具有最高的生產(chǎn)能力，因此，對于評價(jià)轉(zhuǎn)氫酶的提高效果，可以將B-3996作為宿主以評價(jià)轉(zhuǎn)氫酶的提高效果，B-3996菌株含有質(zhì)粒pVIC 40(InternationalPublication Pamphlet WO90/04636)。質(zhì)粒pVIC 40是在含有鏈霉素抗性標(biāo)記的廣泛宿主范圍的質(zhì)粒載體pAYC 32(參見chistorerdov，A.Y.Tsgankov Y.D.，Plasmid，1986，16，161-167)中插入蘇氨酸操縱子而得到的。B-3996株，以保藏號RIA 1867保藏于USSR Antibiotics Research Institute(VNIIA)。
根據(jù)Maniatis的方法(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis，T.，Moleculan，Cold Spring Harbor laboratory Press I.，21(1989))，從實(shí)施例1中所得到的大腸桿菌AJ12929株中，回收pMW∷THY質(zhì)粒，用D.M.Morrison的方法(Methods in Enzymo-logy，68，326(1979))在B-3996株中導(dǎo)入所得到的pMW∷THY質(zhì)粒，命名為B-3996(pMW∷THY)。在以下條件下培養(yǎng)B-3996株和B-3996(pMW∷THY)。
使用含有表2記載的組成成份的培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間為38小時(shí)，溫度為37℃，攪拌114-116rpm進(jìn)行培養(yǎng)。如表2所示，分別制備A成份、B成份、C成份、殺菌、冷卻后，按A成份為16/20體積、B成份4/20體積、C成份30g/L的比例混合，培養(yǎng)結(jié)果用表3表示。對于L-蘇氨酸埃希氏桿菌屬細(xì)菌生產(chǎn)菌，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氫酶活性的增強(qiáng)，可以判明L-蘇氨酸的產(chǎn)率被改善。
表2 蘇氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基(g/l)(A) (NH4)2SO416KH2PO41MgSO47H2O 1FeSO47H2O 0.01MnSO45H2O 0.01Yeast Ext.(Difco) 2L-甲硫氨酸0.5用KOH調(diào)pH值為7.0并于115℃下高壓滅菌10分鐘(16/20體積)(B) 20％葡萄糖115℃下高壓10分鐘(4/20容體積)(C) 藥典CaCO3180℃下，干熱2天(30g/l)抗生素(鏈霉素100μg/ml，卡那霉素5μg/ml)
表3菌株名 B-3996B-3996(pMW∷THY)蘇氨酸(g/l) 12.97 13.99實(shí)施例3 導(dǎo)入轉(zhuǎn)氫酶的菌株的L-賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)對于L-賴氨酸生產(chǎn)棒狀桿菌，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氫酶活性的增強(qiáng)，可以確定L-賴氨酸產(chǎn)率是否被改善。作為棒狀桿菌的L-賴氨酸生產(chǎn)菌，可以使用乳糖發(fā)酵短桿菌AJ 3990(BrevibacteriumLactofermentum)。AJ 3990株從昭和52年2月8日起(1977年2月8日)，以保藏號ATCC 31269保藏于美國。類型，培養(yǎng)，收集，核對(American Type Culture Collection美國、馬里蘭20852、羅克維爾、バクロニドライプ10301)、平成6年10月11日(1994年10月11日)，根據(jù)布達(dá)佩斯條約，從原保藏單位移交國際保藏單位，保藏號相同。
用Maniatis的方法(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis，T.，Moleculan，Cold Spring Harbor laboratory Press I.，21(1989))，從實(shí)施例1中所得到的大腸桿菌AJ 12872株中，回收pHSG∷THYB質(zhì)粒，用電脈沖法(參照專利申請平成2-207791號公報(bào))，將所得到的質(zhì)粒導(dǎo)入AJ 3990。將導(dǎo)入pHSG∷THYB AJ 3990株命名為AJ 3990(pHSG∷THYB)。在如下的條件下，培養(yǎng)AJ 3990株和AJ 3990(pHSG∷THYB)。
使用含有表4記載的組成成份的培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)，溫度為31.5℃，攪拌114-116rpm，進(jìn)行培養(yǎng)。三種不同的糖，葡萄糖、蔗糖和果糖被用作糖源。培養(yǎng)結(jié)果用表5表示。己證明對于L-賴氨酸生產(chǎn)棒狀桿菌，通過提高細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)氫酶活性而提高L-賴氨酸產(chǎn)率。
表4賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基糖 36 g/lNH4Cl 20 g/lKH2PO41 g/lMgSO47H2O 0.4g/lFeSO47H2O 10 mgMnSO47H2O 8 mg大豆蛋白水解物 1 mg(作為氮源)Thiamine-HCl 100mg生物素 300mg在115℃下高壓10分鐘后，添加3％分別殺菌的碳酸鈣表5賴氨酸鹽酸蓄積量(g/l)AJ 3990 AJ 3990(pHSG∷THYB)葡萄糖13.614.5蔗糖 11.112.6果糖 8.2 11.9實(shí)施例4 導(dǎo)入轉(zhuǎn)氫酶的菌株的苯丙氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)對于苯丙氨酸生產(chǎn)埃希氏桿菌屬細(xì)菌，可以確認(rèn)在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氫酶活性的增強(qiáng)之后，苯丙氨酸生產(chǎn)性是否被改善。作為埃希氏桿菌屬細(xì)菌的苯丙氨酸生產(chǎn)菌，可以使用大腸桿菌AJ 12604株。AJ 12604株具有質(zhì)粒pBR-aroG以及質(zhì)粒pACMAB。質(zhì)粒pBR-aroG是在含有氨芐抗性標(biāo)記的載體-質(zhì)粒pBR 322中插入突變型aroG基因而得到的。質(zhì)粒pACMAB是在含有氯霉素抗性標(biāo)記的載體-質(zhì)粒pALYC 184中插入突變型RheA基因而得到的(參照專利申請平成5-344881號公報(bào))。AJ 12604株，平成3年1月28日(1994年1月28日)，以保藏號為FERM P-11975保藏于通產(chǎn)省工業(yè)技術(shù)院生命工業(yè)技術(shù)研究所，平成3年9月26日(1994年9月26日)，根據(jù)布達(dá)佩斯條約，從原保藏單位移交國際保藏單位，保藏號為FERM BP-3579。用Maniatis的方法(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis，T.，Moleculan，Cold Spring Harbor laboratory Press I.，21(1989))，從實(shí)施例1中所得到的大腸桿菌AJ 12930株中，回收pSU∷THY質(zhì)粒，用D.M.Morrison的方法(Methods in Enzymo-l0gy，68，326(1979))在AJ 12604株中導(dǎo)入所得到的質(zhì)粒。將導(dǎo)入pSU∷THY，AJ 12604株命名為AJ 12604(pSU∷THY)株。在以下條件下培養(yǎng)AJ 12604株和AJ 12604(pSU∷THY)。
使用含有表6中記載的組成成份的培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間為16小時(shí)，溫度為37℃，攪拌114-116rpm進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)果用表7表示。對于L-苯丙氨酸生產(chǎn)埃希氏桿菌屬細(xì)菌，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氫酶活性的增強(qiáng)，可以判明L-苯丙氨酸的產(chǎn)率被改善。
表6苯丙氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基g/l葡萄糖 20Na2HPO429.4KH2HPO46NaCl 1NH4Cl 2檸檬酸鈉 20L-谷氨酸單鈉 0.4MgSO47H2O 3CaCl20.23Thiamine-HCl 2mgL-酪氨酸 75mg在115℃下高壓10分鐘后，添加3％分別滅菌的碳酸鈣。
表7AJ 12604 AJ 12604(pSU∷THY)苯丙氨酸4.28 4.89蓄積量(g/l) 3.75 4.28在生產(chǎn)上利用的可能性依據(jù)本發(fā)明，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，使目的物質(zhì)在該培養(yǎng)基中蓄積，并取得這種目的物質(zhì)，關(guān)于這個利用微生物制造目的物質(zhì)的方法，用與傳統(tǒng)不相同的方法，能夠改善目的物質(zhì)產(chǎn)率。
序列表(1)一般資料(i)申請人Ajinomoto Co.Inc.(ii)發(fā)明題目物質(zhì)生產(chǎn)方法(iii)序列數(shù)2(iv)通訊地址(A)地址(B)街道(C)城市(D)州(E)國家(F)郵編(vi)目前申請資料(A)申請?zhí)?B)提交日(C)分類(vii)先有申請資料(A)申請?zhí)?B)提交日(viii)律師/代理人信息(A)姓名(B)注冊號(C)查詢/案號(ix)電信信息(A)電話(B)電傳(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸線性(ii)分子類型其他..合成DNA(iii)假設(shè)無(xi)SEQ ID NO1序列描述CTGATTTTTG GATCCAGATC ACAG 24(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸線性(ii)分子類型其他..合成DNA(iii)假設(shè)無(xi)SEQ ID NO2序列描述CGTTCTGTTA AGCTTTCTCA ATAA 2權(quán)利要求
1.使用微生物生產(chǎn)目的物質(zhì)的方法，包括步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物以在所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生及蓄積目的物質(zhì)，以及從所述培養(yǎng)基收集目的物質(zhì)，其中所述微生物的還原型煙酰胺腺苷二核苷酸磷酸產(chǎn)率提高。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述目的物質(zhì)是L-氨基酸。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述L-氨基酸選自L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-苯丙氨酸。
4.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述微生物屬于埃希氏桿菌(Escherichia)屬。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述微生物是棒狀桿菌。
6.權(quán)利要求1-5之任一的方法，其中通過提高所述微生物細(xì)胞內(nèi)的煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的酶活性而提高所述微生物的還原型煙酰胺腺苷二核苷酸磷酸的產(chǎn)率。
7.權(quán)利要求1-5之任一的方法，其中通過增加所述微生物細(xì)胞內(nèi)的煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶編碼基因的表達(dá)數(shù)量來提高所述微生物的還原型煙酰胺腺苷二核苷酸磷酸的產(chǎn)率。
8.權(quán)利要求1-5之任一的方法，其中通過增加所述微生物細(xì)胞內(nèi)的煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶編碼基因的拷貝數(shù)來提高所述微生物的還原型煙酰胺腺苷二核苷酸磷酸的產(chǎn)率。
全文摘要
通過提高微生物細(xì)胞的還原型煙酰胺腺苷二核苷酸磷酸的產(chǎn)率，來提高微生物發(fā)酵中一些物質(zhì)，例如L-氨基酸、抗生素、維生素、生長因子和生理活性物質(zhì)的產(chǎn)率。
文檔編號C12N9/02GK1139956SQ9419470
公開日1997年1月8日 申請日期1994年10月26日 優(yōu)先權(quán)日1993年10月28日
發(fā)明者児島宏之, 戶一彥 申請人:味之素株式會社 被以下專利引用 (4),