專利名稱：用陰離子交換層析法純化寡脫氧核苷酸硫代磷酸酯的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的背景本發(fā)明涉及對(duì)寡脫氧核苷酸硫代磷酸酯(oligodeoxynucleotidephosphorothioate)的純化的領(lǐng)域。
為了治療的目的，在有選擇性的基因調(diào)節(jié)的領(lǐng)域內(nèi)，以已修飾磷酸骨架的寡脫氧核苷酸作為抗致敏寡核苷酸(antisense oligonucleotide)來(lái)使用，這一點(diǎn)在近幾年來(lái)已引起越來(lái)越多的注意。有許多類型的經(jīng)修飾的磷酸鍵，如甲基膦酸酯(methyl phosphonate)，硫代磷酸酯，磷酰胺酯它們已被結(jié)合進(jìn)抗致敏寡核苷酸和研究中。如Erickson and Izant(Eds.)，Gene RegulationBiology ofAntisense RNA and DNA(Raven Press，New York 1992)。舉例如寡脫氧核苷酸硫代磷酸酯已被發(fā)現(xiàn)來(lái)抑制組織培養(yǎng)中的免疫缺陷病毒(Agrawal et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85，7079(1988)；Agrawal et al.，proc.Natl.Acad.Sci.USA86，7790(1989)；Agrawal et al.，in Advanced Drug Delivery Reviews 6，251(R.Juliano，Ed，Elsevier，Amsterdam，1991)；Agrawal et al.，in Prospects for AntisenseNucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS，143(E.Wickstrom，Ed.，Wiley/Liss，New York，1991；Zamecnik and Agrawal in Annual Review of AIDS Research，301(Koff et al.，Eds.，Dekker，New York，1991)；and Matsukwra et al.，Proc，Natl.Acad.Sci.USA83，4244(1988))，和流感病毒(Leiter et al.，Proc Natl.Acad.Sci USA 87，3420-3434(1990))。此外，寡脫氧核苷酸硫代磷酸酯在基礎(chǔ)研究(如Agrawal et al.，Proc Natl，Acad，Sci.USA87，1401(1990)and Eckstein andGish，Trends Biochem.Sci 14，97(1989))，組織培養(yǎng)中的酶抑制作用研究(Mujumdar et al.，Biochemistry 28，1340(1989))，癌基因表達(dá)的調(diào)控(Reed et al.，Cancer Res.50，6565(1990))，及IL-1表達(dá)(Manson et al.，Lymphokine Res.9，35(1990))眾多領(lǐng)域也成為焦點(diǎn)。
自動(dòng)合成儀已被證實(shí)是獲得寡核苷酸的一個(gè)無(wú)法估量其價(jià)值的工具。寡核苷酸通過每次加一個(gè)單體到新生的寡核苷酸鏈上而逐步產(chǎn)生。然而在每次有一個(gè)核苷酸單體將被加入的循環(huán)期間有2-3％的反應(yīng)失敗了。結(jié)果是，最后的產(chǎn)物通常是寡核苷酸的一個(gè)異源混合物，有各種不同長(zhǎng)度。如在一個(gè)典型的20體合成中，該20體產(chǎn)品只相當(dāng)于回收的寡核苷酸產(chǎn)物的50％-60％。對(duì)很多目的(如治療)而言，純化混合物就異常重要。因而人們對(duì)發(fā)展層析技術(shù)來(lái)純化寡核苷酸就產(chǎn)生了興趣。由于寡核苷酸硫代磷酸酯有治療潛力。因此興趣主要集中在對(duì)它的純化上。
已發(fā)表有純化寡脫氧核苷酸硫代磷酸酯的方法。Agrawal et al.，J.Chromatography 509，396(1990)報(bào)道了用反相高效液相色譜對(duì)寡核苷酸硫代磷酸酯的分析。在這項(xiàng)研究中，Agrawal等人將寡核苷酸硫代磷酸酯轉(zhuǎn)換成它的磷酸二酯對(duì)應(yīng)物(counterpart)再進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析。用這種方法，他們能在一個(gè)強(qiáng)陰離子交換柱(Partisphere SAX柱)上分析含10個(gè)或更少核苷酸的寡核苷酸硫代磷酸酯，而多于10個(gè)核苷酸的寡核苷酸硫代磷酸酯，由于能與該SAX介質(zhì)發(fā)生強(qiáng)相互作用而不能分析。
Metelev and Agrawal，Anal，Biochem 200，342(1992)報(bào)道了在一弱陰離子交換柱(Partisphere WAX)上對(duì)寡脫氧核糖核苷酸硫代磷酸酯的離子交換HPLC分析，在這個(gè)弱陰離子交換柱上使用了結(jié)合到Partisphere二氧化硅上的二甲氨丙基功能基團(tuán)。這種離子交換容量為0.18meq/g的介質(zhì)與陰離子的相互作用弱于那些發(fā)現(xiàn)具有強(qiáng)陰離子交換的介質(zhì)。該研究的作者發(fā)現(xiàn)對(duì)寡核苷酸硫代磷酸酯的分離在不超過25個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度以內(nèi)，是依賴于長(zhǎng)度的。而且，n-1個(gè)峰可以從母體峰很好地分離開。他們還發(fā)現(xiàn)用同樣的梯度可分離30體和35體寡核苷酸硫代磷酸酯，而用一個(gè)較淺的梯度能得到更好的分離效果。
Metelev et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，660，321-323(1992)報(bào)道了用離子交換HPLC對(duì)寡核糖核苷酸和嵌合式寡核糖-寡脫氧核苷酸的分析。他們發(fā)現(xiàn)所研究的寡核苷酸的保留時(shí)間取決于寡核苷酸中核糖核苷酸部分的數(shù)目。此外，發(fā)現(xiàn)寡核糖核苷酸的保留時(shí)間依賴于它的長(zhǎng)度。作者們還發(fā)現(xiàn)直到25個(gè)核苷酸長(zhǎng)的寡核糖核苷酸也能被純化和分析。
Bigelow et al.，J.Chromatography 533，131(1900)報(bào)道了應(yīng)用離子對(duì)HPLC來(lái)分析寡核苷酸硫代磷酸酯。Stec.et al.，J.Chromatography 326，263(1985)，and Agrawal and Zamecnik，Nucleic Acids Res.19.5419(1990)報(bào)道了用反相HPLC分析含有1或2個(gè)硫代磷酸酯核苷酸間鍵的寡脫氧核苷酸。
這些純化寡核苷酸硫代磷酸酯的方法均使用HPLC。而這項(xiàng)技術(shù)只適用于小規(guī)模操作，不適于大規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用。
本發(fā)明的概要本發(fā)明的一個(gè)目的是提供純化寡脫氧核苷酸硫代磷酸酯的改進(jìn)方法。特別是，本發(fā)明的一個(gè)目的是要提供適用于大規(guī)模分離寡核苷酸硫代磷酸酯的純化技術(shù)。我們?cè)诙囗?xiàng)發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上發(fā)展方法而達(dá)到了這些目的。首先，我們開發(fā)了一種層析法用的是一個(gè)DMAE Fractogel EMD柱，憑借它我們可不必再用含有機(jī)溶劑的洗脫緩沖液。這種方法的有利之處還在于，由于它不需高溫，使它更能經(jīng)得起大規(guī)模層析。
我們開發(fā)的另一項(xiàng)改進(jìn)是本發(fā)明的方法用到一種洗脫緩沖液，其鹽濃度顯著低于在本領(lǐng)域中以前所知的濃度。這一發(fā)現(xiàn)所帶來(lái)的最重要有利之處是它允許在離子交換柱上分離更長(zhǎng)的寡脫氧核苷酸硫代磷酸酯。
本文揭示的方法提供更大的優(yōu)點(diǎn)以適用于大批量純化寡脫氧核苷酸硫代磷酸酯。這些方法可取代常規(guī)傳統(tǒng)上的C-18操作程序。
圖的簡(jiǎn)短描述

圖1顯示了在DEM91洗脫時(shí)不同溶劑體系的影響。
圖2顯示了在離子交換柱上對(duì)15體，20體和25體的分離(柱的介質(zhì)顆粒大小為25-40μm)。
圖3顯示了在DMAE Fractogel EMD柱上24體和25體的分離。
圖4顯示了在DMAE Fractogel EMD離子交換柱上對(duì)GEM-91(SEQ IDNo1)的純化。
圖5顯示了圖4所顯示的部分的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。
圖6顯示了圖5所示的部分D的毛細(xì)管凝膠電泳分析。
圖7顯示了在離子交換柱上用2.5cm內(nèi)徑的柱子及與圖2中所描述的相同的緩沖液系統(tǒng)來(lái)純化GEM-91(SEQ ID No1)的結(jié)果。
圖8顯示了圖7所示的各部分的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，電泳條件與圖5中所示的一致。
圖9顯示了在一個(gè)內(nèi)徑為5cm的離子交換柱上對(duì)GEM的純化。
圖10顯示了在一離子交換柱上用高pH緩沖系統(tǒng)對(duì)GEM91的純化。
圖11顯示了在DMAE Fractogel EMD離子交換柱上用高pH緩沖系統(tǒng)對(duì)HOFF(SEQ ID No3)的純化，緩沖系統(tǒng)如上面圖10所述。
圖12顯示了在不同凝膠顆粒大小的層析柱上對(duì)GEM-91(GEM-91(SEQ ID No1))的純化(A)顆粒大小為25～40μm；(B)顆粒大小為45～90μm。
圖13顯示了在內(nèi)徑2.6cm的DMAE Fractogel EMD(凝膠顆粒大小為45～90μm)的層析柱上用高pH緩沖系統(tǒng)對(duì)GEM-91(GEM-91(SEQ IDNo1))的純化。
圖14顯示了圖13所示各部分的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。
圖15A顯示了對(duì)圖13所示的部分的集合(部分3-9的集合)進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳分析，而圖15B顯示了對(duì)集合部分的GEN-FAX離子交換層析分析。
圖16顯示了在內(nèi)徑2.6cm的DMAE Fractogel離子交換柱上對(duì)HOFF(SEQ ID No3)樣本的純化；這里所用的緩沖條件與圖13中所示的一樣。
圖17顯示了圖16中各部分的電泳分析。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明包括用離子交換層析法(色譜法)分離或純化寡核苷酸硫代磷酸酯的方法。正如本文所用到的，術(shù)語(yǔ)“分離”和“純化”均意指可交換使用的兩個(gè)詞，而且它們均意味著一個(gè)過程，其中具有某特殊分子結(jié)構(gòu)的寡核苷酸可從物理上與有不同分子結(jié)構(gòu)的寡核苷酸分離。特別是，本發(fā)明包括用DMAE離子交換層析法分離寡核苷酸硫代磷酸酯。
寡脫氧核苷酸硫代磷酸酯與層析柱介質(zhì)之間的相互作用很復(fù)雜。硫代磷酸酯不僅與離子交換劑樹脂發(fā)生相互作用，還與介質(zhì)作用。結(jié)合到介質(zhì)上的硫代磷酸酯比磷酸二酯的結(jié)合更緊。因而就需要較高鹽濃度來(lái)洗脫。
升溫進(jìn)行層析會(huì)導(dǎo)致延長(zhǎng)寡核苷酸硫代磷酸酯的保留時(shí)間，表明混合物的構(gòu)象在不同層析條件下會(huì)改變。寡脫氧核苷酸硫代磷酸酯在升高的溫度下會(huì)伸展開，因而在分子表面暴露更多的負(fù)電荷。
考慮到硫代磷酸酯與柱介質(zhì)之間相互作用的復(fù)雜性，就想到高pH洗脫緩沖液可以通過松動(dòng)硫代磷酸酯對(duì)DMAE交換劑的結(jié)合而改進(jìn)對(duì)硫代磷酸酯的純化。因此，本文展示的試驗(yàn)計(jì)劃使用更強(qiáng)的高pH緩沖液。此外，還應(yīng)用一個(gè)較高線性流速來(lái)防止觸腳部分(tentacle moiety)的體積排阻效應(yīng)。為簡(jiǎn)化操作過程，洗脫緩沖液中未使用任何有機(jī)溶劑或添加劑。
我們發(fā)現(xiàn)寡核苷酸硫代磷酸酯能在用水相洗脫緩沖液的離子交換柱上純化，該水相洗脫緩沖液比以前所報(bào)道的有更高的pH和更低的鹽濃度。下面呈現(xiàn)的結(jié)果證明所述純化技術(shù)能解析長(zhǎng)度上只差一個(gè)核苷酸的寡核苷酸。本文展現(xiàn)的操作程序可代替?zhèn)鹘y(tǒng)的C18程序用于大規(guī)模純化寡核苷酸硫代磷酸酯。這導(dǎo)致在生產(chǎn)過程中步驟更少，并容許更好地純化和回收產(chǎn)品。
DMAE Fractogel EMD介質(zhì)的PK值約為9。介質(zhì)生產(chǎn)廠家建議所用的洗脫液pH值應(yīng)不超過8。與此警告相反，我們發(fā)現(xiàn)分離約長(zhǎng)10個(gè)核苷酸至約35核苷酸的寡核苷酸硫代磷酸酯時(shí)，用大于pH8的洗脫液效果最好。
根據(jù)本發(fā)明的方法，長(zhǎng)約10至35個(gè)核苷酸的寡核苷酸硫代磷酸酯可在一個(gè)DMAE離子交換柱上分離。也可用聚乙烯亞胺層析柱。在一個(gè)較優(yōu)選實(shí)施方案中，約25至35個(gè)核苷酸長(zhǎng)的寡核苷酸硫代磷酸酯能用本方法分離?？捎帽痉椒ǚ蛛x的寡核苷酸可能有少至一個(gè)及多至全部的硫代磷酸酯核苷酸間鍵。與所述寡核苷酸硫代磷酸酯同樣大小的寡核苷酸硫代二磷酸酯也能用同樣的方法分離。
寡核苷酸被置于層析柱上，在環(huán)境溫度(室溫)下用一種第一緩沖液(緩沖液A)和第二緩沖液(緩沖液B)的梯度洗脫，緩沖液A中有約25mM Tris-HCl和約20％50mM水性甘露醇，緩沖液B有緩沖液A的所有組分及約2MNaCl(或另一種適合鹽)。我們發(fā)現(xiàn)，寡核苷酸硫代磷酸酯將在低于約2M的鹽濃度下，而且經(jīng)常是低于約0.5M的鹽濃度下洗脫出來(lái)。
本發(fā)明的分離方法基本上與層析柱顆粒大小無(wú)關(guān)。大小從25至90μm都能使純化成功。在兩種較優(yōu)選實(shí)施方案中，顆粒大小是25-40μm或45-90μm。
以下實(shí)施例用實(shí)例論證了產(chǎn)生和實(shí)踐本發(fā)明的較優(yōu)選模式，但它并不意味著限制發(fā)明的范圍。
實(shí)施例所有按本發(fā)明的方法純化的寡脫氧核苷酸硫代磷酸酯是在一個(gè)自動(dòng)合成儀(Milli GEN8700或8800DNA合成儀)上用標(biāo)準(zhǔn)條件合成的。它們的序列列在以下表I中。
表1名稱 序列號(hào) 序列 類型
GEM-911CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT 25體GEM-922CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTGGAGAGAG 32體HOFF 3GAGGGGAAACAGATCGTCCATGGT 23體PAD-244ACACCCAATTCTGAAAATGGGCAT 24體PAD-155CTCTCGCACCCATCT15體PAD-206CTCTCGCACCCATCTCTCTC 20體我們?cè)谶@些試驗(yàn)中用的是由E.Merck Separation(Earmstat，Germany)生產(chǎn)的DMAE Fractogel EMD。這種Tractogel基質(zhì)是由寡乙二醇，甲基丙烯酸縮水甘油酯以及季戊四醇二甲基丙烯酸酯的共聚物，其既具有一個(gè)親水表面，又具有機(jī)械穩(wěn)定性和對(duì)特高pH值的化學(xué)抗性。觸須離子交換部分全都位于移植在支持物上的線性聚電解質(zhì)鏈上。
由于一個(gè)水相系統(tǒng)比一個(gè)有機(jī)水溶劑在制藥生產(chǎn)過程中更適用，并且需要較少的鹽來(lái)洗脫寡脫氧核苷酸硫代磷酸酯，因此在此選擇了Tris-HCl加甘露醇的緩沖液來(lái)純化GEM-91(SEQ ID No1)。甘露醇有可能扮演一個(gè)置換因子的角色。
實(shí)施例1不同溶劑系統(tǒng)對(duì)最佳鹽濃度的影響GEM-91(SEQ ID No1)(無(wú)三苯甲基)，在有三苯甲基的C18反相層析中純化再去三苯甲基，將GEM-91上樣于DMAE(二甲基氨基乙基)FractogelEMD(顆粒大小25-40μm)離子交換柱上，柱內(nèi)徑為1.5cm，流速5ml/分鐘。以下緩沖系統(tǒng)被用于測(cè)試不同溶劑系統(tǒng)對(duì)最佳鹽濃度的影響1)緩沖液A-25mM Tris-HCl(pH8.0)含20％乙腈；緩沖液B-緩沖液A＋2M NaCl。
2)緩沖液A-25mM Tris-HCl(pH8.0)含20％50mM甘露醇的水溶液；緩沖液B-緩沖液A＋2M NaCl。
表2表現(xiàn)了所用的洗脫梯度表2時(shí)間(分鐘)梯度0-2 緩沖液B的恒組成的20％濃度2-50 緩沖液B從20％至80％的梯度圖1A顯示了使用緩沖系統(tǒng)1時(shí)的洗脫曲線而圖1B顯示了用緩沖系統(tǒng)2時(shí)的洗脫曲線。結(jié)果顯示，GEM-91(SEQ ID No1)在緩沖系統(tǒng)1中在鹽濃度約1.1M NaCl時(shí)洗脫下來(lái)，而在緩沖系統(tǒng)2中它在一個(gè)較低的鹽濃度下，約1M NaCl，被洗脫。
我們選擇Tris-HCl/甘露醇溶液是因?yàn)樗嘞到y(tǒng)比有機(jī)-水相溶劑更適合于制藥生產(chǎn)。甘露醇在洗脫GEM-91(SEQ ID No1)時(shí)的影響尚未知曉，只知道甘露醇可能作為一種置換因子。
實(shí)施例2決定于長(zhǎng)度的寡核苷酸硫代磷酸酯的解析效果一種GEM-91(SEQ ID No1)(15體)，PAD-15(SEQ ID No5)(20體)，和PAD-20(SEQ ID No6)(25體)的混合物被上樣在一個(gè)1.5cm內(nèi)徑的DMAE Fractogel EMD交換柱上(顆粒大小為25-40μm)并以5ml/分鐘的線性流速洗脫。以下是所用緩沖系統(tǒng)緩沖液A-25mM Tris-HCl(pH8.0)含20％ 50mM甘露醇的水溶液；緩沖液B-緩沖液A＋2M NaCl
表3表示了所用的梯度表3時(shí)間(分鐘) 梯度0-5 緩沖液B5％濃度恒組成5-35 緩沖液B從15％至32％的線性梯度35-40 緩沖液B32％濃度恒組成40-70 緩沖液B從32％至50％的線性梯度圖2描述了結(jié)果。15體的保留時(shí)間是29.66分鐘，20體的是42.14分鐘，25體的是52.67分鐘。這些結(jié)果顯示，當(dāng)總寡核苷酸長(zhǎng)度在15至25個(gè)核苷酸之間時(shí)這種方法能完全解析(分離)長(zhǎng)度差5個(gè)核苷酸的寡核苷酸硫代磷酸酯。
同樣的條件也被用于GEM-91(SEQ ID No1)(25體)及PAD-24(SEQID NO4)(24體)的混合物。圖3描述了這一結(jié)果，顯示了這種方法能部分地分離長(zhǎng)度只差1個(gè)核苷酸的寡核苷酸硫代磷酸酯。
實(shí)施例3純化GEM-91(SEQ ID No1)我們純化了GEM-91(SEQ ID No1)(60 A260單位)的一個(gè)粗樣本，其中含50％用如實(shí)施例2所述的相同方法而得的產(chǎn)品。含有GEM-91(SEQ ID No1)的各部分被收集(圖4)并用PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)凝膠(20％的凝膠，恒流15mA進(jìn)行電泳，圖5)以及毛細(xì)管凝膠(圖6)分析。最終產(chǎn)品的純度約88％，基于CE(毛細(xì)管凝膠)分析。終產(chǎn)物量約是粗樣本的30％。
實(shí)施例4大規(guī)模的層析我們進(jìn)行了遞增(Scale-up)試驗(yàn)以確定離子交換層析是否合適于大量制造過程。GEM-91(SEQ ID No1)在一個(gè)2.5cm直徑的柱上從一個(gè)粗制混合物中進(jìn)行分離，用實(shí)施例2中的同樣的緩沖系統(tǒng)，流速10ml/分鐘。表4列出了所用的梯度表4時(shí)間(分鐘) 梯度0-5緩沖液B等濃度15％5-40 緩沖液B從15％-32％的線性梯度40-45 緩沖液B的15％等濃度45-80 緩沖液B從32％至45％的線性梯度圖7描述了結(jié)果。終產(chǎn)物純度約85％；回收率約30％。PAGE分析顯示較后的部分含有比較前部分更多的n-1的缺陷序列(failure sequence)(圖8)，可能是由于線性流動(dòng)速率所致。所用的線性流速在此柱中(2.04cm/分鐘)比小柱(1.5cm直徑)的低一些，小柱流速為10ml/分鐘。在較低的線性流速條件下，柱介質(zhì)的觸須部分導(dǎo)致柱變成一個(gè)體積排阻層析柱(size exclusionchromatography)，使n-1缺陷序列的洗脫被推遲了。
大量的粗制GEM-91(SEQ ID No1)樣本(100,000 A260個(gè)單位)在一個(gè)5cm直徑柱上用與實(shí)施例2相同的緩沖系統(tǒng)，以20ml/分鐘的流速進(jìn)行純化。表5列出了所用的梯度表5時(shí)間(分鐘) 梯度0-5緩沖液B的15％濃度5-60 緩沖液B從15％-32％的線性梯度
60-120 緩沖液B的32％濃度120-160 緩沖液B從32％-45％的線性梯度160-165 緩沖液B的45％濃度165-260 緩沖液B從45％-100％的線性梯度圖9描述了結(jié)果。終產(chǎn)物的純度約與2.5cm直徑的柱上獲得的一樣，但回收率只有25％。較后各部分也含有更多的n-1缺陷序列。洗脫GEM-91(SEQ ID No1)時(shí)需要更多的鹽(約1.3M NaCl而不是0.8M)。這種柱所用的線性流速減為1.02cm/分鐘，是由于反壓的限制。由低線性流速引起洗脫劑體積不足就要求高濃度的NaCl來(lái)洗脫GEM-91(SEQ ID No1)。
HOFF(SEQ ID No3)(24體)樣本在胍中含量很多，它們不能用Tris-HCl，甘露醇在2M NaCl洗脫，甚至當(dāng)溶液有飽和尿素時(shí)也不行。
實(shí)施例5洗脫緩沖液pH的影響為驗(yàn)證這樣一個(gè)理論，即可以用比廠家建議的DMAE Fractogel EMD柱的更高pH的洗脫緩沖液，我們將一個(gè)粗制的GEM-91(SEQ ID No1)樣品上樣在一個(gè)1.0cm直徑的柱上(25-40μm顆粒大小)，流速5ml/分鐘(相應(yīng)于6.39cm/分鐘的線性流速)。以下是所用的緩沖系統(tǒng)緩沖液A50mM Tris-HCl，pH9緩沖液B緩沖液A＋2M NaCl表6列出了所用的梯度表6時(shí)間(分鐘) 梯度0-2 緩沖液B的0％濃度2-40緩沖液B從0-15％的線性梯度混合物在約200mM NaCl被洗脫(圖10)。雖然GEM-91(SEQ ID No1)的峰相當(dāng)寬，但是產(chǎn)物的量非常接近于從合成產(chǎn)量中計(jì)算出的量。
粗制的HOFF(SEQ ID No1)(24體)樣品也能在同樣條件下分離。終產(chǎn)物的保留時(shí)間幾乎與GEM-91(SEQ ID No1)的一樣(圖11)。
一個(gè)較大的柱(2.6cm內(nèi)徑，顆粒大小45-90μm)被用于遞增試驗(yàn)。所用的緩沖系統(tǒng)如下緩沖液A50mM Tris-HCl，pH9.0緩沖液B緩沖液A＋1M NaCl表7列出了流速為35ml/分鐘時(shí)所用的梯度表7時(shí)間(分鐘)梯度0-5 緩沖液B0％濃度5-60緩沖液B從0-30％的線性梯度60-61 緩沖液B從60％-100％的線性梯度GEM-91(SEQ ID No1)樣本的主要峰被分成9個(gè)不同的部分(圖13)。每個(gè)部分以及最后一個(gè)峰均用PAGE分析。在第4至第9部分較少發(fā)現(xiàn)有缺失序列。在更后的部分中沒有n-1缺失序列。這說(shuō)明較高的線性流速(6.6cm/分鐘)有可能阻止了觸須部分的體積排阻效應(yīng)。數(shù)據(jù)還顯示最后一個(gè)峰主要含有n＋x序列，它們可能是在合成中造成的，并且用C18反相柱不能分離(圖14)。
第3至第9部分被集中起來(lái)，并在GENFAX陰離子交換柱上(圖15A)及用毛細(xì)管電泳(圖15B)進(jìn)行了分析。終產(chǎn)物的純度高于90％，收率是初始材料的50％。SEQ ID 3(24體)可用相同的柱梯度從粗制樣本中純化出(圖16)。然而，有三個(gè)主要峰含有主要的產(chǎn)物(圖16和17)，表明在分離期間可能發(fā)生了堿基堆積(base stacking)。
實(shí)施例6柱介質(zhì)顆粒大小的影響在這個(gè)試驗(yàn)中用到一個(gè)1.0cm直徑的柱，用以下緩沖系統(tǒng)緩沖液A50mM Tris-HCl，pH9.0緩沖液B緩沖液A＋1M NaCl 流速5ml/分鐘。
表8列出了所用的梯度表8時(shí)間(分鐘) 梯度0-5 0％濃度緩沖液B2-50緩沖液B從0-20％的線性梯度使用這個(gè)系統(tǒng)，有兩種不同柱介質(zhì)顆粒大小，其結(jié)果顯示在圖12A(25-40μm顆粒大小)，和圖12B(45-90μm顆粒大小)。正如從圖的比較中可以歸納的一樣，顆粒大小的改變沒有顯著影響。
序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人Tang Ph.D.，Jin-Yan Guo Ph.D.，Que Agrawal Ph.D.，Sudhir(ii)發(fā)明的題目使用陰離子交換色譜純化寡脫氧核苷酸硫代磷酸酯。
(iii)序列數(shù)6(iv)通訊地址(A)地址Allegretti & Witcoff Ltd.
(B)街道10South Wacker Drive，Suite 3000(C)城市Chicago(D)州IL(E)國(guó)家USA(F)郵編60606(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型Floppy disk(B)計(jì)算機(jī)Apple Macintosh(C)操作系統(tǒng)Macintosh System 7.1(D)軟件Microsoft Word 5.1(vi)現(xiàn)有申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類號(hào)(viii)律師/代理人 資料(A)姓名Greenfield Ph.D.，Michael S.
(B)登記號(hào)37，142(C)目錄號(hào)93，769(ix)電信資料(A)電話(312)715-1000(B)電傳(312)715-1234(2)SEQ ID No1的資料
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線性(iii)假擬無(wú)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞(B)位置1..25(D)其他資料/注“所有核苷酸間鍵均為硫代磷酸酯”(xi)序列描述SEQ ID NO1 CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCT(2)SEQ ID No2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線性(iii)假擬無(wú)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞(B)位置1..33(D)其他資料/注“所有核苷酸間鍵合均是硫代磷酸酯”(xi)序列描述SEQ ID NO2CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCTGGAGA GAG(2)SEQ ID No3的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線性(iii)假擬無(wú)
(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞-(B)位置1..24(D)其他資料/注意“所有核苷酸間鍵合均為硫代磷酸酯”(xi)序列描述SEQ ID NO3GAGGGGAAAC AGATCGTCCA TGGT(2)SEQ ID No4的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線性(iii)假擬無(wú)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞-(B)位置1..24(D)其他資料/注意“所有核苷酸間鍵合均為硫代磷酸酯”(xi)序列描述SEQ ID NO4ACACCCAATT CTGAAAATGG GCAT(2)SEQ ID No5的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線性(iii)假擬無(wú)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞-(B)位置1..15(D)其他資料/注意“所有核苷酸間鍵合均為硫代磷酸酯”(xi)序列描述SEQ ID NO5CTCTCGCACC CATCT(2)SEQ ID No6的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線性(iii)假擬無(wú)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞-(B)位置1..20(D)其他資料/注意“所有核苷酸間鍵連接均為硫代磷酸酯”(xi)序列描述SEQ ID No6 CTCTCGCACC CATCTCTCTC
權(quán)利要求
1.一種用DMAE陰離子交換層析法純化寡核苷酸硫代磷酸酯的方法，包括用包含甘露醇和超過8.0的pH的一個(gè)水性洗脫緩沖液梯度，洗脫寡核苷酸，其中寡核苷酸長(zhǎng)度為約10至約35個(gè)的核苷酸，至少有一個(gè)硫代磷酸酯核苷酸間鍵，而且洗脫時(shí)鹽濃度小于2M左右。
2.一種用如權(quán)利要求1的陰離子交換層析法純化寡核苷酸硫代磷酸酯的方法，其中寡核苷酸硫代磷酸酯的洗脫鹽濃度小于約0.5M。
3.一種用如權(quán)利要求1的陰離子交換層析法純化寡核苷酸硫代磷酸酯的方法，其中寡核苷酸硫代磷酸酯長(zhǎng)度為25個(gè)左右至35個(gè)左右的核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了分離和純化寡核苷酸硫代磷酸酯的改進(jìn)方法，我們首次應(yīng)用DMAE離子交換層析來(lái)分離和純化寡核苷酸硫代磷酸酯。我們發(fā)現(xiàn)通過改變所選用的條件，可得到極好的分離效果。尤其是，我們已能用比以往文獻(xiàn)中已報(bào)道的更高的pH和更低的鹽濃度來(lái)獲得長(zhǎng)達(dá)約35個(gè)核苷酸的寡核苷酸硫代磷酸酯的層析分離產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1150431SQ95193486
公開日1997年5月21日 申請(qǐng)日期1995年4月7日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月8日
發(fā)明者湯錦炎, 郭確, 休德海爾·阿格雷沃爾 申請(qǐng)人:海布里頓公司