專利名稱：抑制編程性細(xì)胞死亡的組合物、其純化方法及其用途的制作方法
本申請是美國專利申請系列號No.08/320155的部分繼續(xù)申請，后者是美國專利申請系列號No.08/158980的部分繼續(xù)申請(1993年11月30日申請)并在此引為參考。
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有抑制編程性細(xì)胞死亡作用的物質(zhì)的組合物。
本發(fā)明的背景技術(shù)編程性細(xì)胞死亡是導(dǎo)致個(gè)體細(xì)胞死亡的正常生理過程。此編程性細(xì)胞死亡過程參與了多種正常的及病理的生物過程并可由多種不相關(guān)的刺激物引起。在老齡化過程中，編程性細(xì)胞死亡的生物調(diào)節(jié)也發(fā)生變化，這種變化引起很多與老齡化相關(guān)的癥狀和疾病。最近對編程性細(xì)胞死亡的研究表明導(dǎo)致細(xì)胞死亡的普通代謝途徑可由多種信號引起，包括激素、血清生長因子缺乏、化療試劑、離子輻射及人免疫缺陷病毒(HIV)的感染。Wyllie(1980)Nature 284555-556；Kanter等人(1984)Biochem.Biophys.Res.Commun.118392-399；Duke and Cohen(1986)Lymphokine Res.5289-299；Tomei等人(1988)Biochem.Biophys.Res.Commum.155324-331；及Kruman等人(1991)J.Cell.Physiol.148267-273；Ameisen and Capron(1991)Immunol.Today 12102-105；及Sheppard and Ascher(1992)J.AIDS 5143-147。能作用于編程性細(xì)胞死亡的生物控制試劑便應(yīng)用于多種臨床癥狀的治療中。
編程性細(xì)胞死亡的特征是細(xì)胞收縮、染色體凝聚、細(xì)胞漿產(chǎn)生氣泡、膜的滲透性增加及核小體間DNA裂解。Gerschenson等人(1992)FSDEB J.62450-2455；及Cohen and Duke(1992)Ann.Rev.Immunol.10267-293。
本申請上下文中引用的所有文獻(xiàn)在此引為參考。
部分含有經(jīng)部分加工的植物提取物的多種補(bǔ)充食物已被用于改善化療、輻射及AIDS經(jīng)常伴發(fā)的胃腸道功能紊亂。這種補(bǔ)充食物通常含有碳水化合物、脂肪及植物蛋白水解產(chǎn)物。例如，見Tomei and Cops等人的in Apoptosis The Moleclar Basis of CellDeath(1991)Cold Spring Harbor Laboratory Press。
幾種來自植物提取物的蛋白酶抑制劑具有抗致癌物活性。Troll等人(1987)Adv.Cancer Res.49265-283。在這些抑制劑中，Bowman-birk抑制劑被描述得最充分。Birk(1985)Int.J.Pep.Pro.Res.25113-131。Bowman-birk抑制劑被描述為一族二硫鍵蛋白，分子量約為8kD，它可抑制細(xì)胞變形。Chou等人(1974)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 711748-1752；Yavelow等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825395-5399；及Yavelow等人(1983)Cancer Res.(Suppl.)432454s-2459s。已知大豆的粗提取物含有Bowman-Birk抑制劑。Knnedy等人美國專利4793996；PCT專利WO94/20121；及Kennedy，A.R.(1994)Cancer Res.(suppl.)541999s-2005s。Bowman-Birk抑制劑的免疫學(xué)性質(zhì)也有描述。WO90/03574及美國專利4959310及5053327。還發(fā)現(xiàn)Bowman-Birk抑制劑在巨噬細(xì)胞的失粒作用中有活性。日本專利63051335。
溶血磷脂酸(LPA)以多種磷脂的形式發(fā)現(xiàn)于多種植物產(chǎn)品中。已發(fā)現(xiàn)LPA具有多種生理活性，包括促有絲分裂作用、生長因子及作為抗皺試劑。美國專利4263286、4746652、5326690及5340568。Moolenaar(1994)TICB 4213-219及Eichholtz等人(1990)Biochem.J.291677-680對LPA進(jìn)行了詳細(xì)的綜述。
本發(fā)明概述本發(fā)明包括制備抑制編程性細(xì)胞死亡組合物的方法及由此制備的組合物。此組合物命名為植物源編程性細(xì)胞死亡抑制劑(PAIs)。本發(fā)明包括以足以調(diào)節(jié)編程性細(xì)胞死亡的量適于使用PAIs的生理上可接受的組合物。本發(fā)明還包括PAIs的使用方法。
附圖的簡要描述

圖1表示對于融合的C3H 10T1/2細(xì)胞PAIs的抗編程性細(xì)胞死亡作用。
圖2表示對在指數(shù)生長期的C3H 10T1/2細(xì)胞PAIs的抗編程性細(xì)胞死亡作用與濃度的關(guān)系。
圖3表示由乙醇萃取純化的PAIs與由篩析凝膠過濾色譜進(jìn)一步純化的PAIs對C3H 10T1/2細(xì)胞抗編程性細(xì)胞死亡活性的比較。此數(shù)據(jù)以對胰蛋白酶抑制活性作用表示。
圖4表示不同濃度的大豆PAIs對以放線菌酮處理的非活動(dòng)性的C3H 10T1/2的抗編程性細(xì)胞死亡活性。
圖5表示PAI中單糖的色譜圖。
圖6描述了在鼠心肌細(xì)胞獲得的結(jié)果。
圖7是描述豆粉提取物對氨甲喋呤處理的小鼠的作用圖示。
圖8是描述豆粉提取物對氨甲喋呤處理的小鼠的作用圖示。
圖9是描述豆AcE對氨甲喋呤處理的小鼠的作用圖示。
圖10是描述豆粉提取物對氯甲喋呤處理的小鼠的作用圖示。
圖11是描述用氨甲喋呤和不同食物處理后小鼠腹瀉發(fā)病率的方框圖。
圖12是總結(jié)用氨甲喋呤和不同食物處理后小鼠腹瀉發(fā)病率及體重增加情況的方框圖。
圖13是DNA序列梯的照片，用以測量由感染HIV個(gè)體獲得的淋巴細(xì)胞中的編程性細(xì)胞死亡。
圖14是描述在用BSA或提取段B預(yù)處理提高溶血磷脂酸的情況下，抗編程性細(xì)胞死亡活性的方框圖。所用縮略語為LPA，L-α-溶血磷脂酸、油?；?C181，〔順〕-9)；BSA，牛血清白蛋白；提取段V，乙醇提取物；及“B，”由豆粉所得的提取段B，主要是磷脂酰肌醇。
圖15是描述對體外血清缺乏C3H 10T1/2細(xì)胞，溶血磷脂酸、油酰基(C181，〔順〕-9)的抗編程性細(xì)胞死亡作用圖示。
實(shí)施本發(fā)明的方式現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，多種植物成分含有一些組份，當(dāng)將其至少作部分純化和純化時(shí)，它表現(xiàn)有抑制編程性細(xì)胞死亡的能力。很容易將這些組合物與Bowman-Birk抑制劑分離并明顯不同于其它已知的治療有效的植物產(chǎn)品。此組合物因來源和原來植物的生長條件會(huì)在化學(xué)組成上有細(xì)微的變化。因?yàn)楸景l(fā)明包括通過本文描述的方法制備的相關(guān)組合物，但這些組合物來自不同的植物，故這些組合物在本文指“PAIs”。此組份也可通過類脂合成領(lǐng)域中已知的方法合成制得。有幾種相對純化的組合物，將它們指定為L/G、AcE、MAcE及FAcE以表示下述不同的純化程度。相對純化提取段在下面的討論中也被稱為“D”及“L”，每個(gè)都是磷脂的混合物。相對純化的兩個(gè)組合物還都含有溶血磷脂酸(LPA)、LPA及蛋白載體和LPA及其它無活性提取段“B”。
PAIs可由多種不同的植物及植物器官分離。優(yōu)選的植物屬豆科(蠶豆及豌豆等)，但PAIs也可由其它植物分離，如茄屬(如馬鈴薯)及蔥屬(如大蒜)。PAIs也可由部分純化的植物提取物中分離，包括但不限于糖蜜、植物凝集素、部分純化的蛋白濃縮物及部分純化的蛋白水解物。使用本文描述的方法確定是否可由一種特定的植物、植物提取物或植物器官中分離出PAIs是本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般知識。
能得到此組合物的任何植物提取物或其一部分都適用于本發(fā)明。所用植物器官包括但不限于莖、葉、根、花、根莖并優(yōu)選的是儲(chǔ)存器官和球莖，優(yōu)選所用植物部分是儲(chǔ)存器官包括但不限于馬鈴薯及大蒜。最優(yōu)選豆的干種子包括但不限于黃豆及豌豆用于簡化制備過程。雖然本文中使用了術(shù)語“種子”及“多種種子”，但應(yīng)理解，這些術(shù)語包括能得到至少一種有治療活性的PAI或在細(xì)胞培養(yǎng)中有活性的PAI的任何植物部分。
本發(fā)明包括初步純化PAIs的方法。可達(dá)到不同程度的純化。將多種種子研碎或粉碎，優(yōu)選制成粉或面。在本文中，術(shù)語“粉”指研碎的干燥植物部分。粉的粒度應(yīng)足夠小以便使物質(zhì)表面接觸不同的提取液。任何研碎或粉碎方法均適用于本發(fā)明，一般地講，通過商用磨完成多種種子的粉碎。PAIs對熱異常穩(wěn)定，此研碎過程可在使很多蛋白變性的溫度下進(jìn)行。也可使用購買的種子面。例如，已發(fā)現(xiàn)黃豆面及多種黃或綠豌豆面含有活性PAIs。
然后將種子粉用本領(lǐng)域已知方法脫脂。脫脂需要在惰性環(huán)境(例如無氧的氮?dú)夥栈驓鍤夥?中進(jìn)行，或在此過程中加入抗氧劑如BHT或BHA，以改善活性或降低氧化。脫脂作用一般通過用含有機(jī)溶劑的溶液提取粉末來完成。適宜的有機(jī)溶劑包括但不限于丙酮、四氯化碳、乙醚、己烷及氯仿。溶液中有機(jī)溶劑的濃度一般為50-100％。優(yōu)選有機(jī)溶劑是丙酮。所用有機(jī)溶劑的濃度可隨特定的溶劑及種子類型變化。確定有效的濃度是本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般知識。優(yōu)選丙酮的濃度約為70％。也可進(jìn)行多相有機(jī)提取。粉末與有機(jī)溶液的比率(重量/體積)也可變化。雖然不限于下列范圍，但一般比率為約2∶1至約1∶20(粉末重量/有機(jī)溶劑體積)。對于丙酮，優(yōu)選比率為1∶5。
由于PAIs的穩(wěn)定性，進(jìn)行脫脂作用的溫度和氣壓至多只受到所用有機(jī)溶劑的冰點(diǎn)或沸點(diǎn)的限制。一般為了方便，在室溫和常壓下進(jìn)行脫脂。而提取的時(shí)間并不嚴(yán)格，主要取決于粉末與有機(jī)溶劑的比率。對于用70％的丙酮以1∶5的比率提取時(shí)，脫脂一般進(jìn)行30分鐘，并不斷攪拌。
然后以任何本領(lǐng)域已知的方法將有機(jī)溶劑從粉末中分離。優(yōu)選通過離心將粉末從有機(jī)相中沉降并除去有機(jī)相。也可采用任何適宜的分離形式包括但不限于過濾或通過重力分離。PAIs留在提取后的粉末中。
然后用水溶液提取脫脂粉末得到含有PAIs的水保留液。該水溶液可以是緩沖液如磷酸鹽水緩沖液(PBS)并也可含有高達(dá)約80％的與水混溶的有機(jī)溶劑。適宜的與水混溶的有機(jī)溶劑包括但不限于乙腈、低級鏈烷醇，特別是C1-C4鏈烷醇如乙醇、甲醇及丙醇，低級鏈烷二醇，特別是C2-C4的鏈烷二醇如乙二醇，及低級鏈烷二醇的聚合物，特別是聚乙二醇。優(yōu)選使用乙醇，最優(yōu)選以50％的濃度。
粉末與水溶液的比率也可變化。提取比率可以是約1∶1至至少約1∶20(粉末重量/水溶液體積)。一般使用1∶10的50％乙醇。提取時(shí)間也隨水溶液的體積及所用與水混溶的有機(jī)溶劑的百分率而變化。對于1∶10(體積比)的50％乙醇，提取過程為1小時(shí)，并不斷混合或攪拌(攪動(dòng))。
已發(fā)現(xiàn)水溶液的pH范圍關(guān)系不大，已試驗(yàn)了2.5至11的范圍；而似乎甚至更大的范圍也可以是有效的。一般為了方便，pH范圍為7-8。
水溶液提取的溫度和氣壓可在大范圍內(nèi)變化，在主要決定于水溶液的冰點(diǎn)和沸點(diǎn)。一般，提取在室溫和常壓下進(jìn)行。一旦用水溶液提取，水保留液就被除去以進(jìn)一步加工。本領(lǐng)域已知的任何除去水溶液的方法都是適宜的，包括但不限于離心及過濾。
水保留液再進(jìn)一步純化得到PAI。通過任何本領(lǐng)域已知的方法均可將任何與水混溶的有機(jī)溶劑除去，包括但不限于超濾、干燥及透析。使用10kD分子量的界限值進(jìn)行超濾可除去低分子量蛋白質(zhì)如Bowman-Birk抑制劑單體及有機(jī)溶劑。透析管的分子量界限值同樣可以是10kD。
超濾后通過滲濾或通過多次改變透析液(如純水)可除去殘留的有機(jī)溶劑。水保留液可以以溶液的形式保存最多幾天而以凍干固體的形式可無限期保存。優(yōu)選將水保留液凍干。如果起始物質(zhì)是豆粉，則凍干固體是ACE。水保留液及凍干保留物都可進(jìn)行進(jìn)一步加工；凍干保留物在進(jìn)一步加工前再懸于適當(dāng)?shù)乃芤褐?。得到的物質(zhì)可通過任意分子量篩析色譜法進(jìn)一步分離，包括但不限于用水緩沖液的Sepharose S100HR(PharmaciaBiotechnology Piscataway NJ.USA)或BioGel P-100(BioRadLaboratories Inc，Hercules CA，USA)。適當(dāng)?shù)木彌_液包括但不限于10至50mM磷酸鹽(中性pH)的0.1至0.3M碳酸氫銨或0.1至0.3M氯化鈉。
由篩析色譜得到的PAIs發(fā)現(xiàn)于空體積中并具有大于80kD的外觀分子量。發(fā)現(xiàn)于此提取段的物質(zhì)可通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)在減壓條件下分離出，其中含有幾種蛋白質(zhì)。用考馬司藍(lán)染色表明存在有分子量在18至68kD的6-8種蛋白質(zhì)。通過薄層色譜分析顯示存在幾種類脂型化合物。
由色譜洗脫在280nm具有最大吸收的提取段與含有最大生物活性的提取段相符合。由低分子量物質(zhì)中及空體積中某一位置的洗脫物中分離的生物活性與分子量大于80kD的或凝集物的相一致。此物質(zhì)可以濃縮、透析、凍干并以凍干形式無限期保存。如果起始物質(zhì)是豆粉，則凍干的固體是FAcE。
可溶性PAIs可用濃度為70％或更大的丙酮沉淀。但是，用不同試劑處理，包括強(qiáng)酸，可破壞其活性。例如，三氟乙酸、鹽酸、三氯乙酸及苯酚破壞其活性。而pH若低到2.5則不破壞活性，因?yàn)?％乙酸不影響PAIs的活性。
通過將脫脂及乙醇提取的種子粉末中得到的凍干的高分子量提取段用氯仿∶甲醇∶水(4∶8∶3)單相混合物提取，可進(jìn)一步分離PAIs。通過將干燥物質(zhì)溶于水，然后加入甲醇、氯仿，混合并除去沉淀，可最方便地作到這一點(diǎn)。此提取過程得到保留PAI活性的糖脂/磷脂提取段。
例如，將0.1gEQ(得自0.1g起始物質(zhì)的量)高分子量提取段(FAcE)溶于7.5ml水并不斷攪拌，加入20ml甲醇后，加入10ml氯仿。通過離心(8,000×g×10分鐘)除去不溶物質(zhì)，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑并凍干除去水再從溶液中得到PAI。得到的提取段被命名為L/G提取段。L/G提取段的碳水化合物組合物由比率為3∶2的阿拉伯糖及半乳糖以及微量的巖藻糖、鼠李糖、葡糖胺、葡糖及甘露糖組成。
基于在氯仿∶甲醇混合物中的溶解性通過在硅膠色譜柱中或薄層色譜(TLC)板上進(jìn)行拆分，可將L/G提取段做進(jìn)一步分離。
然后，將此物質(zhì)在硅酸(即Mallinckrodt SiO2·xH2O100目粉末)上進(jìn)行預(yù)色譜步驟。將活性物質(zhì)裝載于氯仿中并用氯仿或氯仿∶甲醇(90∶10)的混合物洗滌，并用甲醇或氯仿∶甲醇(10∶90或20∶80)洗脫。
活性物質(zhì)可在二醇柱如Diol SepPak柱(Waters，Millipore)上經(jīng)色譜法進(jìn)一步純化。例如，硅膠純化的L/G、粗商用植物凝集素或其它溶于氯仿中的豆磷脂制劑可作為起始物質(zhì)。例如，將約100-1000mg的樣品以約為100mg/ml的濃度溶于氯仿中并將其裝載于已平衡的10g二醇柱上。用2-5體積的氯仿洗滌，用2-5體積的異丙醇，2-5體積的乙醇洗脫，最后用2-5體積的甲醇洗脫。雖然在乙醇洗脫液中也發(fā)現(xiàn)了一些活性，但大部分活性存在于甲醇洗脫液中。通過干燥將活性物質(zhì)由甲醇中分離出。適當(dāng)?shù)母稍锓椒òǖ幌抻谛D(zhuǎn)蒸發(fā)或減壓蒸餾。一些樣品在-20℃儲(chǔ)存過夜后產(chǎn)生沉淀，但此沉淀可通過離心除去而不損失活性。
活性物質(zhì)可通過HPLC色譜在硅膠柱如Rainin InstrumentCo.，Inc.的Dynamax 60A Si柱上進(jìn)一步分離。所用洗脫活性物質(zhì)的洗脫液的梯度為乙腈∶甲醇∶水∶氫氧化銨95∶3∶2∶0.05至65∶21∶14∶0.35。在205nm下檢測洗脫液的情況。如下面給出的實(shí)施例中描述的，此純化階段產(chǎn)生5個(gè)分離的產(chǎn)品，指定為提取段1-5。這些產(chǎn)品被分離并對其組份及抗編程性細(xì)胞死亡活性分別進(jìn)行分析。將幾個(gè)提取段合并并檢測它們的抗編程性細(xì)胞死亡活性。發(fā)現(xiàn)主要含有溶血磷脂酸(LPA)的流出液(如下所述)是一類化合物。當(dāng)測其活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)市售LPA，L-α-溶血磷脂酸、油?；?C181，〔順〕-9)沒有抗編程性細(xì)胞死亡活性。在此提取段中發(fā)現(xiàn)的LPA及市售LPA在與其特定結(jié)合的一種蛋白質(zhì)或多種蛋白質(zhì)的存在下，確實(shí)具有抗編程性細(xì)胞死亡活性。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是含有LPA及有效量的特定結(jié)合蛋白的組合物。優(yōu)選此結(jié)合蛋白是血清白蛋白。注意Bowman-Birk抑制劑的存在不影響LPA的抗編程性細(xì)胞死亡活性。還發(fā)現(xiàn)在提取段“B”的存在下，LPA也具有抗編程性細(xì)胞死亡的活性。提取段“B”主要是磷脂酰肌醇，并不具有抗編程性細(xì)胞死亡活性。因此本發(fā)明的另一實(shí)施方案是含有LPA及有效量的提取段B或其某種活性成分的組合物。注意提取段B不含蛋白質(zhì)，因此不僅僅由于磷脂的存在才誘發(fā)LPA具有抗編程性細(xì)胞死亡活性。雖然沒有任何理論闡述，但提取段B的作用可能是由于形成膠?；蛑|(zhì)體，它能保護(hù)LPA和/或能讓LPA正確地引進(jìn)細(xì)胞中。
提取段“D”也可制得并具有抗編程性細(xì)胞死亡活性。此提取段對應(yīng)于實(shí)施例8中的峰3。因此本發(fā)明的另一實(shí)施方案是含有提取段D的組合物。
提取段“L”也可制得并發(fā)現(xiàn)其具有抗編程性細(xì)胞死亡活性。此提取段對應(yīng)于實(shí)施例8中的峰5。因此本發(fā)明的另一實(shí)施方案是含有提取段L的組合物。提取段D及提取段L在其抗編程性細(xì)胞死亡活性上可以加和。因此本發(fā)明的另一實(shí)施方案是含有提取段D和提取段L的組合物。
因此，上述實(shí)施方案也包括在術(shù)語PAI中并適用于本文描述的癥狀和組合物。LPA具有下列結(jié)構(gòu) 其中R是未取代或取代的、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的具有11至約23個(gè)碳原子的烷基。
另外，本文中使用的LPA包含多種分子，包括但不限于結(jié)構(gòu)式如下的2-脫氧或2-脫氧-2-鹵代-溶血磷脂酸化合物或其藥用鹽 其中-R是未取代或取代的、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的具有11至約23個(gè)碳原子的烷基；每個(gè)X獨(dú)立地為O或S；Y是O或CH2；Z是H、鹵素、NH2、SH、OH或OPO3H2。
另外還包括RC(O)O-是月桂?；?、肉豆蔻酰基、棕櫚?；⒂仓；⒆貦坝王；?、油酰基或亞麻?；?；特別是油?；?、棕櫚油?；?、肉豆蔻?；⒆貦磅；蛟鹿瘐；?；特別是肉豆蔻酰基或月桂?；?br> LPAs的藥用鹽包括但不限于堿金屬鹽如鈉及鉀鹽；堿土金屬鹽如鈣和鎂鹽；無毒重金屬鹽；銨鹽；三烷基銨鹽如三甲基銨鹽和三乙基銨鹽和烷氧基銨鹽如三乙醇銨鹽、三(2-羥乙基)銨鹽及三甲胺(三(羥甲基)氨基甲烷)。特別優(yōu)選鈣鹽。與特定結(jié)合蛋白或提取段B聯(lián)合使用的優(yōu)選的LPA化合物包括但不限于L和D1-肉豆蔻?；?2-氟-2-脫氧-甘油基-3-磷酸酯、L和D1-月桂?；?2-氟-2-脫氧-甘油基-3-磷酸酯、L和D1-油?；?2-氟-2-脫氧-甘油基-3-磷酸酯、L和D1-棕櫚油酰基-2-氟-2-脫氧-甘油基-3-磷酸酯、L和D肉豆蔻?；?2-脫氧-甘油基-3-磷酸酯、L和D1-月桂?；?2-氯-2-脫氧-甘油基-3-磷酸酯、L和D1-肉豆蔻?；?2-氯-2-脫氧-甘油基-3-磷酸酯及其鈣鹽。
可能影響這些組合物活性的其它因素是LPA的鏈長，膽固醇的存在，膠粒、脂質(zhì)體、洗滌劑及乳化劑的存在及在LPA中鏈的位置，即是在甘油的第一還是第二個(gè)碳上。對于膠粒、脂質(zhì)體及洗滌劑，膠粒和脂質(zhì)體將提高活性而洗滌劑及類洗滌劑分子將引起活性的降低。
由HPLC硅膠色譜獲得的活性提取段可根據(jù)它們的疏水性進(jìn)一步分離，例如在C18柱(Dynamax 60A，Rainin Instrument Co.Inc.)上用含有緩沖液的多種甲醇進(jìn)行HPLC，所述甲醇液包括但不限于含800mg/l乙酸銨的100％甲醇；含有1mM磷酸鈉(pH7.4)的99％甲醇及含有10％磷酸鈉(pH7.4)的90％甲醇。以90∶10甲醇5mM磷酸鈉(pH7.4)洗脫此物質(zhì)。
本領(lǐng)域已知多種純化及分析類脂的方法。任何本領(lǐng)域已知的方法都可用于本發(fā)明，只要它能純化活性提取段。有關(guān)綜述見Blighand Dyer(1959)Can.J.Biochem.Physiol.37911-917；Patton等人(1982)J.Lipid Res.23190-196；Jungalwala(1985)RecentDevelopments in Techniques for Phospholipid Analysis，inPhospholipids in Nervous Tissues(Eichberg編輯)John Wileyand Sons，pp.1-44；Mamilton等人(1992)，A Practical Approach(Richwood等人編輯)IRL Press at Oxford University Press；及Kates(1986)Techniques of LipidologyIsolation，Analysis andIdentification in Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology(Burdon等人編輯)Elsevier。
一般地講，豆粉面或其某些提取段是通過懸浮于水(對于粉面20％重量/體積)并加入兩體積的甲醇及一體積的氯仿提取的。這是個(gè)單相并于室溫下攪拌/混合30分鐘至1小時(shí)。向此混合物中加入一體積的氯仿，混合后加入一體積的水。形成兩相，在首先除去任何固體后(如果是用粉面做原料)，通過離心或分液漏斗進(jìn)行分相?；钚晕镔|(zhì)在有機(jī)相(底部)中。
PAIs在體外對編程性細(xì)胞死亡的抑制活性似乎主要限于活性增殖細(xì)胞；相對而言，對非活動(dòng)的細(xì)胞似乎無作用。
PAIs的活性組份在蛋白酶的存在下非常穩(wěn)定。例如，用胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、枯草蛋白酶及蛋白酶K在適于蛋白水解的條件下處理PAIs，但此蛋白酶對它們的活性無影響。
本發(fā)明還包括含有基本純化的PAIs的治療組合物。組合物所需純化水平可按照經(jīng)驗(yàn)確定，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。所述組合物適用于如下描述的多種功能紊亂中，并可用于人和獸。
用純化方法得到的PAIs及其活性提取段的活性可用任何本領(lǐng)域已知的抗編程性細(xì)胞死亡試驗(yàn)檢測。這些包括但不限于C3H10T1/2細(xì)胞的血清缺乏試驗(yàn)，它詳細(xì)描述于公眾可得到的PCT
發(fā)明者I·C·巴薩爾斯特, J·D·布拉德雷, L·D·托梅, P·J·巴爾 申請人:Lxr生物技術(shù)有限公司