專(zhuān)利名稱(chēng):阿拉伯木聚糖降解酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明特別涉及到編碼有阿拉伯木聚糖降解活性多肽的基因的克隆和表達(dá)。這些酶適用于工業(yè)加工,如烤面包、加工紙和紙漿和制備飼料及食物(添加劑)。
植物細(xì)胞壁的組成是復(fù)雜和變化的。研究發(fā)現(xiàn)多糖主要以長(zhǎng)鏈纖維素(植物細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分)、半纖維素(含有各種β-木聚糖鏈)和果膠的形式存在。植物細(xì)胞壁中多糖的存在、分布和結(jié)構(gòu)特性由以下因素決定(1)植物種類(lèi),(2)變種,(3)組織類(lèi)型,(4)生長(zhǎng)條件,(5)年齡,(6)喂養(yǎng)前植物材料的加工情況。
單子葉植物(如谷類(lèi)和禾本科植物)和雙子葉植物(如苜蓿屬植物、油菜子和豆科植物)之間、植物的種子和營(yíng)養(yǎng)器官部分之間存在基本的差別(Chesson,1987;Carre and Brillouet,1986)。
單子葉植物的特點(diǎn)是以阿拉伯木聚糖復(fù)合體為主要半纖維素骨架。雙子葉植物中半纖維素的主要結(jié)構(gòu)是木葡聚糖復(fù)合體。另外,還發(fā)現(xiàn)雙子葉植物中果膠的濃度比單子葉植物中的高。通常,種子內(nèi)的果膠類(lèi)物質(zhì)量很高,而纖維素類(lèi)物質(zhì)較少。
細(xì)胞壁中可區(qū)分出三種或多或少相互作用的多糖結(jié)構(gòu)(1)中間層形成外細(xì)胞壁。它還作為植物組織、基質(zhì)內(nèi)各個(gè)細(xì)胞間的連接點(diǎn)。中間層主要由高度酯化的果膠的鈣鹽組成;
(2)初生壁就位于中間層的內(nèi)側(cè)。它是由包埋于果膠、半纖維素、酚酯和蛋白質(zhì)的無(wú)定形基質(zhì)中的纖維素微纖絲組成的有序結(jié)構(gòu);(3)次生壁是在植物成熟時(shí)形成的。在植物生長(zhǎng)和老化期期間,纖維素、微纖絲、半纖維素和木質(zhì)素沉積。
成熟的代謝旺盛的植物細(xì)胞初生細(xì)胞壁比次生細(xì)胞壁對(duì)酶的水解作用更敏感,此時(shí),次生細(xì)胞壁已經(jīng)高度木質(zhì)化了。
細(xì)胞壁內(nèi)的纖維素、半纖維素和果膠間有著高度的相互作用。這些相當(dāng)強(qiáng)地交錯(cuò)連接的多糖結(jié)構(gòu)的酶降解不是一個(gè)簡(jiǎn)單的過(guò)程。例如,至少需要5種不同的酶來(lái)完全破壞阿拉伯木聚糖。內(nèi)切是用內(nèi)-β(1-4)-D-木聚糖酶進(jìn)行。外-(1→4)-D-木聚糖酶在多糖的非還原端釋放木糖單位。另三種酶(α-葡糖苷酸酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和乙酰酯酶)用于攻擊木聚糖骨架上的取代基。具體酶的選擇當(dāng)然取決于要被降解的具體的半纖維素(McCleary and Math-eson,1986)。
攻擊木聚糖側(cè)鏈的酶可能有意義,因?yàn)樗鼈兏淖兙酆衔锏奶匦?,使之更適于某些應(yīng)用。此外,這些酶可以與主鏈裂解酶-內(nèi)木聚糖酶協(xié)同作用(廣泛的綜述見(jiàn)Kormelink,1992,博士論文,Uni-versity of Wageningen)。
編碼一種阿拉伯木聚糖降解酶活性的一段DNA片段是已知的。在歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)463,706中,給出了塔賓曲霉的內(nèi)木聚糖酶的分離、特性和基因克隆。這個(gè)酶不能攻擊阿拉伯木聚糖骨架的側(cè)鏈。
能攻擊側(cè)鏈的酶活性也是從黑色曲霉得知的(Kormelink,1992,Supra,Chapters 6和7)。一種被稱(chēng)為阿拉伯呋喃糖苷酶A(Arafur A)的酶,其特征是具有釋放從阿拉伯木聚糖獲得的寡糖結(jié)構(gòu)的阿拉伯糖殘基的能力。然而,Arafur A對(duì)高分子量物質(zhì)無(wú)活性。
另外,黑色曲霉產(chǎn)生的一種叫Arafur B的酶,對(duì)寡糖有活性,對(duì)高分子量的阿拉伯木聚糖結(jié)構(gòu)也有活性。Arafur B的酶活性限于從末端單取代的木糖殘基釋放阿拉伯糖殘基。至今還不知其DNA片段。
現(xiàn)在已經(jīng)從泡盛曲霉中分離到了在寡糖和高分子量阿拉伯木聚糖結(jié)構(gòu)中都能從非末端單取代的木糖殘基釋放阿拉伯糖殘基的酶。這個(gè)酶被命名為阿拉伯木聚糖阿拉伯呋喃糖水解酶(AXH)。至今尚未得到DNA片段和/或序列數(shù)據(jù)。顯然,并不是所有的阿拉伯木聚糖降解中涉及的酶都已被發(fā)現(xiàn)(Kormelink,1990)。例如,還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)攻擊阿拉伯糖雙取代的木糖分子的酶,其中的原因是這些酶的分泌量低。在適當(dāng)?shù)乃拗髦蟹肿涌寺『瓦^(guò)量生產(chǎn)這些酶,雖然不容易,但也是一個(gè)獲得足夠量純酶的方法,這些酶反過(guò)來(lái)可以在各種應(yīng)用中估量它們的重要性。
本發(fā)明提供含有編碼有阿拉伯木聚糖降解活性的多肽或其多肽前體的DNA片段的重組DNA,其特征在于所述DNA片段選自(a)編碼含SEQIDNO5中氨基酸1至306所代表的氨基酸序列的多肽或氨基酸-27至306所代表的上述多肽的前體的DNA片段;(b)編碼含SEQIDNO7中氨基酸1至306所代表的氨基酸序列的多肽或氨基酸-27至306所代表的上述多肽的前體的DNA片段;(c)編碼仍然有阿拉伯木聚糖降解活性的、SEQIDNO5或7中所示氨基酸殘基1至306所代表的多肽的變體或部分,及其多肽前體的DNA片段;(d)編碼有阿拉伯木聚糖降解活性的多肽并含SEQIDNO5中核苷酸784至1779或SEQIDNO7中核苷酸823至1818所代表的核苷酸序列的DNA片段;(e)編碼有阿拉伯木聚糖降解活性的多肽或這種多肽的一個(gè)部分的DNA片段,該DNA片段能與SEQIDNO5中核苷酸784至1779或SEQIDNO7中核苷酸823至1818所代表的DNA片段雜交。本發(fā)明的重組DNA優(yōu)選從一種的絲狀真菌,特別是從曲霉類(lèi)獲得。特別優(yōu)選的重組DNA序列包括源于黑色曲霉和塔賓曲霉、編碼AXDA的DNA片段。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案,本發(fā)明的重組DNA包括該DNA片段在原核或真核宿主細(xì)胞(當(dāng)存在于其中時(shí))中表達(dá)所需的5’和3’DNA調(diào)控序列。此DNA調(diào)控序列與上述DNA片段的多肽編碼序列間優(yōu)選是異源性的,更優(yōu)選這樣的DNA調(diào)控序列與連接到它的同源性DNA調(diào)控序列上時(shí),此DNA片段在宿主中的表達(dá)相比,該調(diào)控序列增強(qiáng)所述DNA片段在所述宿主中的表達(dá)。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案,上述重組DNA以載體的形式存在。
本發(fā)明還提供了含本發(fā)明重組DNA的轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細(xì)胞(優(yōu)選曲霉屬細(xì)胞),以及通過(guò)在轉(zhuǎn)化條件下用本發(fā)明重組DNA處理宿主細(xì)胞和篩選增強(qiáng)了阿拉伯木聚糖降解酶表達(dá)的細(xì)胞,獲得增強(qiáng)了表達(dá)所述阿拉伯木聚糖降解酶的宿主細(xì)胞的方法。
本發(fā)明還提供了一種獲得阿拉伯木聚糖降解酶的方法,包括在對(duì)產(chǎn)酶有利的條件下,培養(yǎng)能產(chǎn)生上述酶的宿主細(xì)胞并回收上述酶的步驟,其特征在于,上述宿主細(xì)胞或其上一代,已用本發(fā)明的重組DNA轉(zhuǎn)化。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案,本發(fā)明提供一種有阿拉伯木聚糖降解活性的基本純的多肽,其特征在于SEQIDNO6或SEQIDNO8中所示氨基酸序列,及其仍有上述活性的遺傳變體和部分。本發(fā)明還包括含有權(quán)利要求14的基本純的多肽的組合物,配制該組合物用于飼料、食品、或紙和紙漿加工,其中酶被固定或不固定。
本發(fā)明還提供一種使用本發(fā)明的多肽幫助阿拉伯木聚糖降解作為飼料或食品添加劑,在造或紙漿的加工過(guò)程和面包烤制中的使用方法。
本發(fā)明還要求含本發(fā)明多肽的飼料或食品。
另一個(gè)實(shí)施方案提供一種包括由SEQIDNO5中1至783核苷酸代表的、能調(diào)節(jié)連接到其上的DNA序列表達(dá)的DNA片段或它的亞片段的重組DNA,還有包括由SEQIDNO7中1至822核苷酸代表的、能調(diào)節(jié)連接到其上的DNA序列表達(dá)的DNA片段或它的亞片段的重組DNA。
通過(guò)下列附圖的說(shuō)明進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明
圖1.阿拉伯木聚糖降解酶的HPLC洗脫圖(OD280)圖2.圖示AXDA對(duì)玉米的水不溶固體(WIS)活性做為PH值的函數(shù)圖3.作為粗AXDA酶量的函數(shù),體外消化玉米WIS的百分率圖4.pIM3001的限制性位點(diǎn)5.pIM3002的限制性位點(diǎn)圖。
本發(fā)明提供了純化和分離的包括阿拉伯木聚糖降解酶基因的DNA分子和它的遺傳變異體。此DNA分子可包括阿拉伯木聚糖降解酶編碼區(qū)和與它相鄰的5’和3’調(diào)節(jié)區(qū)。遺傳變異體包括編碼突變阿拉伯木聚糖蛋白的DNA分子和所表達(dá)的酶仍保留目的活性的簡(jiǎn)并DNA分子。
本發(fā)明還提供了在目的表達(dá)宿主中表達(dá)阿拉伯木聚糖降解酶的DNA構(gòu)建物。這些表達(dá)構(gòu)建物包括含有與調(diào)節(jié)區(qū)可操縱性地相連的阿拉伯木聚糖降解酶編碼區(qū)的雜合DNA分子,調(diào)節(jié)區(qū)如為來(lái)源于同源或異源生物的啟動(dòng)子、分泌和終止信號(hào),在合適的宿主中這些調(diào)節(jié)區(qū)能指導(dǎo)由阿拉伯木聚糖降解酶編碼DNA分子編碼的酶的增強(qiáng)表達(dá)。更可取地,表達(dá)構(gòu)建物將整合到選擇的表達(dá)宿主的基因組中。
本發(fā)明還提供了載體,特別是質(zhì)粒,用于通過(guò)將DNA構(gòu)建物引入微生物宿主中來(lái)克隆和/或轉(zhuǎn)化微生物宿主,以實(shí)現(xiàn)阿拉伯木聚糖降解酶的表達(dá)。
另外,本發(fā)明提供了用含上述DNA構(gòu)建物的載體轉(zhuǎn)化的同源或異源宿主。異源宿主可以選自細(xì)菌、酵母或真菌。
在本發(fā)明的上下文中,“同源的”一詞可以被理解為所有與編碼感興趣的阿拉伯木聚糖降解酶的DNA分子(包括其調(diào)節(jié)區(qū))有天然聯(lián)系的。“同源”宿主定義為能從中分離到這種DNA分子的種類(lèi)。
因此“異源的”一詞定義為所有與編碼感興趣的阿拉伯木聚糖降解酶的DNA分子(包括其調(diào)節(jié)區(qū))無(wú)天然聯(lián)系的?!胺峭础彼拗鞫x為除了能從中分離到阿拉伯木聚糖降解酶編碼基因外的所有微生物種類(lèi)。
在本發(fā)明的上下文中,“感興趣的阿拉伯木聚糖降解酶的增強(qiáng)表達(dá)”定義為感興趣的阿拉伯木聚糖降解酶的表達(dá)水平高于同源野生型生物中的普通水平。同樣,增強(qiáng)表達(dá)也包括感興趣的阿拉伯木聚糖降解酶在異源生物中的表達(dá),該異源生物本身正常不能產(chǎn)生阿拉伯木聚糖降解酶,除非將編碼感興趣的阿拉伯木聚糖降解酶的表達(dá)構(gòu)建物或DNA分子導(dǎo)入異源表達(dá)宿主。當(dāng)然這些表達(dá)宿主的下一代也可以理解為包含在本發(fā)明之內(nèi)。
本發(fā)明還包括與從上述真菌獲得的DNA序列雜交的DNA序列,但密碼序列可因遺傳密碼的簡(jiǎn)并或種間變異而不同。因此,本發(fā)明包括從除曲霉以外種類(lèi)得到的編碼阿拉伯木聚糖降解酶的DNA片段。典型地獲得類(lèi)似DNA片段的步驟包括篩選用含DNA片段(從一已知或預(yù)期能產(chǎn)生本發(fā)明的阿拉伯木聚糖降解酶的生物獲得)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌或噬菌斑。原位復(fù)制DNA后,DNA從細(xì)胞或噬菌斑中釋放,固定到濾膜上(通常為硝酸纖維素膜)。然后,此濾膜可用于篩選互補(bǔ)DNA片段,用基于任何決定曲霉AXDA基因之序列的標(biāo)記核酸探針篩選。依據(jù)要篩選的生物間關(guān)系的遠(yuǎn)或近,調(diào)整雜交和漂洗的條件,以便選出真正的陽(yáng)性,減少假陽(yáng)性的數(shù)量。濾膜固定化DNA雜交的典型步驟在《核酸雜交——實(shí)用方法》的第120和121頁(yè)第五章表3中有述(B.D.Hames和S.J.HigginsEds.,1985,IRL Press,Oxford)。雖然最適條件是由經(jīng)驗(yàn)決定的,但也可對(duì)有密切或稍不密切相關(guān)的序列給出一些有用的重要原則。
為了鑒別與探針密切相關(guān)的DNA片段,雜交如上述Hames和Higgins書(shū)中的表3中描述的方法進(jìn)行(其主要內(nèi)容復(fù)述如下),最后用0.1×SET緩沖液(20×SET3M NaCl,20mM EDTA,0.4MTris-HCl,pH7.8,0.1%SDS)在68℃下進(jìn)行高嚴(yán)格性漂洗。
鑒別與探針有限制同源性的序列要按上面提到的Hames和Higgins書(shū)中的表3中給出的步驟進(jìn)行,但要降低雜交和漂洗的溫度。例如,最后2×SET緩沖液在55℃下漂洗,可允許鑒定約有70%的同源性的序列。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的,同源性和雜交條件間的確切關(guān)系取決于探針的長(zhǎng)度、堿基組成(G+C%)和錯(cuò)配的分布;隨機(jī)分布對(duì)Tm值降低作用比錯(cuò)配的非隨機(jī)或成簇形式要強(qiáng)。
上述條件適用于長(zhǎng)度至少為300bp,優(yōu)選500bp,更優(yōu)選1kbp左右的探針,要探測(cè)的DNA的GC含量約為50±10%。如果給定生物的GC含量是已知的,那么反應(yīng)條件可以考慮下列方程經(jīng)驗(yàn)性?xún)?yōu)化(在1M NaCl中(G+C)%介于35%和75%之間時(shí))Tm=81.5℃+0.41×(G+C)%。這大略的意思是如果GC含量即(G+C)%比平均值高10%,雜交條件(嚴(yán)格的)可通過(guò)提高4℃雜交和漂洗的溫度調(diào)節(jié)。
為了公開(kāi)目的,上述與本發(fā)明的DNA片段雜交的片段被定義為在與SEQIDNO5或7所述任何序列的至少300bp、優(yōu)選500bp,更優(yōu)選1kbp左右的探針雜交,并按Hames和Higgins書(shū)中第五章中表3提供的步驟(在下文中給出)在50℃下用2×SET緩沖液(即0.3M NaCl)進(jìn)行漂洗后,在固定的DNA上給出了陽(yáng)性信號(hào)。
Hames和Higgins書(shū)中第五章表3的主要內(nèi)容如下(1)無(wú)探針時(shí)濾膜的預(yù)雜交,(2)50-68℃下在下列緩沖液中雜交0.1-4×SET緩沖液(由嚴(yán)格性決定),10×Denhardt氏溶液(100×Denhardt氏溶液包括2%牛血清白蛋白,2%Ficoll,2%聚乙烯吡咯烷酮),0.1%SDS,0.1%焦磷酸鈉,50μg/ml的桂魚(yú)精子DNA,聲處理成200-500bp長(zhǎng)度,置水浴中20分鐘,加水稀釋?zhuān)K濃度為1mg/ml);雜交時(shí)間不十分嚴(yán)格,可以在1-24小時(shí)間任一值,優(yōu)選16小時(shí)(過(guò)夜);探針通常通過(guò)切口平移法用32P為放射性標(biāo)記來(lái)標(biāo)記,達(dá)比活性5×107-5×108c.p.m/μg;(3)用3×SET,0.1%SDS,0.1%焦磷酸鈉于溫度68℃(50-68℃間,由設(shè)計(jì)的嚴(yán)格性而定)下(重復(fù))漂洗濾膜,重復(fù)漂洗同時(shí)SET濃度降為0.1%,4×SET中室溫漂洗一次20分鐘,在3MM紙上干燥濾膜,-70℃下在暗盒中將濾膜曝光于X-光膠片上1-96小時(shí)(由信號(hào)的強(qiáng)度決定),沖膠片。
通常,預(yù)雜交和雜交混合物的體積應(yīng)保持最小。所有“濕潤(rùn)”步驟應(yīng)在一預(yù)熱的水浴中的小封閉包中進(jìn)行。
上述方法是為定義按本發(fā)明能雜交的DNA片段。顯然,鑒定和分離本發(fā)明DNA片段的方法可做許多修改。需要明確的是這樣獲得的DNA片段屬于本權(quán)利要求范圍,只要它們可以用上述方法檢查出來(lái),不論它們實(shí)際上是否已用上述方法鑒定和/或分離。
適合用于鑒定和分離本發(fā)明DNA片段的許多方法已經(jīng)描述在文獻(xiàn)和手冊(cè)(包括上面引用的Hames和Higgins的書(shū))中了。
上述方法是用于多核苷酸探針的。當(dāng)用于寡核苷酸探針時(shí),Td(在此溫度下完全配對(duì)的雜合體半解離)由以下關(guān)系式估算Td=4%/GC堿基對(duì)+2℃/AT堿基對(duì)。在現(xiàn)有方法和這一重要原則的基礎(chǔ)上,可設(shè)計(jì)寡核苷酸探針來(lái)從相關(guān)的和更遠(yuǎn)些的生物中有效地分離編碼本發(fā)明阿拉伯木聚糖降解酶的DNA片段。如果一個(gè)酶已經(jīng)從一不同的來(lái)源純化,而且其部分氨基酸序列已經(jīng)確定,用寡核苷酸的方法更有用。利用此序列,可制出許多簡(jiǎn)并探針用于篩選DNA文庫(kù)或做Southern雜交,基本上如上所述。
用于篩選的好候選生物是其他絲狀真菌類(lèi),如木霉屬、青霉屬、Dichotomitus squalus、Disporotrichum dimorphosporum,和細(xì)菌類(lèi),如芽孢桿菌類(lèi)等等。如果最初的篩選獲得了似乎含有雜交片段的克隆,可分離這樣的片段,必要時(shí)測(cè)序以確定序列相似性。
一旦鑒定了某一感興趣的阿拉伯木聚糖降解酶,編碼這個(gè)酶的DNA序列可按如下從天然產(chǎn)生該酶的絲狀真菌中獲得,在含阿拉伯木聚糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該真菌,用已知的方法(如實(shí)施例1中所示方法)分離目的阿拉伯木聚糖降解酶,并測(cè)定純化蛋白的至少部分氨基酸序列。
然后,根據(jù)推斷的部分氨酸酸序列設(shè)計(jì)寡核苷酸序列可得到DNA探針。氨基酸序列可以由全蛋白的N-末端和/或利用蛋白酶解或化學(xué)消化的全蛋白的內(nèi)部多肽片段的N-末端測(cè)定。得到后,DNA探針用于篩選基因組或cDNA文庫(kù)。
基同組文庫(kù)可以通過(guò)用識(shí)別4個(gè)連續(xù)核苷酸的DNA序列的限制酶(如Sau 3A)部分消化真菌染然體DNA,并將得到的片段克隆到適當(dāng)?shù)馁|(zhì)?;颚?噬菌體載體(如λ-GEM-11)中而制得。
或者,cDNA文庫(kù)可以通過(guò)克隆cDNA到一合適的噬菌體載體,如λgt10中制備,從被誘導(dǎo)合成阿拉伯木聚糖降解酶的真菌細(xì)胞分離的mRNA合成cDNA。
然后,倒平板生長(zhǎng)出足量的菌落或噬菌斑,基因組或cDNA文庫(kù)可以用合適的DNA探針篩選。
如果這個(gè)方法不奏效,基因組或cDNA文庫(kù)可能要用從非誘導(dǎo)的和誘導(dǎo)細(xì)胞中的mRNA所獲得cDNA探針進(jìn)行示差篩選。誘導(dǎo)mRNA是從生長(zhǎng)在含阿拉伯木聚糖為碳源的培養(yǎng)基上的細(xì)胞制備的,而非誘導(dǎo)mRNA必需從生長(zhǎng)在不以阿拉伯木聚糖碳源的培養(yǎng)基(如以葡萄糖為碳源)上的細(xì)胞制備。在只與誘導(dǎo)cDNA探針雜交的克隆當(dāng)中,可以找到含有目的阿拉伯木聚糖降解酶編碼基因的克隆?;蛘撸梢詫⒗揪厶墙到饷富蚺c相關(guān)的序列進(jìn)行交叉雜交來(lái)鑒別。
優(yōu)選寡核苷酸探針從由黑色曲霉培養(yǎng)物的濾液所純化的、表現(xiàn)分子量為32kDa的阿拉伯木聚糖降解酶N-末端氨基酸序列(見(jiàn)實(shí)施例1.5.1)和/或從酶用溴化氰消化得到的內(nèi)部肽片段的氨基酸序列(見(jiàn)實(shí)施例1.5.2)獲得。
這樣得到的寡核苷酸混合物可用于與基因組和cDNA文庫(kù)雜交?;蛘呔拖筮@里描述的這樣,純化的AXDA酶可用來(lái)激發(fā)抗體??贵w用于表達(dá)文庫(kù)的免疫篩選。這樣來(lái)鑒定AXDA表達(dá)克隆。需要指出的是該蛋白質(zhì)是從黑色曲霉塔賓變種分離的,cDNA是從黑色曲霉N400分離的,說(shuō)明不同的曲霉有AXDA活性。
隨著新DNA擴(kuò)增技術(shù)(如直接或反向PCR)的出現(xiàn),已知道編碼區(qū)的末端序列,就可以在體外克隆DNA片段。
有了編碼阿拉伯木聚糖降解酶的DNA序列,使得用定點(diǎn)誘變構(gòu)建突變酶分子成為可能。如果已知阿拉伯木聚糖降解酶的三級(jí)結(jié)構(gòu),而且它的催化和底物結(jié)合區(qū)已定位,就可以選出發(fā)生最可能影響催化和/或底物結(jié)合功能的氨基酸,例如借助于計(jì)算機(jī)模型。如果不知道蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu),可在整個(gè)密碼序列產(chǎn)生隨機(jī)突變,或者可以與從其他微生物分離到的已知的類(lèi)似酶進(jìn)行比較來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。
為了利用含AXDA編碼序列的DNA片段插入到包括一個(gè)或幾個(gè)異源調(diào)節(jié)區(qū)的表達(dá)構(gòu)建物中,可以用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR,《PCR技術(shù);DNA擴(kuò)增的原則和應(yīng)用》,(1989)H.A.Ehrlich,ed.,Stockton Press,New York)在AXDA編碼序列的5’和3’端引入適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c(diǎn)。限制性位點(diǎn)的選擇由表達(dá)載體的DNA序列而定,如DNA分子內(nèi)其他限制性位點(diǎn)的存在。
為了在原始(同源的)生產(chǎn)生物種,或者在異源真菌菌株中獲得AXDA蛋白的增強(qiáng)表達(dá),AXDA的DNA編碼區(qū)(包括其控制區(qū))要導(dǎo)入選擇的表達(dá)宿主中以提高基因的拷貝數(shù),結(jié)果提高蛋白質(zhì)表達(dá)。
如果優(yōu)選異源表達(dá)宿主,選擇了一個(gè)酵母或細(xì)菌菌株,用一不間斷的(無(wú)內(nèi)含子的)DNA分子來(lái)構(gòu)建異源表達(dá)載體,以避免異源宿主不識(shí)別基因組片段上存在的剪接信號(hào)的可能性。這種不間斷的DNA分子可以從由引導(dǎo)AXDA合成的細(xì)胞分離的mRNA構(gòu)建的cDNA文庫(kù)獲得。該文庫(kù)可以用按上面提到的方法獲得的寡核苷酸或cDNA探針來(lái)篩選?;蛘咴趶陌⒗揪厶且龑?dǎo)的細(xì)胞RNA合成的cDNA第一鏈上用適當(dāng)?shù)?’和3’寡核苷酸進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),得到不間斷的DNA分子。
目的AXDA的增強(qiáng)表達(dá)可以通過(guò)選擇異源調(diào)節(jié)區(qū)(如啟動(dòng)子、分沁前導(dǎo)序列和終止區(qū))來(lái)獲得,它們用于提高表達(dá),如果需要的話(huà),還可以提高所選表達(dá)宿主中目的蛋白的分泌水平和/或提供目標(biāo)AXDA表達(dá)的誘導(dǎo)性調(diào)控。
除了目標(biāo)AXDA本身的啟動(dòng)子,其它啟動(dòng)子也可用于指導(dǎo)AXDA的表達(dá)。啟動(dòng)子可以根據(jù)它在指導(dǎo)目標(biāo)AXDA在目的表達(dá)宿主中的效率進(jìn)行選擇。
在另一個(gè)實(shí)施方案中,可以選擇一個(gè)組成型啟動(dòng)子來(lái)指導(dǎo)目標(biāo)AXDA的表達(dá),而基本無(wú)其它酶表達(dá)。這樣的表達(dá)構(gòu)建物的另一優(yōu)點(diǎn)是避免了對(duì)在含阿拉伯木聚糖為誘導(dǎo)底物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)宿主的需要。
優(yōu)選用于真菌表達(dá)宿主的強(qiáng)組成型和/或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的例子是ATP-合成酶,亞單位9(oliC),丙糖磷酸異構(gòu)酶(tpi),乙醇脫氫酶(adhA),α-淀粉酶(amy),葡糖淀粉酶(gam),乙酰胺酶(amdS)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子。
強(qiáng)酵母啟動(dòng)子的例子是乙醇脫氫酶、乳糖酶、3-磷酸甘油酸激酶和丙糖磷酸異構(gòu)酶啟動(dòng)子。
強(qiáng)細(xì)菌啟動(dòng)子的例子是α-淀粉酶啟動(dòng)子、Spo2啟動(dòng)子和細(xì)胞外蛋白酶基因啟動(dòng)子。
雜合啟動(dòng)子也可有利地用于提高表達(dá)構(gòu)建物的誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)。
通常,希望目標(biāo)AXDA從表達(dá)宿主中分泌到培養(yǎng)液中。
根據(jù)本發(fā)明,目標(biāo)AXDA自身的分泌前導(dǎo)序列可用于實(shí)現(xiàn)所表達(dá)AXDA的分泌。
但酶表達(dá)的增加有時(shí)會(huì)導(dǎo)致蛋白產(chǎn)量水平高于表達(dá)宿主能夠加工、分泌的水平而產(chǎn)生瓶頸,結(jié)果蛋白產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)積累。相應(yīng)地,本發(fā)明還給出了異源引導(dǎo)序列以使酶從選擇的表達(dá)宿主最有效地分泌。
根據(jù)本發(fā)明,分泌前導(dǎo)序列可以在目標(biāo)表達(dá)宿主的基礎(chǔ)上選擇。可選擇與表達(dá)構(gòu)建物的其他調(diào)節(jié)區(qū)同源的異源分泌前導(dǎo)序列。例如,高分泌性葡糖淀粉酶蛋白的前導(dǎo)序列可與它自己的葡糖淀粉酶啟動(dòng)子結(jié)合,也可以與其他啟動(dòng)子結(jié)合。在本發(fā)明的上下文中,也可有利地應(yīng)用雜合信號(hào)序列。
優(yōu)選的異源分泌前導(dǎo)序列的例子是那些來(lái)源于葡糖淀粉酶基因(真菌類(lèi)的),α-因子基因(酵母類(lèi)的)或α-淀粉酶基因(芽胞桿菌屬的)的序列。
一般地,不認(rèn)為終止子是基因增強(qiáng)表達(dá)的重要元件。如果需要,可以從與啟動(dòng)子一樣的基因中選擇終止子,或者用同源終止子。
除了上面提到的基因組片段,轉(zhuǎn)化DNA可含一個(gè)選擇標(biāo)記,來(lái)從非轉(zhuǎn)化細(xì)胞堆中區(qū)分出結(jié)合了目標(biāo)基因的細(xì)胞。這個(gè)選擇標(biāo)記,帶有適當(dāng)?shù)?’和3’調(diào)節(jié)序列,可能在含有目標(biāo)基因的同一DNA分子上或者在另外的分子上。在后一情況下,必需進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。以適當(dāng)方式調(diào)節(jié)表達(dá)載體與選擇載體之比,使高百分比的所選轉(zhuǎn)化子同時(shí)摻入了含目的AXDA表達(dá)構(gòu)建物的載體。
最適合于工業(yè)微生物的選擇系統(tǒng)是由在宿主生物中不需要突變的一組選擇標(biāo)記組成的。真菌類(lèi)的選擇標(biāo)記的實(shí)例為乙酰胺酶基因(amdS)、ATP合成酶基因、亞單位9基因(oliC)和benomyl抗性基因(benA)。非真菌類(lèi)選擇標(biāo)記的例子是細(xì)菌G418抗性基因(也可用于酵母,但不能用于真菌)、氨芐青霉素抗性基因(大腸桿菌)和新霉素抗性基因(芽孢桿菌屬)。
一旦目的表達(dá)構(gòu)建物裝配好了,就轉(zhuǎn)化到合適的克隆宿主(如大腸桿菌)中以增殖構(gòu)建物。然后,將表達(dá)構(gòu)建物引入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)宿主中,在那里表達(dá)構(gòu)建物就優(yōu)選整合到基因組中。象芽孢桿菌類(lèi)的宿主可作為克隆宿主又可作為表達(dá)宿主,因此避免了額外的轉(zhuǎn)化步驟。
根據(jù)本發(fā)明,多種生物可用作產(chǎn)生目的AXDA的宿主。
在一個(gè)實(shí)施方案中,可以用同源表達(dá)宿主。這包括表達(dá)構(gòu)建物導(dǎo)回分離到AXDA編碼DNA序列的菌株,提高基因拷貝數(shù),或在上述異源調(diào)節(jié)區(qū)的控制下,或兩者均有。
在另一個(gè)實(shí)施方案中,目的AXDA的產(chǎn)生是通過(guò)在異源宿主(如細(xì)菌、酵母或真菌)中,在適當(dāng)調(diào)節(jié)區(qū)的控制下,導(dǎo)入并表達(dá)編碼阿拉伯木聚糖降解酶的DNA構(gòu)建物而實(shí)現(xiàn)的。為此,編碼目的AXDA的DNA序列優(yōu)選在來(lái)源于異源宿主的啟動(dòng)子和終止子序列控制下表達(dá)。另外,為了獲得產(chǎn)物的最大表達(dá)和分泌效率,有必要用與表宿主同源的前導(dǎo)序列取代原來(lái)的分泌前導(dǎo)序列。
象大小(分子量)、適當(dāng)?shù)奶腔蚰康腁XDA細(xì)胞外分泌的需要等因素,在選擇表達(dá)宿主中起重要的作用。
革蘭氏陰性菌——大腸桿菌廣泛用作異源基因表達(dá)的宿主。但是大量的異源蛋白傾向于在細(xì)胞內(nèi)累積。從大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)蛋白中純化目的蛋白有時(shí)不容易。
與大腸桿菌不同,芽孢桿菌屬細(xì)菌非常適合于作為異源宿主,因?yàn)樗鼈冇袑⒌鞍追置诘脚囵B(yǎng)基中的能力。
根據(jù)AXDA編碼DNA分子本身的性質(zhì),和/或者對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)一步加工的需要,可以?xún)?yōu)選象酵母、真菌這樣的真核宿主。一般來(lái)說(shuō),酵母細(xì)胞優(yōu)于真菌細(xì)胞,因?yàn)樗鼈內(nèi)菀撞僮?。但一些蛋白從酵母?xì)胞中分泌的量少,或者有時(shí)加工不正確(如在酵母內(nèi)過(guò)多地糖基化)。在這樣的條件下,應(yīng)該選擇真菌類(lèi)宿主。
通過(guò)選擇正常不能產(chǎn)生該酶的宿主(如乳克魯維氏酵母),異源宿主也可選來(lái)用于表達(dá)基本無(wú)其他多糖降解酶的目的AXDA。
本發(fā)明范圍內(nèi)優(yōu)選的表達(dá)宿主,例如是真菌類(lèi),如曲霉種(在EP.184,438和284,603中有述)和木霉種,細(xì)菌,如芽孢桿菌種(在EP.134,048中有述)和酵母類(lèi),如克魯維氏菌種(在EP.96,430和EP.301,670中有述)和糖酵母類(lèi)。
特別優(yōu)選的表達(dá)宿主可選自黑色曲霉,黑色曲霉泡盛變種、棘孢曲霉、米曲霉、木霉、枯草芽孢桿菌、地衣形芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、乳克魯維氏酵母和啤酒糖酵母。
目的AXDA酶的表達(dá)受用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的表達(dá)宿主在常規(guī)的營(yíng)養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基中的培養(yǎng)情況影響。
發(fā)酵培養(yǎng)基由含有碳源(如葡萄糖、麥芽糖、糖蜜等)、氮源(如硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等),有機(jī)氮源(如酵母膏,麥芽提取物、蛋白胨等)和無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)源(如磷、鎂、鉀、鋅、鐵等)的普通培養(yǎng)基組成??扇芜x地包含一種誘導(dǎo)物(如阿拉伯木聚糖)。
合適培養(yǎng)基的選擇是基于表達(dá)宿主的選擇和/或基于表達(dá)構(gòu)建物的調(diào)控要求而定的。這樣的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。如果需要,培養(yǎng)基中可含對(duì)轉(zhuǎn)化的表達(dá)宿主有利而對(duì)其他潛在的污染微生物不利的附加成分。
發(fā)酵可用分批或補(bǔ)料分批工藝進(jìn)行0.5-20天,溫度0-45℃,pH2-10。優(yōu)選的發(fā)酵條件是溫度20-37℃,pH3-9。最適條件依據(jù)選擇的表達(dá)宿主而定。
發(fā)酵結(jié)束后,用離心或過(guò)濾法從發(fā)酵液中移出細(xì)胞。去除細(xì)胞后就可回收酶,如果需要,用常規(guī)方法純化和分離。
產(chǎn)物可以穩(wěn)定地配制成液體或固體的形式,對(duì)某些應(yīng)用,優(yōu)選將酶固定在固體基質(zhì)上。
用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的酶可單獨(dú)或與選擇的基他酶一起應(yīng)用于需要阿拉伯木聚糖降解酶作用的各種加工工藝中。
本發(fā)明的阿拉伯木聚糖降解酶可用于處理或制備食物(如面包)、飼料和飲料(如啤酒和果汁)。
阿拉伯木聚糖降解酶也可有利也用于制備和處理紙和紙漿,尤其是與內(nèi)木聚糖酶結(jié)合使用。
正如本發(fā)明中所述,將阿拉伯木聚糖降解酶加到富含阿拉伯木聚糖的動(dòng)物飼料中。當(dāng)加到喂單胃動(dòng)物(如家禽或豬)的飼料(包括青貯飼料,其中含有象大麥、小麥、玉米、黑麥和燕麥等谷類(lèi)植物或谷類(lèi)植物的副產(chǎn)品,如小麥麩或玉米麩)中時(shí),該酶可以顯著改善植物細(xì)胞壁的破壞情況,使動(dòng)物能更好地利用植物營(yíng)養(yǎng)。最終,生長(zhǎng)率和/或食物轉(zhuǎn)化率提高。另外,阿拉伯木聚糖降解酶可以用于降低含阿拉伯木聚糖的飼料的粘度。
如果優(yōu)選預(yù)浸或濕飼料,阿拉伯木聚糖降解酶可以提前加到飼飼料或青貯飼料中。更有利的是,通過(guò)本發(fā)明產(chǎn)生的AXDA可在體內(nèi)繼續(xù)水解飼料中的阿拉伯木聚糖。
阿拉伯木聚糖降解酶還可用于制作面包(如實(shí)施例8所述)。
實(shí)驗(yàn)菌株大腸桿菌BB4(silvay et a1.,1984)el4(mcrA) hsdR514,supE44,supF58,lacYl,or (1aclZY)6,galK2,galT22,metBl,trpR55, (argF-lac)U169[F′,proAB,1acIqZ M15,Tnl0,(retr)]大腸桿菌DH5α(Hanahan,1983)supE44, lacUl69,(φ80lacZ M15),hsdRl7,recAl,endAl,gyrA96,thi-l,relA1大腸桿菌LE 392(Murray,1977)e14(mcrA)hsdR514,supE44,supF58,lacYl,or (1aclZY)6,galK2,galT22,metBl,trpR55大腸桿菌XLl-Blue MRF′(Jerpseth et al.,1992) (mcrA)183, (mcrCB-hsdSMR-mrr)l73,endAl,supE44,thi-1,recAl,gyrA96,relAl,lac,[F′,proAB,lacIqZ M15,Tn10,(tetr)]黑色曲霉N400(CBS 120.49)黑色曲霉N402(cspAl)Goosen et al.,1987)黑色曲霉NW219(leuAl,nicAl,pyrA6)載體pBluescript SK+/-(Short,J.M.,et al.,1988)pUCl9(Yanish-Perron et al.,1985)按Sambrook等(1989)制備了下列溶液緩沖液TE,50*TAE,20*SSC; 雜交 100*Denhardts,SM,DNA 加樣培養(yǎng)基NZYCM,LB和基本培養(yǎng)基按Visniac和Santer(1957)制備Visniac溶液。
實(shí)施例實(shí)施例1酶的分離實(shí)施例1.1黑色曲霉泡盛變種的阿拉伯木聚糖降解酶活性A(AXDA)的純化與特征黑色曲霉泡盛變種DS 16813的培養(yǎng)按照EPA 0 463 706中的描述進(jìn)行,但不用酵母膏并用2%的粗制小麥阿拉伯木聚糖部分代替斯佩耳特燕麥木聚糖,細(xì)胞通過(guò)過(guò)濾去除,上清通過(guò)超濾干燥。
為了純化AXDA,將5g粗酶制備物稀釋到100ml 10mM Tris/HCl(pH8.0)中。過(guò)濾酶溶液(Seitz/supro no 250和Seitz/SuproEKS)并稀釋到蛋白終濃度為5.2g/l(Biorad蛋白測(cè)定)。粗酶通過(guò)HPLC(Waters Preparative 650 Advanced Protein Purification System)在DEAE TSK 650(M)陰離子交換柱(600ml)上進(jìn)行分部分離(速度25ml/min)。柱子用25mM Tris/HCl(pH8.0)平衡,樣品(3g蛋白)上柱并用含100mM NaCl的平衡緩沖液梯度洗脫。AXDA酶在53mMNaCl濃度處被洗脫下來(lái),如圖1所示。
實(shí)施例1.2最適pH為了確定AXDA粗酶制品的最適pH,用玉米的水不溶固體(WIS)聚合物部分作為底物。將1.6mg粗酶制品加入0.5g WIS并用從3.40到7.65的不同pH的緩沖液(100mM NaAc)稀釋到5ml。樣品在39℃保溫60分鐘并離心15分鐘(2800g),上清液中還原糖用Sumner試劑測(cè)定。
Sumner試劑的制備10g苯酚加入到22ml 10%NaOH中,隨后用去礦質(zhì)水將體積調(diào)至100ml并加10g NaHSO3。70ml該溶液依次加入300ml 4.5%NaOH,255g酒石酸鉀或酒石酸鈉和800ml 1%3.5-二硝基水楊酸,混和物隨后在室溫下攪拌直到化學(xué)試劑溶解。
200μl樣品中加入0.5ml Sumner試劑并煮沸10分鐘,冷卻后加入5ml去礦質(zhì)水,在515nm測(cè)定消光值。樣品的還原糖含量利用木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算。
該酶的最適pH為5.0,如圖2所示。
實(shí)施例1.3氨基酸組成來(lái)自DEAE柱的AXDA部分的氨基酸組成在PICO-TAG150MM柱上測(cè)定(在254nm檢測(cè)),發(fā)現(xiàn)下列組成
<p>表1AXDA的氨基酸組成HPLC泵CM4000;檢測(cè)M440,254nm;加樣4μlGilson232;柱PICO-TAG 150MM;數(shù)據(jù)系統(tǒng)Maxima實(shí)施例1.4生化特征(等電點(diǎn)和分子量)AXDA的等電點(diǎn)(IEP)在Pharmacia微型凝膠(minigel)pH3-9上測(cè)定。蛋白用Pharmacia銀染溶液染色。AXDA酶的等電點(diǎn)約為3.6。
AXDA的分子量在Pharmacia微型梯度SDS凝膠(10-15%)上測(cè)定,蛋白用銀染(Pharmacia)檢測(cè)。AXDA的分子量約為32kDa。
實(shí)施例1.5黑色曲霉泡盛變種阿拉伯木聚糖降解酶活性A(AXDA)的蛋白測(cè)序?qū)嵤├?.5.1黑色曲霉泡盛變種阿拉伯木聚糖降解酶活性A(AXDA)的N末端氨基酸測(cè)序大約1nmol(≈30μg)AXDA在15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳,而后根據(jù)Matsudaiza(1987)所描述的方法電轉(zhuǎn)印到Im-mobilon-P膜(Millipore)上。含有具有32kDa表現(xiàn)分子量(SDS-PAGE)的主帶的膜片段在氣相測(cè)序儀(SON facility,Leiden)中進(jìn)行序列分析(Amons,1987),確定出下列序列Lys-?-Ala-Leu-Pro-Ser-Ser-Tyr(SEQIDNO1)
實(shí)施例1.5.2阿拉伯木聚糖降解酶活性A(AXDA)的CNBr肽段的氨基酸序列測(cè)定大約2nmol AXDA用CNBr進(jìn)行化學(xué)裂解將大約2nmol(≈60μg)AXDA冷凍干燥并重新懸浮在含125μg CNBr的60μl70%甲酸(2.5mg/ml)中,該反應(yīng)混和物黑暗中室溫下保溫48小時(shí)。液體在Speedvac中蒸發(fā),用無(wú)菌雙蒸水清洗并再次蒸發(fā)。該清洗步驟重復(fù)兩次。然后反應(yīng)混和物在15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳,隨后根據(jù)Matsudaira(1987)所描述的方法電轉(zhuǎn)印列Immobilon-P膜(Millipore)上,含有具有大約9kDa表現(xiàn)分子量(SDS-PAGE)的主帶的膜片段在氣相測(cè)序儀(SON facility,Leiden)中進(jìn)行序列分析(Amons,1987),確定出下列序列CNBr肽段.Ile-Val-Glu-Ala-Ile-Gly-Ser-Thr-Gly-His-Arg-Tyr-Phe-(Arg/Asn)-(Ser)-(Phe)-(Thr)(SEQIDNO2)不明確的氨基酸在括號(hào)中給出。
實(shí)施例2AXDA的酶特征用對(duì)硝基苯阿拉伯呋喃糖苷為底物(Sigma)測(cè)定α-阿拉伯呋喃糖苷酶的活性。在1ml底物中加300μl酶溶液。30℃溫育15分鐘后用5ml Na2CO3(5M)中止反應(yīng)。測(cè)402nm處的消光度。計(jì)算α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性(體積×消光度)/(Ex時(shí)間)。
制備的粗酶中含0.3 pNPAF U/mg的α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。測(cè)定從DEAE柱所得流份的活性。阿拉伯呋喃糖苷酶活性部分含3.0 pNPAF U/mg活性(見(jiàn)圖1)。其他部分未發(fā)現(xiàn)有α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。然后在玉米的水不溶性聚合物部分上測(cè)試α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性合并液,沒(méi)有測(cè)到對(duì)此底物的活性。
這表明AXDA對(duì)對(duì)硝基苯類(lèi)底物無(wú)α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
為了進(jìn)一步測(cè)定AXDA的酶活性,在含小麥阿拉伯木聚糖的底物上篩選用塔賓曲霉axdA-基因轉(zhuǎn)化的黑色曲霉的培養(yǎng)物濾液的活性。塔賓基因被置于丙酮酸激酶(一種糖酵解酶)啟動(dòng)子控制之下,選擇生長(zhǎng)條件以利于轉(zhuǎn)基因的表達(dá),而避免內(nèi)源性阿拉伯糖降解酶的表達(dá)。
相應(yīng)地測(cè)出了AXDA對(duì)大分子量阿拉伯木聚糖底物有釋放阿拉伯糖的活性。用Sedmak的方法測(cè)蛋白質(zhì)含量。AXDA活性的測(cè)定取100μl培養(yǎng)物濾液的不同釋液(在10mM乙酸鈉緩沖液中pH5.0)加到150μl的50mM乙酸鈉(pH5.0)和250μl 0.4%小麥阿拉伯木聚糖(Megazyme)混合液中,40℃溫育1小時(shí)。100℃加熱此混合物10分鐘以終止反應(yīng)。用HPAEC(高效陰離子交換層析)來(lái)跟蹤阿拉伯木聚糖降解產(chǎn)物,用熱滅活的培養(yǎng)物作為樣品。
結(jié)果如下表0塔賓曲霉AXDA對(duì)小麥阿拉伯木聚糖的活性
1個(gè)單位的阿拉伯呋喃糖水解酶活性定義為每分鐘從阿拉伯木聚糖釋放1μmole阿拉伯糖所需酶的量。
推論塔賓曲霉的AXDA酶有阿拉伯呋喃糖水解酶(AXH)活性。
用Megazyme的阿拉伯聚糖酶檢測(cè)試劑盒并按其說(shuō)明進(jìn)行操作,測(cè)定阿拉伯聚糖酶活性。實(shí)驗(yàn)中,DEAE柱的AXDA合并液對(duì)線(xiàn)性阿拉伯聚糖無(wú)活性。這表明AXDA不是阿拉伯聚糖酶。
用燕麥斯拜耳特木聚糖測(cè)定內(nèi)阿拉伯木聚糖酶活性。將10ml5%的木聚糖懸液(100mM NaAc,pH3.5)煮沸10分鐘。冷卻后,39℃溫育10分鐘。加0.5ml酶溶液開(kāi)始反應(yīng)。幾次溫育(5,10,15,20,25分鐘)后,取在39℃溫育的樣品1.5ml,加到1.5ml脫礦質(zhì)水中,煮沸10分鐘。離心(2800g)樣品15分鐘。用Sumner試劑(見(jiàn)實(shí)施例1.2)檢查上清液中的還原糖。
在AXDA合并液中,發(fā)現(xiàn)了399.0 U/mg的內(nèi)木聚糖酶活性。然后在體外消化系統(tǒng)中(見(jiàn)實(shí)施例6)測(cè)定內(nèi)木聚糖酶和AXDA。
由此得出結(jié)論在AXDA合并液中的內(nèi)木聚糖酶活性是與不同的多肽活性相關(guān)的活性。Kormelink(1992,phD論文,第6章,P107最后二段和P108)發(fā)現(xiàn)了與類(lèi)似AXDA的酶共洗脫具有內(nèi)木聚糖酶活性多肽的進(jìn)一步證據(jù)。因此推斷AXDA本身無(wú)內(nèi)木聚糖酶活性。
實(shí)施例3cDNA表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建實(shí)施例3.1mRNA的誘導(dǎo)和分離按EPA0463 706中所述,分別培養(yǎng)黑色曲霉N400 69和81小時(shí),但無(wú)酵母膏,2%的粗制小麥阿拉伯木聚糖部分代替燕麥斯拜耳特木聚糖,然后過(guò)濾收集菌絲體,用無(wú)菌鹽水漂洗。然后在液氮中冷凍菌絲體,再用微脫膜器(Braun)磨成粉。按照Sambrook等人(1989)提出的異硫氰酸胍/氯化銫法從菌絲體粉中分離總RNA,只是用氯化銫梯度離心RNA兩次。帶poly A的mRNA是用oligo(dT)-纖維素層析法從5mg的總RNA中分離的(Aviv和Leder,1972,Sambrook等,1989),并做如下修改所有的溶液中均無(wú)SDS,載樣緩沖液用9%(V/V)的二甲基亞砜補(bǔ)充。
實(shí)施例3.2cDNA文庫(kù)的構(gòu)建用ZAPTM-cDNA合成試劑盒(Stratagene)按照廠(chǎng)商說(shuō)明從7μgpolyA+mRNA合成cDNA,并連接到噬菌體λ-Uni-ZAP XR中。cDNA連到Uni-ZAP XR的載體臂后,根據(jù)操作說(shuō)明用Packa-geneTMextracs(Promega)包裝噬菌體DNA。將120ng cDNA連接到1.2μg載體臂上,然后包裝反應(yīng)混合物,產(chǎn)生包括3.5×104重組噬菌體的初級(jí)文庫(kù)。用大腸桿菌XL1-Blue MRF’擴(kuò)增此初級(jí)文庫(kù),滴定并在4℃保存。
實(shí)施例4用抗AXDA的抗體篩選黑色曲霉N400 cDNA文庫(kù)并分離cDNA克隆實(shí)施例4.1在兔體中制備抗AXDA的抗體對(duì)pH7.0的1mM磷酸緩沖液中透析500μg AXDA并冷凍干燥。重懸蛋白質(zhì)于1ml無(wú)菌PBS(0.136M NaCl,2.7mM KCl,8mMNa2HPO4,1.75mM KH2PO4,pH7.4)中。向此蛋白質(zhì)混合物中加入1ml福氏完全佐劑,渦旋30分鐘,得到穩(wěn)定的乳狀液。將此混合物注入家兔皮下。第六周,加強(qiáng)注射加入0.5ml福氏不完全佐劑的溶于0.5ml無(wú)菌PBS的250μg AXDA。在第七周取家兔血并檢查血清。第13周進(jìn)行第二次加強(qiáng)注射250μg,第十四周取血。這一間隔6周取血的加強(qiáng)注射過(guò)程可重復(fù)幾次。
收集的血樣置于37℃保持30分鐘,然后在4℃保存16小時(shí)。在Sorvall高速離心機(jī)中5000rpm離心收集血清。
實(shí)施例4.2用抗AXDATUB的抗體免疫篩選黑色曲霉N400的cDNA文庫(kù)為了篩選按實(shí)施例3.2所述構(gòu)建的黑色曲霉N400的cDNA文庫(kù),如已述(Maniatis等,1982,pp64)的方法在直徑85mmNZYCM(含1.5%瓊脂)平板(其頂層瓊脂中含0.7%瓊脂糖)上,每板鋪5×103pfu的axdA克隆,用E.codi BB4為鋪板細(xì)菌。
按Sambrook等人(1989,pp12.16-12.17)的方法,每個(gè)平板用硝酸纖維素濾膜(Schleicher and Schüll,BA85)印兩份。用歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)91205994.5(公布號(hào)0463 706A1)描述的免疫染色法染色后,可用高抗純化AXDATUB的抗體(實(shí)施例4.1)顯現(xiàn)AXDANIG。鑒定出重復(fù)出現(xiàn)在復(fù)制膜上的免疫染色的噬菌斑,篩選了8個(gè)陽(yáng)性噬菌斑。每個(gè)噬菌斑都用巴斯德吸管從平板中吸出,在含20μl氯仿的1ml SM緩沖液中使噬菌體從瓊脂塊中擴(kuò)散出來(lái)(Mnaiatis等人,1982,pp64)。用從含50-100個(gè)所分離噬菌體噬菌斑的平板得到的濾膜復(fù)制品,重復(fù)上述方法,純化得到的噬菌體。
純化以后,將噬菌體(5×103個(gè))鋪在NEYCM培養(yǎng)基中增殖噬菌體。37℃過(guò)夜培養(yǎng),得到鋪滿(mǎn)的平板,加5ml SM緩沖液從中洗脫噬菌體,平板置4℃、4000xg保存2小時(shí),間斷搖動(dòng)。用吸管取上清后,4℃離心10分鐘從溶液除去細(xì)菌。在上清液中加入0.3%氯仿,測(cè)定滴度pfu。此噬菌體儲(chǔ)液的滴度約為1010pfu/ml。
實(shí)施例4.3axdA cDNA克隆的限制酶切分析根據(jù)廠(chǎng)商說(shuō)明,利用與絲狀輔助噬菌體ExAssistTM(包括在Stratagene的ZAPTM-cDNA合成試劑盒中)雙重感染,將含axdAcDNA的重組Uni-ZAP XR克隆轉(zhuǎn)到Bluescript噬菌粒中。
然后按Sambrook等人(1989,pp1.25-1.28)的方法分離噬菌粒DNA。
8個(gè)axdA cDNA克隆的分離DNA用下列限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和XhoI進(jìn)行限制酶切分析。DNA在由下列溶液組成的反應(yīng)混合物中在37℃消化2小時(shí)2μl(=1μg)DNA溶液;2μl適當(dāng)?shù)?0X反應(yīng)緩沖液(BRI);10U的各種限制性?xún)?nèi)切酶(BRL)和無(wú)菌蒸餾水,終體積為20μl。加4μl DNA載樣緩沖液后,加樣于0.7%TAE-瓊脂糖凝膠。80伏電泳分離DNA片段1.5小時(shí)。
限制性酶切分析表明axdA cDNA克隆的分子大小約為1.2kb。
實(shí)施例4黑色曲霉axdA cDNA克隆的序列分析用序列分析結(jié)合在測(cè)序反應(yīng)中用物異的寡核苷酸作引物來(lái)測(cè)定cDNA克隆的一級(jí)結(jié)構(gòu)。
用雙脫氧寡核苷酸鏈終止法(Sanger等,1977)用Pharmacia T7DNA聚合酶測(cè)序試劑盒測(cè)定寡核苷酸序列。用PC/GENE程序進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析。
實(shí)施例4.5片段的32P標(biāo)記黑色曲霉axdA cDNA克隆片段的分離和標(biāo)記按照歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)91205944.5(公布號(hào)0 463 706 A1,實(shí)施例2.2和7.1,并入本文作為參考)描述的方法進(jìn)行。
實(shí)施例4.6從黑色曲霉黑色變種的基因組文庫(kù)篩選axdA基因,并分離該基因。
為了篩選按照Harmsen等人(1990)的方法構(gòu)建的黑色曲霉黑色變種文庫(kù),每個(gè)平板鋪3×103pfu的axdA基因,平板為5個(gè)Ma-niatis等(1982,pp64)所述的85mm直徑的NZYCM(含1.5%瓊脂),頂層瓊脂為含0.6%瓊脂糖的NZYCM,用大腸桿菌LE 392為鋪板細(xì)菌。
37℃過(guò)液培養(yǎng),按照Maniatis等人的方法(1982,pp320-321)每個(gè)平板在HybondN濾膜(Amersham)上印二份。
用3×SSC濕潤(rùn)濾膜后,室溫下用3×SSC沖洗60分鐘。濾膜在65℃下預(yù)雜交二小時(shí),預(yù)雜交緩沖液含有6×SSC,0.5%SDS,10×Denhardt氏溶液,0.01M EDTA和100μg/ml熱變性的鯡魚(yú)精子DNA(Boerhinger Mannheim)。預(yù)雜交二小時(shí)后,用雜交緩沖液代替預(yù)雜交緩沖液。雜交緩沖液與預(yù)雜交緩沖液相同,只是含有按實(shí)施例4.5制備的32P標(biāo)記的含黑色曲霉axdA cDNA克隆(見(jiàn)實(shí)施例4.3)的1.2kb片段。濾膜在65℃溫度下雜交18小時(shí)。
雜交后濾膜先在65℃下用5×SSC/0.1%SDS漂洗30分鐘,再于2×SSC/0.1%SDS中65℃漂洗30分鐘。然后于0.1×SSC/0.1%SDS中65℃漂洗30分鐘,最后在0.1×SSC中65℃漂洗30分鐘。風(fēng)干的濾膜置于一張3MM Whatman紙上,用放射性墨水做標(biāo)記,用Saran Wrap蓋上Whatman紙和濾膜。用Kodak XAR X-光膠片在-70℃時(shí)放置72小時(shí),用增敏屏鑒定雜交噬菌斑。
找到了出現(xiàn)在復(fù)制濾膜上的10個(gè)陽(yáng)性雜交噬斑。用巴斯德吸管吸出4個(gè)陽(yáng)性噬斑。按Maniatis等人的方法(1982,pp64)在含20μl氯仿的1ml SM緩沖液中,使噬菌體從瓊脂塊中擴(kuò)散出來(lái)。用含分離的噬菌體的50-100個(gè)噬菌斑的平板濾膜復(fù)制物重復(fù)上述方法,純化得到的噬菌體。
純化以后,噬菌體(5×103個(gè))鋪于NZYCM培養(yǎng)基中增殖。37℃培養(yǎng)過(guò)夜,得到鋪滿(mǎn)的平板。加5ml SM緩沖液洗脫噬菌體,平板置4℃保存2小時(shí),間斷搖動(dòng)。用吸吸管取上清液后,4℃、4000Xg離心10分鐘從溶液中除去細(xì)菌。在上清液中加0.3%氯仿,測(cè)滴定度。此噬菌體儲(chǔ)存液的滴度約為107pfu/ml。
實(shí)施例4.7從λ噬菌體中分離DNA在300μl SM緩沖液中,5×109E.coli LE329和2×106噬菌體一起在37℃培養(yǎng)15分鐘來(lái)增殖每個(gè)分離的噬菌體。然后將被感染的細(xì)菌接種到100ml預(yù)熱的(37℃)NZYCM培養(yǎng)基中,置于NewBrunswick旋轉(zhuǎn)振蕩器上(轉(zhuǎn)速250rpm)37℃培養(yǎng)9-12小時(shí)。然后裂解細(xì)菌,用Sorvall高速離心機(jī),4℃,10,000rpm離心10分鐘去除細(xì)菌碎片。加入10g聚乙二醇-6000和11.7g NaCl于上面得到的上清液(100ml)中并將溶液置于4℃過(guò)夜,以沉淀噬菌體。沉淀的噬菌體經(jīng)4℃、14,000Xg離心20分鐘收集。吸出上清液,最后痕量液體用紙巾吸出。小心地重懸噬菌體于4ml SM緩沖液中并用等體積的氯仿抽提一次。
在從噬菌體顆粒中提DNA之前,先在37℃用DNase I和RNase A(都是100μg/ml)溫育噬菌體懸液30分鐘,以除去來(lái)自裂解細(xì)菌的DNA和RNA。然后加入EDTA達(dá)終濃度20mM,使噬菌體DNA從噬菌體中釋放出來(lái),同時(shí)用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提兩次去蛋白質(zhì)。用Sorvall離心機(jī)(1400Xg,10分鐘)離心使液相分層后,水相用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次。離心分離噬菌體,然后加入0.1倍體積的5M高聚酸鈉和0.1倍體積的異丙醇,冰上溫育30分鐘使DNA從水相中沉淀。4℃離心(14000Xg)10分鐘回收DNA。吸去上清,重懸DNA于400μl TE緩沖液中。加入0.1倍體積的3M乙酸鈉和2倍體積的乙醇再沉淀一次DNA。4℃離心(14000Xg)10分鐘收集DNA。吸去上清,真空干燥留下的固體物,然后在含0.1μg/ml RNase A的125μl TE緩沖液中重懸DNA。這樣的純化步驟可從每一噬菌體中分離大約50-100μg DNA。
實(shí)施例4.8含黑色曲霉黑色變種axdA cDNA噬菌體的Southern分析。
用下列限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)λnig axd 1至λnig axd 4噬菌體的分離DNA進(jìn)行Southern分析KpnI,SalI,SstI,XbaI和XhoI及酶組合kpnI+XbaI,kpnI+SstI及KpnI+XhoI,在37℃下反應(yīng)5小時(shí),反應(yīng)混合物中包括下列溶液5μl(≈1μg)DNA溶液,2μl適當(dāng)?shù)?0X反應(yīng)緩沖液(BRL),10U限制性?xún)?nèi)切酶(BRL)和無(wú)菌蒸餾水,調(diào)節(jié)終體積為20μl。消化后,加入0.1倍體積3M NaAc和2倍體積的乙醇來(lái)沉淀DNA。室溫下離心(14000Xg)10分鐘收集DNA。吸去上清液,真空下迅速干燥留下的因體物,重懸在無(wú)菌蒸餾水中。加入4μlDNA載樣緩沖液后65℃保溫10分鐘,迅速在冰上冷卻,之后加樣到TAE緩沖液中的0.6%瓊脂糖凝膠中。25V下電泳15-18小時(shí)分離DNA片段,
電泳后,用堿性真空印跡法(VacuGene XL,Pharmacia LKB)變性并轉(zhuǎn)移DNA至尼龍膜(HybondN,Amersham)上,(按指導(dǎo)手冊(cè)中的方法,pp25-26),然后如實(shí)施例4.6所述,用標(biāo)記的黑色曲霉axdA cDNA克隆預(yù)雜交和雜交,雜交條件如實(shí)施例3.3中所述。雜交圖用增敏屏在-70℃下用Kodak XAR-5X光膠片曝光而獲得。
從所得的結(jié)果推斷全部4個(gè)分離克隆的DNA與黑色曲霉ax-dA cDNA雜交。在全部4個(gè)克隆中,找到了來(lái)源于同一基因組區(qū)域的片段。
實(shí)施例4.9黑色曲霉黑色變種的axdA基因的亞克隆用冷凍擠壓法從0.7%的瓊脂糖凝膠中分離來(lái)自λnig axd1的3.7kb的XhoI片段電泳后,切出合適的帶,在1mlFS1溶液(0.3M NaAc,pH7.0,1mM EDTA)中輕輕搖蕩30分鐘。將瓊脂糖膠條轉(zhuǎn)移至一個(gè)0.5ml的eppendorf管中(其中有一個(gè)小的硅烷化的玻璃棉塞,底部有一小孔),在液氮中冷藏。從此0.5ml管移至一只1.5ml的eppendorf管中,然后離心10分鐘。在上清液中加入1/50體積的FS2溶液(0.5M MgCl2,5%乙酸)和2.5倍體積的100%乙醇。-70℃保存20分鐘,4℃(14000Xg)離心15分鐘收集DNA。移去上清液后,用Savant Speedvac真空離心機(jī)干燥DNA沉淀。將此DNA溶于10μl TE緩沖液中,用瓊脂糖電泳測(cè)定其濃度,用已知濃度的λDNA作為參照,溴化乙錠染色檢測(cè)DNA。
載體PBluescript SK-用Xhol消化,用堿性磷酸酶去磷酸化。按下述方法制備1μl(1μg/μl)pBluescript與2μl 10X反應(yīng)液2(BRL),1μl(lU/μl)XhoI和16μl無(wú)菌蒸餾水混合。DNA在37℃下消化2小時(shí),然后加入0.5μl堿性磷酸酶(1U/μl,Pharmacia),再繼續(xù)在37℃溫育30分鐘。如上所述線(xiàn)性化的載體用0.7%瓊脂糖凝膠分離。
按下述步驟將3.7kb XhoI片段連接到XhoI消化的去磷酸化的pBluescript SK-載體中將40ng pBluescript片段與300ng 3.7kbXhoI片段混合,再加入4μl 5×連接緩沖液(500mM Tri-HCl,pH7.6;100mM MgCl2,100mM ATP,10mM二硫蘇糖醇,25%PEG-6000)和1μl(1U/μl)T4 DNA連接酶(BRL),最終體積為20μl。得到的質(zhì)粒被稱(chēng)為pIM3002?;旌衔镌?6℃溫育16小時(shí)后,用Ca-HEPES pH7.0的緩沖液稀釋到100μl。取10μl所稀釋的混合物來(lái)轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。該細(xì)胞的制備方法如下200μl的預(yù)生長(zhǎng)在LB培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基/100ml10g胰蛋白酶胨(BBL),5g酵母膏(BBL),10g NaCl,0.5mM Tris-HCl,pH7.5)的E.colipH5α過(guò)夜培養(yǎng)物。此培養(yǎng)物在定軌搖床上37℃培養(yǎng),直至其濃度達(dá)到OD.600介于0.15-0.2之間。4℃、5000rpm離心收集細(xì)菌。棄上清,迅速置細(xì)胞于冰上。用100ml的100mM MgCl2、5mM Tris-HClpH7.4漂洗細(xì)菌沉淀,懸浮細(xì)胞,再如上離心。用100ml的100mMCaCl2、5mM Tris-HCl pH7.4重復(fù)該操作。最后將細(xì)胞懸浮在2ml的100mM CaCl2、5mM Tris-HCl pH7.4,14%甘油的混合液中。各等份(50μl)可以立即用于轉(zhuǎn)化,也可于-70℃冷藏。
E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)50μl的細(xì)胞懸液與4.5μl的連接混合物混合,冰育30分鐘后,42℃溫育細(xì)胞2分鐘。然后加入1ml LB培養(yǎng)基,在37℃溫育1小時(shí)。14000g離心30秒收集細(xì)菌。棄上清,將細(xì)胞重懸于200μl的LB增培養(yǎng)基中。形成的細(xì)菌懸液鋪在含1000μl/ml氨芐青霉素、50μgX-(Gal)半乳糖和60μg/mlIPTG的LB培養(yǎng)基平板上。
從形成的菌落中挑出12個(gè),在含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。用Maniatis等人(1982,pp368-369)的堿裂解法從培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA,它可用于如實(shí)施例4.3所述的限制性酶切分析以選出帶有目的質(zhì)粒的克隆。根據(jù)廠(chǎng)商的操作說(shuō)明,用Nucleobond PC-500試劑盒(Nagel)從250ml含質(zhì)粒pIM 3002的E.coli DH5α培養(yǎng)物(生長(zhǎng)在含100μl/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中)中大量分離質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒pIM3002進(jìn)一步用限制性?xún)?nèi)切酶分析,得到的限制性酶切圖見(jiàn)圖4。一個(gè)含pIM3002的E.codi DH5α樣品于1995.8.28日保藏在荷蘭Baarn的CBS,保藏號(hào)為CBS637.95。
實(shí)施例4.10克隆基因在黑色曲霉NW219中的超量表達(dá)。
實(shí)施例4.10.1利用共轉(zhuǎn)化法將黑色曲霉黑色變種的axdA導(dǎo)入黑色曲霉NW219中。
在實(shí)施例4.9得到的質(zhì)粒pIM3002通過(guò)黑色曲霉NW219的共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入黑色曲霉中,用黑色曲霉pyrA基因作為質(zhì)粒PGW635(Goosen等,1987)上的選擇性標(biāo)記,質(zhì)粒pIM3002為共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。黑色曲霉NW219的一個(gè)樣品于1995,8,25保藏在荷蘭Baarn的CBS,保藏參為CBS 635.95。
用生長(zhǎng)在補(bǔ)加了5%酵母膏0.2%酪蛋白氨基酸,50mM葡萄糖、10mM煙酰胺和10mM尿苷的基本培養(yǎng)基中18小時(shí)(30℃下)的黑色曲霉NW219的菌絲體制備原生質(zhì)體,并按照Goosen等人(1987)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作。得到的PYR+轉(zhuǎn)化子用Western blot分析法分析黑色曲霉黑色變種axdA基因的表達(dá)。
實(shí)施例4.10.2篩選表達(dá)黑色曲霉黑色變種的axdA基因的轉(zhuǎn)化子。
對(duì)實(shí)施例4.10.1獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行黑色曲霉黑色變種axdA基因產(chǎn)物(AXDANIG蛋白質(zhì))的形成分析。在一個(gè)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中,用19個(gè)這樣的轉(zhuǎn)化子來(lái)分析AXDANIG的表達(dá)。黑色曲霉N402株用作野生型對(duì)照。按實(shí)施例3.1所述,轉(zhuǎn)化子分別生長(zhǎng)了24、40、48和68小時(shí)。然后,過(guò)濾去除菌絲體,培養(yǎng)物濾液用從家兔中獲得的抗AXDATUB抗體(實(shí)施例4.1)進(jìn)行Western印跡分析。用此方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),分析的19個(gè)轉(zhuǎn)化子中有8個(gè)超量產(chǎn)生AXDANIG蛋白。
實(shí)施例4.11黑色曲霉黑色變種axdA基因的序列分析和描述。
在測(cè)序反應(yīng)中用來(lái)自pBluescript SK-中pIM3002和pUC19的亞克隆片段結(jié)合特異寡核苷酸作為引物,測(cè)定黑色曲霉黑色變種的axdA基因的序列,它的啟動(dòng)子/調(diào)節(jié)區(qū),基因的結(jié)構(gòu)部分和終止區(qū)。核酸序列的測(cè)定如實(shí)施例4.4中所述(SEQIDNO5)。
得到的序列包括2101個(gè)bp,783個(gè)bp在5′端非編碼區(qū),332個(gè)bp在3′端非編碼區(qū)。在5′非編碼區(qū)的665-670位置,發(fā)現(xiàn)了一個(gè)TATA盒。黑色曲霉axdA基因的編碼部分有996bp長(zhǎng),未被內(nèi)含子打斷。該基因編碼一個(gè)有332個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。N-末端序列(象在實(shí)施例1.5.1中根據(jù)黑色曲霉塔賓變種的AXDA蛋白質(zhì)那樣測(cè)定)之前有一段長(zhǎng)度為26個(gè)氨基酸的前肽。成熟蛋白質(zhì)大小為306個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)其分子量為33.01kDa,理論等電點(diǎn)為4.07。
實(shí)施例5.1PCR所得含黑色曲霉塔賓變種axdA基因序列的cDNA片段的克隆實(shí)施例5.1.1利用PCR法生成cDNA片段內(nèi)部CNBr片段(SEQIDNO2)的部分氨基酸序列(見(jiàn)AX-DATUB的測(cè)定)用于設(shè)計(jì)寡核苷酸混合物。由此得到下面的混合物5′-ATG ATK GTI GAR GCT ATK GG-3′(20個(gè)堿基)(SE-QIDNO3),其中,I代表次黃嘌呤核苷,K代表A、T或C,R代表A或G。這個(gè)寡核苷酸是從上述實(shí)施例1.4.2中所述的AXDATUB的內(nèi)部氨基酸序列(氨基酸1(I)到6G)推演出來(lái)的。ATG是從甲硫氨酸推出的,如人們所知因?yàn)镃NBr裂解機(jī)制,甲硫氨酸出現(xiàn)在肽片斷N-末端。
這個(gè)寡核苷酸混合物與寡核苷酸T7(Stratagene)5′-AATACG ACT CAC TAT AG-3′(17個(gè)堿基)(SEQIDNO4)起用于如實(shí)施例4.7中分離的cDNA的PCR反應(yīng)。
為進(jìn)行PCR反應(yīng),將2μl的λ-cDNA與5μl10×反應(yīng)緩沖液(100mM Tris-HCl,pH8.3,500mM KCl,15mM MgCl2,0.01%明膠)、4.0μl 1.25mM四種脫氧核苷三磷酸,和0.5μg的寡核苷酸混合,終體積為50μl。混合反應(yīng)混合物,加入0.5μl TAQ聚合酶(5U/μl,HT Biotechnology,Cambridge,UK)。DNA置于95℃溫育3分鐘熱變性,然后進(jìn)行25次循環(huán),95℃1分鐘,42℃1分鐘,72℃1分鐘。25次循環(huán)后,混合物置于72℃溫育5分鐘。對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的分析揭示了兩個(gè)分立的產(chǎn)物500bp和600bp。根據(jù)AXDA的表現(xiàn)分子量32kDa和CNBr肽的表現(xiàn)分子量9kDa,此片段在預(yù)計(jì)范圍內(nèi)。
實(shí)施例5.1.2500bp和600bp PCR片段的克隆和分析實(shí)施例5.1.2.1500bp和600bp PCR片段的克隆依照廠(chǎng)商操作說(shuō)明,兩個(gè)500bp和600bp的PCR片段都連到一個(gè)pGEMTM-T(Pomega)載體上。14℃溫育16小時(shí)后取4.5μl的連接混合物轉(zhuǎn)化E.codi DH5α感受態(tài)細(xì)胞。每個(gè)連接反應(yīng)選出6個(gè)菌落在含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。按照Ma-niatis等人(1982,pp 368-369)的堿裂解法分離培養(yǎng)物的質(zhì)粒DNA。
實(shí)施例5.1.2.2500bp和600bpPCR片段的序列分析按照實(shí)施例4.4的方法測(cè)定片段序列確定500bp和600bp PCR片段的一級(jí)結(jié)構(gòu)。
兩個(gè)PCR片段的核苷酸序列的計(jì)算機(jī)分析表明600bp的PCR片段與已知的阿拉伯木聚糖降解基因無(wú)相似性,因此被看成是一個(gè)PCR反應(yīng)的假相。500bp PCR反應(yīng)片段的核苷酸序列與圖4所示的cDNA克隆的核苷酸序列,從706至1204很相近。
實(shí)施例 5.2500bp PCR片段的32P標(biāo)記PCR反應(yīng)得到的500bp片段按歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)9120 5944.5(公布號(hào)0 463 706 A1,實(shí)施例2.2和7.1并入本文中作為參考)中所述方法進(jìn)行分離和標(biāo)記。
實(shí)施例5.3從黑色曲霉塔賓變種基因組文庫(kù)篩選axdA基因?yàn)榱撕Y選黑色曲霉塔賓變種的基因組文庫(kù)(按照歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)91205944.5,公布號(hào)0463 706 A1實(shí)施例2的方法構(gòu)建),按實(shí)施例4.6的方法鋪平板,每板鋪3×103pfu axdA基因,用32P標(biāo)記的500bp PCR片段(按實(shí)施例5.1.1的方法制備)作為探針。
出現(xiàn)在復(fù)印膜上的重復(fù)的三個(gè)雜交噬斑被鑒別并定名為λtubaxh1到λtubaxh3。按實(shí)施例4.6的方法分離和擴(kuò)增噬菌體。
實(shí)施例5.4含黑色曲霉塔賓變種axdA DNA的噬菌體的Southern分析按實(shí)施例4.7的方法分離λ噬菌體的DNA。用下列限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)從噬菌體λtubaxd1至λtubaxa3分離的DNA進(jìn)行Southern分析BamHI、EciRI、HindIII、Kpn I、SalI、SstI和XhoI。按實(shí)施例4.8的方法進(jìn)行Southern分析。
從得到的結(jié)果推斷全部三個(gè)分離克隆的DNA與黑色曲霉塔賓變種的axdA cDNA雜交。在全部三個(gè)克隆中都發(fā)現(xiàn)了來(lái)自相同基因組區(qū)的片段。
實(shí)施例5.5黑色曲霉塔賓變種axdA基因的亞克隆來(lái)自λtubaxd3的5.5kb SstI片段被分離并連到按實(shí)施例4.9的方法用SstI消化并去磷酸化的p Bluescript Sk-載體上,產(chǎn)生一個(gè)被稱(chēng)為pIM3001的質(zhì)粒。進(jìn)一步用限制性?xún)?nèi)切酶分析質(zhì)粒pIM3001,得到的限制性酶切圖示于圖6中。一份含pIM3001的E.coldi DH5α樣品于1995,8.28保藏荷蘭Baarn的CBS,保藏號(hào)為CBS636.95。
實(shí)施例5.6,黑色曲霉塔賓變種的axdA基因在黑色曲霉NW219中的表達(dá)。
實(shí)施例5.6.1通過(guò)共轉(zhuǎn)化將黑色曲霉塔賓變種axdA基因引入黑色曲霉NW219中。
按實(shí)施例5.5得到的質(zhì)粒pIM3001,按實(shí)施例4.10.1的方法對(duì)黑色曲霉NW219共轉(zhuǎn)化,引入黑色曲霉中。然后用Western印跡分析法分析得到的PYR+轉(zhuǎn)化子的黑色曲霉塔賓變種axdA基因的表達(dá)。
實(shí)施例5.6.2篩選表達(dá)黑色曲霉塔賓變種axdA基因的轉(zhuǎn)化子。
實(shí)施例5.6.1獲得的轉(zhuǎn)化子被用于分析黑色曲霉塔賓變種ax-dA基因產(chǎn)物(AXDATUB蛋白)的形成。在生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中用了19個(gè)轉(zhuǎn)化子來(lái)分析AXDATUB的表達(dá)。黑色曲霉N402株被用作野生型對(duì)照。轉(zhuǎn)化子按實(shí)施例3.1的方法分別培養(yǎng)20、41、60和86小時(shí)。然后過(guò)濾,去除菌絲體,用從家兔中獲得的抗AXDATUB的抗體(實(shí)施例4.1)用Western印跡法分析培養(yǎng)物濾液。分析的19個(gè)轉(zhuǎn)化子中有12個(gè)產(chǎn)生能用此方法檢查到的AXDATUB蛋白質(zhì)。
實(shí)施例5.7黑色曲霉塔賓變種axdA基因的序列分析及描述在測(cè)序反應(yīng)中,用來(lái)自pBluescript SK-中pIM 3001和pUC19的亞克隆片段結(jié)合用特異的寡核苷酸作為引物,測(cè)定黑色曲霉塔賓變種axdA基因的序列,它的啟動(dòng)子/調(diào)節(jié)區(qū)、基因的結(jié)構(gòu)部分和終止區(qū)。核酸序列的測(cè)定如實(shí)施例4.4中所述(SEQIDNO7)。
得到的序列包括2859個(gè)bp,823個(gè)bp在5,端非編碼區(qū),1041個(gè)bp在3′端非編碼區(qū)。在5′端非編碼區(qū)的651-655位置發(fā)現(xiàn)了一個(gè)CAAT盒,在713-720的位置發(fā)現(xiàn)了一個(gè)TATA盒。黑色曲霉塔賓變種axdA基因的編碼部分長(zhǎng)度為996個(gè)bp,未被內(nèi)含子打斷。該基因編碼的蛋白質(zhì)有332個(gè)氨基酸。按實(shí)施例1.5.1測(cè)定的N-末端序列之前有一個(gè)長(zhǎng)26個(gè)氨基酸的前肽。成熟的蛋白質(zhì)有306個(gè)氨基酸大小,預(yù)計(jì)其分子量大小為33.250kDa,理論等電點(diǎn)為4.20。
實(shí)施例6用AXDA體外消化玉米。
實(shí)施例6.1水不溶性固體(WIS)的分離分離用于體外消化系統(tǒng)的玉水的不溶于水的聚合物部分。用Retsch研磨機(jī)磨玉米(3mm大小),用己烷(索氏蒸餾裝置)脫脂6小時(shí),然后在105℃干燥,再磨碎(1mm,Retsch研磨機(jī))。在脫脂的400g玉米中加1.5升1.5%SDS/0.05%β-巰基乙醇,室溫?cái)嚢?小時(shí)(以破壞蛋白質(zhì)),然后24000g離心15分鐘。蛋白質(zhì)變性后,用1升SDS/β-巰基乙醇洗沉淀三次,再用1升脫礦質(zhì)水洗二次。沉淀重懸在4升的脫礦質(zhì)水中,篩濾(32μm)。重復(fù)漂洗和篩濾過(guò)程。粗WIS沉淀部分(大于32μm)溶于1升的馬來(lái)酸緩沖液中(pH6.5)90℃保存50分鐘。再加2mg α-淀粉酶(MaxamylTMGist-brocades),30℃下保存16小時(shí)。然后24000g離心15分鐘。65℃脫礦質(zhì)水洗三次后,重復(fù)酶消化。冷凍干燥沉淀(WIS)。WIS含30%木糖,29%阿拉伯糖、23%葡萄糖和7%半乳糖。測(cè)定的葡萄糖不來(lái)自淀粉(Boeringer Mannheim,淀粉測(cè)定試劑盒)。
實(shí)施例6.2家禽體外消化系統(tǒng)120℃烘干前后分別測(cè)定WIS的干物質(zhì)含量(95.73%)在家禽體外消化系統(tǒng)中向1g的WIS中加入200μN(yùn)aN3(Merck)和1ml內(nèi)標(biāo)(山梨醇35mg/ml,Sigma)。為進(jìn)行谷物的酶消化(含200μg蛋白質(zhì)或不含酶),用緩沖液(NaAc,pH5.5)調(diào)節(jié)樣品體積至15ml,39℃溫育1小時(shí),對(duì)胃消化,加5ml的胃蛋白酶(5.28g/L,pH3.0,Merck),39℃溫育1小時(shí)。對(duì)腸道消化,加入2.5ml的胰酶制劑/膽汁鹽(濃度分別為16g/l,0.1g/l,Merck),39℃溫育1.5小時(shí)。離心樣品(2800g)15分鐘。取上清測(cè)在酶消化過(guò)程中被釋放出來(lái)的單糖(HPLC,Spectra Physics;HPX-87P柱,Biorad)。120℃干燥沉淀,并稱(chēng)重。計(jì)算干物質(zhì)的百分率。
作為對(duì)照,在體外系統(tǒng)中加入不同劑量粗酶制品(結(jié)果見(jiàn)圖3)。與空白對(duì)照相比,AXDA酶(加入了200μg AXDA蛋白)對(duì)干物質(zhì)消化率有很大的提高。
對(duì)玉米WIS部分的干物質(zhì)消化率(15.8%)比對(duì)照的提高了4.1%。
實(shí)施例7玉米WIS的體外消化率實(shí)驗(yàn)實(shí)施例7.1玉米WIS的分離按實(shí)驗(yàn)例6的方法分離玉米WIS,由于SDS/硫基乙醇不適于溫育動(dòng)物飼料而做一些改動(dòng)。用1kg脫脂玉米進(jìn)行分離。在1kg脫脂的玉米中,每100g玉米蛋白加4g木瓜蛋白酶(Gist-brocades),30℃懸浮2小時(shí)。然后,用MaxamylTM(Gist-brocades)(2ml/l)在100℃消化,再離心(24000g)15分鐘。棄上清,沉淀再次用酶消化。再離心懸浮液,用脫礦質(zhì)水(1L)洗三次。然后冷凍干燥沉淀(水不溶固體物)。
用三氟乙酸(TFA)分析法測(cè)定玉米WIS中的單/寡糖類(lèi)含量。在0.3g WIS中,加入1ml 35mg/ml山梨醇(內(nèi)標(biāo)),2ml脫礦質(zhì)水和450μl TFA,然后,120℃水解1小時(shí)。冷卻后,加入20ml脫礦質(zhì)水,繼續(xù)在120℃水解1小時(shí)。冷卻后,將樣品冷凍干燥,重懸于3ml脫礦質(zhì)水中。在HPLC系統(tǒng)中(Spectra Physics)用HPX-87P柱(Bio-rad)除去單糖。玉米的WIS聚合物部分含有124.8mg/g木糖;96.6mg/g阿拉伯糖;28.2mg/g半乳糖和156.0mg/g葡萄糖。由于葡萄糖含量高,分析WIS部分的淀粉(淀粉測(cè)定試劑盒,BoehringerMannheim),發(fā)現(xiàn)WIS部分不含淀粉。
實(shí)施例7.2,小雞消化率試驗(yàn)為測(cè)定AXDA酶對(duì)一種食物(其中加入了20%的玉米WIS)的實(shí)際可代謝能量含量的影響,進(jìn)行了一種試驗(yàn)。所用方法是改進(jìn)的“同胞分析”。
雄雞(三周齡)分別養(yǎng)在人工調(diào)節(jié)室的籠子里禁食48小時(shí),然后用試管喂進(jìn)準(zhǔn)確定量的飼料。為校正含內(nèi)源性能量成分的損耗,試驗(yàn)還包括一對(duì)照組。喂這些雞10g D-葡萄糖,其他的喂10g飼料。每份飼料分喂給6只雞。葡萄糖對(duì)照組有5只雞。
再禁食48小時(shí),其間定量收集其排泄物。排泄物存放在-20℃條件下,直到用于分析。此間喂一次水(也用試管喂)。
冷凍干燥所收集的消化物,空氣中平衡后稱(chēng)重。分析飼料和消化物干物質(zhì)樣品中的氮和能量含量。
對(duì)照組動(dòng)物的試驗(yàn)結(jié)果用于校正喂試驗(yàn)飼料的動(dòng)物的結(jié)果。所用方法是McNab和Blair(1988)的方法做適當(dāng)調(diào)節(jié)。此文中給出了分析和計(jì)算方法的描述。
根據(jù)實(shí)施例6.2的方法還測(cè)定了干物質(zhì)的體外消化率。
試驗(yàn)處理如下I玉米基礎(chǔ)飼料(見(jiàn)表2)II玉米基礎(chǔ)飼料+10%玉米WISII玉米基礎(chǔ)飼料+20%玉米WISIV玉米基礎(chǔ)飼料+20%玉米WIS+100mg/kgAXDAV玉米基礎(chǔ)飼料+20%玉米WIS+45mg/kg粗酶VI玉米基礎(chǔ)飼料+20%玉米WIS+90mg/kg粗酶VII玉米基礎(chǔ)飼料+20%玉米WIS+200mg/kg內(nèi)木聚糖酶。
基礎(chǔ)飼料的組成見(jiàn)表2。
表2實(shí)驗(yàn)中基礎(chǔ)飼料的組成試驗(yàn)結(jié)果(氮校正的實(shí)際可代射能量TMEn)和體外分析的結(jié)果)見(jiàn)表3。
表3實(shí)際可代謝能量(氮量校正,TMEn)和干物質(zhì)體外消化率。
*)殘余標(biāo)準(zhǔn)誤差0.42LSD(5%)0.76根據(jù)LSD-檢驗(yàn),用不同字母標(biāo)出的TMEn值有顯著性差異,(p<0.05)。
隨著玉米-WIS的增加,TMEn水平顯著下降。
所有酶制品都提高了TMEn-值,只是內(nèi)木聚糖酶(+7.0%)和AXDA(+10.7%)的提高有顯著性。根據(jù)平均值,AXDA將能量值提高到加10%玉米WIS的基礎(chǔ)飼料的水平。
在體外模型中(模仿小雞中消化過(guò)程),AXDA大大提高了干物質(zhì)的消化率(+24.5%)。此模型中的內(nèi)木聚糖酶和粗酶制品不如AXDA有效。
實(shí)施例8AXDA用于烤面包用模制面包在puploaf烤制試驗(yàn)中測(cè)試AXDA。用150g生面團(tuán)烤puploaf面包。生面團(tuán)經(jīng)混合200g面粉(Robijntm/Columbustm80/20),104ml水,1.4g干烤制酵母(Fermipantm),4g鹽,3g糖,400mg CaCl2·2H2O,3mg(15ppm)抗壞血酸和5mg(25ppm)真菌α-淀粉酶(FermizymetmP200)和25μg純化的AXDA制成。在絞式和面機(jī)中以52rpm轉(zhuǎn)速混合6分鐘15秒,切分生面團(tuán),30℃發(fā)45分鐘,用力按揉,再發(fā)25分鐘,放入模子中。最后在30℃再發(fā)70分鐘后,在225℃烤20分鐘。用油菜子置換法測(cè)面包的體積。面包體積因?yàn)楹蠥XDA由490ml(對(duì)照)增加到535ml,即增加了9%。
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序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名字Gist-brocades B.V.(B)街道Wateringseweg 1(C)城市Delft(D)國(guó)別荷蘭(F)郵編(ZIP)2611XT(ii)發(fā)明名稱(chēng)阿拉伯木聚糖降解酶(iii)序列號(hào)8(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,版本#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)型(ii)分子類(lèi)型肽(iii)假擬無(wú)(iv)反義無(wú)(v)片段類(lèi)型N-末端(vi)最初來(lái)源(A)生物黑色曲霉塔賓變種(B)菌株DS16813Xaa=cys(xi)序列描述SEQ ID NO1Lys Xaa Ala Leu Pro Ser Ser Tyr1 5(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)型(ii)分子類(lèi)型肽(iii)假擬無(wú)(iii)反義無(wú)(v)片段類(lèi)型內(nèi)部(vi)最初來(lái)源(A)生物黑色曲霉塔賓變種(B)菌株DS16813(ix)特點(diǎn)(A)名字/關(guān)鍵詞氨基酸殘基(B)位置14(D)其他信息Arg或Asn(ix)特點(diǎn)(A)名字/關(guān)鍵詞氨基酸殘基
(B)位置15(D)其他信息殘基=未確定(ix)特點(diǎn)(A)名字/關(guān)鍵詞氨基酸殘基(B)位置16(D)其他信息殘基=未確定(ix)特點(diǎn)、(A)名字/關(guān)鍵詞氨基酸殘基(B)位置17(D)其他信息殘基=未確定(xi)序列描述SEQ ID NO2Ile Val Glu Ala Ile Gly Ser Thr Gly His Arg Tyr Phe Xaa Ser Phe1 5 10 15Thr(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)型(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(iii)假擬無(wú)(iii)反義無(wú)(iv)最初來(lái)源(A)生物黑色曲霉塔賓變種(B)菌株DS16813(xi)序列描述SEQ ID NO3ATGATKGTIG ARGCIATKGG(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特點(diǎn)、(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)型(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(iii)假擬無(wú)(iii)反義無(wú)(iv)最初來(lái)源(A)生物裝色曲霉塔賓變種(B)菌株DS16813(xi)序列描述SEQ ID NO4AATACGACTC ACTATAG(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特點(diǎn)、(A)長(zhǎng)度2101個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)型(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(iii)假擬無(wú)(iii)反義無(wú)(vi)最初來(lái)源(A)生物黑色曲霉(B)菌株CBS 120.49(ix)特點(diǎn)(A)名字/關(guān)鍵詞TATA-信號(hào)(B)位置665..670(ix)特點(diǎn)(A)名字/關(guān)鍵詞CDS(B)位置784..1779(D)其他信息/產(chǎn)物=“阿拉伯木聚糖降解酶”/基因=“axdA”標(biāo)準(zhǔn)-名稱(chēng)=“阿拉伯木聚糖降解酶”(ix)特點(diǎn)(A)名字/關(guān)鍵詞Sig-肽(B)位置784..861(ix)特點(diǎn)、(A)名字/關(guān)鍵mat-肽(B)位置862..1779(xi)序列描述SEQ ID NO5
CTGATTGGGA TTCTGCAGGA ATTCTCTGGG GTATGCCAAA AAAGTATACC GACCTGTAAA 60AGTCCAACCA GTTCGAAATT ACTAACAATA TGTTTTTGAT CAGGATATCT TTGGCATCTA120TGGTGAGAGC CATATCATCA TCTCTTCTTC CGGCAGCTGT CAACTGCCTG CCGAAAGTAC180TGGAAGCCAT TGTGTTTTAA GGTGAAACAA GATCAGGGCG GCTATGTGTC AGGGTAGAAC240CAGTTTGCTT AGCGCCATCA GGGTCCACGT CTAGACTTTC GATGCCCGGA GTTATTCGCC300TTCCCACAGC AGTCATTTCC CCGAATCTAA ACCGATGGAC GGATATTGTG GTGTAATGAT360AGAACAACAC GGTGTAGTGT AGTTTTAAGT GCCGTGCTAG ACACGGCAAC GTTCCGGTGG420GCGATTGTTT CTGGCTAATG TACTCCGTAG TTTAGGCAAC AGGCCGATCA TCTTCCCCCA480TAGGAAAGGA CCCTGAATAG TGCGTCAAAA AGAGCTTGAG GCAAAGGAGG ACTGCACTTT540CCAAGGCCGA AGTGGGGGGG GGGGATAACC AAGCAGCCCA ACTTTTATCC GAAACCTTTC600AGGTGTCATC TAATTTGGAT AAATCCGGAT TGTTCTTCGG CATATGTGGA TGTCACCATG660AGCCATAAAT ACAAATATCT GGACAAGCTG TTGCCCTTTG TTCAAGTTAT TCGTTCTCTG720TGGACCACGA TCCCAACCAT TGATCTCTTT TGTTTGTTCC TCAGCGGATA AAGTCATACG780AAA ATG AAA TTC CTC AAA GCC AAG GGT AGC TTG CTG TCG TCT GGC ATA 828Met Lys Phe Leu Lys Ala Lys Gly Ser Leu Leu Ser Ser Gly Ile-25 -20 -15TAC CTC ATT GCA TTG GCC CCC TTT GTC AAC GCA AAA TGC GCT CTT CCG 876Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Pro Phe Val Asn Ala Lys Cys Ala Leu Pro-10 -51 5TCG ACA TAT AGT TGG ACT TCG ACC GAT GCT CTC GCC ACC CCA AAG TCC 924Ser Thr Tyr Ser Trp Thr Ser Thr Asp Ala Leu Ala Thr Pro Lys Ser10 15 20GGA TGG ACT GCA CTC AAG GAC TTC ACC GAT GTC GTC TCT AAC GGC AAA 972Gly Trp Thr Ala Leu Lys Asp Phe Thr Asp Val Val Ser Asn Gly Lys25 30 35CAT ATT GTC TAT GCG TCC ACT ACC GAC ACA CAG GGA AAT TAC GGC TCC 1020His Ile Val Tyr Ala Ser Thr Thr Asp Thr Gln Gly Asn Tyr Gly Ser40 45 50ATG GGC TTT GGC GCC TTT TCG GAC TGG TCG GAC ATG GCA TCC GCT AGT 1068Met Gly Phe Gly Ala Phe Ser Asp Trp Ser Asp Met Ala Ser Ala Ser55 60 65CAA ACG GCC ACA AGC TTC AGC GCC GTA GCT CCA ACC TTG TTC TAC TTC 1116Gln Thr Ala Thr Ser Phe Ser Ala Val Ala Pro Thr Leu Phe Tyr Phe70 75 80 85CAG CCA AAG AGT ATC TGG GTT CTG GCC TAC CAA TGG GGC TCC AGC ACT 1164Gln Pro Lys Ser Ile Trp Val Leu Ala Tyr Gln Trp Gly Ser Ser Thr90 95 100TTC ACC TAC CGC ACC TCT CAA GAT CCC ACC AAT GTC AAC GGC TGG TCA1212Phe Thr Tyr Arg Thr Ser Gln Asp Pro Thr Asn Val Asn Gly Trp Ser105 110 115TCC GAG CAA GCT CTT TTC ACG GGC AAA ATC AGC GGC TCA AGT ACC GGT126CSer Glu Gln Ala Leu Phe Thr Gly Lys Ile Ser Gly Ser Ser Thr Gly120 125 130GCC ATT GAT CAG ACT GTG ATT GGT GAT GAT ACG AAT ATG TAT CTT TTC1308Ala Ile Asp Gln Thr Val Ile Gly Asp Asp Thr Asn Met Tyr Leu Phe135 140 145TTT GCC GGC GAC AAT GGC AAG ATC TAC CGA TCC AGC ATG TCT ATC AAT1356Phe Ala Gly Asp Asn Gly Lys Ile Tyr Arg Ser Ser Met Ser Ile Asn150 155 160 165GAC TTC CCC GGA AGC TTC GGC AGC CAG TAC GAG GAG ATC CTC AGC GGC1404Asp Phe Pro Gly Ser Phe Gly Ser Gln Tyr Glu Glu Ile Leu Ser Gly170 175 180GCG ACC AAC GAT TTG TTC GAG GCG GTC CAA GTG TAC ACC GTC GAC GGC1452Ala Thr Asn Asp Leu Phe Glu Ala Val Gln Val Tyr Thr Val Asp Gly185 190 195GGC GAG GGT GAC AGC AAG TAC CTC ATG ATC GTC GAG GCG ATC GGT TCC150CGly Glu Gly Asp Ser Lys Tyr Leu Met Ile Val Glu Ala Ile Gly Ser200 205 210ACC GGA CAT CGT TAT TTC CGC TCC TTC ACG GCC AGC AGT CTC GGC GGA1548Thr Gly His Arg Tyr Phe Arg Ser Phe Thr Ala Ser Ser Leu Giy Gly215 220 225GAG TGG ACA GCC CAG GCG GCA AGT GAA GAT CAA CCC TTC GCG GGC AAA1596Glu Trp Thr Ala Gln Ala Ala Ser Glu Asp Gln Pro Phe Ala Gly Lys230 235 240 245GCC AAC AGT GGC GCC ACC TGG ACC GAC GAC ATC AGT CAT GGT GAC TTG1644Ala Asn Ser Gly Ala Thr Trp Thr Asp Asp Ile Ser His Gly Asp Leu250 255 260GTT CGC AAC AAC CCT GAT CAA ACC ATG ACG GTC GAT CCT TGC AAC CTC1692Val Arg Asn Asn Pro Asp Gln Thr Met Thr Val Asp Pro Cys Asn Leu265 270 275CAG CTT CTC TAC CAG GGC CAT GAC CCC AAC AGC AAT AGT GAC TAC AAC1740Gln Leu Leu Tyr Gln Gly His Asp Pro Asn Ser Asn Ser Asp Tyr Asn280 285 290CTC TTG CCC TGG AAG CCA GGA GTT CTT ACC TTG AAG CAG TGAAAGGCTT 1789Leu Leu Pro Trp Lys Pro Gly Val Leu Thr Leu Lys Gln295 300 305ATCATTTGGT TGCAGACCGG GGTTTTCTTC CCCTTCCTTG AGTAGTATTG TTGGTGGAAG 1849ACAGCGGGAT GGGGAGTGAA TACTATCTTG GGCTCAATTG AGGTGGAATC CTGTCAGACT 1909GTGTACATAG GCTACATGCG AATGATTTGG TTTATTCACA AATAGTATTA ACAGATAGTG 1969TAGTATACAC CTCTGTATTC ACAGGTGATA GCCTGTCTAC TAGTAGTAGA GATGTGGCTC 2029GAGATGACTG CACGTGATGA TCACATCATC ATCATCGCAG TCGCTCACGC GACAGTCTCA 2089GACACACACA TA 2101
(2)SEQ ID NO6的情況(i)序列特征(A)長(zhǎng)度332個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)型(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Lys Phe Leu Lys Ala Lys Gly Ser Leu Leu Ser Ser Gly Ile Tyr-25 -20 -15Leu Ile Ala Leu Ala Pro Phe Val Asn Ala Lys Cys Ala Leu Pro Ser-10 -5 1 5Thr Tyr Ser Trp Thr Ser Thr Asp Ala Leu Ala Thr Pro Lys Ser Gly10 15 20Trp Thr Ala Leu Lys Asp Phe Thr Asp Val Val Ser Asn Gly Lys His25 30 35Ile Val Tyr Ala Ser Thr Thr Asp Thr Gln Gly Asn Tyr Gly Ser Met40 45 50Gly Phe Gly Ala Phe Ser Asp Trp Ser Asp Met Ala Ser Ala Ser Gln55 60 65 70Thr Ala Thr Ser Phe Ser Ala Val Ala Pro Thr Leu Phe Tyr Phe Gln75 80 85Pro Lys Ser Ile Trp Val Leu Ala Tyr Gln Trp Gly Ser Ser Thr Phe90 95 100Thr Tyr Arg Thr Ser Gln Asp Pro Thr Asn Val Asn Gly Trp Ser Ser105 110 115Glu Gln Ala Leu Phe Thr Gly Lys Ile Ser Gly Ser Ser Thr Gly Ala120 125 130Ile Asp Gln Thr Val Ile Gly Asp Asp Thr Asn Met Tyr Leu Phe Phe135 140 145 150Ala Gly Asp Asn Gly Lys Ile Tyr Arg Ser Ser Met Ser Ile Asn Asp155 160 165Phe Pro Gly Ser Phe Gly Ser Gln Tyr Glu Glu Ile Leu Ser Gly Ala170 175 180Thr Asn Asp Leu Phe Glu Ala Val Gln Val Tyr Thr Val Asp Gly Gly185 190 195Glu Gly Asp Ser Lys Tyr Leu Met Ile Val Glu Ala Ile Gly Ser Thr200 205 210Gly His Arg Tyr Phe Arg Ser Phe Thr Ala Ser Ser Leu Gly Gly Glu215 220 225 230Trp Thr Ala Gln Ala Ala Sar Glu Asp Gln Pro Phe Ala Gly Lys Ala235 240 245Asn Ser Gly Ala Thr Trp Thr Asp Asp Ile Ser His Gly Asp Leu Val250 255 260Arg Asn Asn Pro Asp Gln Thr Met Thr Val Asp Pro Cys Asn Leu Gln265 270 275Leu Leu Tyr Gln Gly His Asp Pro Asn Ser Asn Ser Asp Tyr Asn Leu280 285 290Leu Pro Trp Lys Pro Gly Val Leu Thr Leu Lys Gln295 300 305
(2)SEQ ID NO7的情況(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2859個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)型(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(iii)假擬無(wú)(iii)反義無(wú)(vi)最初來(lái)源(A)生物黑色曲霉塔賓變種(B)菌種DS 16813(ix)特點(diǎn)(A)名字/關(guān)鍵詞CAAT-信號(hào)(ix)特點(diǎn)(A)名字/關(guān)鍵詞TATA-信號(hào)(B)位置713..720(ix)特點(diǎn)(A)名字/關(guān)鍵詞CDS(B)位置823..1818(D)其他信息/產(chǎn)物=“阿拉伯木聚糖降解酶”/基因=“axdA”/標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng)=“阿拉伯木聚糖降解酶”(ix)特點(diǎn)
(A)名字/關(guān)鍵詞Sig-肽(B)位置823..901(ix)特點(diǎn)(A)名字/關(guān)鍵詞mat-肽(B)位置901..1818(xi)序列描述SEQ ID NO7CATACTGGGT GTGGTACTGT AGGGAACCTG CAGATGCTCT GCCGAAGGTC TGCAAATAGT 60CCCTGGAGTT TGGTAGTAAA GAGTACCAAC TCGTAAAAGT AGTATGTCCA ACCAATTTGA120AAGTACAAAC TTTTAGTTTG ATTGATTAAA ATACTTTTGG TGTGTACAGT GACAGCCAAA180ATATCATCTC TTCAGCCGAT AGATGTCAAC TGCCCGCCGA AAGTACCGGA AGGTCGTGGT240GTTTTAAGGT GAAACACTAT CAGGGCGGCA ATGTGTCAAA GTAGAACCAG TTTGCTTAGC300GCCATTAGGG TCCACGCCTA GACCCCTCGA TGCCCGGGAG TCATCCGTCC TGTCACAGCA360ATTATTTCCC CGAGTCTACT GCCGAAGAAG AGCTATTGTG GCGTAATCAT GGAATTACCC420TCTGTGTAGG GTAGTCTTGA ACGCCGTTCT AGACACGGCA ACGTTCCGGT GGACGATCGT480TTCTGGCTAA TGTACTCCGT AGTTTAGGCA GCTAGCTGAT CATCTTCCCC CTAGGGAAAG540GACCTGAATA GTGCGCCAAA ATGAGCTTGA GCAAAGGAAT GTTCTTTCTA AGCCAAAGTG600GGGGAAATAA CCAAGCAGCC CACTTTTATC CGAAACGTTT CTGGTGTCAT CCAATATGGA660TAAATCCCGA TTGTTCTTCT GCACGTATCA GTATTGCCAT CAACGTAACT ACATATATTT720GAACATGGTC TGGTCCTCCG TTCGATTTAT TCGTTCTCCG TGGCCAACGA CTTCAGCCAT780TGATCTCTTT TGTTTCTTTC CTGCGGCTAA ACCCATTCGA AG ATG AAG TTC TTC 834Met Lys Phe Phe-25AAA GCC AAA GGC AGC TTG CTG TCA TCA GGC ATC TAC CTC ATT GCA TTA 882Lys Ala Lys Gly Ser Leu Leu Ser Ser Gly Ile Tyr Leu Ile Ala Leu-20 -15 -10ACC CCC TTT GTC AAC GCC AAA TGT GCT CTT CCG TCG TCC TAT AGT TGG 930Thr Pro Phe Val Asn Ala Lys Cys Ala Leu Pro Ser Ser Tyr Ser Trp-51 5 10AGT TCA ACC GAT GCT CTC GCA ACT CCA AAG TCA GGA TGG ACC GCA CTG 978Ser Ser Thr Asp Ala Leu Ala Thr Pro Lys Ser Gly Trp Thr Ala Leu15 20 25AAG GAC TTT ACT GAT GTT GTC TCG GAC GGC AAA CAT ATT GTC TAT GCG1026Lys Asp Phe Thr Asp Val Val Ser Asp Gly Lys His Ile Val Tyr Ala30 35 40TCC ACT ACT GAT GAA GCG GGA AAC TAT GGC TCG ATG ACC TTT GGC GCC1074Ser Thr Thr Asp Glu Ala Gly Asn Tyr Gly Ser Met Thr Phe Gly Ala45 50 55TTC TCA GAG TGG TCG AAC ATG GCA TCC GCT AGC CAG ACA GCC ACC CCC1122Phe Ser Glu Trp Ser Asn Met Ala Ser Ala Ser Gln Thr Ala Thr Pro60 65 70TTC AAT GCC GTG GCT CCT ACC CTG TTC TAC TTC AAG CCG AAA AGT ATC1170Phe Asn Ala Val Ala Pro Thr Leu Phe Tyr Phe Lys Pro Lys Ser Ile75 80 85 90TGG GTT CTG GCC TAC CAA TGG GGC TCC AGC ACA TTC ACC TAC CGC ACC1218Trp Val Leu Ala Tyr Gln Trp Gly Sar Ser Thr Phe Thr Tyr Arg Thr95 100 105TCC CAA GAT CCC ACC AAT GTC AAT GGC TGG TCG TCG GAG CAG GCG CTT1266Ser Gln Asp Pro Thr Asn Val Asn Gly Trp Ser Ser Glu Gln Ala Leu110 115 120TTC ACC GGC AAA ATC AGC GAC TCA AGC ACC AAT GCC ATT GAC CAG ACG1314Phe Thr Gly Lys Ile Ser Asp Ser Ser Thr Asn Ala Ile Asp Gln Thr125 130 135GTG ATT GGC GAT GAT ACG AAT ATG TAT CTC TTC TTC GCC GGC GAC AAC1362Val Ile Gly Asp Asp Thr Asn Met Tyr Leu Phe Phe Ala Gly Asp Asn140 145 150GGC AAG ATC TAC CGA TCC AGC ATG TCC ATC AAT GAC TTC CCC GGA AGC1410Gly Lys Ile Tyr Arg Ser Ser Met Ser Ile Asn Asp Phe Pro Gly Ser155 160 165 170TTC GGC AGC CAG TAC GAG GTG ATC CTG AGT GGC GCC CGC AAC GAT CTA1458Phe Gly Ser Gln Tyr Glu Val Ile Leu Ser Gly Ala Arg Asn Asp Leu175 180 185TTC GAG GCG GTC CAA GTA TAC ACC GTC GAC GGC GGT GAG GGC GAC ACG1506Phe Glu Ala Val Gln val Tyr Thr Val Asp Gly Gly Glu Gly Asp Thr190 195 200AAG TAT CTC ATG ATC GTT GAG GCG ATC GGG TCC ACC GGA CAT CGT TAT1554Lys Tyr Leu Met Ile Val Glu Ala Ile Gly Ser Thr Gly His Arg Tyr205 210 215TTC CGC TCC TTC ACG GCC AGC AGT CTG GGT GGA GAG TGG ACA GCC CAG1602Phe Arg Ser Phe Thr Ala Ser Ser Leu Gly Gly Glu Trp Thr Ala Gln220 225 230GCG GCA AGT GAG GAT CAA CCC TTC GCA GGC AAA GCC AAC AGT GGT GCC1650Ala Ala Ser Glu Asp Gln Pro Phe Ala Gly Lys Ala Asn Ser Gly Ala235 240 245 250ACC TGG ACC GAA GAC ATT AGC CAT GGT GAC TTG GTT CGC AAC AAC CCT1698Thr Trp Thr Glu Asp Ile Ser His Gly Asp Leu Val Arg Asn Asn Pro255 260 265GAT CAA ACG ATG ACT GTC GAT CCT TGC AAC CTC CAG TTG CTC TAT CAG1746Asp Gln Thr Met Thr Val Asp Pro Cys Asn Leu Gln Leu Leu Tyr Gln270 275 280GGC CAT GAC CCC AAC AGC AGT GGC GAC TAC AAC CTC TTG CCG TGG AAG1794Gly His Asp Pro Asn Ser Ser Gly Asp Tyr Asn Leu Leu Pro Trp Lys285 290 295CCG GGC GTC CTT ACC TTG AAG CAG TGAAGGTATT ATAATTAGTT GCAGATTGTG 1848Pro Gly Val Leu Thr Leu Lys Gln300 305TTTTCATTCC TTCTTCAAGA GTGCTTAGTG GTGGAAGACA GCAGAAGGTG GTCACTATCT 1908TAGGCTCAGT TGGGGTGGGC TTGTGTCCAT AGGCTAGTAA TGTGCGCATA ATTCAGTTCA 1968TTGGCAAGGA GTGCGGTATA AATACCTGTT CTCACAAAAA AAAATAGGCC CGGTGGTCAT 2028ACTCCGTATT GGGATAGAGA TCTCGTAGTA GTAGGATTGT GGGCCTCAGA GGATGACCGA 2088CACGTGAGCA GTCTCCTTCT ACGGCTAGTC GCGTTCTACA TAAGAAATAG TCAGCTCAGA 2148GTTTGTTTTT TGGCTACTTT GAAGGATGGC CTATCGAATC GCACGTCTCC TCAATTGGCC 2208AGGTATTGGC ATTCACTCTC CGCGCTTTGC GGGTGCCGGC ACGAGATGTC TCCTGGAGAA 2268ACTGGGCAAC GAGCAGACTA CGGATATGGG AGATTGTTGA CGACGTTCTT CTTGGTAAAT 2328TTGAACCCTT CAGGGGCTCT ATAAAGGCGG AAATCTAAAT CTCATGTGCC CTAACGTGTC 2388CGACCACGGT GTTGATCAGC ACCTATTAGA TCAGACAACA ACCTTTGGCT CGGAAATTGA 2448ACAGGTAGCT CTTGAATGAC ACTCTGGATC CTGATTCAAT TTATAATGCG TCACTTGAGC 2508GTGCAAGGGG TGCTATATTC ACATCTTGCC CCAATCCAAG GGGCGTCGGA TCCCATTGTG 2568CTCGACAGCC TGGAACTTCG CCGACAGTAT TCTTACGACG TCGATACTGA AATAGTCCAC 2628CTGGTGTGCA TTCGTACGCC GGAAAGACCC TCGTCCGACC GCGTGGCCTT GATTCTGACG 2688AGATGCTTCA ACAAGCGGCC AATTCGATGC CAGCTGTTCA TCGGTTAGAT GTGCTACACA 2748GTGACCTGAT TCCAGGAAAC ATATTCTGGA ACGAAGGAAA TGGCCGCGTC AATTTTCATT 2808GACTTTGAGT GTGCAATAAC CCAAAATAAC GAAATAATGA ACGACCGCTG T 2859
(2)SEQ ID NO8的情況(i)序列特征(A)長(zhǎng)度332個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)型(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Lys Phe Phe Lys Ala Lys Gly Ser Leu Leu Ser Ser Gly Ile Tyr-25 -20 -15Leu Ile Ala Leu Thr Pro Phe Val Asn Ala Lys Cys Ala Leu Pro Ser-10 -5 1 5Ser Tyr Ser Trp Ser Ser Thr Asp Ala Leu Ala Thr Pro Lys Ser Gly10 15 20Trp Thr Ala Leu Lys Asp Phe Thr Asp Val Val Ser Asp Gly Lys His25 30 35Ile Val Tyr Ala Ser Thr Thr Asp Glu Ala Gly Asn Tyr Gly Ser Met40 45 50Thr Phe Gly Ala Phe Ser Glu Trp Ser Asn Met Ala Ser Ala Ser Gln55 60 65 70Thr Ala Thr Pro Phe Asn Ala Val Ala Pro Thr Leu Phe Tyr Phe Lys75 80 85Pro Lys Ser Ile Trp Val Leu Ala Tyr Gln Trp Gly Ser Ser Thr Phe90 95 100Thr Tyr Arg Thr Ser Gln Asp Pro Thr Asn Val Asn Gly Trp Ser Ser105 110 115Glu Gln Ala Leu Phe Thr Gly Lys Ile Ser Asp Ser Ser Thr Asn Ala120 125 130Ile Asp Gln Thr Val Ile Gly Asp Asp Thr Asn Met Tyr Leu Phe Phe135 140 145 150Ala Gly Asp Asn Gly Lys Ile Tyr Arg Ser Ser Met Ser Ile Asn Asp155 160 165Phe Pro Gly Ser Phe Gly Ser Gln Tyr Glu Val Ile Leu Ser Gly Ala170 175 180Arg Asn Asp Leu Phe Glu Ala Val Gln Val Tyr Thr Val Asp Gly Gly185 190 195Glu Gly Asp Thr Lys Tyr Leu Met Ile Val Glu Ala Ile Gly Ser Thr200 205 210Gly His Arg Tyr Phe Arg Ser Phe Thr Ala Ser Ser Leu Gly Gly Glu215 220 225 230Trp Thr Ala Gln Ala Ala Ser Glu Asp Gln Pro Phe Ala Gly Lys Ala235 240 245Asn Ser Gly Ala Thr Trp Thr Glu Asp Ile Ser His Gly Asp Leu Val250 255 260Arg Asn Asn Pro Asp Gln Thr Met Thr Val Asp Pro Cys Asn Leu Gln265 270 275Leu Leu Tyr Gln Gly His Asp Pro Asn Ser Ser Gly Asp Tyr Asn Leu280 285 290Leu Pro Trp Lys Pro Gly Val Leu Thr Leu Lys Gln295 300 30權(quán)利要求
1.含有編碼有阿拉伯木聚糖降解活性的多肽或其多肽前體的DNA片段的重組DNA,其特征在于,所述DNA片段選自(a)編碼具有SEQ ID NO5中氨基酸1至306所代表的氨基酸序列的多肽或氨基酸-27至306所代表的上述多肽的前體的DNA片段;(b)編碼具有SEQ ID NO7中氨基酸1至306所代表的氨基酸序列的多肽或氨基酸-27至306所代表的上述多肽的前體的DNA片段;(c)編碼仍有阿拉伯木聚糖降解活性的SEQ ID NO5或7中氨基酸殘基1至306所代表多肽的變體或部分或其多肽前體的DNA片段;(d)編碼具有阿拉伯木聚糖降解活性的多肽,并具有SEQ IDNO5中核苷酸784至1779或SEQ ID NO7中核苷酸823至1818所代表的核苷酸序列的DNA片段;(e)編碼有阿拉伯木聚糖降解活性的多肽或此多肽的一部分、并能與SEQ ID NO5中核苷酸784至1779代表的DNA片段或與SEQ ID NO7中核苷酸823至1818代表的DNA片段雜交的DNA片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組DNA,其特征在于阿拉伯木聚糖降解活性可以從絲狀真菌中獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的重組DNA,其特征在于絲狀真菌是一種曲霉種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的重組DNA,其特征在于此曲霉是黑色曲霉或塔賓曲霉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的重組DNA,其還含有所述DNA片段在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)所需的DNA調(diào)控序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求6的重組DNA,其特征在于調(diào)控DNA序列與上述DNA片段的多肽編碼序列是異源的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的重組DNA,其中選擇異源DNA調(diào)控序列以便與DNA片段連接到自身的同源調(diào)控DNA序列上時(shí)在宿主中的表達(dá)相比,增強(qiáng)此DNA片段在所述宿主中的表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)的重組DNA,它是以載體的型式存在的。
9.含有權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)的重組DNA的轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化的真核宿主細(xì)胞,該宿主屬于曲霉屬。
11.一種獲得能增強(qiáng)表達(dá)阿拉伯木聚糖降解活性的宿主細(xì)胞的方法,其中在轉(zhuǎn)化條件下用權(quán)利要求8的重組DNA處理宿主細(xì)胞,并篩選上述阿拉伯木聚糖降解活性的增強(qiáng)表達(dá)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法,其特征在于所述宿主細(xì)胞是曲霉類(lèi)宿主細(xì)胞。
13.一種獲得阿拉伯木聚糖降解酶的方法,包括在對(duì)產(chǎn)酶有利的條件下使能產(chǎn)生所述酶的宿主生長(zhǎng)并回收所述酶的步驟,其特征在于所述宿主細(xì)胞或它們的上一代已用權(quán)利要求8的重組DNA轉(zhuǎn)化。
14.具有阿拉伯木聚糖降解活性的基本純的多肽,其特征在于SEQ ID N06或SEQ ID NO8所示的氨基酸序列,及其仍有所述活性的遺傳變體和部分。
15.含有權(quán)利要求14的基本純的多肽的組合物,可配制該組合物用于飼料、食品或紙和紙漿加工。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物,其中的酶是固定化的。
17.權(quán)利要求14的多肽在幫助阿拉伯木聚糖降解中的應(yīng)用。
18.權(quán)利要求14的多肽作為飼料或食品添加劑的用途。
19.權(quán)利要求14的多肽在紙、紙漿加工中的用途。
20.權(quán)利要求14的多肽在面包烤制中的用途。
21.含有權(quán)利要求14的多肽的飼料或食品。
22.含有SEQ ID NO5中1~783核苷酸所代表的能調(diào)節(jié)其上結(jié)合的DNA序列表達(dá)的DNA片段或其亞片段的重組DNA。
23.含有由SEQ ID NO7中1~822核苷酸所代表的能調(diào)節(jié)其上結(jié)合的DNA序列表達(dá)的DNA片段或其亞片段的重組DNA。
全文摘要
本發(fā)明提供了在選擇的微生物宿主細(xì)胞中克隆和過(guò)量表達(dá)真菌來(lái)源的阿拉伯木聚糖降解酶的方法和表達(dá)構(gòu)建物。該酶對(duì)從玉米中獲得的水不溶固體物表現(xiàn)出降解活性。該酶可以用于動(dòng)物飼料組分、人類(lèi)食物制備和工業(yè)加工中。
文檔編號(hào)C12N9/42GK1134727SQ95190812
公開(kāi)日1996年10月30日 申請(qǐng)日期1995年8月28日 優(yōu)先權(quán)日1994年8月26日
發(fā)明者M·J·A·萬(wàn)德伍, A·J·J·萬(wàn)奧詹, M·M·C·吉爾肯斯, L·H·德格拉夫, J·威瑟爾 申請(qǐng)人:吉斯特-布羅卡迪斯有限公司