專利名稱：檢測5'-甲硫腺苷磷酸化酶缺陷型哺乳動物細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測哺乳動物細(xì)胞5′-甲硫腺苷磷酸化酶的方法，該酶的狀態(tài)是這些細(xì)胞是否處于惡性狀態(tài)的標(biāo)志。檢測出了對所述酶有缺陷的細(xì)胞，就可以在化療中靶擊這些細(xì)胞，這一化療中利用了這些細(xì)胞不能將5′-甲硫腺苷轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸的特性。
甲硫氨酸(MET)是正常和惡性細(xì)胞生長所必需的。在某些惡性細(xì)胞中，這種需求是絕對的，即沒有合適的MET供應(yīng)，細(xì)胞就死亡。
在哺乳動物細(xì)胞中，MET有三種來源。即可從食物中獲得，或者通過從L-高半胱氨酸(高半胱氨酸)或5′-甲硫腺苷(MTA)(聚胺生物合成途徑的一種產(chǎn)物)生化合成MET。在后一種情況下，由5′-甲硫腺苷磷酸化酶(MTAse；EC 2.4.2.28)將MTA轉(zhuǎn)化為MET。
在過去的十年中，研究者們已經(jīng)鑒別了喪失了MTA酶因此不能將MTA轉(zhuǎn)化為MET的許多惡性細(xì)胞系。例如，Katamari等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA，781219-1223(1981)報道的3個人惡性腫瘤細(xì)胞系中有23％喪失了可檢測的MTA酶，而在所研究的16個非惡性細(xì)胞系中每個細(xì)胞都存在MTA酶活性。已有報道認(rèn)為，MTA酶缺乏是非小細(xì)胞肺癌(參見，Nobori等人，Cancer Res.531098-1101(1991))，6個淋巴瘤細(xì)胞系和白血病細(xì)胞系(同上)，腦腫瘤細(xì)胞系和原發(fā)性腦腫瘤組織樣品(同上)，以及其他惡性腫瘤(參見，例如，Kries，et al.，Cancer Res.331866-1869(1973)，Kries，et al.，CancerTrmt.Rpts.631069-1072(1979)，以及Rangrone等人，Biochem.J.281533-538(1992))的特征。MTA酶陰性的細(xì)胞主要通過將高半胱氨酸轉(zhuǎn)化而滿足對MET的需要。但是，當(dāng)?shù)貌坏礁甙腚装彼釙r，細(xì)胞通常會死亡。
已知L-甲硫氨酸-L-去氨基-y-巰基甲烷裂解酶(ED 4.4.1.11；MET酶)不僅能降解MET，而且也降解高半胱氨酸。因此，從理論上講，可通過用MET酶降解血漿MET和高半胱氨酸而使喪失MTA酶的惡性細(xì)胞(即MTA酶陰性細(xì)胞)處于饑餓狀態(tài)。預(yù)期正常的MTA酶陽性細(xì)胞通過將MTA連續(xù)轉(zhuǎn)化為MET而滿足對MET的需求。
研制使惡性細(xì)胞MET饑餓的方法的一個障礙是需要鑒定出適于用作治療靶目標(biāo)的惡性細(xì)胞，即那些MTA酶陰性的惡性細(xì)胞。為此目的，已研制出了一種檢測方法，該方法通過測定一個細(xì)胞培養(yǎng)物是否具有催化活性而預(yù)測該惡性細(xì)胞是否MTA酶陰性(Seidenfeld等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，951861-1866，1980)。但是，由于該檢測方法中需要的放射性化學(xué)物質(zhì)從商業(yè)途徑購買不到，將這種方法用于常規(guī)評估目前來說是行不通的。而且，該檢測方法只檢測該細(xì)胞培養(yǎng)物中是否存在該酶，而不管在檢測進(jìn)行時該酶是否有催化活性，因而這種檢測方法不考慮該MTA酶的體外催化活性的不穩(wěn)定性。
通過研制一種免疫檢測法可避免該活性檢測法的局限性，所述免疫檢測法對檢測相當(dāng)少量的酶具有足夠的靈敏性。但是，從天然來源純化MTA酶用于制備在MTA酶的免疫檢測中使用的抗體已證明是一個費(fèi)力的方法，該方法產(chǎn)率很低(Rangrone等人，J.Biol.Chem.，26112324-12329，1986)。
缺乏檢測MTA酶缺陷細(xì)胞的簡單、有效的方法是造成還不能獲得使MTA酶缺陷型惡性細(xì)胞在體內(nèi)選擇性地處于MET饑餓狀態(tài)的有效治療方法的部分原因。本發(fā)明通過提供用于檢測一個樣品中編碼MTA酶的基因的存在的方法以及通過提供重組來源的MTA酶來解決這一問題。
本發(fā)明的目的是提供用于檢測MTA酶缺陷型細(xì)胞的方法(所述缺陷型細(xì)胞被認(rèn)為是那些在其中不存在可檢測到的有催化活性或不具催化活性的MTA酶蛋白的細(xì)胞)。本發(fā)明的方法是以下列假設(shè)為基礎(chǔ)MTA酶的缺失是由于從具有MTA酶陰性惡性腫瘤的哺乳動物的基因組中缺失了編碼MTA酶的基因引起的。因此本發(fā)明方法涉及檢測哺乳動物基因組中MTA酶蛋白質(zhì)編碼區(qū)內(nèi)的多核苷酸，如果存在這種多核苷酸則產(chǎn)生MTA酶，如果不存在，則成為MTA酶缺陷型細(xì)胞。
更具體地講，本發(fā)明提供了一種用于檢測MTA酶的方法，該方法包括下列步驟(a)從惡性腫瘤中獲得可檢測樣品，(b)使該樣品處于有利于編碼MTA酶的核酸選擇性擴(kuò)增的條件下，(c)向該樣品中加入與編碼MTA酶的核酸進(jìn)行特異性雜交的寡核苷酸探針，該加入過程是在允許該探計(jì)與該樣品中存在的任何這樣的核酸進(jìn)行可檢測雜交的條件下進(jìn)行的。并且
(d)檢測該樣品中是否存在該核酸。
本發(fā)明的另一方面包括一種由合適的載體從編碼MTA酶的多核苷酸表達(dá)MTA酶而獲得的重組MTA酶。重組MTA酶的獲得使得相對于分離和純化天然MTA酶的Rangione方法(見上文)來說，可更容易和更大量地制備高度純化的MTA酶。
附圖簡述

圖1顯示MTA酶的基因圖譜，并指明了該多核苷酸中外顯子的位置。底下劃線處為推測的外顯子；推測的內(nèi)含子由替代該多核苷酸序列中的堿基的一個或多個“N”表示。圖1中描述的序列對應(yīng)于本文所附的SEQ ID No.1中含有的序列。
發(fā)明詳述A.用于擴(kuò)增細(xì)胞樣品中存在的任何MTA酶的方法如上所述，本發(fā)明假設(shè)細(xì)胞缺失MTA酶是由于從哺乳動物基因組中缺失正常編碼MTA酶的基因引起的。因?yàn)楸景l(fā)明涉及檢測一個被懷疑是MTA酶陰性的細(xì)胞樣品中是否存在該基因，所以最好將該樣品中的核酸進(jìn)行擴(kuò)增以提高該檢測方法的靈敏度。盡管在聚合步驟中使用鏈反應(yīng)不是絕對必需的，但是該擴(kuò)增過程最好是使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來完成。
為了用于本發(fā)明方法中，獲得被懷疑其含有MTA酶缺陷型細(xì)胞的生物樣品。例如，該樣品含有來自一個細(xì)胞系，組織或腫瘤的體液或細(xì)胞。利用臨床醫(yī)學(xué)上已知方法可得到這樣的樣品，例如通過活組織檢查或外科切除術(shù)獲得腫瘤細(xì)胞。優(yōu)選地，該細(xì)胞基本上沒有“污染”，即不含有可能影響本發(fā)明方法結(jié)果的細(xì)胞、蛋白質(zhì)和類似成分。例如，當(dāng)以實(shí)體腫瘤用作為基因組MTA酶DNA的來源時，可將正常非惡性細(xì)胞以及在獲得生物樣品操作過程中從這些細(xì)胞中釋放的MTA酶認(rèn)為是污染物。
樣品中被擴(kuò)增的核酸通常存在于被認(rèn)為含有MTA酶的基因組或野生型DNA中。該待擴(kuò)增的DNA(下文中稱作為“靶DNA”)可從真核細(xì)胞，優(yōu)選的是哺乳動物獲得。更優(yōu)選地，從人獲得基因組DNA。
根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)已知方法例如由Maniatis等人描述的方法可分離基因組DNA(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Habor Laboratory，1982)。本文提供了說明人MTA酶的基因組克隆分離的操作的例子，其中利用下文中進(jìn)一步描述的MTA酶cDNA基因探針篩查粘?；蛭膸?。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到也可使用其他合適方法獲得本發(fā)明DNA。
附后的序列表中SEQ ID NO.1提供了MTA酶的基因組克隆的全長核苷酸序列；附圖1中描繪了該序列中的外顯子。含有大鼠MTA酶的全長基因組DNA的大腸桿菌菌株于1993年12月30日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為55536(外顯子“TC3”；MTA酶基因的核苷酸616-720)；55538(外顯子“1.1”；MTA酶基因的核苷酸254-421)；55537，55539和55540(分別為“IX-7”，“4-3”和“7-2”，它們?yōu)镸TA酶基因的剩余部分)。每一保藏物的宿主是大腸桿菌。我們不認(rèn)為該保藏物是實(shí)施本發(fā)明所必需的。但是在適用于本發(fā)明的專利法要求的期限內(nèi)，該保藏物將保持存活。
一旦獲得了基因組DNA，就可將含有該DNA的樣品置于有利于靶核酸選擇性擴(kuò)增的條件下。優(yōu)選的是，靶核酸是編碼MTA酶的基因的一個多核苷酸部分(即“靶多核苷酸”)。擴(kuò)增該靶多核苷酸的優(yōu)選的方法是PCR方法。PCR方法是利用寡核苷酸引物體外酶促合成特定DNA或RNA序列的方法，所述引物與特定核酸序列雜交并位于靶核酸中目的區(qū)域兩端。在進(jìn)行了模板變性，引物退火和退火引物的酶促延伸一系列重復(fù)循環(huán)后，可使引物的5′末端所限定的特定核酸片段呈指數(shù)積累。在一個循環(huán)中合成得到的產(chǎn)物(PCR產(chǎn)物)具有作為下一個循環(huán)的模板的作用；因此，靶核酸拷貝的數(shù)目在每一循環(huán)中約增加一倍。
在Mullis等人的美國專利4,683,195和4,683,202中描述了基本的PCR技術(shù)，這兩個專利公開的內(nèi)容引入本文中作為實(shí)施PCR的常規(guī)技術(shù)的實(shí)例。但是，本發(fā)明并不局限于使用Mullis等人的′202專利中教導(dǎo)的PCR技術(shù)。自從Mullis等人的技術(shù)出現(xiàn)后，已經(jīng)開發(fā)出了許多基于PCR的檢測方法。這些方法使用了經(jīng)過修飾的所述技術(shù)。這些經(jīng)修飾的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，因此在本文中不再描述。但是，為了描述該領(lǐng)域內(nèi)公知技術(shù)范圍，下文中描述了幾種經(jīng)修改的方案。
在Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1 990)872725-2729(Gilliland et al.，作者)中描述了一種PCR技術(shù)，該技術(shù)利用一種競爭性模板，提供了一種內(nèi)部擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)，所述模板在序列和大小上與靶核酸不同。在Nuc.Acids Res.，213469-3472(1993)，(Kohsaka等人，作者)描述了進(jìn)行“競爭性”PCR的另一技術(shù)，該技術(shù)利用序列不同但大小相同的模板。該技術(shù)是將其用于酶連免疫吸附檢測(ELISA)技術(shù)分析擴(kuò)增的核酸的特別優(yōu)選技術(shù)。在Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)866230-6234(Saiki，等人，作者)中描述了一種非競爭性PCR技術(shù)，所述技術(shù)利用位點(diǎn)特異性寡核苷酸來檢測基因的突變或多態(tài)性，該技術(shù)也可用于本發(fā)明的方法。這些技術(shù)中每一種比利用雜交探針的技術(shù)具有優(yōu)勢，它可消除在PCR期間出現(xiàn)的由于非特異性擴(kuò)增而產(chǎn)生的假陽性結(jié)果。
進(jìn)一步就背景技術(shù)而言，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員希望參照Innis等人，“Optimization of PCR′s”PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications(Acad.Press，1990)。該出版物概括了將會影響預(yù)期的PCR產(chǎn)物的特異性、精確度和產(chǎn)率的技術(shù)。
應(yīng)選用能與MTA酶靶多核苷酸的任一側(cè)(即5′和3′)的一段堿基對(即，“側(cè)面序列”)特異性雜交的寡核苷酸引物(至少一個引物對)。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員能夠容易地基于序列表中列出的SEQ ID NO.1和圖1提供的多核苷酸序列信息不經(jīng)過過多的試驗(yàn)可選出合適的引物。
設(shè)計(jì)引物時，引物內(nèi)不含有能與它本身雜交的互補(bǔ)堿基是很重要的。為了消除在樣品中可能存在的污染物質(zhì)的擴(kuò)增，優(yōu)選的是將引物設(shè)計(jì)成跨越外顯子(對于MTA酶基因，顯示于圖1中)。
如上文所述，為了適當(dāng)?shù)財(cái)U(kuò)增樣品中的核酸，在該聚合步驟中使用鏈反應(yīng)并不是必要的。例如，當(dāng)使用Kohsaka等人上文描述的技術(shù)時，聚合步驟是在固相支持物上進(jìn)行的，并且隨后用靶多核苷酸特異性探針進(jìn)行雜交。由于該檢測手段的靈敏度高，該靶多核苷酸的一次聚合反應(yīng)就已足夠了。
一旦擴(kuò)增步驟完成，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，以確定在該樣品中是否存在編碼MTA酶的基因。優(yōu)選地，將雙鏈PCR產(chǎn)物結(jié)合到固相物上，以便通過變性將其鏈分離開，從而基本上按照Kohsaka等人上文描述的方法使序列特異性探針與PCR產(chǎn)物的被束縛的反義鏈進(jìn)行雜交以便檢測該基因。另一種可選方法，在加入探針與雙鏈PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交之前，從反應(yīng)環(huán)境中取出以及從擴(kuò)增混和物中分離出PCR產(chǎn)物。在后一種方法中，根據(jù)本發(fā)明領(lǐng)域內(nèi)已知方法例如凝膠排阻，電泳或親和層析，可從擴(kuò)增混合物中分離PCR產(chǎn)物。
利用與一種可檢測標(biāo)記物穩(wěn)定結(jié)合的雜交探針可檢測經(jīng)擴(kuò)增的產(chǎn)物。標(biāo)記物是一種共價結(jié)合到或堅(jiān)固地結(jié)合到一種核酸探針上的物質(zhì)，結(jié)合后可以檢測該探針。例如，一種標(biāo)記物可以是放射性同位素、一種酶底物或抑制劑、一種酶、一種不透射線的物質(zhì)(包括膠體金屬)、一種熒光劑、一種化學(xué)發(fā)光分子、含有上述標(biāo)記物的脂質(zhì)體或者一種特異性結(jié)合對成員。一種合適的標(biāo)記物在擴(kuò)增期間不會喪失其可被檢測的特性。
診斷領(lǐng)域內(nèi)熟練技術(shù)人員對用于體外檢測分析的合適的可檢測標(biāo)記是熟悉的。例如，體外使用的合適的放射性同位素包括3H，125I，131I，32P，14C，35S。采用γ-計(jì)數(shù)器或者采用放射自顯影密度計(jì)檢測法，或與密度檢測相結(jié)合的擴(kuò)增片段的Southern印跡分析法可直接檢測采用放射性同位素標(biāo)記的擴(kuò)增片段。合適的化學(xué)發(fā)光分子的例子包括吖啶或魯米諾。與由吖啶酯衍生的探針雜交的靶序列可抵抗由于插入而發(fā)生的水解。合適的熒光劑的例子是熒光素，藻膽蛋白，稀土螯合劑，丹?；蛉舻っ?。
合適的酶底物或抑制劑的例子是那些與辣根過氧化物酶，葡萄糖氧化酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，β-半乳糖苷酸，丙酮酸激酶或堿性磷酸酶，乙酰膽堿酯酶特異性結(jié)合的化合物。不透射物質(zhì)的例子是膠體金或磁粒。
特異性結(jié)合對包括兩種不同的分子。其中一種分子在其表面或空腔內(nèi)有一區(qū)域，該區(qū)域與另一分子的特定空間和極化結(jié)構(gòu)特異性地結(jié)合。經(jīng)常將特異性結(jié)合對的成員稱作配體和受體，或者稱為配體和抗配體。例如，如果受體是抗體，則配體是相應(yīng)的抗原。其他特異性結(jié)合對包括激素受體對，酶底物對，生物素-抗生物素蛋白對以及糖蛋白-受體對，包括保留了結(jié)合特異性的特異性結(jié)合對的片段或組成部分，如免疫球蛋白的片段，包括Fab片段等等?？贵w可以是單克隆或多克隆。如果特異性結(jié)合對的一個成員被用作標(biāo)記物，則優(yōu)選的分離步驟包括親和層析。
如果在上面描述的檢測分析中沒有檢測到經(jīng)擴(kuò)增的產(chǎn)物，則表明該樣品中存在的細(xì)胞為MTA酶缺陷型。因?yàn)檎J(rèn)為正常(非惡性)細(xì)胞具有可檢測量的MTA酶，則MTA酶缺陷型的發(fā)現(xiàn)表明該被分析的基因組DNA是從惡性細(xì)胞中獲得的。本發(fā)明的檢測方法特別適用于診斷目的，例如用于診斷與瘤形成特別是惡性瘤形成相關(guān)的MTA酶缺陷型。
如果需要，利用Seidenfeld等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，951861-1866(1980)；也可參見下文的實(shí)施例I描述的方法對樣品的MTA酶催化活性進(jìn)行預(yù)篩查。然后利用本發(fā)明的檢測方法確定該樣品的細(xì)胞中是否存在編碼MTA酶的基因。為了篩查樣品中是否存在污染物即非惡性細(xì)胞。再對樣品進(jìn)行分析看其是否存在具催化活性或不具催化活性的蛋白質(zhì)。關(guān)于這一點(diǎn)可使用Nobori等人，Cancer Res.531098-1101(1991)和在審U.S專利申請(流水號為No.08/176,413，申請日為1993年12月29日)描述的合適的免疫檢測法。
B.合成的或重組的MTA酶多核苷酸和肽的生產(chǎn)本發(fā)明的另一方面提供了能夠使MTA酶特異的核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增的多核苷酸(特別是，寡核苷酸)。設(shè)計(jì)所述寡核苷酸的方案將考慮上面提到的幾個方面。所述的寡核苷酸特別適用于診斷與MTA酶的缺陷相關(guān)的惡性腫瘤。
本發(fā)明還提供了合成和重組MTA酶和MTA酶肽，以及編碼MTA酶和MTA酶肽的多核苷酸。本文中使用的“多核苷酸”是指以分離的片段形式或以較大結(jié)構(gòu)的成份的形式存在的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合體?？蓮慕M成合成基因的寡核苷酸或cDNA片段裝配編碼本發(fā)明MTA酶或MTA酶肽的DNA，該合成基因在重組轉(zhuǎn)錄單位中可進(jìn)行表達(dá)。本發(fā)明的多核苷酸序列包括DNA，RNA和cDNA序列?？蓮倪z傳密碼推測多核苷酸序列，但是，必須考慮遺傳密碼的簡并性。本發(fā)明的多核苷酸包括由于遺傳密碼簡并性而產(chǎn)生的序列。本發(fā)明的肽和多核苷酸包括MTA酶，MTA酶肽以及編碼它們的核苷酸的各自的功能衍生物?！肮δ苎苌铩笔侵敢粋€分子的“片段”，“變異體”，“類似物”，或者“化學(xué)衍生物”。一個分子的“片段”，例如本發(fā)明的任一個多核苷酸，包括所述分子的核苷酸的片段的集合。所述分子的“變異體”是指天然存在的基本上與整個分子或其片段相類似的分子。一種分子的“類似物”是指基本上與整個分子或其片段相類似的非天然分子。
一種分子“基本上類似”于另一種分子是指由兩種分子的氨基酸序列或者就多核苷酸而言其核苷酸序列基本上是相同的?；旧项愃频陌被岱肿泳哂邢囝愃频纳飳W(xué)活性。因此，即使一種分子含有另一種分子中不存在的其他氨基酸殘基或者如果氨基酸殘基的序列是不相同的，只要兩種分子具有相似活性，則它們可被認(rèn)為是本文中該術(shù)語所指的變異體。
如本文中使用的，如果一種分子含有通常不是該分子一部分的其他化學(xué)部分則認(rèn)為該分子是另一種分子的“化學(xué)衍生物”。所述部分可以改善分子的溶解性，吸附性，生物半衰期等等?；蛘咚霾糠纸档土嗽摲肿拥亩拘?，消除或降低了該分子的任何不需要的副作用等等。例如在Remington′s Pharma-ceutical Sciences，16 th Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Penn.(1980)公開了能介導(dǎo)所述效果的化學(xué)部分。
對MTA酶的一級氨基酸序列進(jìn)行微小改變就可產(chǎn)生具有與本文所述的MTA酶和肽基本上等同活性的蛋白質(zhì)。所述的改變可以是預(yù)先設(shè)計(jì)的，如采用位點(diǎn)特異性誘變，或者是自發(fā)產(chǎn)生的。只要仍存在MTA的生物學(xué)活性則本文中包括由這種改變作用產(chǎn)生的所有蛋白質(zhì)和肽。再者，一個或多個氨基酸的缺失也可以導(dǎo)致所得到的分子的結(jié)構(gòu)改變而不顯著改變其生物活性。這可導(dǎo)致產(chǎn)生具有更廣泛用途的較小的活性分子。例如，可以除去該酶發(fā)揮所需的催化或抗原活性所不需要的氨基或羧基末端氨基酸。
本文中使用的術(shù)語“保守變異”是指由另一種生物學(xué)活性類似的殘基替代一種氨基酸殘基。保守變異的例子包括用例如異亮氨酸，纈氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸的疏水或殘基代替代另一個疏水殘基，或者以一個極化殘基替代另一個極化殘基，例如精氨酸替代賴氨酸，谷氨酸替代天冬氨酸，或者谷氨酰胺替代天冬酰胺等等。術(shù)語“保守變異”還包括使用被取代的氨基酸代替未被取代的親本氨基酸，只要針對被取代多肽的抗體也與未被取代的多肽發(fā)生免疫反應(yīng)。
用于產(chǎn)生本發(fā)明的MTA酶和MTA肽的DNA序列也可由幾種方法獲得。例如，利用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的雜交步驟可分離該DNA。這包括但不限于1)將探針與基因組或cDNA文庫進(jìn)行雜交以檢測共同具有的核苷酸序列；2)用抗體篩查表達(dá)文庫以便檢測共有的特征結(jié)構(gòu)以及3)采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行合成。
通過使用經(jīng)標(biāo)記的合成寡核苷酸探針混合物將雜交步驟用于篩查重組克隆，在所述探針混合物中，每種探針都可能與雜交樣品中的特定DNA序列完全互補(bǔ)，所述雜交樣品含有經(jīng)變性的雙鏈DNA的異源混合物。在這種篩查中，優(yōu)先地在單鏈DNA或變性的雙鏈DNA上進(jìn)行雜交。所述雜交特別適用于檢測來自于存在與所需多肽相關(guān)的非常低量的mRNA序列的來源的cDNA克隆。換句話說，通過使用針對避免非特異性結(jié)合的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件，例如可以通過靶DNA與該混合物中的單個探針進(jìn)行雜交而對特定的cDNA克隆進(jìn)行放射自顯影觀察。
通過將由cDNA產(chǎn)生的各種mRNA注射到卵母細(xì)胞中，并給予足夠的時間使之表達(dá)cDNA基因產(chǎn)物，并例如通過使用特異于MTA酶的抗體或者通過利用針對重復(fù)基序(motif)的探針以及具M(jìn)TA酶特性的組織表達(dá)模式而檢測存在的所需cDNA表達(dá)產(chǎn)物，對含有MTA酶的cDNA文庫進(jìn)行篩查。換另一種方法，利用特異于下述多肽的抗體而間接篩選一個cDNA文庫中的至少具有一個表位決定基的MTA酶肽。如下文C節(jié)所述的，所述抗體是多克隆的或單克隆的并用于檢測表明MTA酶cDNA存在的表達(dá)產(chǎn)物。
依賴于核酸雜交的篩選步驟可以分離來自于任何生物體的基因序列，條件是可以得到合適的探針。對應(yīng)于編碼所需蛋白質(zhì)的序列的一部分的寡核苷酸探針可采用化學(xué)方法合成。這要求必須知道一段短的寡肽氨基酸序列。從遺傳密碼推導(dǎo)編碼該蛋白質(zhì)的DNA序列，但是，必須考慮遺傳密碼的簡并性。如果該序列是簡并的則可以加入多種序列的混合物。這包括變性的雙鏈DNA的異源混合物。對于上述篩選步驟，優(yōu)先地是在一條單鏈DNA或變性的雙鏈DNA上進(jìn)行雜交。
編碼MTA酶或其片段的特定DNA序列可通過1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學(xué)方法制備一個DNA序列以提供所需多肽的必要密碼子；以及3)通過將從真核供體細(xì)胞中分離的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄而體外合成雙鏈DNA序列獲得。對于后一種情況，最后形成了mRNA的互補(bǔ)雙鏈DNA，通常被稱為cDNA。
在本發(fā)明中，可將編碼MTA酶的多核苷酸及其變異體插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”是指本領(lǐng)域內(nèi)已知的質(zhì)粒、病毒或其他載體。這些載體中經(jīng)過操作插入或摻入了合適的遺傳序列。所述表達(dá)載體含有促使被插入的遺傳序列在宿主中有效轉(zhuǎn)錄的啟動子序列。
采用本領(lǐng)域內(nèi)已知的常規(guī)技術(shù)也可以完成用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。該宿主細(xì)胞可以是真核(例如中國倉鼠卵巢細(xì)胞)或原核(例如細(xì)菌或酵母)。如果宿主是原核，例如大腸桿菌，則通過在指數(shù)生長期之后收集細(xì)胞，隨后根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)已知步驟用CaCl2法處理而制備能夠攝取DNA的感受態(tài)細(xì)胞。另一種方法，可使用MgCl2或RbCl。在將宿主細(xì)胞形成原生質(zhì)體之后或者采用電擊穿方法也可完成轉(zhuǎn)化。
由本領(lǐng)域內(nèi)熟練的技術(shù)人員采用的常規(guī)技術(shù)，包括制備性層析和涉及單克隆或多克隆抗體的免疫分離可以將微生物表達(dá)的本發(fā)明的MTA酶或其片段進(jìn)行分離和純化。
基于SEQ ID NO.1中含有的信息，可容易地推導(dǎo)出MTA酶的全長氨基酸序列。利用該信息，可以采用常用方法，例如t-BOC或FMOC保護(hù)α-氨基方法，不經(jīng)過多的試驗(yàn)也可以合成MTA酶和MTA酶肽。兩種方法都涉及分步合成，從肽的C末端開始每一個步驟增加一個氨基酸(參見，Coligan，et al.，Current Protocols in Immunology-Wiley Interscience，991，Unit 9)。采用各種熟知的固相肽合成法，例如由Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，852149(1962)描述的方法，以及Stewart和Young，Solid Phase Peptides Synthesis，(Freeman，San Francisco，27-62，1969)描述的方法，利用含有0.1-1.0mmol胺/每克聚合體的一種共聚體(苯乙烯-二乙烯基苯)也可以合成本發(fā)明的肽。
在后一種方法中，完成化學(xué)合成后，在0℃，用液體HF-10％甲氧基苯處理約1/4-1小時而從該聚合體上將肽去保護(hù)并切割掉。在將試劑蒸發(fā)之后，用1％乙酸溶液從該聚合體中提取肽，然后冷凍干燥而產(chǎn)生粗產(chǎn)品。通?？刹捎眠@樣的技術(shù)如用5％乙酸作為溶劑在Sephadex G-15上凝膠過濾進(jìn)行純化。將該柱子的合適級分冷凍干燥產(chǎn)生勻質(zhì)肽或肽衍生物，然后采用諸如氨基酸分析，薄層層析，高效液相層析，紫外吸收分光分析，摩爾旋光度，溶解度可對肽進(jìn)行定性分析，并且可采用固相埃德曼降解進(jìn)行定量測定。
C.抗-MTA酶抗體的生產(chǎn)采用常規(guī)技術(shù)可以測定MTA酶肽的抗原特性，該常規(guī)技術(shù)用來確定已用該肽免疫接種的動物的抗體應(yīng)答的強(qiáng)度。通常，用于制備抗-MTA酶抗體的MTA酶肽應(yīng)該是那些誘導(dǎo)高效價抗體產(chǎn)生的肽，而所產(chǎn)生的抗體與MTA酶具相當(dāng)高的親和性。利用例如在Rangione et al.，(J.Biol.Chem.，見上文)中描述的方法或者上文中描述的用于獲得MTA酶肽的方法可以純化出這樣的肽用作免疫原。
一旦制備了抗原肽，通過將該肽導(dǎo)入到哺乳動物(例如兔，鼠或大鼠)中來制備抗免疫接種的肽的抗體。為了說明該目的，在本文所附的序列表中的SEQ ID NO.2和3中提供了兩種抗原MTA酶肽的氨基酸序列。接種這些肽的兔產(chǎn)生的抗體顯示對以1∶1500和1∶4000稀釋的純MTA酶溶液的應(yīng)答分別為最大值的50％。
對于用抗原MTA酶肽接種動物時優(yōu)選使用的是多次注射的免疫接種方案(參見，例如，Langone et al.，eds.，“Production of Antisera with Small Dosesof ImmunogenMultiple Intradermal Injections”，Methods ofEnzymology(Acad.Press，1981)。例如，通過皮內(nèi)注射1mg抗原MTA酶肽(懸浮于完全佛氏佐劑中)，隨后幾個星期通過注射一次或多次加強(qiáng)劑量的相同抗原(于不完全佛氏佐劑中)可從兔中獲得良好的抗體應(yīng)答。
如果需要，利用本領(lǐng)域內(nèi)已知技術(shù)通過接合將免疫接種肽偶合到載體蛋白上。這種普遍使用的化學(xué)偶合到該肽上的載體包括鑰孔血藍(lán)蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)，甲狀腺球蛋白，牛血清白蛋白(BSA)以及破傷風(fēng)類毒素。然后將該偶合的肽用于接種動物(例如小鼠或兔)。由于目前認(rèn)為MTA酶在哺乳動物種內(nèi)是保守的，使用一種加強(qiáng)MTA酶蛋白的免疫原性的載體蛋白是優(yōu)選的。
例如通過結(jié)合到一種基質(zhì)上并從其上洗脫可進(jìn)一步純化由動物產(chǎn)生的多克隆抗體，所述基質(zhì)上結(jié)合了制備該抗體的肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會知道在多克隆抗體和單克隆抗體的純化和/或濃縮的免疫技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)常用的各種技術(shù)(參見，例如，Coligan，et al.，Unit 9，Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，1991)。
為了制備單克隆抗體，優(yōu)選免疫接種一種小鼠或大鼠。本發(fā)明中使用的“抗體”是指能夠結(jié)合到表位決定基上的完整分子及其片段，例如Fab和F(ab′)2。在本文中“本發(fā)明的mAb”是指與MTA酶具特異性的單克隆抗體。
用于生產(chǎn)分泌單克隆抗體(“mAb”)的雜交瘤的常規(guī)方法是公知的(Kohler和Milstein，Nature，256495，1975)。簡單地說，如Kohler和Milstein所述，該技術(shù)包括由外科標(biāo)本獲得淋巴細(xì)胞，所述淋巴細(xì)胞是從患有不同癌癥的5個患者的局部排液淋巴結(jié)(regional draining lymph node)分離的，這5個患者分別患有黑色素瘤，畸胎瘤癌或?qū)m頸癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤或肺癌。將這些淋巴細(xì)胞集合在一起，然后與SHFP-1融合。篩選產(chǎn)生與瘤細(xì)胞系結(jié)合的抗體的雜交瘤。
利用常規(guī)篩選技術(shù)(例如酶連免疫吸附檢測反應(yīng)或“ELISA”)證實(shí)mAb中MTA酶的特異性，從而確定目的mAb的基本反應(yīng)模式。
通過確定所檢測的mAb是否能阻止本發(fā)明的mAb與上文中描述的方法分離到的MTA酶結(jié)合，可以在不經(jīng)過過多試驗(yàn)情況下確定一種mAb是否與本發(fā)明的mAb具相同特異性。如果所檢測的mAb與本發(fā)明的mAb進(jìn)行競爭，如顯示出使本發(fā)明的mAb的結(jié)合降低，那么這兩種單克隆抗體是結(jié)合到相同或密切相關(guān)的表位決定簇上。
確定一種mAb是否具有本發(fā)明mAb的特異性的另外一種方法是，將本發(fā)明mAb與對所檢測mAb具正常反應(yīng)性的一種抗原進(jìn)行預(yù)保溫，并確定所檢測的mAb是否被抑制了其結(jié)合該抗原的能力。如果所檢測的mAb受到了抑制，則極有可能該mAb與本發(fā)明mAb具有相同的或密切相關(guān)的表位決定基特異性。
D.MTA酶檢測試劑盒可以制備在實(shí)驗(yàn)室和臨床上使用的MTA酶檢測試劑盒，它包括上文描述的方法中使用的試劑。例如，用于上文A節(jié)所述方法中的試劑盒，優(yōu)選包括寡核苷酸引物(如在上文B節(jié)中制備的)，可檢測標(biāo)記的雜交探針以及試劑包被的微滴板。該檢測試劑盒還可包括上文C節(jié)中描述的用于MTA酶蛋白質(zhì)免疫檢測的抗體(如在審專利申請，序列號No.08/176,413，申請日為1993年12月29日中的描述)。
上文中已詳細(xì)描述了本發(fā)明，下文中提供了說明實(shí)施方法的實(shí)施例。這些實(shí)施例只是舉例說明，不限制本發(fā)明的范圍。
在實(shí)施例中，使用了下列縮寫AS＝反義，DTT＝二硫蘇糖醇；min＝分鐘；MTA酶＝5′-脫氧-5′-甲硫腺苷磷酸化酶；PCR＝聚合酶鏈反應(yīng)；S＝有義；SSc＝0.3M NaCl，0.03M檸檬酸鈉二水合物；v/v＝體積/體積；SDS＝十二烷基硫酸鈉。
實(shí)施例I在一個樣本中檢測MTA酶催化活性通過檢測從[甲基-14C]5′-脫氧-5′-甲硫腺苷形成的[甲基-14C]5-甲硫核糖-1-磷酸鹽可測定MTA酶的磷酸解活性(Seidenfeld等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.95，1861-1866，1980)。在200μl的總體積中，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物含有50mM磷酸鉀緩沖液，pH7.4，0.5mM[甲基-14C]5′脫氧-5′-甲硫腺苷(2×105CPM/mmol)，1mM DTT以及所示量的酶。在37℃保溫20分鐘之后，通過加入50μl的3M三氯乙酸而終止反應(yīng)，并將200μl樣品加到用水平衡的0.6×2cm的“Dowex”50-H*柱上。將[甲基-14C]5-甲硫核糖-1-磷酸鹽直接洗脫到含2ml 0.1M HCl的閃爍計(jì)數(shù)小瓶中。
實(shí)施例II從大鼠肝臟中純化天然的MTA酶采用經(jīng)修改的Rangione等人的方法(J.Biol.Chem.261，12324-12329，1986)從大鼠肝臟中分離MTA酶。在加有4倍體積的含1mM DTT的10mM磷酸鉀緩沖液，pH7.4(緩沖液A)的Waring Blendor中，將50克的新鮮大鼠肝臟進(jìn)行勻漿化處理。將該勻漿液離心(以15,000×g離心1小時)，并將得到的上清液進(jìn)行硫酸銨分級分離。通過離心(15,000×g離心20分鐘)收集55和75％飽和度之間的沉淀，并溶于最小體積的緩沖液A中。然后將樣品在經(jīng)三次替換的100份體積的相同緩沖液中透析過夜。
通過以15,000×g離心30分鐘而使樣品澄清，然后上樣到預(yù)先用緩沖液A平衡過的DEAE-Sephacyl柱(1.5×18cm；Pharmacia)。在用80ml平衡緩沖液洗滌之后，用線性梯度(80ml)或溶于緩沖液A中的0-0.3M NaCl洗脫。在0.1和0.15M NaCl之間洗脫出MTA酶。通過超過濾(Amicon PM-10 Diaflow膜)將含有至少0.06單位/mg蛋白質(zhì)的組分濃縮20倍，并在含1mMDTT的25mM磷酸鉀緩沖液，pH7.4(緩沖液B)中充分透析。然后將該樣品加到羥基磷灰石柱(1×12cm)(Bio-Rad)上。在用緩沖液B洗脫未吸附的蛋白質(zhì)之后，用含1mM DTT的40ml 50mM磷酸鉀緩沖液，pH7.4，洗脫柱子。
然后用50-250mM磷酸鉀，pH7.4線性梯度(40ml)洗脫MTA酶。通過超過濾將具M(jìn)TA酶活性的組分濃縮30倍，通過重復(fù)濃縮和用50mM磷酸鉀緩沖液，pH7.4稀釋去除二硫蘇糖醇。然后將部分純化的酶加到用50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4平衡的有機(jī)汞瓊脂糖(Bio-Rad)柱(0.8×3cm)上。用a)50mM磷酸鉀緩沖液，pH7.4；b)50mM磷酸鉀緩沖液，pH7.4，2MKCl；以及c)50mM磷酸鉀緩沖液，pH7.4，2M KCl，40mM 2-巰基乙醇對該柱逐步進(jìn)行洗脫。然后用50mM磷酸鉀緩沖液，pH7.4，2M KCl，200mM2-巰基乙醇洗脫酶。收集至少含3單位/mg蛋白質(zhì)的組分，通過超過濾濃縮到1ml，并于1000倍體積的10mM Tris/HCl，pH7.4，1M DTT(緩沖液C)中透析過夜。作為一個最終純化步驟，以1ml/分的流速將樣品(1ml)注射到“MONO Q”柱(Pharmacia)，該柱用含1mM DTT的10mM Tris/HCl，pH7.4進(jìn)行預(yù)平衡，收集0.5ml組分。于緩沖液C中0.08-0.14M NaCl之間洗脫出MTA酶活性。通過超過濾將該級分濃縮到0.5ml并于1000倍體積的緩沖液B中透析。
實(shí)施例III大鼠MTA酶的部分氨基酸序列的測定將純化樣品凍干，溶于50μl載體緩沖液(1％十二烷基硫酸鈉(SDS)，10％甘油，0.1M DTT以及0.001％溴酚藍(lán))并上樣到0.5mm厚10％SDS聚丙烯酰胺凝膠(Bio Rad“MINIGEL”儀)。電泳后，按照Towbin等人描述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76，4340-4345，1979)利用轉(zhuǎn)移緩沖液(15mM Tris，192mM甘氨酸以及20％甲醇，pH8.3)在一個Bio-Rad轉(zhuǎn)印系統(tǒng)中將該蛋白質(zhì)電印跡2小時至硝基纖維素膜(0.45μm孔徑，Millipore)。
在轉(zhuǎn)移之后，按照Salinovich和Montelaro描述的經(jīng)過修改的方法(Anal.Biochem.156，341-347，1987)，用Ponceau S(Sigma)將蛋白質(zhì)可逆染色。然后將該硝基纖維素膜在溶于1％乙酸水溶液中的0.1％Ponsean S染料溶液中浸60秒。通過于1％醋酸水溶液中緩慢振蕩1-2分鐘而從印跡上除去過多染料。將由染色檢測到的含蛋白質(zhì)的區(qū)域切下，轉(zhuǎn)移到Eppendorf管(1.5ml)，并用蒸餾水洗滌，并在37℃于溶于100mM乙酸中的0.5％聚乙烯的吡咯烷酮(平均分子量＝40,000；PVP-40，Sigma)的1.2ml溶液中保溫30分鐘，以便阻止蛋白酶在消化期間吸附到硝基纖維素膜上。通過用水徹底地洗滌(至少5次)而去除過量的PVP-40。
然后將硝基纖維素膜切成約1mm×1mm的小片并放回到同一個管中。如前面描述方法(Los等人，Science 243217-220，1989)將硝基纖維素膜片上的蛋白質(zhì)進(jìn)行消化。加入溶于100μl的100mM Tris-HCl，pH8.2/乙腈，95∶5(v/v)中的胰蛋白酶(10pmol)，并于37℃保溫過液。在消化之后，用30μl 10％三氟乙酸將含肽的上清液酸化，并于Vortex上快速旋轉(zhuǎn)一下，以15,000×g離心1分鐘。除去上清液，并立即注射到裝備了BrownleeAquapore Bu-300分析柱(2.1×100mm)的反相HPLC系統(tǒng)(Beckmann)中。
以200μl/分鐘的流速將洗脫液D0.1％三氟乙酸(測序用級別，溶于水中)泵入柱子5分鐘，然后將流速降至100μl/分，并用洗脫液E(0.08-0.095％三氟乙酸，溶于乙腈/H2O，70∶30(v/v))開始梯度洗脫。基于在215nm處UV吸收值，通過手工操作將含有肽的組分收集到Eppendorf管中。將具代表性的組分60和77進(jìn)行氨基酸測序(ABI 477A Protein Sequencer，它帶有120AOnline PTH-AA Analyzer。由此獲得了大鼠MTA酶的獨(dú)立的部分氨基酸序列。在SEQ ID NO.5-6中描述了被稱為肽1(級分60)和肽2(級分77)的氨基酸序列。
實(shí)施例IV編碼部分人MTA酶基因的DNA片段的擴(kuò)增基于肽1(SEQ ID NO.4)和2(SEQ ID NO.5)的部分氨基酸序列，合成2套具不同極性的寡核苷酸引物。將每個寡核苷酸設(shè)計(jì)成在其5′-末端包含唯一限制性位點(diǎn)(EcoRI或BamHI)，以便利被擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行隨后的克隆。為了用于PCR擴(kuò)增，利用“λ-TRAP”試劑盒(Clontech)從1×106噬菌斑形成單位(pfu)的人胎盤cDNA基因文庫(Clontech)中分離總cDNA。在100μl總體積中進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述總體積含有來自人胎盤cDNA基因文庫的1μg總cDNA，1×PCR緩沖液(10mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8.3，2.5mM MgCl2)，各0.2mM的各種dNTP，有義和反義引物各100mg以及10單位的Taq DNA聚合酶，Stoffel片段(“AMPLITAQ”，Perkin-ElmerCetus)。
用“GENE AMP”PCR系統(tǒng)9600(Perkin-Elmer Cetus)進(jìn)行四十個循環(huán)，各個循環(huán)包括變性(92℃，1分鐘)，退火(55℃，2分鐘)以及延伸(72℃，2分鐘)。通過在0.8％瓊脂糖凝膠上于1×TA緩沖液(40mM Tris-乙酸鹽，20mM乙酸鈉，2mM EDTA，pH7.9)中電泳而分離PCR產(chǎn)物，擴(kuò)增了一個450bp的DNA片段。用限制性酶EcoRI/BamHI對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙消化，在0.8％瓊脂糖凝膠上于1×TA緩沖液中分離，并用“GENE CLEAN”試劑盒(Bio 101)從凝膠上回收，將回收產(chǎn)物亞克隆到EcoRI/BamHI切割的pBluescript載體SK+(Stratagene)上并根據(jù)雙脫氧終止法利用通用的測序引物(“SEQUENASE”Version 1.0 DNA測序試劑盒，USB)進(jìn)行測序。
實(shí)施例V人胎盤cDNA基因文庫的篩查對PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物(實(shí)施例IV)進(jìn)行序列分析結(jié)果證明其序列與肽1(SEQID NO.5)的C-末端氨基酸序列完全一致。利用450bp DNA片段作為雜交探針，篩查人胎盤cDNA基因文庫(Clontech)。為此，將大腸桿菌菌株Y1090宿主細(xì)胞在含0.2％麥芽糖和10mM MgSP的LB培養(yǎng)基(每升含10克胰蛋白胨，5克酵母抽提物，10克NaCl)中于37℃激烈振蕩培養(yǎng)過夜。對于每個培養(yǎng)平板，將0.3ml宿主細(xì)胞培養(yǎng)物與3×104pfu噬菌體混合并在37℃溫育20分鐘。將宿主細(xì)胞和噬菌體的混合物加到8ml含0.7％瓊脂糖(LB頂級瓊脂糖(LB-top-agarose))的LB培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基中含有的瓊脂糖預(yù)先在48℃溫?zé)幔賰A至20個瓊脂平板上(135×15mm)。在37℃培養(yǎng)6-8小時之后肉眼可見噬菌斑，將平板冷卻至4℃保持1小時。將噬菌斑轉(zhuǎn)移至菌落/噬菌斑篩選尼龍轉(zhuǎn)移膜(NEN Research Products，Dupont Boston，MA)上3分鐘，然后變性(在0.5N NaOH中變性2分鐘2次，)，復(fù)性(于1.0MTris-HCl pH7.5中2分鐘2次)，通過風(fēng)干而固定。在各含有10個膜的2個塑料袋中，利用20ml的預(yù)雜交緩沖液(1％SDS，2×SSC，10％糖酐酯，50％去離子甲酰胺)于42℃將20個膜預(yù)雜交4小時。
利用缺口轉(zhuǎn)譯試劑盒(Boehringer Mannheim)，以[α-32P]dATP(3000Ci/mmol)對部分人MTA酶基因的450bp EcoRI-BamHI片段進(jìn)行標(biāo)記，并在NICK柱(Pharmacia)上將它與未摻入的放射活性分離開，通過在96℃加熱10分鐘而變性，于冰上冷卻，加到含濃度為106dpm/ml的探針的塑料袋中的膜上。經(jīng)標(biāo)記的探針的比活為約108dpm/μg。在42℃進(jìn)行雜交反應(yīng)過夜。完成雜交之后，用過量2×SSC在室溫下將膜洗三次5分鐘，然后在65℃用2×SSC，0.1％SDS洗20分鐘，在室溫下用0.2×SSC，0.1％SDS洗一次20分鐘。洗滌之后的膜置于X-射線膜下過夜。
將含有一個陽性信號周圍的幾個噬菌斑的瓊脂塊移到1ml無菌噬菌體稀釋液(50mM Tris-HCl，pH7.5，0.1M NaCl，8mM MgSO4，0.01％明膠)，并按如上方法再次篩選，直至獲得純陽性噬菌斑。從約0.5×106個噬菌斑篩選結(jié)果看，獲得6個相互獨(dú)立的陽性克隆。在LB平板上擴(kuò)增之后，利用“λ-TRAP”試劑盒(Clontech)純化陽性克隆的每個噬菌體DNA。純化到的噬菌體DNA用EcoRI酶切割，得到整個插入物，但由于該插入物內(nèi)存在一個EcoRI位點(diǎn)，從所有克隆都切割出兩條帶。
將來自名為MTAp-1的典型噬菌體克隆得到的兩個EcoRI插入片段(850bp和1100bp)亞克隆到EcoRI切割的pBluescript SK+載體(Stratagene)。將這些亞克隆分別命名為MTAP-2(850bp)和MTAP-3(1100bp)。對這兩個亞克隆進(jìn)行限制性分析和DNA測序分析顯示，MTAP-2亞克隆具有編碼254個氨基酸的開放閱讀框架，在該氨基酸序列的C-末端含有對應(yīng)于肽3的氨基酸序列(同源性90％)。從人的MTA酶的分子量為32 KDa的計(jì)算(F.D.Rangione et al.，J.Biol.Chem.26112324-12329，1986)來看，它覆蓋了總蛋白的85％以上。缺失了約50個氨基酸(以DNA水平上計(jì)算至少是150bp)。
實(shí)施例VI為獲得MTA酶的缺失的5′末端cDNA的引物延伸為了獲得5′末端缺失的DNA片段，使用RACE(cDNA末端的快速擴(kuò)增)(Loh等人，Sciece，243217-220，1989；Frohman，et al.，PNAS 858998，1988)。將人胎盤的1μg聚(A+)RNA(Clontech)溶于6.25μl H2O中，在65℃加熱5分鐘，置于冰上冷卻，并加到由4μl 5×RTC緩沖液(250mMTris-HCl，pH8.15，30mM MgCl2，200mM KCl，5mM DTT)；4μl(0.4mg/ml)的放線菌素D(Boehringer)，各1μl的各種dNTP(20mM)，0.25μl(10個單位)的RNasin(Boehringer)，1μl的[α-35S]dATP(1443 Ci/mmol)，lμl的人MTA酶特異的反義寡核苷酸3AS和10單位鳥類成髓細(xì)胞白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(Boehringer)組成的混合物中。將該混合物在42℃保溫2小時。
按如下方法除去過量引物和dNTP將20μl cDNA集合物加到NICK-柱(Pharmacia)上，并收集兩滴組分。收集與放射活性的第一峰值相關(guān)的組分5-8，在-80℃用1/10體積的7.5M NHOAC和2.5倍體積的乙醇沉淀2小時，在4℃以15,000×g離心30分鐘，用0.5ml的80％乙醇洗滌，在減壓條件(Speedvac)下干燥并溶于20μl的H2O中。為了加尾，加入1.5μl的dGTP(20mM)，2.4μl的CoCll2(25mM)，6μl的5×加尾緩沖液(1mM砷酸鉀，125mM Tris-HCl，pH6.6，1.25mg/ml(牛血清白蛋白)以及0.5μl(15單位)的末端脫氧核?；D(zhuǎn)移酶(Boehringer)。
將該混合物在37℃保溫一小時，在65℃加熱15分鐘，用同樣體積的TE緩沖液(10mM Tris-HCl，pH7.5，0.1mM EDTA)提抽一次，所述TE緩沖液用酚飽和，然后如上面所述用乙醇沉淀。將加了尾的cDNA集合物溶于20μl的H°中并用1μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。為了進(jìn)行擴(kuò)增合成二種其他引物。一種引物是MTA酶特異性反義引物，該引物定位于寡核酸3 AS位置上游180bp處。另一引物是針對聚(G)末端的引物。按如上所述擴(kuò)增進(jìn)行40個循環(huán)。每個循環(huán)由變性(92℃，1分鐘)，退火(50℃，2分鐘)和延伸(72℃，0.5分鐘)組成。
在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離PCR產(chǎn)物。特異性地?cái)U(kuò)增了所得到的520bp DNA片段。在0.8％瓊脂糖制備性凝膠上純化之后，用NotI和BclI消化(在延伸的DNA片段和亞克隆MTAP-2的原始片段之間的重迭區(qū)中存在的相關(guān)限制性位點(diǎn))該520bp DNA片段并亞克隆到NotI/BamHI切割的pBluesript SK+載體(Stratagene)上。對分別命名為MTAP-4，MTAP-5和MTAP-6的三個獨(dú)立的亞克隆進(jìn)行序列分析的結(jié)果顯示，每個克隆在重迭區(qū)中含有完全區(qū)配的氨基酸序列。
這三個引物延伸的cDNA亞克隆的長度稍有差異。這表明，它們是相互獨(dú)立的PCR產(chǎn)物，并且它們的序列反映出正確的mRNA序列，在PCR擴(kuò)增過程中沒有任何錯誤摻入。具有起始密碼子ATG(編碼甲硫氨酸)的新上游序列與亞克隆MTAP-2的下游序列結(jié)合，產(chǎn)生了編碼283個氨基酸的開放閱讀框。
實(shí)施例VII重組人MTA酶在大腸桿菌中的表達(dá)通過利用其共同的限制性位點(diǎn)HindII，將亞克隆MTAP-4的引物延伸的cDNA片段(實(shí)施例VI中獲得的含有三個亞克隆的最大插入物)加到亞克隆MTAP-2的DNA插入物的5′末端而構(gòu)建人MTA酶的全長cDNA。將來自亞克隆MTAP-4的NotI/HindII-DNA片段以及來自亞克隆MTAP-2的大HindII/EcoRI片段混合，并亞克隆到NotI/EcoRI切割的pBluescript載體SK+(Stratagene)上。將獲得的含有人MTA酶的全長cDNA的亞克隆命名為MTAP-7。為了核實(shí)該cDNA克隆的可靠性，利用裝備了Taq啟動子(Pharmacia)的大腸桿菌表達(dá)載體pKK223-3表達(dá)該重組蛋白質(zhì)。
為了在該cDNA片段的5′末端產(chǎn)生新的EcoRI位點(diǎn)以及在該cDNA片段的3′末端產(chǎn)生一個PstI位點(diǎn)，利用含有Shine-Dalgarno(SD)序列的5′-引物寡核苷酸以及另一3′引物進(jìn)行PCR。按上面所述擴(kuò)增20個循環(huán)，每個循環(huán)由變性(92℃，1分鐘)，退火(55℃，1分鐘)和延伸(72℃，1分鐘)組成。用限制性酶EcoRI/PstI消化該P(yáng)CR產(chǎn)物，在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳純化，并亞克隆到EcoRI/PstI切割的pBluescript載體SK+(Stratagene)中。
在核實(shí)了稱為MTAP-8的亞克隆中的插入物的全長序列之后，切下EcoRI/PstI片段，并亞克隆到EcoRI/pstI切割的pKK223-3載體中，產(chǎn)生含有人MTA酶cDNA的大腸桿菌表達(dá)載體，將命名為MTAP-9的亞克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM105菌株中。對有或沒有異丙基-β-D-硫半乳糖吡喃糖苷(IPTG)誘導(dǎo)情況下轉(zhuǎn)化細(xì)胞的總蛋白質(zhì)譜帶和酶促活性進(jìn)行分析。將一個單轉(zhuǎn)化菌落接種到2ml的LB培養(yǎng)基中并在37℃培養(yǎng)過夜，將該培養(yǎng)過夜的20μl培養(yǎng)物加到兩個塑料管中，每個管含有2ml新鮮LB培養(yǎng)基(1/100稀釋)。
在37℃培養(yǎng)1小時之后，向一個試管中加入20μl 0.1M IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，以得到1mM IPTG的終濃度，并在37℃再培養(yǎng)4小時。通過在15,000×g離心5分鐘收集細(xì)胞之后，將細(xì)胞懸浮于100μl磷酸鹽緩沖液(50mM磷酸鉀，pH7.5，1mM DTT)中，通過在步驟3中于冰上超聲處理0.5分鐘破碎細(xì)胞，通過在15,000×g離心10分鐘而獲得粗細(xì)胞提取物。
利用Bradford方法(Bio-Rad，Protein Assay)確定蛋白質(zhì)濃度。分析有或沒有IPTG誘導(dǎo)的相同量的樣品的酶促活性，并在10％SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳。從IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞獲得的粗提取物顯示的MTA酶活性比未誘導(dǎo)細(xì)胞的MTA酶活性高5倍以上。此外，在SDS凝膠上，檢測到新誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)帶(31 KDa)。
實(shí)施例VIIIMTA酶基因組克隆的克隆和部分特征為了診斷目的而采用PCR最有效地?cái)U(kuò)增DNA片段，片段的大小優(yōu)選低于500bp。cDNA序列反映外顯子的總和，而外顯子常被內(nèi)含子分隔開，這使得從cDNA序列中找到具合適大小的正確序列是困難的。為了克服這個問題，分離人MTA酶的基因組克隆。利用MTA酶cDNA基因探針(從MTAP-7亞克隆得到的NotI/EcoRI片段)對從人胎盤DNA構(gòu)建的粘?；蛭膸?Clontech)進(jìn)行篩選。以1-2×104/135×15mm平板的菌落密度將該文庫的轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)于含氨芐青霉素(50mg/升)的LB平板上。
按實(shí)施例IV描述完成下列步驟。從1/2×106菌落分離出單個陽性菌落，命名為MTAP-10，并采用PCR分析和直接測序法進(jìn)行部分定性。合成兩個引物，一個有義寡核苷酸，定位于終止密碼子上游120bp，一個反義寡核苷酸，定位于終止密碼子下游20bp處，并用于PCR分析。PCR反應(yīng)進(jìn)行25個循環(huán)，每個循環(huán)由變性(92℃，1分鐘)，退火(55℃，2分鐘)以及延伸(72℃，5分鐘)組成。在0.8％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物。
附圖1中描繪了利用上面介紹的技術(shù)到目前為止在MTA酶基因中鑒別到的處顯子的位置。
實(shí)施例IX將MTA酶序列特異的寡核苷酸應(yīng)用到惡性細(xì)胞系中以便檢測其中是否存在MTA酶為了檢測寡核苷酸的使用效果，將PCR方法應(yīng)用到已知含有MTA酶陽性和陰性細(xì)胞的幾個細(xì)胞系中。按實(shí)施例VIII描述分離基因組DNA并將1μg該DNA用于PCR反應(yīng)。按如上所述擴(kuò)增40個循環(huán)，每個循環(huán)包括變性(92℃，1分鐘)，退火(55℃，1分鐘)以及延伸(72℃，1/2分鐘)。在1.5％脂糖凝膠上分析該P(yáng)CR產(chǎn)物。在已知是MTA酶陰性的細(xì)胞系中未檢測到MTA酶，而在MTA酶陽性細(xì)胞系中檢測到了MTA酶。
序列概述SEQ ID NO.1是甲硫腺苷磷酸化酶(MTA酶)的基因組克隆。
SEQ ID NO.2是抗原MTA酶肽(“肽40”)。
SEQ ID NO.3是抗原MTA酶肽(“肽51”)。
SEQ ID NO.4是MTA酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物(“肽1”)。
SEQ ID NO.5是MTA酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物(“肽2”)。
序列表(1)一般資料(i)申請人THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA(ii)發(fā)明名稱檢測5′-甲硫腺苷磷酸化酶缺陷型哺乳動物細(xì)胞的方法(iii)序列數(shù)5(iv)通信地址(A)收信人Robbins，Berliner & Carson(B)街道201 N.Figueroa street，5th Floor(C)城市Los Angeles(D)州California(E)國家USA(F)郵編90012(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)現(xiàn)有申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類號(viii)律師/代理人資料(A)姓名Berliner，Robert(B)登記號20，121(C)案號5555-287(ix)電信資料(A)電話213-977-1001(B)傳真213-977-1003(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度2763個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vii)直接來源(B)克隆甲基腺苷磷酸酶(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞(NAME/KEY)CDS(B)位置1..2763(xi)序列描述SEQ ID NO1TTTATACAGA GCATGACAGT GGGGTCCTCA CTAGGGTCTG TCTGCCACTC TACATATTTG 60AAACAGGAGT GGCTTCTCAG AATCCAGTGA ACCTAAATTT TAGTTTTAGT TGCTCACTGG 120ACTGGGTTCT AGGAGACCCC CTGTGTTAGT CTGTGGTCAT TGCTAGSAGA ATCACTTAAT 180TTTTTCTAGA CTCTAGGAGA AAACAGTTGG TGGTGTACTC ATCACGGGTT AACAATTTCT 240TCTCTCCTTC CATAGGCATG GAAGGCAGCA CACCATCATG CCTTCAAAGG TCAACTACCA 300GGCGAACATC TGGGCTTTGA AGGAAGAGGG CTGTACACAT GTCATAGTGA CCACAGCTTG 360TGGCTCCTTG AGGGAGGAGA TTCAGCCCGG CGATATTGTC ATTATTGATC AGTTCATTGA 420CANNNNNNNN NNNNNNNNNN GAGGTCGACG GTATCGATAA GCTTTGTAAA CAATTGTCTT 480TAGCTTATCC AGAGGAATTG AGTCTGGAGT AAAGACCCAA ATATTGACCT AGATAAAGTT 540GACTCACCAG CCCTCGGAGG ATGGAAAGAT GGCCTTAAAA TAAAACAAAC AAAAACCTTT 600TTTGCTTTAT TTTGTAGGAC CACTATGAGA CCTCAGTCCT TCTATGATGG AAGTCATTCT 660TGTGCCAGAG GAGTGTGCCA TATTCCAATG GCTGAGCCGT TTTGCCCCAA AACGAGAGAG 720GTGTGTAGTC TTTCTGGAAG GTGTACCAGA ATAAATCATG TGGGCTTGGG GTGGCATCTG 780GCATTTGGTT AATTGGCAGA CGGAGTGGCC CCATACCCTC ACTCAAGTTT GCTTTGTATT 840ATGCAAGTTT ATGGAGAGTT ATTTCCTGTT GCTAATAATT TNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 900AAGTGCAGCC TTAAGTTGTG CATGTGCTAG TATGTTTTGA AGTTTCTGGT TTTTCTTTTC 960TAGGTTCTTA TAGAGACTGC TAAGAAGCTA GGACTCCGGT GCCACTCAAA GGGGACAATG1020GTCACAATCG AGGGACCTCG TTTTAGCTCC CGGGCAGAAA GCTTCATGTT CCGCACCTGG1080GGGGCGGATG TTATCAACAT GACCACAGTT CCAGAGGTGG TTCTTGCTAA GGAGGCTGGA1140ATTTGTTACG CAAGTATCGC CATGGGCACA GATTATGACT GCTGGAAGGA GCACGAGGAA1200GCAGTAGGTG GAATTCTTTT CTAAGCACAT ATAGCATGGG TTTCTGGGTG CCAATAGGGT1260GTCTTAACTG TTTGTTTCTA TTACGTTAGT TTCAGAAAGT GCCTTTCTAC AAGGTTTTGA1320AGTTGTTAAT ATTTTCTGTA GTTCCATTGG AAGGTAAGAA CAAAGATCAA AAGAAAGAAA1380GAGACACTTT TACCCAAGGA TCAGTAGTGA AAATAGTACA TTGTAGGCAT GTAGATGTGT1440TGAGAATCAT ACTAAGACTT GGGCCTTANN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNTACCCTAC1500ATTGAGGATT CGGTTTCAGC AGATAAATTT GAGGGACACA AACATTTAGG CTGTAGCAAG1560GCTGGAGCTC AGAAAAATGT TTTATGACAA GCAGTGGAAT TTTAAGTTCT AGTAACCTCC 1620AGTGCTATTG TTTCTCTAGG TTTCGGTGGA CCGGGTCTTA AAGACCCTGA AAGAAAACGC 1680TAATAAAGCC AAAAGCTTAC TGCTCACTAC CATACCTCAG ATAGGGTCCA CAGAATGGTC 1740AGAAACCCTC CATAACCTGA AGGTAAGTGC AGCCATGGAC AATCAGGCAT GTCTGTAGAC 1800TCTCTATTGT CTTCTTTTCT TACTTGCATT TCACCTTTGG TCCTCATGTA TTTTTTGCCA 1860GCCTAGATGT TTTCAACAAG TTTTTGTGAC ATCTACTACT ACCATACCAA CCACTTGTGA 1920AACTGAGTAG TCTTATTTTC TTGGCTGGTA GTGCAGANNN NNNNNNNNNN NNAATAAACA 1980ATAATCCAGG CTGGGCTGGT ATGGCAATAA GTGATTATCA GAACAATGCT CTGAGATAAG 2040CATTATTAAC CTCACTTTAC AGGAAAGGGA GGTGAGGAAC CAAGAGTTTA GAGTACCCGA 2100AGTTCCACAT CTGGTTAGTG AACTTGAAAA TTTTCTGTAG AATTTATTTA AAGTGTATGT 2160TTCCTGCGTC CTCACTTTGA TCTAGAAAAT CAAAATCTGT TTTTTTTTTT AACAAACATC 2220TCAGTAATTA CGCCAACATG TGAATATCAC TGCCTCCTTT CTTCCTTTCA GAATATGGCC 2280CAGTTTTCTG TTTTATTACC AAGACATTAA AGTAGCATGG CTGCCCAGGA GAAAAGAAGA 2340CATTCTAATT CCAGTCATTT TGGGAATTCC TGCTTAACTT GAAAAAAATA TGGGAAAGAC 2400ATGCAGCTTT CATGCCCTTG CCTATCAAAG AGTATGTTGT AAGAAAGACA AGACATTGTG 2460TGTATAGAGA CTCCTCAATG ATTTAGACAA CTTCAAAATA CAGAAGAAAA GCAAATGACT 2520AGTAACATGT GGGAAAAAAT ATTACATTTT AAGGGGGAAA AAAAACCCCA CCATTCTCTT 2580CTCCCCCTAT TAAATTTGCA ACAATAAAGG GTGGAGGGTA ATCTCTACTT TCCTATACTG 2640CCAAAGAATG TGAGGAAGAA ATGGGACTCT TTGGTTATTT ATTGATGCGA CTGTAAATTG 2700GTACAGTATT TCTGGAGGGC AATTTGGTAA AATGCATCAA AAGACTTAAA AATACGGACG 2760TAC 2763(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度17個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(vii)直接來源(B)克隆甲基腺苷磷酸酶肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..17(xi)序列描述SEQ ID NO2Ile Gly Ile Ile Gly Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu Ile Leu Glu Gly
1510 15(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度13個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(vii)直接來源(B)克隆甲基腺苷磷酸酶肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..13(xi)序列描述SEQ ID NO3Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro G1n Ile Gly Ser Met Glu15 10(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(vii)直接來源(B)克隆甲基腺苷磷酸酶引物(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..8(xi)序列描述SEQ ID NO4Tyr Val Asp Thr Pro Phe Gly Lys15(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(vii)直接來源(B)克隆甲基腺苷磷酸酶引物(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..9(xi)序列描述SEQ ID NO5Thr Trp Gly Ala Asp ValIle Asn Met1 權(quán)利要求
1.一種用于檢測哺乳動物細(xì)胞中具催化活性和不具催化活性的MTA酶的存在的方法，該方法包括，a)獲得被懷疑是MTA酶缺陷型的細(xì)胞的可檢測樣品，b)加入可與樣品中存在的任何編碼MTA酶的核酸進(jìn)行特異性雜交的寡核苷酸探針，并使條件處于允許該探針與該樣品中存在的任何這樣的核酸進(jìn)行可檢測雜交的條件下，以及c)檢測該樣品中是否存在編碼MTA酶的核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，該方法進(jìn)一步包括將該樣品置于有助于編碼MTA酶的核酸選擇性擴(kuò)增的條件下的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該細(xì)胞來源于已知的惡性腫瘤。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其中還對該惡性腫瘤的MTA酶催化活性進(jìn)行檢測。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中該探針來自于SEQ ID NO.1中含有的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所使用的條件包括聚合酶鏈反應(yīng)。
7.一種分離的多核苷酸，它編碼MTA酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述多核苷酸，它具有基本上類似于SEQ ID NO.1中含有的序列的核苷酸序列。
9.一種重組表達(dá)載體，含有權(quán)利要求7所述的多核苷酸。
10.由權(quán)利要求9的重組表達(dá)載體表達(dá)的MTA酶。
11.一種重組表達(dá)載體，含有權(quán)利要求7的編碼肽的多核苷酸片段。
12.由權(quán)利要求11的重組表達(dá)載體表達(dá)的MTA酶肽。
13.用權(quán)利要求12的MTA酶肽免疫一種動物產(chǎn)生的抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述抗體，其中所述抗體是由接種動物的細(xì)胞形成的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體。
15.合成的MTA酶或MTA酶肽片段。
16.用權(quán)利要求15的MTA酶或MTA酶肽片段接種一種動物而產(chǎn)生的抗體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述抗體，其中該抗體是由接種動物的細(xì)胞形成的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體。
全文摘要
檢測一個細(xì)胞樣品中是否存在催化活性形式或非催化活性形式的甲基腺苷磷酸酶(MTA酶)的方法。一方面，該方法包括向該樣品中加入寡核苷酸探針，在有利于進(jìn)行雜交的條件下該探針能與樣品中的編碼MTA酶的核酸特異性地雜交。在樣品中沒有MTA酶是惡性腫瘤的指示。本發(fā)明還提供了編碼MTA酶的多核苷酸，MTA酶肽和抗該MTA酶的抗體以及實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。
文檔編號C12R1/19GK1145640SQ94195031
公開日1997年3月19日 申請日期1994年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月29日
發(fā)明者楚特穆·諾伯里, 丹尼斯·A·卡森, 肯吉·塔卡巴亞什 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會, 西巴-蓋爾基公司