專(zhuān)利名稱(chēng)：一種重組人腫瘤壞死因子衍生物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療腫瘤的物質(zhì)，特別是一種腫瘤壞死因子的衍生物。
腫瘤是人類(lèi)排在心腦血管疾病之后的第二大死因。據(jù)估計(jì)全世界每年死于各種惡性腫瘤的人數(shù)接近1000萬(wàn)。目前，臨床上常規(guī)治療腫瘤的方法為手術(shù)、化療及放療等。對(duì)于腫瘤早期患者可采取手術(shù)切除合并其它療法，往往可取得較好的效果，但是對(duì)于那些無(wú)手術(shù)指征的晚期癌癥病人，化療及放療的效果往往很差，且后兩種治療方法本身具有嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，故眾多的醫(yī)學(xué)科學(xué)家都致力于找到一種既有高效抗腫瘤作用，又不影響機(jī)體正常功能的治療方法。以細(xì)胞因子為基礎(chǔ)的腫瘤生物治療正是在這種情況下誕生和發(fā)展的。
在眾多的細(xì)胞因子中，目前已知唯有腫瘤壞死因子α(Tumer necrosisfacterα，TNFα)可起到直接特異地殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。故而自TNFα發(fā)現(xiàn)后，立刻引起了人們的重視，人們對(duì)其在腫瘤治療中的價(jià)值曾寄予了很大的希望。國(guó)內(nèi)外應(yīng)用重組TNFα(rh-TNFα)臨床試用的結(jié)果表明，該因子對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞具有明顯的殺傷作用，許多患者經(jīng)過(guò)治療后腫瘤縮小甚至消失，病情緩解，生存期延長(zhǎng)，但是亦發(fā)現(xiàn)rh-TNFα具有十分明顯的毒副反應(yīng)，如發(fā)熱、寒戰(zhàn)、低血壓、體重下降，個(gè)別病人甚至可發(fā)生嚴(yán)重的休克，故限制了rh-TNFα的臨床應(yīng)用。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種高活性、低毒副作用的重組人腫瘤壞死因子α衍生物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種上述衍生物的制備方法。
本發(fā)明的重組人腫瘤壞死因子α衍生物(表示為rh-TNFαDlla)的化學(xué)結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)如下Arg Lys Arg Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln AlaGlu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu AlaAsn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu GlyLeu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys ProSer Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val SerTyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys GlnArg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro IleTyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser AlaGlu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln ValTyr Phe Gly Ile Ile Ala Phe其中Arg為精氨酸，Lys為賴(lài)氨酸，Pro為脯氨酸，Val為纈氨酸，Ala為丙氨酸，His為組氨酸，Asn為天冬酰胺，Gln為谷氨酰胺，Glu為谷氨酸，Gly為甘氨酸，Leu為亮氨酸，Trp為色氨酸，Asp為天冬氨酸，Ser為絲氨酸，Tyr為酪氨酸，Ile為異亮氨酸，Phe為苯丙氨酸，Cys為半胱氨酸，Thr為蘇氨酸。
本發(fā)明的重組人腫瘤壞死因子α衍生物的制備方法為將TNFα分子的第1～7位氨基酸(即Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr)缺失掉，并將第8、9、10位和157位的氨基酸(Pro Ser Asp和Leu)置換為Arg Lys Arg和Phe。
本發(fā)明的方法的具體實(shí)施方案是將人TNFαCDNA、引物5′GGAA TTCATG CGT AAA CGT AAG CCT GTA GCC CAT3′、引物5′CG GGATCC TTA TCA GAA AGC AAT GAT ACC AAA3′、dNTP在PCR緩沖液中進(jìn)行多聚酶聯(lián)反應(yīng)，將所得改造后的TNFα基因重組入帶有PRRL啟動(dòng)子的原核表達(dá)載體PBV220中，得到重組質(zhì)粒，可在大腸桿菌中表達(dá)，得到本發(fā)明的衍生物。
本發(fā)明所制得的重組人腫瘤壞死因子α衍生物(rh-TNFαDlla)與原型rh-TNFα相比活性高700倍以上，毒性低100倍左右。所以本發(fā)明的rh-TNFαDlla活性高、毒性低，可適用于各種惡性腫瘤患者，對(duì)肚癌、肺癌、乳腺癌、腎癌、黑色素瘤、皮膚癌、胃癌和食管癌等有較好療效。另外，應(yīng)用于經(jīng)手術(shù)、化療、放療的腫瘤患者，可使機(jī)體免疫功能恢復(fù)加速，起抗轉(zhuǎn)移、抗復(fù)發(fā)的作用。
下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明的最佳實(shí)施方案。實(shí)施例本發(fā)明所用的突變引物I為5′GGAA TTC ATG CGT AAA CGT AAGCCT GTA GCC CAT3′，引物II為5′CG GGA TCC TTA TCA GAA AGCAAT GAT ACC AAA3′，取PCR緩沖液(KC150mM，Tris·HCl100mM，MgCl15mM，明膠0.1mg/L)IOμL，2mMdNTP IOμl，引物I100ng，引物II100ng，人TNFαCDNA 80ng，加滅菌水至100μl?；靹蚝笤?5℃變性5分鐘，加TagDNA聚合酶2.5U，混勻，加石醋油50μl，保持94℃1分鐘，57℃1分鐘，72℃1分30秒，然后再保持在94℃1分鐘，如此進(jìn)行共30個(gè)循環(huán)，最后保持在72℃7分鐘。將所得改造后的TNFα基因克隆入PUC19載體中，利用雙脫氧法進(jìn)行核苷酸序列分析，結(jié)果如下5′GGAA TTC ATG CGT AAA CGT AAG CCT GTA GCC CAT GTTGTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTGAAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAGCTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTGTAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGCTGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGCCGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTCTCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAGGGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTGGGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGCGCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAGTCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC TTC GGA TCC CG3′其中方框中堿基為起始密碼子和終止密碼子，劃線部分為改造后的密碼子。
將改造后的具有正確序列的TNFα基因重組入帶有PRPL啟動(dòng)子的原核表達(dá)載體PBV220中，得PBVTNFαDlla重組質(zhì)粒。
所述重組質(zhì)粒可在大腸桿菌特別是DH5α中表達(dá)。一種優(yōu)選的方案為將以上重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中，挑取一個(gè)正確的轉(zhuǎn)化子，經(jīng)3次劃板(在含50μg/ml的瓊脂平板上劃線)活化，最后挑取一個(gè)菌落，在2ml LB培養(yǎng)基中30℃振蕩過(guò)夜，次日以1％的量接種于200mLB中，30℃培養(yǎng)至OD600＝0.4～0.6時(shí)，迅速升溫至42℃，快速振搖，熱誘導(dǎo)4～6小時(shí)，rh-TNFαDlla表達(dá)量約占菌體總蛋白量的30％。
下面將rh-TNFαDlla與原型rh-TNFα進(jìn)行比活性比較分別測(cè)定純化的以上兩種蛋白質(zhì)含量后，采用在放線菌素D存在下，TNF對(duì)L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性方法，測(cè)定其細(xì)胞毒活性，根據(jù)所得數(shù)據(jù)分別計(jì)算出比活性，見(jiàn)下表
下面是動(dòng)物急性毒性實(shí)驗(yàn)情況本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯^察一次性劑量rh-TNFαDlla給藥后動(dòng)物表現(xiàn)出的毒性反應(yīng)，從而確定它的臨床應(yīng)用價(jià)值。
初步實(shí)驗(yàn)表明5×103IU/kg以下的rh-TNFαDlla注射末出現(xiàn)任何毒副反應(yīng)；≥6.1×103IU/kg后部分動(dòng)物發(fā)生死亡；≥1.5×109IU/kg后則動(dòng)物全部致死。說(shuō)明5×103IU/kg劑量下是安全的。
結(jié)論1.rh-TNFαDlla用藥劑量在≤5×103IU/kg對(duì)小鼠無(wú)任何毒副反應(yīng)，是安全的，此為人體用量的25000倍，據(jù)此可以認(rèn)為rh-TNFαDlla人體內(nèi)給藥亦是安全的。
2.rh-TNFαDlla的毒性比原型(rh-TNFα)低約100倍左右。
3.rh-TNFαDlla對(duì)小鼠的LD50為8.6×103IU/kg。
本發(fā)明的上述方案僅作為實(shí)例給出，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明采用不同的實(shí)施方案，但均不脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種重組人腫瘤壞死因子α衍生物，其特征是化學(xué)結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)如下Arg Lys Arg Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln AlaGlu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu AlaAsn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu GlyLeu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys ProSer Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val SerTyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys GlnArg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro IleTyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser AlaGlu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln ValTyr Phe Gly Ile Ile Ala Phe
2.一種權(quán)利要求1的重組人腫瘤壞死因子α衍生物的制備方法，其特征是將TNFα的第1-7位氨基酸(即Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr)缺失掉，并將第8、9、10位和157位的氨基酸(Pro Ser Asp Asp和Leu)置換為Arg Lus Arg和Phe。
3.如權(quán)利要求2的方法，其特征是將人TNFαCDNA、引物5′GGAATTC ATG CGT AAA CGT AAG CCT GTA GCC CAT3′、引物5′CGGGA TCC TTA TCA GAA AGC AAT GAT ACC AAA3′、dNTP在PCR緩沖液中進(jìn)行多聚酶聯(lián)反應(yīng)，將所得改造后的TNFα基因重組入帶有PRPL啟動(dòng)子的原核表達(dá)載體PBV220中。
4.如權(quán)利要求3的方法，其特征是將所述重組入PBV220中的改造后的TNFα基因在大腸桿菌中表達(dá)。
5.如權(quán)利要求4的方法，其特征是所述大腸桿菌為DH5α。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種重組人腫瘤壞死因子α衍生物及其制備方法。本發(fā)明將原型TNFα分子的第1-7位氨基酸缺失掉，并將第8、9、10、157位的氨基酸置換為Arg Lus Arg和Phe，所制得的衍生物比活性比原型高720倍，毒性低約100倍，可廣泛用于治療各種惡性腫瘤，如肝癌、肺癌、乳腺癌、腎癌、黑色素瘤、皮膚癌、胃癌和食道癌等。
文檔編號(hào)C12N15/28GK1127786SQ95115489
公開(kāi)日1996年7月31日 申請(qǐng)日期1995年9月18日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月18日
發(fā)明者劉麗, 王國(guó)志, 謝寶樹(shù), 馮彪, 冷愛(ài)軍 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍空軍總醫(yī)院