專利名稱：酶和微生物的失活方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了關(guān)于酶和微生物的失活方法，該方法特別適于在食品加工過程中應(yīng)用。
工業(yè)酶在食品加工中的成功應(yīng)用通常需要一個(gè)特殊的失活步驟，即不僅要在所需要的階段停止反應(yīng)，而且要保證終產(chǎn)品中的殘余酶處于最低或測(cè)不出的水平。這是保證良好產(chǎn)品質(zhì)量和穩(wěn)定性(保質(zhì)期)的基本條件。就保質(zhì)期而論，上述條件也同樣適用于許多食品和食品原料中的內(nèi)源酶，在食品加工和貯存過程中殘余的酶活性(如脂酶和氧化酶)會(huì)造成嚴(yán)重的問題。
酶的失活通常是在適當(dāng)?shù)臏囟群蚿H下通過熱處理而實(shí)現(xiàn)的。不過，使酶徹底滅活的處理可能會(huì)引起產(chǎn)品重要特性(如顏色、味道、濃度和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值)的改變。因此，在低溫下提高酶的失活作用的新技術(shù)的開發(fā)引起了人們的普遍興趣。
這項(xiàng)新技術(shù)的開發(fā)是十分重要的，因?yàn)樗餐瑯舆m用于活體微生物中維持生命所必需的蛋白質(zhì)的變性，其中通過加熱可使微生物的死亡率增加(也就是說與食品的消毒有關(guān))。這種失活方法更適用于造成食品主要污染物(細(xì)菌、酵母和霉菌等)的微生物孢子的失活。
加熱可使蛋白質(zhì)變性或使蛋白質(zhì)喪失生物活性。在酸、堿、有機(jī)溶劑、去污劑和高濃度的脲和胍的作用下其效果尤為顯著(即無論是電荷、水的活度或氫鍵都會(huì)對(duì)酶的最佳穩(wěn)定性產(chǎn)生不利的影響)。但無論怎樣，除了用酸或堿微調(diào)pH外，以上所提到的化學(xué)試劑是不能在食品加工中應(yīng)用的。
大于1，000巴的高流體靜力壓的應(yīng)用是失活的一個(gè)特殊的條件，早在1899年已有過將1，000巴的高壓用于牛奶的貯存和消毒的報(bào)道。在-25℃至100℃的變化溫度范圍內(nèi)，把壓力升到10，000巴的高壓所得到的結(jié)果已由Timson和Short在“微生物對(duì)流體靜力壓的耐性”[見Biotechnol Bioeng.7，139-159(1965)]一文中做過深入的研究。他們認(rèn)為，壓力增強(qiáng)了離子的溶劑化作用，因而增加了弱電介質(zhì)的電離作用。大于2，000巴壓力下的電離作用和蛋白質(zhì)中電荷基團(tuán)間形成的離子鍵改變了蛋白質(zhì)的溶解性，從而引起沉淀和不可逆的變性(酶的失活)。非常有趣而引人注意的是，對(duì)孢子而言，當(dāng)存活微生物的數(shù)量很少時(shí)，它們對(duì)持久的壓力是不敏感的，并且當(dāng)壓力在2，000巴以上時(shí)，溫度相對(duì)而言似乎也不很重要了。當(dāng)終產(chǎn)物的體積較大時(shí)，壓力與反應(yīng)是成反比的，而且似于高于1，000巴的壓力會(huì)阻礙由加熱而導(dǎo)致的蛋白質(zhì)的變性。Timson和Short推斷，由壓力而引起的蛋白質(zhì)變性機(jī)制與由熱而導(dǎo)致的蛋白質(zhì)變性機(jī)制是不同的。
FR-A-2·650·942公開了一種在CO2和/或N2O壓力下通過對(duì)食物加熱而使酶失活的方法，這種方法可以降低處理溫度并減少處理時(shí)間。
本發(fā)明的首要目的是改進(jìn)這種方法，以達(dá)到在較低的溫度下和較短的時(shí)間內(nèi)更有效的失活效果。
從純理論的角度看，假設(shè)一種酶在臨界溫度變得不穩(wěn)定時(shí)，CO2就具有插入到酶氫鍵松弛部位的趨向。當(dāng)溫度和壓力增加時(shí)，蛋白質(zhì)分子的氫鍵進(jìn)一步被打開，使蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而造成酶的失活。然而，這個(gè)過程很可能是可逆的，所以，當(dāng)CO2壓力解除后，酶的活性又可恢復(fù)。
所以，本發(fā)明的另一個(gè)目的是克服上述反應(yīng)機(jī)制的可逆性，提供一種使酶或微生物完全且不可逆失活的方法。
本發(fā)明人還有一個(gè)意外的發(fā)現(xiàn)，即如果上述法國(guó)文獻(xiàn)中提到的加熱/CO2或N2O壓力處理相結(jié)合的方法在硫化還原劑(如SO2、半胱氨酸、谷胱甘肽等)存在下進(jìn)行，進(jìn)一步受到CO2或N2O壓力開鍵作用的反應(yīng)性基團(tuán)，特別是蛋白質(zhì)分子的-SH、-S-S-、-OH、-NH2等基團(tuán)，會(huì)與所述的還原劑發(fā)生不可逆的反應(yīng)。
因而，本發(fā)明的目的就是要達(dá)到上述的效果，即提供一種使酶或微生物特別是食品中的酶或微生物失活的方法，該方法包括在選自活性硫化物的還原劑的存在下，在CO2或N2O壓力下在含水介質(zhì)中酶或微生物的熱處理。
確切地說，含水介質(zhì)意味著水的含量不應(yīng)少于10%，待失活的微生物既可處于生長(zhǎng)期又可處于芽孢期。
活性硫化物，如可使用亞硫酸鹽，優(yōu)選的是以SO2氣體的形式加入，加入量約為10-1，000ppm，最好控制在30-100ppm范圍內(nèi)。在CO2壓力的作用下，從稀釋的硫酸氫鈉(NaHSO3)水溶液中也可以得到適量的氣態(tài)SO2。也可以有效地使用硫羥基活性化合物，例如還原態(tài)的谷胱甘肽、半胱氨酸或維生素B1，使用濃度約為0.05-0.5%。
當(dāng)然，還原劑最好要選擇食品加工中允許使用的試劑。
處理溫度通常與食品的加工溫度相符合，即一般小于120℃，但最好高于50℃。至于CO2或N2O壓力，可在5-1，000巴范圍內(nèi)選擇，如能控制在50-500巴范圍內(nèi)更好，以便保持CO2的濃度不小于5g/L；但優(yōu)選的是20g/L或更大些。
本發(fā)明的方法既可處理液態(tài)食品也可處理糊狀食品；在這種情況下，氣態(tài)的硫化物(如SO2)通過攪拌就可以直接注入到液態(tài)或糊狀食品中。如果食品是固體的，如馬鈴薯、調(diào)味品或甚至是做好的飯菜，也可用上述的方法有效處理，從食品外部施加CO2壓力和SO2(例如從亞硫酸氫鈉溶液中得到)而無需任何攪拌。
本發(fā)明將通過以下實(shí)施例進(jìn)一步闡明，參見附圖。
附

圖1至4分別用圖示的形式描述了實(shí)施例的結(jié)果，特別是在分別加入谷胱甘肽時(shí)CO2和SO2對(duì)兩種不同酶(半乳糖苷酶和脂酶)和微生物孢子(枯草桿菌)的失活的影響。D值是酶的拾-失活時(shí)間，相當(dāng)于達(dá)到酶活性降低10倍所需的時(shí)間，表達(dá)式為D=t/(log[E]0-log[E]t其中E0起始酶濃度Ett時(shí)間后的酶濃度。
實(shí)施例1將1.5升緩沖液(0.1M醋酸鈉、0.02M半乳糖，pH4.5)倒入2升的玻璃高壓釜中，(BuChj，最大壓力12巴)，攪拌均勻，55℃下恒溫處理。
把從米曲霉得到的乳糖酶(β-半乳糖苷酶)溶液用壓力泵注入到體系中，使酶的終濃度達(dá)到5單位/毫升。定時(shí)取樣分析乳糖酶的活性。
重復(fù)以上的操作，但先在5巴的壓力下用CO2使反應(yīng)釜中的緩沖液飽和。仍繼續(xù)以上所有的操作，但先將亞硫酸氫鈉添加到緩沖液中，使其中SO2的當(dāng)量濃度達(dá)到300ppm。附圖1所示的結(jié)果表明，當(dāng)二氧化碳與二氧化硫結(jié)合后，會(huì)使乳糖酶失活作用增強(qiáng)。
加工樣品中的殘留的乳糖酶活性通過與對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷酶于30℃保溫30分鐘，并在410nm處進(jìn)行比色而測(cè)定。
實(shí)施例2重復(fù)實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)步驟，但用谷胱甘肽(還原形式，2g/L)代替亞硫酸鹽。在5.8巴的壓力下使CO2達(dá)到飽和。附圖2所示的結(jié)果清楚地表明，當(dāng)使CO2壓力與硫羥基活性化合物結(jié)合時(shí)乳糖酶的失活作用增強(qiáng)了。
實(shí)施例3同實(shí)施例1那樣，把含有24mg/L的油酸的1.5升pH6.5，0.08M的檸檬酸鈉緩沖液置于2升的玻璃高壓釜內(nèi)恒溫至55℃，用高壓泵將脂酶(M10，Amano)溶液注入到體系中，使酶的終濃度達(dá)到0.5單位/毫升，定期從反應(yīng)介質(zhì)中取樣，測(cè)定脂酶的活性。
重復(fù)上述操作，在8巴的壓力下用CO2使緩沖液飽和。繼續(xù)最后一項(xiàng)操作，先向緩沖液中加入亞硫酸鈉使SO2的當(dāng)量濃度達(dá)到500ppm。附圖3的結(jié)果再次表明當(dāng)CO2壓力與SO2結(jié)合時(shí)脂酶的失活效果提高。
殘留的脂酶活性通過將反應(yīng)混合物與橄欖油于37℃保溫而測(cè)定。游離的脂肪酸用改進(jìn)的銅皂比色法[Koos and Klomp,Neth. Milk Dairy J. 31∶56-74(1977)]進(jìn)行分析。
實(shí)施例4在3.5升的無菌脫礦質(zhì)水中接種0.5升枯草桿菌的孢子(作為食物的耐熱污染物分離出來)，使CFU計(jì)數(shù)達(dá)到大約1×106/ml，在5升的不銹鋼高壓釜內(nèi)攪拌下迅速恒溫至100℃(Brignole-Nova，最大壓力300巴)，保壓，定期取樣，用標(biāo)準(zhǔn)平板測(cè)定法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定。
重復(fù)上述操作，用薄膜壓縮機(jī)從CO2氣瓶向微生物孢子懸浮液中充入CO2，加壓到150巴，通過加壓密封定期取樣。60分鐘后，向體系中注入60ml的亞硫酸鹽，使SO2的當(dāng)量濃度達(dá)到15ppm。附圖4的結(jié)果也證明了在SO2的作用下，微生物孢子的失活率增加。
以加壓處理后的菌落形成單位(CFU/ml)表示的殘余微生物計(jì)數(shù)是在未經(jīng)處理的樣品中直接測(cè)定的和在于80℃下處理10分鐘的樣品中測(cè)定的。把樣品用無菌鹽水進(jìn)行梯度稀釋，然后取0.1ml稀釋液涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上，于37℃培養(yǎng)3天以上進(jìn)行測(cè)定。拾-失活時(shí)間D值由以下公式計(jì)算D=t/(log[CFU]0-log[CFU]t其中[CFU]0和[CFU]t分別是零時(shí)間與t時(shí)間微生物孢子計(jì)數(shù)(80℃下未失活的)。
實(shí)施例5用尼龍網(wǎng)兜著整塊生馬鈴薯掛在實(shí)施例4所述的高壓釜內(nèi)，以3.2巴/分的速率用CO2向高壓釜內(nèi)加壓，使終壓力達(dá)到165巴，同時(shí)，以0.75℃/分的速率加熱使容器中的溫度達(dá)到55℃，將馬鈴薯樣品在165巴和55～60℃下保持20分鐘。然后在40分鐘內(nèi)以-4巴/分的速度減壓并冷卻至10℃。從切片加壓處理的馬鈴薯樣品中滲出的汁液放置后逐漸褐變，這表明有殘留的多酚氧化酶存在。
除與上述加壓加溫等條件相同外，在高壓釜的底部加入稀釋的亞硫酸氫鈉(水)溶液，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品并無褐變反應(yīng)，仍保持著生馬鈴薯的自然性狀。所以，對(duì)于典型“固體食品”來說多酚氧化酶的完全失活證明了二氧化硫和超臨界二氧化碳共同使用的滲透效果。
權(quán)利要求
1.酶或微生物特別是食品中的酶或微生物的失活方法，該方法包括在5-1，000巴的CO2或N2O壓力下，在選自活性的硫化物的還原劑存在下，在含水介質(zhì)中所述酶或微生物于50-120℃條件下的熱處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中還原劑是亞硫酸鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中亞硫酸鹽是SO2的液態(tài)或氣態(tài)形式，其用量為10-1，000ppm，優(yōu)選30-500ppm。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中氣態(tài)SO2是從稀釋的亞硫酸氫鈉水溶液中產(chǎn)生的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中還原劑是硫羥基活性化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中硫羥基活性化合物是還原態(tài)的谷胱甘肽、半胱氨酸或維生素B1，其濃度為0.05-0.5%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6之一的方法，其中CO2或N2O壓力為50-500巴，以使CO2或N2O的濃度不小于5g/L，優(yōu)選20g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一用于處理液態(tài)或糊狀產(chǎn)品的方法，其中活性硫化物以氣態(tài)的形式通過攪拌直接注入到所述的液態(tài)或糊狀產(chǎn)品中。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一用于處理固體食物的方法，其中CO2或N2O壓力與氣態(tài)硫化物無需攪拌而從外部發(fā)揮作用。
全文摘要
酶或微生物特別是食品中的酶或微生物的失活方法，該方法包括在二氧化碳或一氧化二氮的壓力下，在選自活性硫化物的還原劑(如亞硫酸鹽或硫羥基活性化合物)存在下，在含水介質(zhì)中所述酶或微生物的熱處理。
文檔編號(hào)A23L3/16GK1111112SQ9510358
公開日1995年11月8日 申請(qǐng)日期1995年3月27日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月28日
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