專利名稱：發(fā)酵生產(chǎn)d-核糖新菌株及用該菌株制備d-核糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)D—核糖的微生物菌種以及D—核糖生產(chǎn)方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
D—核糖是微生物體內(nèi)核糖核酸的組成成份，又是還原型誘導(dǎo)物，在生理上是十分重要的物質(zhì)。D—核糖在工業(yè)上一直是維生素B2的重要合成原料。近來，D—核糖作為調(diào)味品，調(diào)味品香料等合成原料，在食品工業(yè)上有廣闊的應(yīng)用前景。制造廉價(jià)的D—核糖，在工業(yè)上有廣泛深遠(yuǎn)的意義。
D—核糖的制造方法，有從天然物中抽提分離的方法，也有使用化學(xué)合成的方法制造。有機(jī)化學(xué)合成法制造核糖時(shí)，最早是采用一種汞極進(jìn)行電解還原反應(yīng)制得，此法會引起汞的污染?；瘜W(xué)合成法經(jīng)不斷改進(jìn)后，從葡萄糖經(jīng)氧化、置換、轉(zhuǎn)化、內(nèi)酯化、還原等七步反應(yīng)后獲得D—核糖。這種化學(xué)合成法反應(yīng)時(shí)間長，操作步驟復(fù)雜，所用設(shè)備多，制造成本高，收率低，并且會造成環(huán)境污染。
在本發(fā)明完成前所公開一份技術(shù)中，用短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)突變珠的D—核糖生產(chǎn)菌，在其發(fā)酵原料上要采用特定的方法制備玉米漿，因?yàn)榉枷阕灏被岬牧靠刂浦甑陌l(fā)酵。這種發(fā)酵方法工藝復(fù)雜，成本高。
本發(fā)明的目的是采用紫外線、甲基磺酸乙酯等化學(xué)、物理誘變因子作為誘變源，對親株進(jìn)行定向誘變選育，獲得莽草酸營養(yǎng)缺陷型突變株，改變了糖代謝途徑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種工藝簡單、制造成本低，采用上述菌株制備D—核糖的發(fā)酵方法。
本發(fā)明通過下列方案來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明首先涉及枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)JSIM—1018突變株菌種。其特征是以Bacillus subtilis為出發(fā)菌株，用化學(xué)、物理等誘變劑處理細(xì)胞，獲得莽草酸缺陷型突變株。該菌株在培養(yǎng)過程中菌體呈彎曲型、數(shù)字型及鎖狀結(jié)構(gòu)。發(fā)明中所述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)JSIM—1018突變株菌種，已于1995年9月19日保芷在中國微生物菌種保芷管理委員會普通微生物中心、登記入冊的編號CGMCC NO.0238一、D—核糖產(chǎn)生菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)JSIM—1018突變株的獲得。
1、菌種從28株不同類型的細(xì)菌Bacillus，Brevibacterium，Cory—nebacterium，Psendmonas，Arthrobacter中，經(jīng)篩選有三株Bac—illus sp.菌株具有積累D—核糖的能力，最高的一株SM—18菌株，D—核糖積累量6.35mg/ml，其余均在3mg/ml以下。
2、菌種誘變過程從三株積累D—核糖的B.subtilis菌株中，選擇B.subtilisSM—18為親株，將菌株在斜面上溫度為25—32℃下，培養(yǎng)12—24小時(shí)制成菌懸液，細(xì)胞數(shù)為1×109個(gè)/ml，按常規(guī)誘變方法，用紫外線、甲基磺酸乙酯等物理、化學(xué)透變劑相間或連續(xù)處理。紫外照射時(shí)間0.5—3.0分鐘，甲基磺酸乙酯最終濃度為0.5—2.0％，處理時(shí)間20—45分鐘，經(jīng)處理的細(xì)胞分別移種到含有和不含有莽草酸的基本培養(yǎng)基上，在溫度為25—32℃下培養(yǎng)2—5天，檢出含有莽草酸的基本培養(yǎng)基上生長，而無莽草酸的基本培養(yǎng)基上不生長的菌落，編號B．subtilis JSIM—1018冰箱保藏。
基本培養(yǎng)基組成(％)．葡萄糖0.1—0.5；硫酸銨0.2；磷酸氫二鉀1.4；磷酸二氫鉀0.6；硫酸鎂0.02；硫酸錳0.001；硫酸亞鐵0.001；腺嘌呤40—60ug/ml；組氨酸40—60ug/ml；含莽草酸的基本培養(yǎng)基莽草酸含量40—60ug/ml。
3、誘變選育獲得的莽草酸營養(yǎng)缺陷型突變株，D—核糖積累量比親株有極大地提高。然后經(jīng)多次紫外線和甲基磺酸乙酯反復(fù)誘變處理，從突變株中不斷選優(yōu)，再經(jīng)菌株的營養(yǎng)要求、培養(yǎng)條件多個(gè)方面的研究，獲得了B.subtilis JSIM—1018菌株。
二、B.subtilis新菌株制備D—核糖的方法B.subtilis發(fā)酵生產(chǎn)D—核糖方法主要是通過下列步驟來實(shí)現(xiàn)的(1)、斜面培養(yǎng)基(％)取葡萄糖0.1—0.5；蛋白胨0.5—1.0；酵母膏0.1—0.4；氯化鈉0.1—0.4；瓊脂1.5—2.5；PH為7.0—7.5，此培養(yǎng)基可按不同需要制作成試管斜面或茄子瓶大斜面。將冰箱保藏的菌種移種到斜面上，在溫度30—34℃下培養(yǎng)24—48小時(shí)。
(2)、種子培養(yǎng)基(％)取葡萄糖0.5—2.0；玉米漿0.5—2.0；磷酸氫二鉀0.1—0.5；磷酸二氫鉀0.1—0.5；硫酸鎂0.1—0.5；硫酸錳0.005—0.01；PH為7.0—7.5。
種子罐可以是碳鋼或不銹鋼制，最好為標(biāo)準(zhǔn)型。容量300升，裝液量150—210升。轉(zhuǎn)速250—350轉(zhuǎn)/分。常規(guī)滅菌，發(fā)酵罐冷卻至32—35℃，接入從大斜面上用無菌水洗下的菌種，所用的大斜面茄子瓶4—10只，在溫度為28—36℃下，培養(yǎng)16—24小時(shí)。風(fēng)量1∶0.25—0.5。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基(％)取用玉米淀粉水解糖或玉米粉經(jīng)淀粉酶、糖化酶雙酶法制得的糖18—20；玉米漿0.5—2.0；硫酸銨0.5—1.0；酵母粉0.1—0.5；硫酸鎂0.05—0.1；硫酸錳0.05—0.1；碳酸鈣1—2.5；PH為7.5—8.0，發(fā)酵罐可以是不銹鋼或碳鋼制，最好為標(biāo)準(zhǔn)型。攪拌轉(zhuǎn)速160—240轉(zhuǎn)/分，容量3000升，裝液量為1500—2100升。
培養(yǎng)基滅菌可以把糖質(zhì)原料單獨(dú)分開消毒后與其它成份合并。也可混在一起直接消毒。時(shí)間4—8分鐘，冷卻至32—35℃接入種子罐中的全部種子，接種量5—10％。在溫度為34—38℃下通風(fēng)攪拌培養(yǎng)60—80小時(shí)，風(fēng)量1∶0.4—0.8。發(fā)酵過程中測定的項(xiàng)目，D—核糖、葡萄糖、PH、O.D、CO2。每隔6小時(shí)測定。葡萄糖基本耗盡，D—核糖不再增長，CO2降至1以下，即可放罐。
(4)、提取放罐后的發(fā)酵液調(diào)PH為7.5—10.5，加絮凝劑脫乙酰甲殼素或甲殼素，絮凝劑用量為發(fā)酵液總量的100—600PPM，此時(shí)，發(fā)酵液中的菌體顆粒、雜質(zhì)變大，連結(jié)成絮狀物，易與清液分開。經(jīng)沉淀后用壓濾，抽濾或離心除去菌體雜質(zhì)得到發(fā)酵清液。清液上陽離子和陰離子交換樹脂柱，除去發(fā)酵液中的鹽類。用活性炭脫色，脫色液減壓濃縮，濃縮溫度不高于55℃，濃縮至30％以上的D—核糖糖漿備用。或者在濃縮后添加濃縮液4倍量的乙醇得到D—核糖結(jié)晶。
下面的實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明
實(shí)例11、培養(yǎng)基配制(1)、斜面培養(yǎng)基(％)取葡萄糖0.5，蛋白胨1.0，酵母膏0.4，氯化鈉0.1，瓊脂2.0，定容到100毫升，PH7.2。
(2)、種子培養(yǎng)基(％)玉米粉酶解糖2.0；玉米漿1.0；磷酸氫二鉀0.5，磷酸二氫鉀0.2；硫酸鎂0.1；硫酸錳0.005，定容到200升，PH7.2。
(3).發(fā)酵培養(yǎng)基(％)玉米粉酶解糖18；玉米漿0.6；硫酸銨1.0；酵母粉0.2；硫酸鎂0.1；硫酸錳0.01；碳酸鈣2.0；定容到2000升，PH7.5。
(4)、發(fā)酵將保藏的Bacillus subtilis JSIM—1018菌株接種至5只茄子瓶斜面上，30℃培養(yǎng)48小時(shí)，用無菌生理鹽水，將斜面上菌苔洗下，在無菌條件下合并入血清瓶中，用壓差法接入種子罐中。種子罐容積300升，裝液量200升。轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分，風(fēng)量1∶0.5，在溫度為35℃±1℃下，培養(yǎng)22小時(shí)，接入盛有發(fā)酵培養(yǎng)基2000升的發(fā)酵罐中，轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分，風(fēng)量1∶0.8，接種量10％，在溫度為38±1℃發(fā)酵70小時(shí)，發(fā)酵液中D—核糖含量81.75克/升。
將發(fā)酵液調(diào)PH8.0，加脫乙酰甲殼素300PPM。發(fā)酵液經(jīng)沉淀后，將上清液與沉淀分開，沉淀部分用壓濾法除去沉淀，合并上清液。上清液經(jīng)陽柱、陰柱脫鹽，活性炭脫色，50℃減壓濃縮至35％的D—核糖漿，實(shí)際得純D—核糖124.5公斤。
實(shí)例2(1)、斜面培養(yǎng)基同實(shí)例1(2).種子培養(yǎng)基(％)
取葡萄糖2.0；玉米漿2.0；磷酸氫二鉀0.5；磷酸二氫鉀0.5；硫酸鎂0.2；硫酸錳0.005，定容量到200升，PH7.5。
(3)、發(fā)酵培養(yǎng)基(％)取工業(yè)葡萄20；玉米漿2.0；硫酸銨0.6；酵母粉0.5；硫酸鎂0.05；硫酸錳0.05；碳酸鈣1.5；定容2000升，PH7.5。發(fā)酵與提取條件均與實(shí)例1相同，發(fā)酵78小時(shí)，發(fā)酵液中D—核糖含量70.75克/升，經(jīng)提取實(shí)得純D—核糖107公斤。
實(shí)例3在發(fā)酵中除用淀汾水解糖18％；玉米漿1.5％以外，其余均與實(shí)例1相同，發(fā)酵78小時(shí)，發(fā)酵中D—核糖含量60.04克/升，提取后實(shí)得純D—核糖90公斤。
本發(fā)明與已有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)1、采用發(fā)酵法生產(chǎn)D—核糖在常溫常壓下進(jìn)行，原材料來源廣，價(jià)格低廉。
2、本發(fā)明所用的菌種是枯草芽孢桿菌突變株，營養(yǎng)要求粗放，對原材料中所含的芳香族氨基酸量、玉米漿制作方法沒有嚴(yán)格的要求。
3、可以直接以玉米粉等粗原料進(jìn)行D—核糖發(fā)酵生產(chǎn)，生產(chǎn)成本降低。
4、微生物發(fā)酵生產(chǎn)D—核糖的方法，改善了化學(xué)合成法對環(huán)境造成的污染，根本改變了勞動條件。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)D—核糖新菌株，其特征是以Bacillus sub—titis為出發(fā)菌株，采用化學(xué)、物理等誘變劑處理細(xì)胞，獲得莽草酸營養(yǎng)缺陷型突變株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)D—核糖的新菌株，其特征是所述的誘變劑為紫外線、甲基磺酸乙酯連續(xù)或相間對出發(fā)菌株進(jìn)行誘變育種，紫外線照射時(shí)間為0.5—3分鐘，甲基磺酸乙酯的濃度為0.5—2％，處理時(shí)間為20—45分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)D—核糖的新菌株，其特征是所述的突變株，在培養(yǎng)過程中菌體形態(tài)特征呈彎曲型，數(shù)字型、鎖狀型等。
4.一種新菌株制備D—核糖的方法，其特征是前述1—3權(quán)利所述的新菌株，將獲得的新菌株移種到斜面培養(yǎng)基上，在溫度為30—34℃下，培養(yǎng)24—48小時(shí)后，轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，在種子罐中進(jìn)行培養(yǎng)，并在溫度為28—36℃下通風(fēng)培養(yǎng)16—24小時(shí)，風(fēng)量為1∶0.25—0.5，將培養(yǎng)好的種子液，以5—10％的接種量，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為34—38℃下，在發(fā)酵罐中進(jìn)行通風(fēng)攪拌培養(yǎng)60—80小時(shí)，通風(fēng)量為1∶0.4—0.8，攪拌轉(zhuǎn)速為160—240轉(zhuǎn)/分，得到D—核糖發(fā)酵液，將發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液調(diào)PH7.5—10.5，加絮凝劑脫乙酰甲殼素100—600PPM，發(fā)酵液經(jīng)絮凝、沉淀、抽濾后得到清液，發(fā)酵清液上陽離子和陰離子交換樹脂脫鹽，用活性炭脫色，脫色液經(jīng)減壓濃縮得D—核糖糖漿。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的新菌株制備D—核糖的方法，其特征是所述的斜面培養(yǎng)基包括葡萄糖0.1—0.5％，蛋白胨0.5—1.0；酵母膏0.1—0.4％；氯化鈉0.1—0.4％；瓊脂1.5—2.5％；PH為7.0—7.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的新菌株制備D—核糖的方法，其特征是所述的斜面菌種培養(yǎng)基包括葡萄糖0.5—2.0％，玉米漿0.5—2.0％；磷酸氫二鉀0.1—0.5％；硫酸錳；0.005—0.01％；硫酸鎂0.1—0.5％；PH為7.0—7.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的新菌株制備D—核糖的方法，其特征是所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括玉米粉(淀粉)制得的糖18—20％，玉米漿0.5—2.0％；硫酸銨0.5—1.0％；酵母粉0.1—0.5％；硫酸鎂0.05—0.1％；硫酸錳0.05—0.1％，碳酸鈣1—2.5％；PH為7.8—8.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及用微生物發(fā)酵生產(chǎn)D-核糖的微生物菌株以及用該菌株制備D-核糖的方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。其特征是以B.subtilis為出發(fā)菌株，采用化學(xué)、物理等誘變劑處理細(xì)胞，獲得莽草酸營養(yǎng)缺陷型突變株。用該突變株發(fā)酵生產(chǎn)D-核糖。本發(fā)明采用發(fā)酵法生產(chǎn)D-核糖在常溫常壓下進(jìn)行，原材料來源廣，價(jià)格低廉，對原材料中所含的芳香族氨基酸量，玉米漿制作方法無嚴(yán)格要求，并可改善化學(xué)合成法對環(huán)境造成的污染。
文檔編號C12N1/20GK1122833SQ9511273
公開日1996年5月22日 申請日期1995年10月25日 優(yōu)先權(quán)日1995年10月25日
發(fā)明者鄧崇亮, 柏建新 申請人:江蘇省微生物研究所